JPH04500208A - インターロイキン―６で末端分化を誘導することによる骨髄性白血病の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−６で末端分化を誘導することによる骨髄性白血病の治瘉光朋 Ω背量 循環血球は新たに発生した細胞で絶えず置き換えられている。置換血球は二つの 主要な系、すなわち、（１）赤血球（正赤芽球）、マクロファージ（単球）、好 酸性顆ａ球、巨核球（血小板）、好中性顆粒球、好塩基性顆粒球（Ｉ！清細胞） を含む骨髄系：および（２）Ｔリンパ球および８９７８球を含むリンパ系；に属 する少なくとも８種類の成熟血球種を生じる造血と呼ばれる過程で形成されるこ バージニス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）およびニコラ（Ｎｉｃｏｆａ）、ＧｒｏｗｔｈＦ ａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ、アカデミツク・プレス（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、二ニー・ヨーク、１９８３］、血球の増殖および分 化の制御の大部分はコロニー刺激性因子（Ｃ３Ｆ）と呼ばれる相互に作用する糖 タンパク質の群によって媒介される。これらの糖タンパク質はそれらの存在を検 出するのに用いられる生体内および試験管内の検定法ゆえにそのように呼ばれて いる。造血細胞の半固体培養基でのクローン培養のための方法は、試験管内での 検定の開発に特に重要であった。この種の培養において、個々の前駆細胞（すな わち、発生上、特定の系に委ねられるが、更に増殖可能な細胞）を増殖させて、 生体内での比較可能な過程と重責的に同一と思われる方法で子孫を成熟させるコ ロニーを形成することができる。造血におけるＣＳＦの役割は、最近の多くの論 評、例えばメｌ−力−フ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏ−ｏｉｅｔｉｃ 　Ｃｏ１ｏｎ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉ　Ｆａｃｔｏｒｓ。

［エルセヴイア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニュー・ヨーク、１９８４］　；メトカ ーフ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１６“〜２２頁（１９８５）；ニコラ（Ｎｉ ｃｏｌａ）ら、１ｍ　ｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　、５巻、７６〜８０頁（１９８４ ）；ウエツトン（Ｗｈｅｔｔｏｎ）ら、ＴｌＢ５．１１８．２０７−２１１頁（ １９８６）；クラーク（Ｃ１ａｒｋ＞およびカーメン（Ｋａｍｅｎ）、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２３６＠、１２２９”１２３７頁、（１９８７）：およびサソクス（Ｓ ａｃｈｓ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８巻、１３７４・−１３７９Ｍ、（１９８７ ＞の論題とな−ノている。

更に、Ｃ３Ｆはｔｕ性白血病の発病および進行にある役割を果たしていると二） ）れる、ｔｆＪ性白血病はｖｔｉ球−マクロファージ前駆、４１ｉ１胞のクロー ン新生物であり、二つの主要な群、すなわち慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および 急性骨髄性白血病（Ａ、ＭＬ＞に分けられる。

Ｃ〜ＩＬは５牌臓および血液中の造血集団か大きく増大する全成熟段階て′の顆 粒球−単球集団の一＃髄中での増大を特徴とする。化学苧法は過剰量の白血病性 細胞集団を減少させるのに有効であるが、通常の養生法ではで未熟形態または興 常形態になる細胞の比率か漸進的に一層高い）末端の重大なｌ−ランスフぢ−メ ージョシを防止することまたは罹患患者の寿命を延長することに成功１７なか一 層な（メトカー）、前記に引用した、１９８４）。

ＡＭＬは、未熟顆粒球−単球幼若細胞の蓄積を特徴とし、成熟する顎粒球−単球 紹胞の形跡かほどんどまたは全くないことが多い、この疾患は主として？髄に間 するものであり、肺臓の肥大は中程度にすき゛ないのが一般的である。総有核血 球は増加することもまたはしないこともあるが、比較的少数の成熟細胞を含む高 比早の未熟幼″７：細胞が存在する０通常、関連した貧血および血小板減少症か 存在し月つｔ髄および末梢血液中で・は成熟顆粒球およＶ単球か相間的に欠損す る。制御不能な出血または圧倒的感染の結果として致死か一般的である（ヌトカ ーフ、前記に引用した、１９８４　）　。

＋髄性白血病を油管するための１！電なアブロー−１−とじて、未熟な白血病性 細胞を誘導して成熟機能細胞に分１ヒか仕ることが可能な原因物質の同定が２要 である［例えば、ホズミ（Ｈｏｚｕｍｉ）、Ａｄｖ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　 、３８８．１２１−１６９頁（１９８６ｉ”ｉ、白血病性細胞のスベクｊ・ル全 体に楳・７な有効性を有するこのような原因物質の大多数が試験管内検定法によ −Ｊて同定された。

これらにはＧ−Ｃ３ＦＪ例えば、トミグ（Ｔｏｍｉｄａ）ら、ＦＥＢＳココルチ コイドホルモンおよびある種のビタミン（ホズミ、前記に引用した）かψけちれ る。これらの原因物質を用いていくつか臨床的に成功したが、争のところ、試験 された原因物質には広範囲の白血病性４＋Ｉｉｌ胞種に対する効果的な分化誘導 活性を有すると思われるものはない、このような現在入手可能な原因物質よりも 活性の範囲が広いかまたはこのような現在入手可能な原因物質に補足する分化誘 導活性を有する更に別の原因物質か入手可能であるならば、医学界に有用である と思われる。

ユ照Ω旦些 本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ　６）を用いて分化を誘導することによ るｆ粘性白血病を泊僚する方法である。本発明は、Ｂ細胞増殖因子−２およびイ ンター７　工０　ソーβ２［セーカル（Ｓｅｈｇａｌ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２ ３５：４．７３１〜７３２頁（１９８７）を参照されたいコとし２ても知られて いるＩＬ〜６が骨髄性白血病細胞を用量に依存して最終的に成熟細胞種に分化さ せるという発見に基づくものである。

工閃り註想皇説囚 本発明は、骨髄性白血病に罹患している患者に効果的な量のＩＬ−６を投与する ことを包含する１本文中で用いられるように、「効果的な量」とは、患者の末梢 血液中の未熟白血病性細胞の止子を有利に減少させるのに１分な量を意味する、 特定の患者に効果的な量は油管が行なわれる白血病の容態、患者の全体的な健康 状も、投与の方法、副作用の過酷さ等のような因子にｒｊ５じて変更することが できる。

通常、ＩＬ−６は効果的な量のＩＬ−６および薬剤担体から成る薬剤組成物どし て投与される。薬剤担体は本発明の組成物を患者に与えるのに遇した、相溶性で 貴毒性物質であればいかなるも１のでもよい、概して２、：のような薬剤の非経 口的投与に有用な組成物は周知て′あるＣたとえば、Ｒｅｙｎｊｎ　ｔｏｎ’至 Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５版、マクロ・パブリッシ ング・カシバ二一（ＭａＣｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペン シルバニア州、イーストン、１９８０′Ｊ、或いは、本発明の組成物を移植可能 な薬剤供給シス１ムによ−ノて患者の体内に導入してもよい［例えば、アーダハ ート（Ｕｒｇｕｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈａｒ　ａｃｏｌ。

Ｔｏｘｉｃｏｌ、　、２４８．１９９〜２３６頁（１９８４）］。

非経口的に投与する場き、ＩＬ−６は薬剤担体と一緒に注射可能な形も（典型的 に溶液、悲濁液またはエマルジシン）の単位投与量で処方される。このような担 体は本質的に無毒性且つ非治療的である。このような担体の例は規定食塩水、リ ンカ−溶液、７キストロース溶液およびハンクス液である。非水性担体、例えは 固定油およびオレイン該エチルを用いてもよい、好ましい担体は５％デキストロ ース／″食塩水である。担体は、等強性および化学的安定性を増大させる物質、 例えは緩衝側および防腐剤などの少量の添加剤を倉んでいてもよい。ＩＬ−６は 約５−２０μｇ、、／ｍ＋の範囲の濃度で凝結体および他のタンパク譬を実質的 に含まない精製された形態で処方されるのが好ましい。

好ましくは、ＩＬ−６を、−日当り約５０”−８００μｇの範囲の量（すなわち 、約１−１．６μｇ／ｋｇ／′日）を与えるような連続的注射によって投与する 。毎日の注射の割きは副作用および血球数の監視に基づいて変更してもよい。

本発明で用いるためのＩＬ−６は、（例えば）アサゴエ（Ａｓａｇｏｅ）ら、旦 上立工立立立立立土旦盈ヱ、６巻、８０６〜８０９頁（１９８８）（細菌発現） ：クルジャン＜Ｋｕｒｊａｎｌら、米国特許第４，５４６，０８２！；明細書（ 酵母発現）：またはクラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、米国特許第４．６７５．２８５ ’：明細書またはタカベ（Ｔａｋａｂｅｌら、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ　 、８８．４６６−４７２頁（１９８８）（哺乳動物発現）に記載の発現宿主での ＩＬ−６３１仁子の発現によ一層て調製される。

好ましくは、ＩＬ−６は、ＩＬ−６遺伝子を運搬する発現ベクターによ−ノて一 時的トランスフェクションまたは安定的１−ランスフ］−メーションが生じた哺 乳動物細胞の培養物上澄みから精製されるｌも好ましくは、ＩＬ−（：）は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣ ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴＣＣ）（メリーランド州、口・ ツクビル）から］０！搏０！電：６７７４８として入手可能なｐｃＤ発現ベクタ ーｐｃＤ−ヒトＩＬ−６（Ｌｌ−１２１１によ−）て一時的にトラシフエクシＪ ンか生じたＣ　ＯＳ　７　ｋＲ胞の培ｇ：：″ａＪ上澄みから精製される。ＣＯ ３７細胞はＡＴＣＣから取得番’；ＣＲＬ１６５１としても入手可能である。Ｃ ０Ｓ７細胞のｐｃＤ−ヒｌ−Ｉ　Ｌ−６（Ｌｌ−１２１）によるｌ−ランスフェ クションは下記のように行なわれる。

すなわち、トランスフェクンヨンの前日に約１０６のＣＯ３７サル細胞を１００ ｍｍのそれぞれのプレー１−上の、ウシ胎児血清Ｉ　Ｑｎ、、；およびクルクミ ン２ミ９ランスフエクシゴシを行なうには、その培地を各グレートから吸引し、 ＰＨ７、４のトリスＭＣＩを５０ミリモル、Ｄ　Ｅ　Ａ．　Ｅ　−　７キストラ ン４００μｇ／］）１およびプラスミドＤＮＡ５０ｕｇを含むＤＭＥ４ｍｌ’″ Ｃ″置き換える．ブｌ／−１−を３７℃で４時間インキコベー１−した後、ＤＮ Ａ含宥含泡培地去し、そのグレートを血清不合ＤＭＥ５ｍｌて゛２回洗浄する． ＤＭＥをプレートに戻して加えた後、３７°Ｃで更に３時間インキュベー１・す る。プレートをＤＭＥで１回洗浄した後，ウシ胎児血清４９６、グルタミン、ペ ニシリンおよびス）・レゾ１ヘマイシン２ミた後、増殖培地をＩＬ−６の精製用 に集める。

トラシスフエクンゴン用プラスミドＤ　Ｎ　Ａは、カサタバン（Ｃａｓａｄａｂ ａｎ．）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｊ．Ｍｏ＋。

Ｂｊｏｌ．、１３８巻、１７９〜２０７頁（１９８０）に記載された大Ｈｊ薗（ Ｅ．ｃｏｌｉ）または同類の生物中でｐｃＤ−ヒ１−ＩＬ−６　（Ｌｌ−１２ｉ ）を増殖させることによ一層て得ることができる．プラスミドＤＮＡは標準法、 例えばマニア”ｚス（Ｍａｎｉａｔｔｓｌら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ　Ｍａｎｕａｌ　［コールド・スプリング・バ ーポジ・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｎ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ）、ニュー・ヨーク、１　９８２コによ一層て培養物から重子される。

或いは、ヒトＴＬ−６を昭；化する遺伝子はブリティッシュ・バイオテクノロジ ー・リミテッド（Ｂｒｊｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．）（ オツクスフジード、英国）から商業的に購入することかできる．このような遺伝 子はｐＵｃりローニングベクターに成り、し、たか−ノて−それらは発現ベクタ ー、例えは前記に挙げたものの１種類に再クローン化される必要がある。

好ましくは、ＩＬ−６は下記の一連の段階によ−２て培養物上澄みから万策され る。最初に、上澄みを一緒にし、ρｊえばミリボア（ペンドフ呵−ド、ＭＡ）Ｙ Ｍ５限外濾過１または同類の膜を用いる限外？過によ−２て、例えば１０倍に濃 縮する。濃縮された上澄みをＰＨ安定性Ｃ−８逆相高圧液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣｌカラム２例えばＶ’ｌ’ＤＡＣ（ヘスベリア、ＣＡ）Ｃ−８コーテ ツドマクロポーラスシリカカラムまたは同類のカラムに装填する。ヒトＩＬ−６ 含有画分を一定勾配のＪｉＡｔ　（ホウ酸すトリウム０．１モル、ｐＨ９，２５ ＞および溶ＪＢ、（アセト二１〜リル７５％およびホウ酸すトリウム０．０２モ ル、ｐＨ９，２５）を流す二とによ−ノてカラムから（容なさせる。すなわち、 ＩＬ−６画分は’１４ｋＢＩ約５０９６でカラムから除かれる。少なくとも２〜 ３リットルの濃縮された土１みに、１０ｎｎｍＸ２５０ｍｍのカラムを用いるこ とかできる０画分は種・マの生物学的検定によ−）てヒトＩＬ−６活性について 検定を行なうことかでき、例えば、つｉンダ（Ｗｏｎｇ）ら、Ｔｍｍｕｎｏｌｏ 　ｙ　Ｔｏｄａｖ、９巻、１．３７”−１３９−互（１９８８）に数種類の検定 法を記載している。画分は、ヒト１１、、−６のＮ末端に対して容易に生ずる抗 ペプチド抗血清によ−ノても検定を行なうことがてきる１ｒａｈえは、ヒラメ＜ Ｈｉｒａｎｏ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、、８４＠、２２８〜．２３１頁（１９８７））、好まし くは、ヒトＩ　Ｉ＝−６は、ＡＴＣＣから取得番号Ｔｌ８２３として入手可能な プラズマ細胞＋１１４［Ｂ胞系であるＭＯＰＣＢ１５の増殖を支持するその能力 によ−）て検定される、溶離シ、たＩＬ−６画分のＰＨを稀トリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）を加えることによ−ＪてｐＨ２，０に調整し、そのｐＨ１ｉｌ整両分を 、最初のカラムと同じＣ−８基質から成る第２の逆相ＨＰＬＣカラムに装填する ６本質的に純粋なヒトＩｔ−６は一定勾配の溶液Ａ　（水中ＴＦＡ０．１％、ｐ Ｈ２，０）および溶液Ｂ２（水中イソプロピルアルコール１５”、アセト二Ｉ・ リル７５°６およびＴＡＦｏ、１°６）を流すことによ−２て第２のカラムから ゼ容；される、すなわち、シの■１、−６画分はＢ２溶液約４５９δでカラムか ら除去される。最初のカラムに装填される開始容量２゛−３リットルの濃縮され た上澄みに対して、第２のカラムの寸法は４６ｍｍｘ２５０ｍｍであることかで きる。

本発明の前記の態様についての記数は例証および説明の目的で示した。それらは 本発明を開示された正確な形態に徹底させまたは制限するためのものではなく、 前記の内容を考慮に入れて多くの変更および変化か可能であることは明らかであ る１本発明の原理およびその実際的な用途を最もよく説明し、ぞれによ−ノて当 該技術者に種々の態様で、しかも予想される特定の利用に退会するように様々に 変更して本発明を最もよく利用することを可能にするために、その態様を選択し 且つ記載する。それは本発明の範囲をこれに添付した請求の範囲によ・ノて定義 することを意味するものである。

本出願人はｐｃＤ−ヒＩ−ＩＬ６　（Ｌｉ１２１）をアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクシヨン、メリーランド州、ロックビル、米国（ＡＴＣＣ）に取得 ＠”；　６７７４８として寄託した。この寄託は、特許を目的とする培養物の寄 託のためのＡＴＣＣ協定に基づいて提供される条件下で行なわれ、それによ−ノ てその寄託を米国特許法＜３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，）１２２条および米国基準規制（Ｃ ，Ｆ。

Ｒ）３７　ｉ　１４条にしたか−７で米国特許商標局長に対して利用可能にし且 つ寄託を維持することを必要とする米国特許明細書の公的発行に対して利用可能 にすることを保証するものである。寄託された菌株の利用可能性を、いずれかの 政府の特許法にしたカーでその政府の代理権の下で許可された権利に違反して、 本発明を実施するライセンスと解釈してはならない。

寄託は、微生物の寄託に間するブダベス１−条約の要件にしたか−Ｊで変更され た。

国際調査報告

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．効果的な量のヒトインターロイキン−６を投与する段階から成る骨髄性白血 病の治療方法。
2. ２．前記の投与段階が約１〜１６μｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲の量のヒトイン ターロイキン−６を静脈内に与えることを含む、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の骨髄性白血病が急性骨髄性白血病である、請求項２に記載の方法。