JPH04500460A - プロオキシダント状態を発生する薬品のバイオアッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 プロオキシダント状態を発生する薬品のバイオアッセイ発明の分野 本発明は、一般に環境中の薬品毒性試験または毒性試験の分野に関するものであ り、特に迅速で便利な毒性スクリーニング操作に関する。

発明の背景 近年、多くの商業上及び工業上の薬品は、極めて少量であっても、ヒト、飼育動 物、及び魚並びに野性生物に毒性作用を生じることが広く認められていた。この ような毒物は、医薬品、食品添加剤、工業上及び農業上の製品中に痕跡量で存在 することがあり、これらの物質に暴露され、あるいはこれらを摂取するヒトまた は動物に急性もしくは慢性の体細胞に作用する悪影響、並びに突然変異誘発性の 作用、催奇性の作用または発癌性の作用を生じ得る。

それ故、一連の毒性作用に関して新規に合成された薬品または製品を試験するこ とか現代社会で常識になっていた。しかしながら、これらの作用の多くは、それ らがこのような物質に暴露されたヒトまたは動物に病気をひき起こし得るとして も、評価し難い。また、毒性の特徴のある汚染物質の存在に関して未知のコンシ スチンシーの加工された材料もしくは物質または食品を試験できることが次第に 重要になってきている。

それ故、毒性物質を同定でき、または未知のコンシスチンシーの材料の試料中の それらを検出できるアッセイを有することか全く育益である。理想的には、この ようなアッセイは、明白な結果がそのアッセイにより得られる場合に、検出され る化学物質の種類を定性的且つ定量的に示す。しかしながら、毒性物質の未知の 試料の定性的な化学分析は、現在極めて遅くしかも高価な技術的努力である。種 々の毒性物質の混合物は、その成分に関して別々の分析を行なう必要のため特別 な困難を呈することがある。その状況は、多数の毒性物質か単一の試料中に存在 する場合に更に複雑にされることがある。何となれば、毒物間の相互作用が付加 的、相乗的もしくは拮抗的な相互作用をもたらし、こうして結果を極めて予測し 難くすることかあるからである。それにもかかわらず、定性分析が実用的でない としても、存置な毒物（例え、それが未知のものであったとしても）の存在に関 してスクリーニングされるべき試料の感度のよい定性分析は、ヒトまたは動物の 環境中の物質の安全性を測定するのに至大な用途がある。

試料中の不利益な毒性薬品の存在に関する感度の良い試験の問題に対する一つの 一般化された方法は、アッセイ中に極めて感度の良い生物物質を使用することで ある。これらのバイオアッセイは、典型的に未知の成分の試験の薬品試料または 環境上の試料からの攻撃誘発に対する生物製剤または全生物の応答を測定して製 剤または生物が影響を受けるかどうかを調べる。このようなバイオアッセイは、 関係する薬品を同定しないが、生物活性に関するそれらの作用を定量的に測定す る。このようなバイオアッセイ試験からのデータは、通常の毒物学データまたは 疫学データにより測定される場合の実験動物及びヒトに及ぼす作用と良い相関関 係があることがわかった。種々の従来のアッセイは、簡単な酵素試験または一群 の酵素試験に基づいていたが、あるいは当該試料に暴露されるバクテリアまたは 魚の如き全生物の応答に基いていた。

一つの商業的な系は、生物発光バクテリアの発光量を利用して試験される試験薬 品試料または環境試料の生物応答を測定する。

毒性物質に関するバイオアッセイが亜ミトコンドリア粒子の使用に基いて実用的 であることが、本発明者のうちの幾人かにより既に親告されている。通電子輸送 として知られる亜ミトコ〉・ドリア粒子を使用するこのバイオアッセイ、即ちＲ ＥＴアッセイは、種々の薬品の水生毒性及び細胞毒性を正確に予測するために、 電子輸送、ＥＴＲと称される別の試験と共に使用されていた。そのアッセイは、 応答能のある酵素をその中に含む無傷のミトコンドリア膜を有する亜ミトコンド リア粒子の使用並びに生成物が分光測光的に測定し得る反応を存利にするように 反応が選択的に誘導し得るように電子の流れを阻止するのに適当な抗生物質の使 用に基く。ＲＥＴ法を用いて触媒作用を受け得る好適な反応は、ＮＡＤ十からＮ ＡＤＨへの変換である。応答能のあるミトコンドリア酵素の作用はミトコンドリ ア脂質膜そのものの応答能を妨害する試験試料中の毒性物質の存在は、ＲＥＴｔ 子流系の作用を乱し、その乱れが溶液の光度応答の変化により検出し得る。この バイオアッセイが米国特許第４，８０８，５１７号明細書に記載されている。

プロオキシダントは、生存生物に毒性を与え得る毒性物質の別のカテゴリーを構 成する。生物学者は、このような薬品が生体内でプロオキシダント状態を誘導す ることによりそれらの急性毒性、突然変異誘発性及び発癌性を示すことを最近気 づいた。プロオキシダント状態が細胞レベルで誘導される場合、酸素の活性形態 の細胞濃度が増加する。活性酸素の主要な形態は、超酸化物陰イオンラジカル（ Ｏｆ−）及びその兵役酸、ヒドロペルオキシラジカル（ＨＯ！＞、−重項酸素（ ０，’）、過酸化水素及びヒドロキシルラジカル（ＨＯ）である。これらの三つ のラジカルの夫々は非常に反応性であり、しかも細胞脂質膜、タンパク質、及び ＤＮＡを攻撃してそれらの酸化分解を生じる能力を育する。プロオキシダント状 態の生物学的帰結は、細胞間の間隙接合連絡の抑制、姉妹染色分体交換、核ＤＮ Ａ及びミトコンドリアＤＮＡの突然変異、発癌、老化、及び細胞死滅を含む。こ れらの損傷作用を避けるため、全ての好気性細胞は複雑な多重レベルの防御系を 発現した。

これらの保護防御系は、遊離基またはオキシダントか細胞成分を攻撃しそれらの 套性効果を与える前にそれらを分解するビタミンＡ、Ｃ１及びＥ並びにグルタチ オンの如き酸化防止剤またはスーパーオキサイドジスムターゼ、カタラーゼ及び ペルオキシダーゼの如き酵素の能力に基く。

正常な健康な細胞に於いて、微妙なバランスが、存気呼吸及びその他の代謝プロ セスの少ない副生物として生産される活性水素ラジカルと、それらの短かい存在 に帰因するわずかな酸化損傷を伴なう酸化防止剤によるこれらのラジカルの除去 との間に存在する。しかしながら、このバランスは遊離基の過度の生産または細 胞の防御系中の欠陥により悪くされることがある。除草剤バラクアット及びジク アット、抗癌剤アドリアマイシン及び１．ドックス染料スルホナシ（ｓｕｌｆｏ ｎａｚｏ）Ｉ［［の如き種々の薬品への暴露は、生体内で酸素遊離基の生産速度 を増し、細胞がそれらを処理できるよりも早く酸素の活性形態の生成をもたらし 得る。その結果は、バラクアットに暴露された人に見られる知命的な肺損傷、ジ クアット暴露に関連する腎臓損傷、及び癌化学療法で投与されるアドリアマイシ ンの必毒性の原因と考えられるプロオキシダント状態である。

プロオキシダント状態を誘導し得るこのような薬品への暴露のひどい結果のため 、環境試料中のこれらの物質の検出のためまたはこの能力を有する新規な薬品も しくは既存の薬品を同定するための迅速な感度の良い方法を開発することが重要 である。研究者は雑雑な細胞培養系または遺伝子系を用いてプロオキシダント状 態を発生する伺々の物質の能力を実証し得たが、プロオキシダント状態を透導す る薬品への一般的な適用性のための迅速なスクリーニング試験は従来利用可能で はない。

発明の要約 本発明は、試料中のプロオキシダント状態を誘導し得る毒物の存在に関して分析 するための方法が応答能のある電子輸送酵素複合体■をその上に有するミトコン ドリア膜の少なくとも部分を含む懸濁液を調製する工程；緩衝剤塩、ＮＡＤＨｌ 及び分光光度分析により検出し得る状態に遊離酸素ラジカルにより触媒作用を受 ける物質を含むアッセイ媒体を懸濁液に添加する工程、所定量の試験試料を添加 する工程；及びプロオキシダント薬品の存在により生じる分光光度変化を測定す る工程を含む分光光度分析により検出されることにより要約される。

本発明の目的は、環境試料、工業上の試料及び製薬試料が感度の良いバイオアッ セイ技術に基く経済的な有効方法で試験し得るような、全体内でプロオキシダン ト状態を誘導する物質の同定及び検出のための方法を提供することである。

本発明の別の目的は、プロオキシダントを誘導する毒性薬品を同定し、検出する バイオアッセイを行なうのに使用するためのキットを提供することである。この ようなキットは、このような毒性物質のアッセイが迅速且つ容易に行ない得るよ うに好適な支持体及び材料を含む。

以下の発明のその他の目的、利点、及び特徴は、以下の明細書から明らかになる 。

図面の簡単な説明 第１図は、ミトコンドリア電子輸送系の酵素複合体中の反応生成物の正常な流れ を略図形式で示す。

第２は、下記の好ましい実施態様の方法で形成される変化系を示す。

第３図は、本発明の方法を用いて得られた結果の図示である。

第４図は、このような結果の別の図示である。

好ましい実施態様の説明 本発明のバイオアッセイを使用する方法及びキットは、未知のコンシスチンシー の試料中の特別の類の毒物の存在を同定または検出することを目的とする生物ア ッセイ手段としてミトコンドリア調製物を使用することを目的どする。このよう なミドフンドリア調製物は、前記されており、殆どの試験管内アッセイの過度の 簡素化と全生物を用いて行なわれる複雑なアッセイの時間を消費し且つ高価な性 質との間の魅力的な折衷を代表する。ここに記載される試験は高感度を有し、し かも共通の様式の毒性により作用する特別な類の毒性薬品に対して選択的である 。

ミトコンドリアは、真核細胞の生化学パワープラントであるとして、しばしば特 性決定される細胞器官である。何となれば、ミトコンドリアは細胞レベルで栄養 素を酸化して細胞のためにエネルギーを生じるのに必要とされる塩基性生化学酵 素を存するからである。加えて、ミトコンドリアは、膜構造中で酵素の高度に組 織化された系を必要とする細胞内の種々のその他の代謝作用及びイオン伝達作用 を行なう酵素を有する。重要な酵素は、ミトコンドリアの内部の膜で運ばれる電 子輸送カスケード中の酵素である。

電子輸送鎖は、細胞内にエネルギー貯蔵分子及びエネルギー利用分子を生成する ために電子の流れを伴う。或種の類の薬品、即ち生体内で細胞中にプロオキシダ ント状態を誘導する薬品に関して、毒性薬品が作用する機構はミトコンドリアの 呼吸性の電子輸送鎖間で供給される電子を吸引して不安定な中間体を生成するこ とである。これらの不安定な中間体は、元素状の二酸素と相互作用して細胞プロ 七スを損ない得る酸素の活性形態を生成し得る遊離基である。ミ）フンドリア電 子輸送酵素カスケードの少なくとも部分の存在が生体内アッセイに於いて、この ようなプロオキシダント状態を誘導する毒物の存在を検出するのに育益であるの は、この理由のためである。

本発明は、応答能のある電子輸送酵素複合体Ｉをその上に有するミトコンドリア 酵素の少なくとも部分を利用して未知の特性の試料中で化合物を誘導して、この ようなプロオキシダントの存在に関して試験するため、またはこの能力を有する 純粋な化合物を同定するだめのバイオアッセイ及びミトコンドリア試験調製キッ トの形成に関する。それ故、本発明を実施するためには、適当な酵素複合体をそ の上に有する膜中に必要な応答能のあるミトコンドリアを含むミトコンドリア調 製物を育することが適切である。

アッセイに使用されるミトコンドリア粒子または亜ミトコンドリア粒子の源は１ 要ではない。ウサギの心臓、ラットの肝臓、ラットの腎臓、ラットの褐色脂肪、 または未分割の牛の心臓ミトコンドリアの如き通常のミトコンドリア調製物、並 びにこのようなミトコンドリアの全調製物または部分ｍ製物が本発明内で使用し 得る。また、存在するミトコンドリアバックグラウンドから電子輸送鎖の複合体 ■を単離すること、及び本発明のバイオアッセイ内でその複合体単独を使用する ことが理論上可能であった。しかしながら、本発明は使用するのに好ましいミト コンドリア調製物は亜ミトコンドリア粒子である。亜ミトコンドリア粒子は、全 ミトコンドリアが破断される場合にクリステ膜の断片からのミセル形成により得 られる。二層脂質小胞である。本質的に、生物源からの全ミトコンドリアは、音 波処理もしくはジギトニンの如き洗剤またはフレンチプレス中の処理により破断 され、遠心分離により細胞質ゾル残渣から分離され、ついで膜セグメントが小胞 （これらはミトコンドリアの無傷の内部膜の挙動をモデルとする）に改質される 。このようなミトコンドリア粒子は、電子輸送鎖中で酵素のミトコンドリア挙動 を良くモデルとすることに加えて、亜ミトコンドリア調製物のアリコートが長期 間にわたって毒性バイオアッセイを行なうのに使用するのに利用可能な量でそれ らが調製でき貯蔵のために凍結または凍結乾燥できるという利点を有する。

それ故、本発明に使用するための亜ミトコンドリア粒子は、全ミトコンドリアの 調製でもって開始する。あらゆる利用可能な源からの全ミトコンドリアが使用し 得る。牛の心臓ミトコンドリアが、プライア−（Ｂｌａｉｒ）により記載された 方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０巻、７８〜８１頁（ １９６７年）を参照のこと）により調製するのに比較的容易である。その後、亜 ミトコンドリア粒子そのものが、好ましくはハンセン（）ｔａｎｓｅｎ）及びス ミス（Ｓ＋ｎ１ｔｈ）により記載された方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ　８１巻、２１４〜２２２頁（１９６４年）を参照のこと）によ り新しいミトコンドリアまたは凍結ミトコンドリアから調製し得る。一旦調製さ れたこのようなミトコンドリア粒子は、当業者に知られたような保存混合物中で 凍結されて貯蔵または輸送し得る。また、ミトコンドリア粒子はまた当業界で既 知の方法により凍結乾燥し得る。凍結調製物は使用のために単に融解されること を必要とし、一方凍結乾燥調製物は使用直前に単にアッセイ媒体中に挿入するこ とにより元へもどすことができる。

本発明に従って行なわれるアッセイの操作を理解するために、ミトコンドリア中 の電子輸送鎖中に通常認められる酵素複合体を考えることが必要である。第１図 に見られるように、酵素複合体ＩはＮＡＤＨからＮＡＯ＋への還元を触媒作用す ると同時に、ＡＤＰがその反応中にＡＴＰに変換される。その後、電子の流れが 酵素複合体Ｉから補酵素Ｑへ向かい、その後酵素複合体■へと向かう。その間に 、スクシネートが酵素複合体■中で酸化されて電子輸送カスケードへの電子流の 別の源を生じる。補酵素Ｑから５、電子流は酵素腹腔体■を通ってチトクロムＣ １酵素複合体■へと進行し、この複合体が最終的に電子を酸素分子に伝達する。

電子輸送カスケード中の夫々の酵素複合体は個々の毒物により選択的に抑制でき 、これらの毒物ハ望ましくない通路中の電子流を選択的に抑制するのに試験管内 アッセイに使用し得る。例えば、複合体Ｉから補酵素Ｑへの電子流はロチノンに より抑制でき、複合体■はセノイルトリフルオロアセトンにより抑制でき、補酵 素Ｑから複合体■へのｔ子流はアンチマイシン八により抑制し得る。電子流を酵 素複合体■から離れることを防ぐのは、特にロチノンまたはアンチマイシンの如 きインヒビターであり、これらは以下の説明で明らかになる理由のため複合体Ｉ 中に自由電子が存在することが所望される本発明の実施に有益である。

本質的に、本発明のアッセイに記載される促進電子吸引技術は、酵素複合体Ｉ中 に存在する過剰の電子を生成するように設計され、その後これらの電子がプロオ キシダント状態を誘導し得る毒物の存在下に“漏出”されて毒物をその遊離基の 活性形態に変換し得る。促進電子吸引操作は第２図に図示される。見られるよう に、複合体ＩはＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化からの電子を受容した。

電子輸送カスケードの複合体■に向かうこれらの電子の流れは、ロチノンの存在 により、及びアンチマイシンの存在により抑制される。その後、複合体■中に存 在する過剰の電子は、プロオキシダントを誘導する毒物Ｘ（それが存在する場合 に）に作用してそを生成させるのは、毒物の遊離基状態からもとのＸへの変換で ある。また、エピネフリンの如きレドックス指示薬が試料中に存在し、これは酸 素の活性形態によりアドレノクロムに還元される。

アドレノクロムは特徴的な褐色を有し、これがその還元生成物の生成を反応中に 分光光度測定することを可能にする。

ミトコンドリア調製物に加えて、またアッセイ媒体が本発明の促進電子吸引操作 を用いるバイオアッセイを行なうのに必要である。アッセイはＨＥＰＥＳ緩衝剤 の如き好適な緩衝剤を含むべきであり、且つ第２図に示された所望の酵素作用を 誘導するのに適した必要な基質及びインヒビターを含むべきである。亜ミトコン ドリア粒子からそれらのスーパーオキサイドジスムターゼ含量を減少することが 適切である。ミトコンドリア膜のマトリックス中に通常存在するこの酵素は、ス ーパーオキサイドラジカルの分解を触媒作用する。それ故、この試験の感度は、 スーパーオキサイドジムスターゼの含量を減少することにより増大され、これは そうしなければ実験溶液中に存在するスーパーオキサイドラジカルの濃度を減少 するであろう。スーパーオキサイドジムスターゼの減少は粒子をＥＴＤＡで洗浄 することにより都合よく行なうことができ、その金融キレート剤はスーパーオキ サイドジムスターゼからマンガンコファクターを除去する。

アッセイ媒体は、本発明のアッセイに所望されない酵素活性を阻止するためにイ ンヒビターを含んでもよい。ロチノン及びアンチマイシンＡの如きインヒビター は、夫々複合体１から酵素Ｑへの電子流または補酵素Ｑから複合体■への電子流 を抑制するのに個々に、または合わせて使用し得る。また、シアニドまたはアミ タールの如きその他の好適な酵素複合体インヒビターが本発明のアッセイに使用 でき、または補酵素Ｑがペンタン抽出により粒子から除去し得ることが考えられ る。

また、本発明のアッセイ媒体は、レドックス指示薬を必要とする。レドックス指 示薬は、反応生成物の存在が分光光度測定し得るような様式で還元または酸化し 得る物質であるべきである。可能なレドックス指示薬はフェリシトクロムＣまた はニトロブルーテトラゾリウムを含む。しかしながら、好ましいレドックス指示 薬はエピネフリンであり、これは上記のように分光光度で容易に検出し得る特徴 的な褐色を育するアドレノクロムに酸化される。

また、本発明のアッセイ媒体は電子源を必要とする。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの如き電子 源が第２図に示されている。また、ＮＡＤＨを生成する物質が電子を与えるのに 使用でき、またはその他の源が電子を与えるのに使用し得る。例えば、補酵素Ｑ からの電子の流れがアンチマイシンにより阻止されると仮定して、過剰の電子を 酵素複合体■に導入することが可能であり、この複合体から電子が酵素複合体！ に逆に流れる。その場合、スクシネートが電子源として使用し得る。また、その 場合、コピキノンからの電子漏出が複合体■の全くの不在下に使用し得る。

本発明のアッセイ法の一つの利点は、反応体が共通の受け話中で簡単に混合し得 ることである。何となれば、反応は電子源を所望されるまで制止することにより 制御し得るからである。それ故、その他の成分の全てが実験溶液に添加でき、試 料が分光光度計に導入されようとするまで遅延された電子源の添加による使用の ために調製される。これは分析が通常の１ｃｍ＋の光学長さのキュベツトの如き 分光光度計キュベツト中で都合よく行なわれることを可能にするが、またその他 のキュベツトが本発明内で使用し得ることがわかった。この技術を用いて、アッ セイはミトコンドリア調製物、緩衝剤、ミトコンドリア酵素インヒビター及びレ ドックス指示薬の全てをキュベツトに添加することにより行ない得る。また、ア ッセイ試料がこの組合せに直接添加し得る。光学特性のベースライン読取値がこ の時点で分光光度測定されてベースラインレベルを決定し得る。その後、酵素複 合体への電子流の源が、ＮＡＤＨの添加によるように添加し得る。この時点で、 プロオキシダント活性を誘導する毒物の活性は、褐色のアドレーＪ−クロムの如 きレドックス指示薬反応生成物の生成により明らかになる。こうしてこの反応生 成物は、アッセイの結果が測定できるように分光光度測定し得る。

一般に、本発明の方法は、多種の環境源のいずれかから、またはこれらの毒性物 質の存在または不在に関して試験することが所望されるその他の材料の試料から 試料中でプロオキシダント状態を誘導する毒物の存在または不在を測定するのに 使用し得る。結果は定性的及び定量的の両方で使用でき、潜在的に汚染された源 中のこのような毒物の濃度を測定し、または種々の毒物を比較し得る。その方法 は幾つかのプロオキシダントを誘導する毒物に関して有効且つ実用的であること がわかり、確かにそのアッセイはその作用が特性決定されるべきその他のこのよ うな毒物を検出し、同定するのに有効であることがわかる。

本発明の実施例 本発明の実施は、牛の心臓から分離された亜ミトコンドリア電子輸送粒子（ＥＴ Ｐと称する）の形成でもって開始した。これらはまた亜ミトコンドリア粒子と称 される。ミトコンドリアを上記のプライアーの方法によりウシの心筋から分離し た。スーパーオキサイドジムスターゼが減少されたＦＴＰ粒子は、融解ミトコン ドリアを０．２５　Ｍの蔗糖及び２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，５を含む媒体中で ２５１１１ｇ１０１のタンパク質濃度で２分間音波処理することにより調製した 。結果物を等容量の０．２５　Ｍの蔗糖で希釈し、ｐＨ７，５に調節し、その後 それを１０５，０００Ｘｇで４０分間遠心分離した。得られたＦＴＰ粒子を１０ 倍容の０．２５Ｍの蔗糖中で洗浄し、遠心分離により沈降させた。処理後、ＦＴ Ｐ粒子を緩衝剤入りの０、２５　Ｍ蔗糖中で２０ｍｇ／−のタンパク質濃度で凍 結して貯蔵した。

試験媒体は５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１．５　ｍＭのエピネフリン及び０． ４μＭのアンチマイシンを含んでいた。媒体を５Ｍの水酸化カリウムでｐＨ７， ２に調節し、１．７’のアリコート中でＩＣｍの経路の長さのガラスキュベツト に計量分配した。水性希釈液または試験試料を、最終濃度がθ〜１００μｇ／− の範囲になるように、２０〜５０μｌの容量で添加した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ 緩衝液０．１＋７！中に懸濁されたＳＯＤ減少ＦＴＰ粒子０．５Ｈの添加後、キ ュベツトをパラフィルムで覆い、３回倒立させて内容物を混合した。まず、ベー スライン吸光度の読取りを、４８０ｒ＋ｎ＋にセットした分光光度計により行な った。

ベースライン読取りを行なった後、５＋ｎＭのＮＡＤＨ５０μＥを添加するごと により反応を開始した。その後、最終吸光度の読取りを室温で１０分間保温後に 行なった。最終吸光度の読取り値を使用して試験薬品の夫々に関する最低の観察 可能な作用濃度（ＬＯＥＣと称する）を計算した。ＬＯＥＣは平均対照値より上 の３４１準偏差応答を与える濃度として定義される。ＬＯＥＣ値は通常の分析を 受ける環境試料に使用された限界検出値に類似することが意図される。

第３図は、バラツクアットの幾つかの希釈液で試験されたこのアッセイの実験結 果を示すグラフである。バラクアットを、アンチマイシンＡまたはロチノンを添 加して、またはこれらを添加しないで試験した。八で示される曲線はアンチマイ シンＡまたはロチノンのいずれも含んでおらず、一方、Ｂで示される曲線は０． ２μｇ／ｒｄのアンチマイシン八でアンチマイシンＡを含み、Ｃて示される曲線 は０．２μｇ／−のロチノンを含んでいた。その曲線は、呼吸性毒素により誘導 される電子輸送の抑制が、バラクアットか電子輸送のカスケードから電子を吸引 し得る速度を増すことを示す。バラクアットは不安定な遊離基中間体に還元され るので、それは電子を二酸素分子に迅速に伝達し、その基底状態にもどる。

このレドックスサイクリング操作は、４８０ｒ＋ｍに於ける吸光度の増加により 定量化されるアドレノクロム反応により検出されるスーパーオキサイドアニオン ラジカルを生成する。

第４図は、薬品バラクアット、ジクアット、スルホナシ■、アドリアマイシン、 及び４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイドで行なわれた実験の結果を示す。これ らの結果は、プロオキシダント状態を誘導するこれらの５つの薬剤の効能の相対 的な目安を与え、スルホナシ■がプロオキシダント状態の最も強い誘導物質であ り、アドリアマイシンが最も弱いものである。５つのプロオキシダントを誘導す る毒物に関する最低の観察可能な作用濃度（ＬＯＥＣ）が下記の表に示される。

この表及び第４図に要約される全ての実験は、２−のＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７ ，２，１，５０μＭのエピネフリン、０．２μｇ／ｄのアンチマイシンＡ、０． ５ｍｇのＦＴＰ、１２５μＭのＮＡＤＨ及びＯ〜１０μｇ／Ｗｄ！の試験毒物を 用いて行なわれた。

スルホナシ■　３２０μｇ／Ｅ ジクアット　１６００μｇ／ｆ！ ４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド　１６００μｇ／ｌバラクアット　３５０ ０μｇ／Ｖ アドリアマイシン　６３００μｇ／ｉ 結果は、そのアッセイがプロオキシダント状態を誘導する多種の毒物を測定する のに有効であることを示し、実験試料の分光光度分析から得られる観察応答がこ のようなプロオキシダント状態の形成によるものであることを更に示す。

本発明は上記のその特別な実施態様に限定されないが、下記の請求の範囲内に入 るような全てのこのようなその改良形態を包含することが理解される。

ＮＡＤ÷ ＦＩＧ、３ プロオキシダント濃度（μｇ／ｌ）の対数ローバラクアット　×−ジクアット　 ◇−スルホナ゛ハ１１Δ−アドリアマイシン　ｏ−４−ＮＱＯ・・・・・・・Ｌ ＯＥＣＦＩＧ、４ 平成　年　月　日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）応答能のある電子輸送酵素複合体１をその上に有するミトコンドリア 膜の少なくとも部分を含む懸濁液を調製する工程；（ｂ）懸濁液に緩衡剤塩；そ の他の酵素複合体への電子流を抑制する選択的なミトコンドリア酵素インヒビタ ー；及び還元生成物が分光光度分折により検出し得るレドックス指示薬を含むア ッセイ媒体を添加する工程； （ｃ）所定量の試験される試料を添加する工程；（ｄ）分光光度のベースライン 試料を採取する工程；（ｅ）電子流の源を酵素複合体１に添加する工程；及び（ ｆ）反応の分光光度応答を測定してレドックス指示薬の反応生成物の存在下の増 加を測定し、こうして試料のプロオキシダント活性を示す工程 を含むことを特徴とする分光光度分析により試料中のプロオキシダント状態を誘 導する毒物の存在に関して分抗する方法。
2. ２．ミトコンドリア膜の少なくとも部分の懸濁液が亜ミトコンドリア粒子を含む 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ミトコンドリア膜がそれらのスーパーオキサイドジスムターゼ含量を減少さ れている請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．ミトコンドリアインヒビターがアンチマイシンＡ、ロテノン、シアニド、及 びアミタールからなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．レドックス指示薬がエビネフリン、フェリチトクロムＣ、及びニトロブルー テトラゾリウムからなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．レドックス指示薬がエビネフリンである請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．電子流の源がＮＡＤＨである請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．電子流の源がスクシネートである請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．電子輸送カスケードの複合体１の応答能のある酵素をその上に有するミトコ ンドリア膜部分の懸濁液；酵素複合体への電子の送出がプロオキシダントを誘導 する毒物の存在下のみでレドックス指示薬からその反応生成物への変換を生じる ように共に選ばれた緩衝剤塩及び反応生成物が分光光度で検出し得るレドックス 指示薬を含むアッセイ媒体；及び反応をプロオキシダントを誘導する毒物の存在 下でレドックス指示薬の反応生成物を生じるようにさせるのに充分な酵素複合体 １への電子流の源 を含むことを特徴とするプロオキシダント状態を誘導する毒物の試料中の存在に 関して分光光度分析するのに使用するためのキット。
10. １０．ミトコンドリア膜部分が亜ミトコンドリア粒子である請求の範囲第９項記 載の方法。
11. １１．ミトコンドリア酵素部分がそのスーパーオキサイドジスムターゼ含量を減 少されている請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．アッセイ媒体が電子輸送カスケード中の電子流を制限する選択的なミトコ ンドリア酸素インヒビターを更に含む請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．ミトコンドリア酵素インヒビターがアンチマイシンＡ、ロテノン、シアニ ド、及びアミタールからなる群から選ばれる請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．レドックス指示薬がエビネフリン、フェリチトクロムＣ、及びニトロブル ーテトラゾリウムからなる群から選ばれる請求の範囲第９項記載の方法。
15. １５．レドックス指示薬がエビネフリンである請求の範囲第９項記載の方法。
16. １６．電子流の源がＮＡＤＨである請求の範囲第９項記載の方法。
17. １７．電子流の源がスクシネートである請求の範囲第９項記載の方法。