JPH04500602A - 合成ｈｉｖプロテアーゼ遺伝子およびその発現法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子およびその発現性発明の背景 発明の分野 本発明は合成遺伝子およびそれらの発現生成物に関する。具体的には、本発明は 合成プロテアーゼ遺伝子およびその発現生成物に関する。

関連技術の説明 精製したピリオン製剤にプロテアーゼタン白質が含まれていることは、免疫学的 手法によってのみ示された。

ｇａｇおよびｐｏｌ配列を有するＨＩＶプロテアーゼ配列または融合タン白質は 、細菌のウィルスＤＮＡから発現された。かかる開示の例には、１．ヘンダーソ ン（Ｈｅｎｄｅｒ−ｓｏｎ）ら、１９８８年、「ヒトレトロウィルス、癌および ＡＩＤＳ：予防および治療法（）Ｉｕｉａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｌｒｕｓｅｓ、Ｃａ ｎｃｅｒ　ａｎｄ＾ＩＤｓ：＾ｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ディー・ボログネ／（Ｄ、　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｌ ）監修、アラン・アール・リス・インコーボレーテド（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ 　Ｉｎｃ。

）より出版、二ニー・ヨーク、二ニー・ヨーク州、１３５ＨＩＶプロテアーゼの 一次配列はタン白質分析およびプロウィルスＤＮＡのヌクレオチド配列によって 決定された。したがって、このプロテアーゼは、ＨＩＶプロウィルスの２９７ｂ ｐの長さの鎖によってフードされた９９アミノ酸の長さのタン白質であることが 決定された。プロテアーゼ遺伝子およびその発現についての従来の実験は、プロ ウィルスのｃＤＮＡからクローニングされたヌクレオチド配列を用いることによ って行われた。合成りＮＡを用いる本発明者の研究は、プロウィルスＤＮＡのヌ クレオチド配列および決定されたアミノ酸配列が正確であることを証明している 。

ＨＩ　Ｖ　−１プロウイルスＤＮＡの完全なヌクレオチドｐｏｌオーブンリーデ ィングフレームにおけるプロテアーゼの配列コーディングは、以前の分析によっ て決定されており、ヌクレオチド１６０９〜１９０６に対応する。Ｎ末端および Ｃ末端アミノ酸は、それぞれプロリンおよびフェニルアラニンである。ＨＩＶ− １９９アミノ酸プロテアーゼをコードするこの配列は、下記のような２９７ｂｐ の長さのものである。

２６０　２７０　’　２８０　、　２９０感染性ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ 　Ｖ）の完成（複製）に必須の特異的酵素またはプロテアーゼをコードする合成 りＮＡ配列は存在しない。このＤＮＡ配列配列線菌および／または真核細胞にお いて組換え法によってこのプロテアーゼを発現させ、生化学的および物理的特性 決定に十分なプロテアーゼを産生させてこの酵素の強力な阻害剤を設計し且つ産 生じ、感染性ＨＩＶ粒子の産生を阻止する上で望まれている。

発明の概要 本発明は、ヒト免疫不全症ウィルスのプロテアーゼをコードする遺伝子である。

この遺伝子は、ヒト免疫不全症ウィルスの感染力に必須なプロテアーゼに関する 合成ヌクレオチド配列から本質的に成る。

このプロテアーゼは、望ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の感染力に必須な これらのウィルスのプロテアーゼである。

本発明の好ましい態様は合成遺伝子であり、ＨＩＶ−１プロテアーゼの発現のた めのコード配列は前記ヌクレオチド配列の上列によって表わされる。

図面の簡単な説明 第１図は、ウェスタンプロットにおいて分析された発現されたＨＩＶプロテアー ゼを表わす。

第２図は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子の合成の方法を例示するものである。

３′オーバハングは、下の場合である。相補鎖（図示せず）はコード鎖に合う３ ′オーバーハングを備えていた。

第３図は、様々な時間における遺伝子の誘導を例示するものである。

第４図は、合成ペプチドａＳａ基質を用いて発現したプロテアーゼの活性を例示 するものである。

好ましい態様の説明 本発明は、特異的酵素またはプロテアーゼをコードする合成りＮＡ配列である。

このプロテアーゼは、ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ　Ｖ）の感染力にとって必 須である。本発明の遺伝子は、細菌および／または真核細胞における組換え技術 によるプロテアーゼの発現、および、生化学的および物理的特徴決定のためのプ ロテアーゼの商業的に望まれる量の産生に望ましいものである。この特徴決定は 、この酵素の強力な阻害物質の設計および産生に必要である。本発明は、他のレ トロウィルス、例えばＨＩＶ−２、ヒト白血病ウィルス、例えばＨＴＬＶＩ、Ｉ Ｉおよび白血病性肉腫および他の悪性腫瘍を引き起こす他のヒトおよび動物のＲ ＮＡ含有ウィルス、のプロテアーゼ遺伝子の合成および発現を包含する。

本発明の好ましい態様のヌクレオチド配列は、ラトナーら（Ｒａｔｎｅｒ　％前 掲）の文献から得られた。ＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードするｐｏｌオーブ ンリーディングフレームの配列は、ヌクレオチド１６０９〜１９０６に対応する 。

Ｎ−末端およびＣ−末端アミノ酸は、それぞれプロリンおよびフェニルアラニン である。９９アミノ酸プロテアーゼをコードするこの配列は、前記のような２９ ７ｂｐの長さのものである。本発明においては前記および他の遺伝子において１ 以上の塩基を僅かに置換するだけで、所望なプロテアーゼを発現することができ る変異体遺伝子を産生産生することができる。

この配列は、ＤＮＡ合成装置を用いて５個のフラグメントとして合成した。これ らの５個のフラグメントに対応する相補鎖も合成した。４個の塩基の３′オーバ ーハングは、この５個のフラグメントのそれぞれを効率的に連結し且つプロテア ーゼ遺伝子の正確なコード配列が得られるように、適当な配列に付された。遺伝 子の５′末端に対応するフラグメントにヌクレオチドＡＴＧを加え、３′末端に はＴＡＡを加えた。

原核発現ベクターを用いて、クローニングを行い、プロテアーゼをコードする合 成配列を発現させた。この発現は、原核生物（細菌）または他の適当な発現系で 行うことができる。組換えクローンを、プロテアーゼ遺伝子の内部領域に及ぶ標 識フラグメント（６２ｂｐ）を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行うこ とによってスクリーニングした。陽性のコロニーを挿入物の大きさについて更に 分析した。陽性であったクローンを発現させ、ウェスターンプロットで分析して 、特異的抗体を用いてタン白質生成物を決定した。第１図に一例を示す。

これまでスクリーニングしたクローンの内３個のクローンは、第１図に例示する ように特異的抗体に対して反応する１　１　、５ｋｄの生成物を発現するものと 同定された。

プロテアーゼ遺伝子の誘導の条件をＥ、　ｃｏｉｌで検討して、最適条件を得た 。本発明者らは、この遺伝子生成物が合成および天然の基質のいずれをも開裂さ せることができることから、この遺伝子生成物は特異的プロテアーゼ活性を有す ることを明らかにした。この酵素を、親和性クロマトグラフィのような特殊なカ ラムクロマトグラフィ法によって精製した。本発明の方法によれば、プロテアー ゼの構造、その活性の機構、および、ウィルスによって引き起こされるＡＩＤＳ のような病気の治療のための治療用のこの酵素に対する特異的阻害物質を得るこ とを検討するのに十分な活性プロテアーゼを産生させることができる。本発明の 他の悪様では、ＨＩＶ−２プロテアーゼに対する下記の遺伝子のような他のプロ テアーゼを発現させる遺伝子を用いることができる。

ＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＣＴＣＴ！ＴＧＧ入入入入Ｇ入ＣＣＡＧＴ入ＧＴＣＡＣＡ ＧＣＡ’Ｉ’ＡＣ入’ＩＴＧλＧＧＧＴＣ入ＧＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＴＧ ＴＴＡＧ入ＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＣにＡＣＴＣＡＡＴＡＧＴＡＧＣＡＧＧ入 ＡＴＡＧ入ＧＴＴＡｃＧＧＡＡＣＡＡ’ＩＴＡＴＡＧＣＣＣＡＡＡＡＡＴ入ＧＴ ＡＧＧＧＧＧλＡＴＡＧＧＧＧＧ入ＴＴＣ入Ｔ入入ＡＴＡＣ（：入ＡＧＧＡＡＴ ＡＴλυＷＴＧＴＡＧ入ＡＡＴＡＧ入入ＧＴＴＣＴＡλＡＴλＡＡＡＡＧＧＴＡ ＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＡＣＡ Ｔ’ＩＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＧ ＴＣＡＴＴ入入入τＣＴＡＣ 第１図は、Ｅ、　ｃｏｌｉでのＨＩＶプロテアーゼの発現を示す。適当な発現ベ クター中でＨＩＶプロテアーゼの合成配列で形質転換した細胞を誘導し、細菌性 溶解物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。タン白質をニトロセルロース膜 に移動させた後、ＨＩＶプロテアーゼに対する特異的抗体を用いて免疫プロッテ ィング法を行った。

Ａｇ−Ａｂ錯体の検出は、１１２５タン白質Ａを用いて行った。オートラジオグ ラフのレーンＡは、プラスミドで形質転換したＥ、　ｃｏｌｉを表わし、レーン ＢおよびＣは、ＨＩＶプロテアーゼをコードするプラスミドを有する合成りＮＡ で形質転換したＥ、　ｃｏｌｔをを表わす。左側には、キロダルトンで示したタ ン白質分子量マーカーがある。

１１．５ｋｄのバンドがプロテアーゼである。

本発明の合成りＮＡは、（感染性の）ウィルス性物質を操作する必要が全くなく 、他の方法により、得ることができる量の制限をなくすことができる。

実施例 下記の物質および方法を用いて実施例を行った。

プラスミド、細菌性鎖および化学薬品：原核性発現ベクターであるプラスミドＰ ＫＫ２３３−２は、ファルマシア社（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ）から購入した。

Ｐ■２３３−２を用いて、１ａｑ−ｑ宿主、Ｅ、　ｃｏｉｊＪＭ１０５またはＲ Ｂ７９１中で形質転換を行った。細胞は、ｌｕｇ／ｌチアミンを含むＭ９最少培 地中で選択した後、これらを形質転換に用いた。オリゴヌクレオチドの合成に用 いた総ての化学薬品は、アプライド・バイオシステム・インコーポレーテド（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｆｏｓｙｓｔｅａ　１ｎｃ、）社から入手した。Ｔ４ポリヌク レオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼおよびＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのフレノウフラグメントｌは、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した。制限エンドヌクレアーゼ、 ＰＭＳＦおよびｌ　ＰＴＧはベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　ＭａｎｎｈｅＩ■）　、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびプロメガ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）社からそれぞれ入手した。

ＤＮＡ合成、プラスミド構成およびスクリーニング：ＤＮＡフラグメントは、エ イビーアイ（ＡＢＩ＞　ＤＮＡ合成装置（３８１人型）を用いて合成した。総て の合成フラグメントは、１２％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素配列ゲル中で電気 泳動によって精製した。ＤＮＡは紫外部シャドウィングによって視認し、全長の フラグメントを当該技術分野で知られているゲルから溶出した。全長フラグメン トの純度を、標準的手法を用いてチェックした。

適当な相補フラグメントを等モル濃度混合して、アニールし、別の箇所で記載す るようにキナーゼ処理し、連結した。連結の効率は、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって監視した。線形化したプラスミドと適当な濃度のプロテアーゼ遺 伝子を導結して、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５の形質転換に用いた。組換えクロ ーンを、キナーゼ処理によって標コしたａ２ｂｐフラグメントを用いるコロニー ／＼イブリダイゼー／！Ｉンによってスクリーニングした。沸騰法を用いてｖＡ 換えクローンからプラスミドＤＮＡを小規模で単離し、挿入物の大きさは、Ｅ、 　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて３′　リセス ト（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）末端を標識した後にオートラジオグラフィによって視認 した。

ＨＩＶプロテアーゼに対する抗体。

ポリクローン抗体は、ウサギで（１）ＨＩＶ−１プロテアーゼの１〜９９アミノ 酸の完全合成配列および（１ｊ）好ましくはプロテアーゼのＣ末端に対応するト リデカペプチドに対して生成した。

増殖期まで成長させ、誘導させ、超音波処理によって溶解させた。全細胞抽出物 をＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥによって分析し、免疫プロット分析に付した。

発現プロテアーゼ活性の分析法： オリゴペプチドは、以前に報告された方法（コープランド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ） とオロツラン（Ｏｒｏｓｚｌａｎ）、１９８１年）に準じてペプチドシンセサン ザ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３０＾型）で合成した。開裂 生成物は、ｕＢｏｎｄａｐａｃｋ　Ｃ１ｇカラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉ ａｔｅｓ）上でのＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。ピーク画分のアミノ酸組成 を、ピコ−タグ（Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ）アミノ酸分析装置（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ ｏｃｉａｔｅｓ）を用いて分析した。

実施例１ この実施例は、好ましい態様を表わす。

プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）らの方法 によって決定した。プロテアーゼ遺伝子のｐａｌオープンリーディングフレーム の配列は、ヌクレオチド１６０９から始まり、１９０６で終わり、９９アミノ酸 をコードする。この配列およびその補体は、第２図に示されるような約６０塩基 の５個の別個なフラグメントとして合成した。（下部の場合に示される）４塩基 の３′オーバーハングは、正確なコード配列を形成するために、適当なフラグメ ントを選択的に連結するようフラグメントに付した。翻訳開始コドンＡＴＧおよ び終止コドンＴＡＡを、プロテアーゼ遺伝子の適当な末端に付した。

配列を加えて、制限酵素部位Ｎｅｏ　Ｉに適合する付着端を有するよう遺伝子の ５′末端に突出部を付した。遺伝子の３′末端における５′突出部を加えて、Ｈ ｉｎｄ３適合性末端を付した。相補鎖（図示せず）は、コード鎖に合う３′オー バハングを備えていた。

発現ベクターＰＫＫ２３３−２に正確なコード配列を有する３個のクローン（Ｐ Ｒ−Ｃ，ＰＲ−Ｈ，およびＰＲ−Ｊ）の発現を分析して、遺伝子の最適誘導の条 件を選択した。

第３図は、遺伝子生成物のウェスターンプロット分析の例を示す。

プロテアーゼに対するコード配列を有するクローンＰＲ−Ｃを誘導して発現させ た。タン白質（細菌抽出物７５■）をＮａＤｏｄＳｏ４／ＰＡＧＥ中で電気泳動 を行い、ニトロセルロースに移し、（ｉ）ＨＩＶ−１プロテアーゼの１〜９９ア ミノ酸の完全合成配列および（ｉｆ）このプロテアーゼのＣ末端に対応するトリ デカペプチドに対する２種類のプロテアーゼ特異性ウサギポリクローン抗体の混 合物を用いて免疫プロット分析に付した。第３Ａ図は、様々な時間における０、 ４ｒａＭ　Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇによる遺伝子の誘導を示す。第３Ｂ図は３０分間の誘 導を示す。誘導物質ＩＰＴＧの濃度の増加に伴い、１〜５はそれぞれＩＰＴＧの ＩＩＩＭで表した濃度、０．２８．０．５６．１，１２．２．２４および４．４ ８を表わす。第３Ｃ図は、１ｍＭＩＰＴＧで６０分間誘導し、各種の緩衝液中で 細胞を溶解した後の分析を示す。Ｂ１は、５０ＩＤＭトリスーＨＣ１、ｐＨ７， ０，１５０ｄＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌｄ　ＰＭＳＴ、１ｍＭ　ＤＴＴお よび０．５％ＮＰ−４０中での細胞の溶解を示す。Ｂ２は、ＮａＣ１およびＥＤ ＴＡがないことを除き、Ｂ１と同じである。Ｂ３は、５ｈＭリン酸カリウム、ｐ Ｈ６，０、ｈａＭＰＭＳＦおよび１ｍＭＤＴＴ中でのものである。Ｂ４はｐ）１ が６．５であること以外はＢ３と同じである。タン白質分子量マーカーの位置を 、キロダルトンで左側に示す。

プラスミドＰＲ−Ｃを有するＥ、　ｃｏｌｔをルリアプロス中で０．４　Ａ６０ ０ｎＩｇの光学濃度になるまで生育させた後、様々な時間誘導を行い、第３Ａ図 に示したように０．４＋ａＭの濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガ ラクトピラノシド）を加えることによってｔｒｅプロモーターから発現させた。

クローニングされた遺伝子は、１１．５ｋｄの単一の未融合タン白質バンドを発 現した。発現は、３０分間の誘導の後に最大となった。この水準は６０分後には 約２５％まで減少した。１２０分間の誘導の後および０分では発現は検出されな かった。この形態の誘導は、分析を行った他のクローン（ＰＲ−ＨおよびＰＲ− Ｊ）（図示せず）の場合と同じであった。

様々な誘導物質濃度における３０分間の誘導の結果は、第３図Ｂに示される通り である。Ｉ　ＰＴＧによる１ｍＭから４ｍＭの範囲の誘導が最大の発現を示した 。同様のデータはクローンＰＲ−ＨおよびＰＲ−Ｊにおいても得られた（図示せ ず）。

プロモーターを効率的に可溶化して酵素分析を行う条件を選択するために、１ｍ ＭＩＰＴＧで最適誘導を行った後、様々な緩衝液系を用いて細胞（クローンＰＲ −Ｃ）を溶解した。５０ｒＢＭトリスーＨＣＬ　ｐＨ７，５，１ａＭＤＴＴ。

１ｍＭＰＭＳＦ及び０．５％ノニデソト（ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０の緩衝 液系で超音波処理を行ったところ、可溶性画分中にプロテアーゼ５０〜７０％を 放出することが観察された（第３Ｃ図）。これは、発現生成物の含量を、可溶性 抽出物および不溶性沈澱物のウェスターンプロット分析分によって算出した。

特異的タン白質分解活性の証明 第４図は、合成ペプチドを基質として用いる発現したプロテアーゼの活性を示す ものである。プロテアーゼ分析は、クローンＰＲ−Ｃ，誘導体（Ａ％Ｂ、Ｃ）お よび未誘導体（Ｄ）並びにプラスミドＰＫＫ２３３−２のみを有するコントロー ル細胞（図示せず）から得られた細菌溶解物２２．５ＩＩｇで３７℃で行った。

ノナペプチドを、反応緩衝液（０，２５Ｍリン酸カリウム）　、ｐ）Ｉ　７．０ ．０．５％（ｖ／ｖ）　ＮＰ４０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ａＭジチオ トレイトおよびＺＭＮ　ａ　Ｃｌ中で基質として用いた。それぞれ２５ｊ１ずつ を、０時間（Ａ）　、１時間（Ｂ）　、３時間ＣＣ）および６時間後に採取して 、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。Ｓは基質を表わし、ＰｌおよびＰ２はそれ ぞれ開裂生成物１および２を表わす。

クローニングしたＨＩＶ−１プロテアーゼの活性を評・価するため、ＨＩＶ−１ のｐ１７〜ｐ２４開裂部位（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９８８ 年）に対応する合成ノナペプチドを基質（４Ｅ）として用いた。反応緩衝液中の 基質を各種の細胞抽出液（前記の第４図の説明を参照）の画分と混合して、３７ ℃でインキュベーションした。インキュベーション混合物を等量ずつ様々な時間 で採取してＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。０時試料中の基質は、第４Ａ図に示され るように単一のピークとして溶出した。

１時間インキュベーションした後、基質ピークが有意に減少するのと相関して、 標忠した生成物である２個の新たに現れるピークＰ１およびＰ２がみられる。次 いで、回収したピークのアミノ酸分析を行うことによって、生成物１および生成 物２は、表−１に示されるように決定された天然の開裂部位であるＴｙｒ−Ｐｒ ｏ結合の開裂を示す予想された開裂生成物に対応することが示された。３時間ま でインキュベーションを延長すると、基質ピークは更に減少し、生成物１のピー ク高さが実質的に増加し、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ結合の加水分解が進行することを示し ていた。

しかしながら、テトラペプチドＰｒｏ−１１８−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎ）１２の吸 光度は遊離のＣ００Ｈ−末端チロジンを有するペンタペプチドの吸光度より実質 的に小さいので、生成物１のピークは予想されたように小さいものと思われた。

３時間インキュベーションした後の生成物１および２は増加し、基質ピークが対 応して減少することが見られた。

未誘導細胞、クローンＰＲ−Ｃ（第４Ｄ図）およびコントロール細胞（コントロ ールプラスミドＰＫＫ２３３−２、データーは示さず）からの抽出物を用いる反 応では、開裂生成物は検出されなかった。６時間インキュベーションを行ったと ころ基質ピークは減少しなかったが、これは、ノナペプチドが細菌プロテアーゼ による分解に耐性を有することを示している。このことは、粗製の抽出物中のウ ィルス性プロテアーゼ活性を分析し、プロテアーゼの精製と単離を容易にする上 でこの基質を特に有用なものとする。

基質およびその開裂生成物のアミノ酸組成データーを、表−１に示す。観察され たアミノ酸の量は明らかに予想された量に対応することから、開裂はｇａｇ前駆 体のｐ１７〜ｐ２４部位に対応する合成ペプチドの予想される開裂部位で起こっ ていることを示している。

特表千４−５００６０２　（６） Ｍ、Ｗ、　Ａ　Ｂ　Ｃ ｄ ゛□−轡鴫一−−一一一・ ｆｒａｇｍｅｎｔ　１ ５’　ＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＣＧＴＣ ＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＡｃｔａａｆｒａｇｍｅｎｔ　２ ＡＧ　ＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＧ　ＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣ ＡＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡ（、ＴＴＴＧＣＣＡＧfＡａ　ｇ　ａｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ　３ ＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧ　Ｇ　ＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴ ＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡｇ　ａ@ｔ　ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ　４ ＣＴＣＡＴＡＧＡＡＡＴ　ＣＴＧＴＧＧＡＣＡＴＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＧＴＡＣ ＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴ　ｃａ≠■ ｆｒａｇｍｅｎｔ　５ ＡＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴ　ＣＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡＧＡＴＴ　ＧＧＴＴ Ｇ　ＣＡＣＴＴＴＡＡＡｒ口１３′ＦＩＧ、　４Ｅ ９　尤／￥　（２０６ｎｍン 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２９９６ ２、発明の名称 合成ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子およびその発現法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国バージニア用、スプリングフィールド、ポート、ロイヤ ル、ロード、５２８５ 名　称　アメリカ合衆国 ４、代　理　人 （郵便番号１００） 請求の範囲 ８、　下記の合成ヌクレオチド配列または機能的にこの配列と類似の配列を有す る組換えベクターによって産生される、組換えプロテアーゼタン白質。

ＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡ　ＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡ　ＡＣＧＡＣＣＣＣＴＣＧＴＣＡ ＣＡＡＴＡＡ　ＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧ６゜ ＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧ ＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴ　ＴＡＧＡＴＡＣＡＧＧ　ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴ　ＡＣＡ ＧＴＡＴＴＡＧ　ＡＡＧ入ＡＡＴＧＡＧ’Ｉ’ｒＴＧＣＣＡＧＧＡ １コ０　１４０　１５０　１６０　１７０ＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡ入Ａ入入Ｔ Ｇ入Ｔ　ＡＧＧＧＧＧ入入ＴＴ　ＧＧＡＧＧＴＴｒＴＡ　ＴＣＡＡ入ＧＴ入ＡＧ ＡＣＡＧＴ入ＴＳＡＴ １９０　２ｑＯ２１０２２０２３０ ＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡ　ＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧ　ＴＧＧＡＣＡＴ入入Ａ　ＧＣＴ ＡＴＡＧＧＴ入　Ｃ入ＧＴ入↑ＴＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＣＡ ＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡ　ＴＡＡＴＴＧＧＡＡ、Ｇ　入λ入ＴＣＴＧＴＴＧ　ＡＣ ＴＣＡＧＡ’Ｉ’ｒＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴ入入ＡＴＴＴＴ ９、（１）下記配列： ＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡ　ＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡ　ＡＣＧＡＣＣＣＣＴＣＧＴＣＡ ＣＡＡＴＭ　ＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣ入ＡＣＴＡＡＡＧ ７０　８０　９０　１００　１ユ０ ＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴ　ＴＡＧＡＴＡＣＡＧＧ　ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴ　ＡＣＡ ＧＴＡＴ“ηＡＧ　人ＡＧＡ入ＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡ ＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＭＡＡＡＴＧＡＴ　ＡＧＧＧＧＧＡＡ？ｒ　ＧＧＡＧＧ Ｔ’ｒ’Ｍ’Ａ　ＴＣＡＡＡＧＴ入ＡＧＡＣ入ＧＴＡＴＧＡＴ ＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡ　ＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧ　ＴＧＧＡＣＡＴ入Ｍ　ＧＣＴＡ Ｔ入ＧＧＴＡ　ＣＡＧＴＡＴ’Ｉ’ＡＧＴ人ＧＧ入ＣＣＴＡＣＡ またはこの配列と構造類似の配列を合成し、（２）段階（１）で製造した組換え ベクターを宿主細胞に挿入し、 （３）タン白質を発現させ、 （４）このタン白質を精製する段階を含んで成る、請求の範囲第８項に記載のプ ロテアーゼの産生法。

１０、タン白質を親和性クロマトグラフィによって精製する、請求の範囲第９項 に記載の方法。

１ユ、　下記の配列またはこの配列に構造類似の合成配列の合成遺伝子を含んで なる、ベクター。

ＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡ　ＣＴＣＴ’！’ＴＧＧＣ入　入ＣＧＡＣＣＣＣＴＣＧＴ ＣＡＣλＡＴＡＡ　ＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＴ入ＡＡＧ Ｇλ入ＧＣＴＣＴＪ％ＴＴ入Ｇ入Ｔ八ＣＡＧＧ　入ＣＣＡＧ入ＴＧ入Ｔ　λＣλ ＧＴ入ＴＴ入Ｇ　入λＧへ入ＡＴＧ入ＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧ入 ＡＧＡＴＧにＡＡＡＣＣ入入入λ入ＴＧＡＴ　へＧＧＧＧＧ入ＡＴＴ　ＧＧ入Ｇ ＧＴＴＴＴＡ　ＴＣ入λ入ＧＴ入ＡＧ人ＣＡＧＴＸＴＧＡＴ ＣＡＧＡＴＡＣＴＣＡ　ＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧ　ＴＧＧＡＣＡＴＡＡＡ　ＧＣＴ ＡＴＡＧＧＴＡ　ＣＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣＣＴＡＣＡ ＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡ　ＴＡＡＴＴＧＧＡＡＧ　ＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧ　ＡＣＴ ＣＡＧＡＴＴＧ　ＧＴＴにＣＡＣＴＴｒＡ入ＡＴＴＴｒ １２、請求のｉ門弟９項に記載の方法によって産生されるタン白質。

国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト免疫不全症ウィルスの感染力に必須なプロテアーゼの合成ヌクレオチド 配列から本質的に成る、ヒト免疫不全症ウィルスのプロテアーゼをコードする遺 伝子。
2. ２．前記プロテアーゼがレトロウィルスの感染力に必須なものである、請求の範 囲第１項に記載の遺伝子。
3. ３．レトロウィルスがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＨＴＬＶヒト白血病ウィル スから成る群から選ばれるものである、請求の範囲第２項に記載の遺伝子。
4. ４．コード配列が下記の通りである合成二本鎖ヌクレオチド配列から本質的に成 る、ヒト免疫不全症ウィルスのプロテアーゼをコードする遺伝子。 【配列があります】
5. ５．レトロウィルスの感染力にとって必須なプロテアーゼの合成遺伝子を含む組 換えベクターを宿主細胞に挿入し、この遺伝子を発現させ、前記プロテアーゼを 分離することから本質的に成る、プロテアーゼを発現させる方法。
6. ６．レトロウィルスがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＨＴＬＶヒト白血病ウィル スから成る群から選ばれるものである、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．前記レトロウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子が下記のヌクレオチド 配列を有する、請求の範囲第５項に記載の方法。 【配列があります】