JPH04500612A - ヒト精巣アンジオテンシン転換酵素（ａｃｅ）をコードする核酸、ならびに、特に有機体の中のこの酵素の試験管内追跡のための、その用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト精巣アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）をコードする核酸、ならびに、特 に有機体の中のこの　、の−゛　のための、その　゛余水発明は、ヒト精巣の生 殖細胞内のアンジオテシン転換酵素（ＡＣＥ）をコードする核酸、ならびに、こ の核酸を含むベクター及びこの酵素の製造のためのこの核酸の利用に関する。本 発明は同様に、有機体内のこの酵素の区腋豆式（ＩＮ　ＶＩＴＲＯ）追跡のため のこの核酸の利用にも関する。

ＡＣＥすなわちペプチジル・ジペプチダーゼＡ（ＥＣ３，４，１５，１）すなわ ちキニナーゼ■は、動脈圧の調節において、アンジオテンシンＩ　（レニンによ るアンジオテンシノーゲンの開裂の後に遊離された不活性ペプチド）を、動脈圧 の調節において主な役割を果たす昇圧性アンジオテンシンＨに加水分解すること によって重要な役割を果たす。［５ＫＥＧＧＳ、　Ｌ、Ｔ、その他（１９５６年 ）Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１０３，２９５−２９９］　。

ＥＤＴＡ及び金属キレート剤によるＡＣＥ活性の抑制は、メタロペプチダーゼ、 と（にアンジオテン、シンエのみならずブラジキニン（不活性へブタペプチドに 転換される血管拡張性及びナトリウム排泄増加性のペプチド）及び生物学的活性 をもつ他の数多くのベブチドをも加水分解することのできる亜鉛ペプチダーゼが 問題となっていることをことを示している　［ＹＡＮＧ、　Ｈ。

Ｙ、　Ｔ、他　（１９７０年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、 　２１４，３７４−３７６、　ＥＲＤＯＳ、　Ｅ、Ｇ、他　（］、　９８７年） 　Ｌａｄ、Ｉｎｖｅｓｔ、５６．　３４５−３４８］。

ＡＣＥは、有機体の中に広く分布しているペプチダーゼであり、これらは例えば 血管内皮細胞及び背止皮細胞の表面に膜性酵素の形で、ならびに血漿内を循環す る酵素の形で見い出される　［ＥＲＤＯＳ他（１９１１７年）止揚、　ＣＡＲＤ ＷＥＬＬ、　Ｐ、Ｒ，Ｂ他；（１９７６年）　５ｃｉｅｎｃｅ、１９１゜１０５ ０−１０５１．　ＲＹＡＮ　Ｌｌ、Ｓ、他　（１９７６年）　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃ ｅ１ｌ、　８゜１２５−１４５］。

ヒト又は動物の内皮ＡＣＨの精製方法についてはすでに記述されてきており［特 に、ＢＵＬＬ　Ｈ，Ｇ　他著（１９８５年）　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６ ０．２９６３−２９７２　；　ＨＯＯＰＥＲ。

Ｎ、　Ｍ、他著、　（１９８７年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２４７．８５ −９３）　、また、動物から得た内皮ＡＣＨのいくつかのペプチド配列も公表さ れた　（ＢＥＲＮＳＴＥＩＮに、Ｅ他著（１９８８年）　、　ＫｉｄｎｅｙＩｎ ｔ、、　３３，６５２−６５５　；　）ＩＡＲＲＩＳ、Ｒ，Ｂ他著　ｆ１９８５ 年）Ｊ、Ｂｉｏｌ、、　Ｃｈｅｍ、、２６０．２２０８−２２１１　；　ＩＷＡ ＴＡ、　Ｋ他著（１９８２年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ 、　Ｃｏｍ＋ｎｕｎ、１０７゜１０９７−１１０３　、　ＩＷＡＴＡ、　Ｋ他　 （１９８３年）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　２２７，１８８−２０１　；　ＳＴ　ＣＬＡＩＲ，Ｄ、に 他著（１９８６年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ ｍｕｎ、１４１，９６８−９７２　；５ＯＦＦＥＲ，ＲＬ、他著（１９８７年） 　Ｃ１１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｈｙｐ、　Ａ９゜２２９−２３４］。

動物のＡＣＥをコードするＤＮＡのいくつかのクローニング試験が、ＡＣＥを豊 富に含む２つの器官すなわち腎臓と肺から実施されたが、動物のＡＣＥをコード 化する完全な核酸については全（記述がない。

唯一このような核酸のいくつかのフラグメントについてのみ記述されているにす ぎない（ＤＥＬｔｌＣＡ−ＦＬＡＩ（ＥＲＴＹ、　ｃ、他　（１９８７年１１Ｎ Ｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、、２９．６７８−６８４ 　；　ＢＥＲＮＳＴＥＩＮ　Ｋ、Ｅ、他、　（１９８８年）Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、、２６３．１１０２１−１１０２４）、　Ａ’ＣＥをコードする伝令Ｒ ＮＡ　（ｍＲＮＡ）の量は恐ら（これらの器官においてあまりにも少なすぎて、 このｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）のクローニングを容易に可能にでき ないものと思われる。

ヒトの内皮細胞のＡＣＨに対してコード化するＤＮＡのクローニングは初めて、 本出願の発明者によって実現された。内皮ＡＣＨについてコード化するＤＮＡの 完全なヌクレオチド配列ならびにこのＡＣＨのアミノ酸配列は、Ｒｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（米国国立科学アカデミ−会報）、８ ５、ｐｐ９３８６−９３９０　（１９８８年）に掲載された５ＯＵＢＲＩＥＲＦ 、他著の論文中に記されている。

ＡＣＥ酵素活性と同じタイプの酵素活性は同様にヒト及び動物の精巣中において も実証された　［Ｊ、Ｊ、　ＬＡＮＺＩＬＬＯ他著Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２ ６０．　ｐｐ１４９３１１１−１４９４４　（１９８５年）１゜ しかしながら、ヒトの精巣のＡＣＥ　（または精巣ＡＣＥとも呼ばれる）の構造 は、現在のところわかついない。また、これまでにこの精巣ＡＣＨについてコー ド化するＤＮＡの配列について記述されたことは全く無い、　１９８８年Ｓ、Ｎ 、　ＲＯＹ他は、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ　１５５　：　６７８−６８４の論文 の中でクローンを分離したと言明しているが、クローンの配列は示されていない 。

本発明はまさに、ヒト精巣ＡＣＨに対してコード化する核酸のクローニングと配 列決定をその目的としている。この作業は、内皮ＡＣＨに相応するヌクレオチド プローブとヒト精巣からのｍＲＮＡの相補的ＤＮＡの２つのバンクを用いて行な われた。本発明に従った核酸のクローニング及び配列付けのために用いられる技 術は、本発明の詳細な説明の中でより具体的に記述される。

以下においては、次のような図面を参照するニー図１は、核酸ならびにそれから 導かれヒト精巣ＡＣＨに相応するポリペプチドを示す。

−図２は、ヒト精巣ＡＣＨについてコード化する核酸の確認のために用いるられ る４つのクローンの核酸のそれぞれの位置を表している。

本発明の核酸ならびにこの核酸から導かれヒト精巣ＡＣＨに相応するポリペプチ ドについて詳しく研究すると、以下のような観察事実が得られるニー　精巣ＡＣ ＨのＤＮＡの複合配列は、２４７７のヌクレオチドのものであり、図１の位置１ 及び２４７７に相応するヌクレオチドによって限定される。図１の位置２９及び ２２２４にあるヌクレオチドにより限定されているヌクレオチド配列は、７３２ 個のアミノ酸のポリペプチドに対してコード化するオーブンリーディング段階を 含んでいる。このヌクレオチド配列は、２１個のアミノ酸のシグナルペプチドに ついてコード化する可能性のある図１の位置２９及び９１に相当するヌクレオチ ドにより限定されたＤＮＡ配列、ならびに７１１個のアミノ酸の成熟タンパク質 についてコード化する可能性のある図１の位置９２及び２２２４にあるヌクレオ チドにより限定されたＤＮＡ配列で構成されている； 一図１の位置２２８及び２２２４にあるヌクレオチドにより限定さたているヌク レオチド配列は、ヒト内皮ＡＣＨの最後の６６５個のアミノ酸に対しコード化す る位置１９４４から３９４０までにあるヌクレオチドにより限定され、かつ、前 述の５Ｏ１ＪＲＢＩＥＲ他著の論文の図２に示されているものと同じである；− ブレ精巣酵素（又は精巣酵素前駆体）の最初の６７個のアミノ酸に対しコード化 する位置２９及び２２９にあるヌクレオチドにより限定されたヌクレオチド配列 、さらに限定的にいうと、成熟精巣酵素の最初の４６のアミノ酸に対してコード 化する位置９２及び２２９にあるヌクレオチドによって限定されている配列は、 特に精巣ＡＣＨに特異的なものである；−図１の位置４１４から４１８までにあ るアミノ酸に相応する配列）１ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓを含むポ リペプチドは、精巣ＡＣＨの活性部位の一部分を構成することができる。

従って、本発明は、図１の位置２９及び２２９にあるヌクレオチドにより限定さ れているヌクレオチド配列の全て又は一部分をそれ自体含んでいるような図１の ヌクレオチド配列の一部分或はこの配列の全て、を含んでいること、ならびに、 −図１の位置１から６７にあるアミノ酸により限定されているペプチド配列から くるあらゆるペプチドを特異的に認識する多クローン性又は単クローン性の抗体 により認識される可能性があり、−　しかも場合によってはアンジオテンシンＩ 及び／又はキニン特にブラジキニンを加水分解することができる、 ポリペプチドに対しコード化することを特徴とする核酸、 或は、前記特性を失わせるための条件の下で前記ポリペプチドのアミノ酸配列の 変更をひき起こさないヌクレオチドの置換によってのみそのヌクレオチド配列レ ベルで前述のものと識別されるような全ての核酸。

に関する。

本発明は、さらに具体的に言って、図１の位置２９及び２２２４にあるヌクレオ チドにより限定されるＤＮＡ配列を含み、７３２個のアミノ酸（すなわちＮ末端 側の最初の２１個のアミノ酸はシグナルペプチドを表わし、残りの７１１個のア ミノ酸は未変性のヒト精巣ＡＣＥを表わす）のヒト精巣プレＡＣＥ　（又はプロ 酵素）に対しコード化するあらゆる核酸に関する。

本発明は同様に、図１の位置９２及び２２２４にあるヌクレオチドにより限定さ れているＤＮＡ配列を含み、成熟ヒト精巣ＡＣＨに対しコード化するあらゆる核 酸に関する。

本発明に従った核酸として、特に、図１の位置１から９２までの間にあるヌクレ オチドと図１の位置２２９から２２２４までの間にあるヌクレオチドとの間に拡 がるＤＮＡ配列を含む核酸を挙げることができる。

本発明は、さらに具体的に言うと、精巣ＡＣＨに特異的なものである図１のヌク レオチド配列の一部分を含むあらゆる核酸、すなわち図１の位置２９にあるヌク レオチドと図１の位置２２７にあるヌクレオチドの間に拡がるヌクレオチド配列 を含むすべての核酸、或いはまたこのヌクレオチド配列からの１つの配列を含む あらゆる核酸をその目的としている。

従って、本発明は同様に、 −図１の位置２９にあるヌクレオチドと位置２２７にあるヌクレオチドの間に拡 がる核酸からの約１５好ましくは４５個から２０１個のヌクレオチドのＤＮＡ配 列を含むあらゆる核酸、 −図１の位置９２のヌクレオチドと図１の位置２２７の間に拡がる核酸からの約 １５個好ましくは４５個から１３５個のヌクレオチドのＤＮＡ配列を含むあらゆ る核酸、 にも関するものである。

本発明は同様に、上述の核酸から誘導された核酸であってしかもこれらの核酸に よってコード化されたポリペプチドが同じ一次構造又は自らの免疫学的特徴或は 場合によっては酵素特性を保持するかぎり、遺伝子コードの変更により許容され ている限界内で変更されるようなヌクレオチド配列を有するような核酸にも関す る。

このような非制限的変更は例えば、単数又は複数の付加及び／又は除去及び／又 は単数又は複数のヌクレオチドの変更により上述の核酸と識別されるような派生 的核酸を導き出す。

本発明は、特に以下の条件の下で、図１に示された核酸と特異的にハイブリッド 形成するという特徴をもつあらゆる核酸をそのさらに具体的な目的としている− 　以下に定める支持体上への固定に先立って、アルカリ溶液（０，５ＭのＮａ０ Ｈ）を用いた処理により図１のものとハイブリッド形成することができる核酸（ それが２本鎖ＤＮＡの形をしている場合）の変性、ならびにそれに続く中性ｐＨ への移行；−２５ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７，４：　５ＸＳＳＣ；５　Ｘ　Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ″ｓ；　５０ｕｇ／−の超音波処理されたサケ精子のＤＮＡ：０．１ ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ又はＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４−）と いう組成をもつ溶液で３時間５０℃での、図１のものとハイブリッド形成するこ とができる核酸が上に固定されている支持体にトロセルロースフィルタ又はナイ ロン膜）のプレハイブリッド形成処理； −上述のプレハイブリッド形成処理の組成と同じ組成を有しく場合によっては１ ０％のデキストランを加える）、特に放射線により標識づけされ３分間９０℃で の処理により予め変性されたプローブとして図１の核酸を含む緩ｆ液による、支 持体と接触したプレハイブリッド形成処理溶液の置換；６０℃、１２時間の保温 ； −・２ＸＳＳＣの溶液で６０℃、３０分間２回、−・ｌＸ５ｓｃ、０．１％ＳＤ Ｓの溶液で６５℃、１５分間１〜２回 の連続洗浄。

Ｄｅｎｈａｒｄｔのポリビニルピロトン、１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） であること、そしてｌＸ５ｓｃが０．１５ＭのＮａＣ１と０．０１５Ｍのクエン 酸ナトリウムのｐＨ７の溶液であるということに留意されたい。

本発明は同様に、非ストリンジェント条件下では温度が４０℃であり、連続する 洗浄が４５℃１５分間で２回にわたりＳＤＳを含んで又はＳＤＳを含まずに行わ れるという点を除いて、上述のストリンジェント条件の基本的特徴を保持する非 ストリンジェント条件の下で図１の核酸と特異的にハイブリッド形成することが できることを特徴とする核酸にも関する。

本発明は同様に、特に上述のハイブリッド形成条件の下で、上述の図１の核酸か らの核酸又はその相補的配列とハイブリッド形成することができるあらゆる核酸 をもその目的とする。

本発明は同様に、特に上述のハイブリッド形成条件の下で、図１の核酸の全てと 、又はこの核酸の上述のような全てのフラグメントと、ならびに精巣ＡＣＨに対 しコード化する伝令ＲＮＡと及び精巣ＡＣＨの表現を担うヒト遺伝子とハイブリ ッド形成することができるヌクレオチドプローブ、又はその相補的配列をも目的 としている。

当然のことながら、前述のストリンジェント又は非ストリンジェントハイブリッ ド形成条件はハイブリッド形成にとって好まれる条件ではあるものの、全（限定 的な意味をもたず、上述のプローブ及び核酸の認識及びハイブリッド形成特性に 影響を与＾ることな、（変更できるものである。

ハイブリッド形成及び膜の洗浄中の塩分及び温度条件は、ハイブリッド形成の検 出に影響を及ぼすことな（、より高い又はより低いストリンジェントの方向へと 変更することが可能である。例えば、ハイブリッド形成中の温度を低下させるた め可変的割合のホルムアミドを付加することが可能である。

本発明は同様に、ヒト精巣ＡＣＨに相応する図１のポリペプチド、ならびに、図 １の位置１から６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列、特に図１の 位置２２から６７にあるアミノ酸により限定されているペプチド配列からの全て のペプチドを特異的に認識する多クローン性又は単クローン性の抗体により認識 されることができ、かつ場合によっては精巣ＡＣＥと同じタイプの酵素活性をも つ可能性のある、図１の核酸からの上述のＤＮＡフラグメントによってコード、 化される全てのポリペプチドにも関する。

上述のポリペプチドの中でも、特に次のものを識別することができるニ ー　図１の位置１および７３２に相応するアミノ酸の間に拡がるポリペプチド； −位置２２と７３２に相応するアミノ酸の間に拡がるポリペプチド； −図１の位置１及び６７にあるアミノ酸によって限定されているペプチド配列を もつポリペプチド、−図１の位置２２及び６７にあるアミノ酸によって限定され ているペプチド配列をもつポリペプチド；−図１の位置２２及び６７にあるアミ ノ酸により限定されたペプチド配列からの約５個乃至６７個のアミリ酸のペプチ ド配列を特徴とするポリペプチド；−図１の位置２２及び６７にあるアミノ酸に より限定されたペプチド配列からの約５個乃至４５個のアミリ酸のペプチド配列 を特徴とするポリペプチド；上述のポリペプチドは、前述の生化学的又は免疫学 的又は薬学的特性を保持しているかぎり、変更可能である。

例えば、制限的な意味はなく、本発明の枠内に入るポリペプチドは、上述のよう な生化学的又は免疫学的又は薬学的特性が保持されることを条件としている。

単数又は複数のアミノ酸の付加及び／又は削除及び／又は変更によって、上述の ポリペプチドと区別することのできるものである。

当業者であれば、本発明の範囲内に入るさらに短かい配列のポリペプチドを識別 しひいては選定することが可能である。この識別を可能にする一般的な手段の１ つとしては例えば、Ｎ末端又はＣ末端の領域内で選ばれたペプチド部位において 上述のポリペプチドを分割させるタンパク質分解酵素による図１のポリペプチド の処理、及びそれに続（、前記ポリペプチドの残りのＣ末端フラグメント又はＮ 末端フラグメントの分離、がある、ここでこの「残りの」ポリペプチドはその後 、図１の位置２２から６７にあるアミリ酸により限定されるペプチド配列からの １つのペプチドに対抗して導かれた単クローン性又は多クローン性の抗体による その認識特性について、又場合によっては、アンジオテンシン及び／又はプラジ キニンに対するその酵素活性について、テストされる。応答が陽性であった場合 、Ｎ末端又はＣ末端フラグメントが、前述の免疫学的及び／又は酵素的特性の表 示にとって不可欠とはいわないまでも有意な役割を果していなかったということ を立証できたことになる。残りのポリペプチドのＮ末端又はＣ：ｆ端に近いもう １つの特異的部位を認識する可能性のあるタンパク質分解酵素が利用できるかぎ りこの作業を場合によっては反復することが可能である。源であるさらに長いフ ラグメントの免疫学的及び／又は酵素的特性をそれより小さい認識されたポリペ プチドが失なった場合、分離されたＲ後のフラグメントが図１のポリペプチドの 酵素特性の表示において有意な役割を果したということを仮定することができる 。

精巣ＡＣＨの酵素活性の表示にとって不可欠なこのＡＣＥ＜７）ｆｉｎ域の検出 についての前述のものよりもさらに単純なもう１つの変形態様は、精巣かＡＣＨ に対してコード化する核酸の酵素処理に基づいたものでありうる。この処理はこ のようにして得られた核酸の取り込みの前に実施され、適当な細胞宿主における 前述のポリペプチドの生産方法（以下により詳しく説明する方法）の実施のため に用いられる０表現ベクター内で、精巣ＡＣＥと同じタイプの免疫学的及び／又 は酵素的活性を有するポリペプチドに対してコード化するものと予測されている 。このときこの酵素処理は、例えばＢａ１３１のようなエキソヌクレオチド分解 酵素によるか或は又初期核酸の配列内のそれぞれの認識部位（場合によっては有 向点突然変異生成によって作られたもの）のために選ばれた単数又は複数の制限 酵素による初期核酸（例えば図１のポリペプチドの全体に対してコード化するも の）の端部を切り落とすこと、或いはまた制限酵素の切断部位と表現すべき領域 の初めの間に合成接合ＤＮＡフラグメントを付加することから成っていてよい、 このようにして、伝令ＲＮＡの３°末端から、翻訳停止コドンにより置換される 増大する長さの配列を削除することができる。これと同じ方法は５°末端にも適 用できるが、この場合開始コドン（ＡＴＧ）を維持することが必要であり（シグ ナルペプチド又はその地金ての配列がペプチドの分泌を可能にしている）、また オーブンリーディング段階を維持することも必要である。

得られた切形の核酸はこのとき、選択されたベクター内の取込み及び得られた組 換え型ベクターでの宿主細胞の形質転換の後で、前述の免疫学的及び／又は酵素 的特性をなおも持ちつづけているか又は逆にもはや持っていない、相応する切形 ポリペプチドを表現するというその能力についてテストされることができ、かく して、前述の変形大要におけるように、図１のポリペプチドの中で、精巣ＡＣＨ の免疫学的及び／又は酵素的特性の表示において不可欠といわないまでも有意な 役割を果たす配列を識別することが可能となる。

本発明は同様に、ヒト精巣プレＡＣＥ又は成熟したヒト精巣ＡＣＨに対して、或 いはまたその組換え型核酸が導入されつる宿主細胞のポリメラーゼにより認識さ れた転写ターミネータ（終了暗号）及び／又はプロモータと結びつけられかつ精 巣ＡＣＥと同じタイプの免疫的及び／又は酵素的活性を有する可能性のある全て のポリペプチドに対してコード化する上述のタイプのＤＮＡのフラグメントを全 て含むあらゆる組換え型核酸をも、その目的とするものである。

宿主細胞内への前記組換え型核酸の導入は、有利なことにベクター特にプラスミ ドタイプで、前記宿主細胞内で複製し酵素に対してコード化する配列をそこで表 現することのできるようなベクターを用いて、実施される。

前記組換え型核酸は同様に、前記宿主細胞を感染させることのできるウィルスベ クター（組換え型ウィルス）を用いてか、或いはまた、宿主細胞のゲノム内に組 込まれそこで本発明に基づく核酸によりコード化されたポリペプチドを表現させ ることのできる（この核酸は宿主細胞内で活性のウィルス又はレトロウィルスプ ロモータの制御下にある）レトロウィルスベクターを用いても、宿主細胞内に導 入されつる。

本発明の枠内で使用可能なベクターの例としては、細胞ＮＩＨ３Ｔ３を感染させ ることのできるモロニータイプのマウス白血病ウィルス（Ｍ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ 　）又は、昆虫の細胞に感染させるのに用いられるバキュロウィルスを挙げるこ とができる。

従って、本発明は、ヒト精巣ＡＣＥ又は精巣ＡＣＥからの上述のポリペプチドの 生産方法において、上述のベクターを用いての宿主細胞の形質転換、適当な媒養 基内で形質転換された宿主細胞の培養、ならびに、前記ポリペプチドが中で分泌 された場合の培養基からの直接的なその回収（特に宿主細胞内でのその合成の際 に、当該ポリペプチドの前にシグナル配列がある場合）或いは又ポリペプチドが この宿主細胞内で分泌されない場合の宿主細胞の壁の溶解の後のその回収、を含 むことを特徴とする方法に関する。

上述の方法の実施のために用いられる宿主細胞は、原核細胞、特に大腸菌の細胞 であってよく、さらに有利なことに、特にタンパク質をそのグリコジル化された 成熟した形で得られるようにする真核細胞であってもよい（酵母、ＣＨＯ細胞又 はその他の細胞、又はバキュロウィルスによる感染を受けた昆虫の細胞）。

本発明は同様に、アミノ又はカルボキシル官能基からのいくつかの保護基の付加 又は除去を伴う１選択されたペプチド残基の段階毎の付加、或いはまた、選択さ れた保護基の付加又は除去を伴う、フラグメント生成のための選択されたペプチ ド残基の付加とそれに続（適当なアミノ酸配列への前記フラグメントの凝縮、と いった段階を含む前述の新しいポリペプチドの合成による調製方法をもその目的 としている。

本発明は同様に、上述のポリペプチドに対する特異的抗体にも関する。特に本発 明は、上述のペプチド配列に対する多クローン性又は単クローン性の抗体をその 目的とする。

精巣ＡＣＨの配列から誘導されたペプチドに対する多クローン性抗体の獲得方法 について、以下に要約するニ ー　約５個から１５個のアミノ酸を最小サイズとするペプチドを以下のものに結 合させる； ☆ペプチドに、人工的に天然の配列に付加することができるシスティンが含まれ る場合には、ウシ血清アルブミン又はＫＬＨ［キーホールリンベットヘモシアニ ン（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ　ｃｒｅｎｕｌａｔａ）］るなおこのシスティンは予め ５ＰＤＰ＝　（ピリジルジチオ−２）−３プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステルにより活性化されている；☆ベンゾキノンを介してＫＬＨ又は ＬＰＨ（リムルスポリへマスの血液リンパへモニアニン）に；☆グルタルアルデ ヒドによりＬＰＨに；☆カルボジイミドによりＬＰＨに； −次に、結合したペプチドを等量のフロイントのアジュバント中で、ウサギの後 脚掌球内に注入する。

等１回の注入の際には、完全フロインドアジュバントを用い、その後不完全アジ ュバントを用いる。

−３週間〜４週間毎に一回反復注入を行う。

−注入の度に、抗体価を測定する目的で、採血を行なう（抗体価は、注入に用い られ放射線で標識づけされたペプチドが抗体に５０％で結合される希釈倍数を測 定することにより設定される）。

上述の単クローン性抗体は、以下に一般的原理を示すハイブリドーマ（雑種細胞 ）技法により生産できる。

第１段階においては、上述のポリペプチドの１つを選ばれた動物（例えばＢｉｏ ｚｚｉ又はＢａ１ｂ／Ｃタイプのマウス）に接種する。このときこの動物のＢリ ンパ球はこのポリペプチドに対する抗体を作り出すことができる。注入プロトコ ルには、例えば、完全フロインドアジュバントで行なわれる最初のものを含む３ 回の注入が含まれている。被験動物は、牌臓の細胞の単離より数時間前にポリペ プチドの１．Ｖ、（静脈内）注入を受ける。注入を受けた被験動物の牌臓細胞を 、ポリエチレングリコールな用いてＤＩ　ＰＡＵＬＩが記している方法に従って ［ＤＩ　ＰＡＵＬＩ　Ｒ，Ｗ、ｃ、、ＲＡＳＣＨＫＥ共著（１９７８年）　、ｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｋｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍ ＩＩｌｕｍｏｌｏｇｙＪ第８１巻、Ｆ、ＭＥＬＣＨＥＲＳ、　Ｍ、ＰＯＴＴＥ及 びＮ、　Ｌ、　ＷＡＲＮＥＲ，監修、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリ ン、３７−３９１、骨髄腫系統の「不死の」細胞と融合させる。融合された細胞 （ハイブリドーマ）を次にヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン培養基中 で再度培養し選定する。こうして得られた細胞の異質混合物から、次に特定の抗 体を生成し無限に増殖することのできる選り抜きの細胞を作り上げる。

抗体を生成するバイブリドーマを次に、細胞選別器を援用して非常に入念にクロ ーニング、サブクローニングする。その後、ブリスタンで処理した被験動物特に Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの腹膜内にハイブリドーマを再度注入する。その後、抗体の 存在について腹水を試験し、腹水内に存在する免疫グロブリンをアフィニイティ ー力うム上、特にタンパク質−Ａセファロース上で純化する。

単クローン性又は多クローン性抗体は同様に、ＡＣＨの分子全体に対して生成さ れつる。

上述の多クローン性又は単クローン性抗体の製造のために用いられるポリペプチ ドのうち、さらに具体的に言うと、精巣ＡＣＨに特異的なポリペプチドすなわち 図１の位置１及び６７又は２２及び６７にあるアミノ酸によって限定されている ポリペプチド、或いは又図１の位置１及び６７にあるアミノ酸により限定されて いるペプチド配列からの少なくとも５つのアミノ酸を有するポリペプチドが挙げ られる。

本発明は同様に、ＡＣＥ又はＡＣＨの特性を生０体内で有する生成物、さらに具 体的に言うと、ヒト精巣ＡＣＥ又は上述のポリペプチドのような精巣ＡＣＥから 誘導された生成物のｍΔ工９、これらを含む可能性のある生物学的試験における 検出又は定量方法にも関する。本発明に基づくこのような検出方法は、上述のよ うな単クローン性抗体或いは上述のヌクレオチドプローブを用いて行なうことが できる。

本発明は特に、ヒト精巣ＡＣＨのＵ１亘検出又は定量方法の実施のための、図１ の位置１及び６７にあるアミノ酸により限定されているポリペプチド、又は位！ ２２及び６７にあるアミノ酸により限定されているポリペプチド或いはまた位置 １及び６７にあるアミノ酸により限定されているペプチド配列からのポリペプチ ドを用いて得られ、かつこれらのポリペプチドを特異的に認識するような多クロ ーン性又は単クローン性抗体の利用をもその目的とする。

本発明は同様に、上述の検出又は定量方法の実施のための、上述のヌクレオチド プローブ特に上述のヒト精巣ＡＣＥに特異的なポリペプチドに的してコード化す る核酸配列とハイブリッド形成するヌクレオチドプローブにも関する。

上述の生物学的試料採取は１．１１液といった流動的組織内は器官内で行なわれ 、器官内で行なわれる場合、上述の抗体又はプローブを後で上に同定することに なる組織の薄い切片を特に得ることが可能となる。

上述の抗体を介して行われる本発明に基づ（測定には、特に以下のような段階が 含まれている；−本発明に基づく精巣ＡＣＥから誘導されたポリペプチド又は精 巣ＡＣＥを特異的に認識する抗体を、精巣ＡＣＥ又はそれから誘導された生成物 と上述の抗体の間で形成される免疫学的複合体の生成を場合によって可能にする ような条件の下で、上述の成物学的試料と接触させる段階； −適当なあらゆる手段を用いて上述の免疫学的複合体を検出する段階； 有利には、このような方法の実施のために用いられる抗体は、特に酵素又は放射 線によって標識づけられている。

本発明に基づくこのような方法は、特に、以下の段階を含むＥＬ　Ｉ　ＳＡ方法 （酵素結合免疫吸着検定法）に従って実現される。

−固体支持体上、特に血小板のくぼみの表面に、予め定められた量の抗体を固定 する段階；−上述の支持体上に、（液体の形での）生物学的試料を付加する段階 。

−前記抗体と精巣ＡＣＥ又はそれから誘導された上述の生成物との間での免疫反 応を可能にするのに充分な時間保温する段階ニ ー　生物学的試料から固定されていない部分を除去し、固定支持体を洗浄する（ 特に血小板のくぼみ）段階； −自らに特異的な基質を活性化させることのできる酵素により標識づけされた免 疫グロブリンを付加する段階； −前の免疫反応の際に放出された酵素活性に特異的な基質を付加する段階ニ ー　適当なあらゆる手段を用いて、酵素による基質の分解を検出する段階；　及 び、 −生物学的試料内に最初存在したヒトＡＣＥａ度に対し、遊離された酵素量を相 関する段階、；本発明の測定方法のもう１つの実施態様に従うと、上述の抗体は 標識づけされず、ポリペプチドと前記抗体の間で形成される免疫複合体の検出は 、この複合体を認識する標識付けされた免疫グロブリンを用いて実現される。

本発明に基づく測定方法は、同様に、生物学的試料内に含まれている可能性のあ るポリペプチドと上述の抗体に対するこれらの同じポリペプチドの予め定められ た量の間の競合のメカニズムによっても実施できる。この後者の場合、予め定め られた量の本発明のポリペプチドは、有利には、酵素マーカーを用いて標識付け されている。

本発明は、この発明に基づくポリペプチドのｍ内測定のための上述の実施態様に 制限されるものでは全くなく、この秤量は、適切なその他のあらゆる免疫学的方 法を用いて実施できるものである。

本発明は同様に、ＡＣＥ又はＡＣＨの特性を！体］で有する生成物、特にヒト精 巣ＡＣＥのＷでの検出又は定量方法において、このＡＣＨの全部又は一部に普遍 遺伝子コードに従って相応する核酸を検出又は定量することから成ること、又こ の核酸を含む可能性のある生物学的試料を用いて行なわれることを特徴とする方 法にも関する。この方法は以下の段階が含まれていることを特徴とする； −上述のヌクレオチドプローブと前述の生物学的試料とを、このプローブと検出 すべき核酸の閘で形成されるハイブリッド形成複合体を場合によって生成できる ようにするような条件の下で接触させる段階−かかるハイブリッド形成複合体を 適切なあらゆる手段を用いて検出する段階； 本発明の一実施態様に従うと、上述の生物学的試料は、検出の実施前に、それが 含んでいる細胞を溶解させるように、かつ場合によっては前述の細胞内に含まれ ているゲノム材料がＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩなどのタイプの制限酵素を用いて分 析されるような形で、或いはまたＲＮＡが、特にＴＨＯＭＡＳ、　Ｐ、　Ｓ、著 （１９ｇ３年）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ　（酵素学的方法）　、　１００ ．２５５−２６６内に記されている方法に従ってそこから分離されるような形で 、処理される。

有利なことに、本発明のヌクレオチドプローブは、特に（例えばアルカリ性ホス ファターゼといった）容易に検圧可能な活性をもつ酵素に結合されている１つの 抗体による検圧を可能にするようなハブテン（部分抗原）に結合されているか又 は放射性をもつ単数又は複数のヌクレオチドの取り込みによって、標識付けされ る。生物学的試料からのＤＮＡ又はＲＮＡは、適当な支持体特に例久ばナイロン 膜といったニトロセルロースその他のフィルターの上に置かれ、次にこの支持体 の上には上述のプローブが付加される。

本発明に従った上述の方法のもう１つの有利な実施態様によると、上述の生物学 的試料を用いて組織学的切片が作られ、本発明のヌクレオチドプローブは、切片 上ハイブリッド法により本発明の核酸を検出するため、この組織学的切片と直接 接触させられる。

本発明は同様に、精巣に特有の病理学（特に生殖細胞レベルの）、特に精巣の腫 １ｍ（精上皮腫とも呼ばれる）、雄生殖細胞の成熟、低生殖及び男性生殖不能と いった病理のｍ診断に対する、上述の精巣ＡＣＨの検出又は定量方法の利用にも 関する。

低生殖能及び男性生殖不能の診断の枠内で、上述の方法は、有利にも、精子又は 精子から分離された精液類又は生殖細胞を用いて、或いは又精巣生検を用いて実 施される。

本発明は同様に、上述の仄駄１泗検出又は定員方法の実施のための必要品又はキ ットをもその目的とする。

一例を挙げると、このようなキットには、以下のようなものが含まれている。

−本発明に基づく精巣ＡＣＥは精巣ＡＣＥから誘導されたポリペプチドの１つと 特異的免疫反応を起こす可能性のある上述の多クローン性又は単クローン性抗体 の１つの一定量： −及び／又は、上述の抗体と免疫反応を起こす可能性のある精巣ＡＣＥ又はポリ ペプチドの一定量；−有利には、本発明に基づ＜ＡＣＥ又はポリペプチドと上述 の抗体との間の免疫反応の形成に適した塔側１ −　有利には、上述の免疫反応の際に生成される免疫複合体の検出を可能にする 試薬。

又ヌクレオチドプローブを用いたＵ豆ヨ検出方法の実施の枠内で、使用されるキ ットには、例えば以下のものが含まれている； −本発明に基づ（精巣ＡＣＥ又は精巣ＡＣＥから誘導されたポリペプチドに対し てコード化する上述の核酸とのハイブリッド形成反応を起こす可能性のある上述 のヌクレオトヂブローブの１つの一定量；−上述のハイブリッド形成反応の際に 生成されるハイブリッド形成複合体の検出を可能にする試薬。

本発明は同様に、現在のＡＣＥ抑制因子よりもさらに強力でかつ／又はこのヒト ＡＣＨに対する一層の特異性を有する新しいヒトＡＣＥ抑制因子を考案するため 、図１のポリペプチド又はこのポリペプチドから適切なあらゆるボブチドフラグ メントを利用することにも関するものである。

本発明は同様に、図１のポリペプチド又はこのポリペプチドを源としＡＣＥと同 じタイプの酵素活性を有するあらゆるペプチドフラグメントを前記抑制因子と接 触させる段階及び、これらの抑制因子について解離定数［Ｋｉ］及び酵素の５０ ％抑制に必要な濃度［Ｉ　Ｃ，。］を決定する段階を含む、ＡＣＥ抑制因子の検 出又は定量又はその抑制能の数量化の方法をもその目的としている。

本発明は同様に、図１のポリペプチド又はキニン、特にブラジキニンを加水分解 することができる上述のもののようなこのポリペプチドのあらゆるフラグメント を、炎症性又は感染性疾患、急性膵炎さらに一般的には生体内でのキニンの遊離 が病原的役割を果たしつるような疾病の治療において使用することにも関するも のである。

したがって、本発明は、さらに具体的に言うと、受容可能な薬学的賦形剤と、キ ニン、特にブラジキニンを加水分解することができる図１のポリペプチドの全て 又は一部分を会合させることを特徴とする、上述の疾病の治療のための薬学的化 合物に関する。

本発明のもう１つの目的は、上述の遺伝子のさまざまな対立形質の決定のため、 上述の条件下でヒト精巣ＡＣＨの表現を担う遺伝子とハイブリッド形成すること ができる本発明に基づくヌクレオチドプローブを利用することにある。

本発明は同様に、図１のヌクレオチド配列からの約１５個乃至３０個のヌクレオ チドのあらゆるヌクレオチド配列又は前記図１のヌクレオチド配列の相補的配列 、或いはまた図１からの約１５個乃至３０個のヌクレオチドの前記配列と（上述 の条件下で）ハイブリッド形成する可能性のある約１５個乃至３０個のヌクレオ チドの配列、ならびに特に１９８６年３月２７日付の欧州特許出願明細書簡８６ ／３０２，２９８．４号に記載の増幅方法に従っての図１のヌクレオチド配列の 全て又は一部分の遺伝子の増幅を可能にするようなプライマとしてのこのような 配列の使用をもその目的とする。

これらのオリゴヌクレオチドプライマは、そのさまざまな上述の段階の前に宿主 細胞の形質転換段階に先立つ精巣ＡＣＨに対しコード化する遺伝子の増幅段階が あるような、上述のもののような遺伝子工学の方法による精巣ＡＣＥの合成の枠 内で、きわめて有効である。

本発明は同様に、場合によっは上述のような単数又は複数のプライマ対を用いて その他の細胞構成要素から分離されたこのｍ　ＲＮ　、Ａの全て又は一部分を予 め増幅する段階（又は精巣ＡＣＨに対しコード化するＲ　Ｎ　、ＡのＤＮＡコピ ーの増幅）を含む、上述のような精巣ＡＣＨに対しコード化するｍＲＮＡの仄狭 豆式検出方法にも関する。

従って、本発明は同様に、少なくとも上述のプライマ対ｌ対を含み、これらのプ ライマは、ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰといった４つの異なる適量のデオキシヌクレオ チド三リン酸と適当なポリメラーゼが存在する中で検出すべき核酸のコピー数を 増幅することができることを特徴とする、前述のもののような診断キットをもそ の目的とする。

本発明の補足的な特徴は、さらにヒト精巣ＡＣＨに対してコード化する核酸のク ローニングならびにこのクローニングのために用いられるプローブについての以 下の記述から明らかになることだろう。ただしこの記述は、クレームの範囲を制 限するものとして解釈されてはならない。

■−ヒト精巣ＡＣＥの相補的ＤＮＡの配列決定、先ｇｔｌｌファージにおいて構 築されたオリゴ（ｄＴ）でブライミングされたヒト精巣ｃＤＮＡバンク（Ｃ１ｏ ｎｔｅｓｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）を、下記のプローブを用い てスクリーニングした。

ファージとのハイブリッド形成は、ＢＥＮＴＯＮ　ＷＤ及びＤａｕｉｓ　ＲＷ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　（ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ）　１９７７年、　１９６．１８０− １８２の方法に従って行なった。さらに具体的に言うと、このハイブリッド形成 は、６ｘＳＳＣ（ｌｘＳＳＣはＮａＣ１１５０ｍＭ、クエン酸塩１５ｍＭに相当 する）、０．１％のＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４、緩衝液ＮａＰ０．　５０ｍ Ｍ、ｐＨ６，８、０，−ＩＢ／ｍｊの変性ＤＮＡ、サケの精子から成る溶液内で ６５℃で行なわれた。

プローブとして用いられた配列はバクテリオファージＬ１９−２２内に含まれ、 上述ｉ：Ｉ）ＳＯＵ−ＢＲＩＥＲＦ、他の論文中に記述されているような相補的 ＤＮＡ配列の最後の３２４８個のヌクレオチド（位置６９１〜４０２４を表す、 この配列が選ばれたのは、ヒト精巣内でＡＣＨの伝令ＲＮＡとハイブリッド形成 するからである。　ＦＥＩＮ−ＢＥＲＧＡＰ他（１９８３年）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２．６−１３で記述されている方法に従ってオリゴヌク レオチドプライマとＥ、　ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■を用いて静的標識づ けを行なうことにより、内皮ＡＣＨのＤＮＡのクローニングされた配列をプロー ブとして用いた。比活性が３０００　ｃｉｅｓ／　ｍｍｏｌのアルファ［ｓ＊ｐ ］　、デオキシシチジン三リン酸を用いることにより、このプローブの比活性は ＤＮＡ　１μｇ・　あたり２〜８　Ｘ　１０　”ｃｐｍとなる。フィルタのハイ ブリッド形成溶液中の放射性プローブの濃度は１０　’ｃｐｍ／ｍ１である。次 に、ストリンジェンスの高い条件下で６８℃で３０分間フィルターを洗浄した（ ０．ｌＸ５ＳＣ１０，１％Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏａで最終洗浄）。バンク の２Ｘ１６’のクローンのスクリーニングにより、陽性のクローンを１７分離す ることができた。これらのクローンのうち２つの陽性クローンを分離した。組換 え型ファージ内に挿入されたＤＮＡフラグメントを純化し、プラスミドｐＢ１ｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位内に挿入した。挿入 の配列は、直接プラスミドの二本鎖ＤＮＡ上で、或いはまたへルバーファージＫ Ｏ２を用いて培養基を感染させることにより一本鎖ＤＮＡを得ることによって、 得られた。

これらのクローンのヌクレオチド配列の決定は、ＫｌｅｎｏｗのＤＮＡポリメラ ーゼ又は変性Ｔ７のＤＮＡポリメラーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、　ＵＳ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒの方法（ＳＡ　ＮＧＥＲ，Ｆ他著　 （１９７７年）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７）によって実施さ れた。デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の代わりに、デオキシイノシン 三リン酸（ｄＩＴＰ）又はデアザ−デオキシグアノシン三リン酸（７−ｄｅａｚ ａ　ｄＧＴＰ）を用いて、いくつかの領域を配列決定した。

［Ｓ”］　ｄＡＴＰにより標識付けされたフラグメントの電気泳動を、尿素−ポ リアクリルアミドゲル上で行なった。配列に沿って等間隔に並べられたプライマ として用いられた約３５０の塩基対毎に徐々に近いオリゴマを合成することによ って、各配列を決定した。

クローンんｈｔｉｏは、図１に示された精巣ｃＤＮＡの配列の位置２６０から２ ４７７までに拡がり、２２１７個のヌクレオチドの長さをもつ配列を含む。この クローンは、ポリアデニル化配列に至るまで伝令ＲＮＡの領域３°の中に拡がり 、短かいボリ（Ａ）配列を含む、２２６３個のヌクレオチドの長さをもつクロー ンλｈｔ１６は、図１の位置５０及び２３１３の間にある精巣ｃＤＮＡの領域に 相当する。

２２個のヌクレオチドの長さのオリゴマを合成し、伝令ＲＮＡの最も５°の領域 に相当するクローンを得るべ（バンクを再びスクリーニングするのに用いた。こ のオリゴマの配列はクローンえｈｔ１６の配列内に含まれている（位置５９〜８ ０）、このオリゴマを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、Ｎｒ−［”Ｐ −］アデノシン三リす酸ＡＴＰ　（比活性５０００　ｃｉｅｓ／　ｍｍｏｌｅ） で標識づけした。プローブの比活性は５×１０“ｃｐｍ／ｐｍｐｌｅである。ハ イブリッド形成温度を６０℃とし洗浄温度を６５℃とし溶液２ＸＳＳＣ内で行な ったという変更点を除いて上述のものと同じ条件の下で、フィルターをスクリー ニングした。このスクリーニングにより、ＡＣＨの精巣ｃＤＮＡのヌクレオチド ３１までの５°で拡がる２、２ｋｂの長さのクローンλｈｔ３４を分離すること ができた。

精巣ＡＣＨに対しコード化する伝令ＲＮＡの末端５°に相応する相補的ＤＮＡを 得るような形で、外科手術の際に得られたヒト精巣組織から分離したＲＮＡ５μ ｇを用いて、ｃＤＮＡのもう１つのデータバンクを構築した。相補的ＤＮＡバン クは、２つのプライマを用いてＧｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ　（ｒ遺伝子Ｊ 　（１９８３）年、２５、２６３−２６９１１の方法に従って構築された。その １つは、以前に得られたクローン配列によって決定されたＡＣＨの伝令ＲＮＡの 特異的プライマである。すなわち、まず１の位置２２８−２４４に局在化した配 列に相補的な１７個の塩基のオリゴマ（ＡＴＨ１７）である、第２のプライマは オリゴ−ｄ　（Ｔ）１２−１８ｍｅｒｓ　（ｐｈａｒｍａｃｉａ）に相当する。

２重鎮の相補的ＤＮＡを合成し、次にＫｏｅｎｉｇ他［Ｋｏｅｎｉｇ、　Ｍ他、 著（１９８７年）、［細胞Ｊ　５０，５０９−５１７］の方法に従って酵素Ｅｃ ｏＲＩにより切断されたファージλｇｔｌｏ内に挿入した。

組換え型ファージ（ＩＸＩＯ’の組換え型ファージ）を、前述のように標識づけ したオリゴマＴＨ１６を用いてスクリーニングした。バンクのスクリーニング条 件は、同じプローブを用いて上述のものと同じである。得られた陽性クローンの うち、２４４の塩基体の長さのクローンλｈｔ２２１を配列決定した。これには 、精巣ＡＣＨに対してコード化する伝令ＲＮＡの最も５°の部分が含まれている 。

４つのクローンから得られた精巣ｃＤＮＡの複合ヌクレオチド配列から誘導でき るような精巣伝令ＲＮＡの配列の長さは、ヌクレオチド２４７７個である。この 配列は、精巣ｃＤＮＡの位置２２８の３°において内皮伝令ＲＮＡのものと同じ ヌクレオチド配列を呈している。この位置の５°において、２つの精巣及び内皮 伝令ＲＮＡは拡散し、決定された精巣特異配列は、２２８のヌクレオチドから成 るものである。最初のＡＴＧコドンから停止コドンに至るまで、７３２個のアミ ノ酸に対してコード化するオーブン段階が存在する。このヌクレオチド配列から 導き出されたペプチド配列と分析すると、翻訳の開始メチオニンの後、シグナル ペプチドの特徴を呈する１つのペプチドが存在することがわかり、シグナルペプ チドの切断部位の予測のためのＶＯＮ　ＨＥＩＪＮＥが記したプログラム［Ｎｕ ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１９８６年、１４．４６８３−４ ６９０］を用いると、シグナルペプチドの切断部位は、位置２１のアミノ酸と位 置２２のアミノ酸の間にくることになる。このシグナル配列の後では、精巣ＡＣ Ｈの特異的ペプチド配列は、グリコジル化の可能性ある潜在部位であるセリンと トレオニンが極めて豊富であり、このタイプの配列は、集団Ｏ−グルコシル化を 思い起こさせるものである。

精巣酵素の酵素特性は、アンジオテンシン■に対するＫｃａｔ、　Ｖｍａｘ及び Ｋｍに関して内皮酵素のものと同じであるため、その構造を内皮酵素の構造と比 較することによって、ＡＣＥ分子内の構造と活性の関係に関する興味深い情報を 得ることができる。実際、内皮酵素は互いに極めて相同な２つの大きなドメイン で構成されている。これらのドメインの各々は、サーモリジン、コラゲナーゼ又 は中性エンドベブチターゼといった亜鉛性金属ベブチターゼの活性部位のコンセ ンサスアミノ酸の短い配列を含んでいる。精巣転換酵素は内皮ＡＣＨのカルボキ シ末端ドメインしか含まず、７このことは、このドメインが独自で酵素活性を担 う構造を支持していることを表しているように思われる。もう１つの仮定は、精 巣酵素が１つのグイマ（二量体）として作用するということである。しかしなが ら密度勾配遠心分離による非変性化条件でテストされたウサギの天然精巣酵素は 、まさに内皮ＡＣＨのものよりも低い分子量を有している。

１００ｂρ ト鐸→ Ｆｉｇｕｒｅ　２ 国際調査報告 １１１１“１１１−　Ｘｉｌ陛Ｑｌ’ｌ／＋１０へ１１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．図１の位置２９及び２２９にあるヌクレオチドにより限定されている核酸配 列の全て又は一部をそれ自体含んでいるような図１の核酸配列の一部分或いはこ の配列の全てを含んでいること、ならびに、−図１の位置１から６７にあるアミ ノ酸により限定されているペプチド配列からくるあらゆるペプチドを特異的に認 識する多クローン性又は単クローン性の抗体により認識される可能性があり −しかも場合によっては、アンジオテンシンＩ及び／又はキニン、特にブラジキ ニンを加水分解することができる ポリペプチドに対しコード化することを特徴とする核酸、 或いは、前記特性を失わせるための条件の下で前記ポリペプチドのアミノ酸配列 の変更を引起こさないヌクレオチドの置換によってのみそのヌクレオチド配列レ ベルで前述のものと識別されるような全ての核酸。
2. ２．−アルカリ溶液（０．５ＭのＮａＯＨ）を用いた処理により図１のものとハ イブリッド形成することができる核酸（ＤＮＡ）の変性及びそれに続く中性ｐＨ への移行、 −２５ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．４；５×ＳＳＣ；５×Ｄｅｎｈａｅｄｔ′ｓ； ５０ｕｇ／ｍｌの超音波処理されたサケ精子のＤＮＡ；０．１％のドデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ又はＮａＤｏｄＳＯ４−）という組成をもつ溶液で、３時間 、５０℃での、図１に示されている核酸が上に固定されている支持体（ニトロセ ルロースフィルター又はナイロン膜）のプレハイブリッド形成処理；−上述のブ レハイブリッド形成処理の組成と同じ組成を有し（場合によっては１０％のデキ ストランを加える）、特に放射線により標識づけされ、３分間、９０℃での処理 により予め変性されたプローブとして図１の核酸を含む緩衝液による、支持体と 接触したブレハイブリッド形成処理溶液の置換、−６０℃で１２時間のインキュ ベーション、−・２×ＳＳＣの溶液で６０℃３０分間２回、１×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳの溶液で６５℃、１５分間１〜２回 の連続洗浄 といったストリンジェントハイブリッド形成条件の下で、図１に示されている核 酸とハイブリッド形成することができることを特徴とする核酸。
3. ３．非ストリンジェント条件下では温度が４０℃であり、連続する洗浄が４５℃ １５分間で２回にわたりＳＤＳを含んで又はＳＤＳを含まずに行なわれるという 点を除いて、請求範囲２に記載のストリンジェント条件の基本的特徴を保持する 非ストリンジェント条件の下で、図１の核酸とハイブリッド形成することができ ることを特徴とする核酸、
4. ４．成熟したヒトの精巣のＡＣＥに対してコード化する、図１の位置９２及び２ ２２４にあるヌクレオチドによって限定されているＤＮＡ配列を含むことを特徴 とする、請求の範囲１に記載の核酸。
5. ５．成熟ヒト精巣ＡＣＥに対してコード化する前記ＤＮＡを列の前に、図１の位 置２９及び９１にあるヌクレオチドにより限定され２１のアミノ酸のシグナルペ プチドに対しコード化するＤＮＡ配列があることを特徴とする、請求の範囲４に 記載の核酸。
6. ６．図１の位置１から９２の間にあるヌクレオチドと図１の位置２２９から２２ ２４の間にあるヌクレオチドの間に拡がるＤＮＡ配列が含まれていることを特徴 とする。請求の範囲１に記載の核酸。
7. ７．図１の位置２９にあるヌクレオチドと図１の位置２２９にあるヌクレオチド の間に拡がる核酸配列からの約１５乃至２０１個のヌクレオチドのＤＮＡ配列が 含まれていることを特徴とする、請求の範囲１に記載する核酸。
8. ８．図１の位置９２にあるヌクレオチドと図１の位置２２９にあるヌクレオチド の間に拡がる核酸配列からの約１５乃至１３５個のヌクレオチドのＤＮＡ配列が 含まれていることを特徴とする、請求の範囲１の記載の核酸。
9. ９．図１の位置１から７３２にあるアミノ酸により限定されているペプチド配列 の全て又は一部分を含んでいること、ならびに、 −図１の位置１から６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列からのあ らゆるペプチドを特異的に認識する多クローン性又は単クローン性の抗体により 認識されることができ、 −しかも場合によっては、アンジオテンシンＩ及び／又はキニン、特にブラジキ ニンを加水分解することができる ことを特徴とする、請求の範囲１に記載の核酸によりコード化されたポリペプチ ド。
10. １０．図１の位置２２及び７３２にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列 を特徴とする、請求の範囲９に記載のポリペプチド。
11. １１．図１の位置１２及び６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列を 特徴とする、請求の範囲９に記載のポリペプチド。
12. １２．図１の位置２２及び６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列を 特徴とする、請求の範囲６に記載のポリペプチド。
13. １３．図１の位置１及び６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列から の、約５〜６７個のアミノ酸のペプチド配列を特徴とする、請求の範囲９に記載 のポリペプチド。
14. １４．図１の位置２２及び６７にあるアミノ酸により限定されたペプチド配列か らの、約５〜４５個のアミノ酸のペプチド配列を特徴とする、請求の範囲９に記 載のポリペプチド。
15. １５．請求の範囲１乃至８のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列の転写を抑 制しうるプロモータに結びつけられた状態のこのヌクレオチド配列及び場合によ っては転写の終結信号に対しコード化するＤＮＡ配列が含まれていることを特徴 とする核酸。
16. １６．適切な宿主細胞、特に真核細胞を形質転換又は感染させることができる組 換え型ベクター、特に組換え型プラスミド又はウィルスにおいて、宿主細胞内で のＤＮＡフラグメントの表現を可能にする調節要素、特にこの宿主細胞のポリメ ラーゼにより認識されるプロモータの制御の下で請求の範囲１乃至８のいずれか １項に記載の核酸を含んでいることを特徴する組換え型ベクター。
17. １７．成熟した又は未成熟のヒト精巣ＡＣＥ又は請求の範囲９乃至１５のいずれ かに１項に記載のヒト精巣ＡＣＥからのポリペプチドを製造する方法において請 求の範囲１６に記載のベクターを用いた宿主細胞の形質転換、適当な培養基中で の形質転換された宿主細胞の培養ならびに、これらの細胞又は培養基からの酵素 の回収が含まれることを特徴とする方法。
18. １８．請求の範囲９乃至１５のいずれか１項に記載ポリペプチドに対抗して方向 づけされていることを特徴といる多クローン性又は単クローン性抗体。
19. １９．請求の範囲２又は請求の範囲３に記載の条件下で、請求の範囲１乃至８の いずれか１項に記載の核酸の全て又は一部分とハイブリッド形成できるヌクレオ チド配列によって構成されていることを特徴とするヌクレオチドプローブ、或い は、請求の範囲１乃至８のいずれか１項に記載の核酸と前記プローブのハイブリ ッド形成特性の変更をひき起こさないヌクレオチドの置換によってのみ前述のも のとそのヌクレオチド配列レベルで識別されるような全てのヌクレオチドプロー ブ。
20. ２０．請求の範囲１乃至８の１項に記載のヌクレオチド配列又はこの配列の相補 的配列からの約１５から３０個の一連のヌクレオチドで構成されていること、又 はこれらの配列のうちの１つとハイブリッド形成することのできる約１５個から ３０個の一連のヌクレオチドで構成されていることを特徴とする、ヌクレオチド プライマー。
21. ２１．ＡＣＥ又は生体内でＡＣＥ、特にヒト精巣ＡＣＥの特徴を有する生生物を 、このＡＣＥ又は生生物を含んでいる可能性のある生物学的採取標本内で試験管 内にて検出又は測定する方法において、−請求の範囲１８に記載の抗体を、ＡＣ Ｅ又はＡＣＥから誘導された生生物とこの抗体の間で形成される免疫学的複合体 の生成を場合によって可能にするような条件の下で、前記生物学的標本と接触さ せる段階、 −前記免疫学的複合体を検出する段階 が含まれていることを特徴とする方法。
22. ２２．ＡＣＥ又は生体内でＡＣＥ、特にヒト精巣ＡＣＥの特徴を有する生生物を 、このＡＣＥ又は生生物を含んでいる可能性のある生物学的採取標本内で、試験 管内にて検出又は測定する方法において、−場合によっては、請求の範囲２０に 記載の一対のプライマを用いて検出すべき核酸のコピー数を拡大させる段階、 −請求の範囲１９に記載のヌクレオチドプローブを、このプローブと検出すべき 核酸の間で形成されるハイブリッド形成複合体の生成を場合によって可能にする ような条件の下で、前記生物学的標本と接触させる段階、 −前記ハイブリッド形成複合体を検出する段階、が含まれていることを特徴とす る方法。
23. ２３．ヒトの雄生殖細胞の成熟、低生殖能及び男性生殖不能又は精巣種瘍（又は 精上皮腫）の試験管内診断に利用された、請求の範囲２１又は２２に記載の試験 管内検出方法。
24. ２４．−請求の範囲９乃至１５のいずれか１項に記載の検出すべきポリペプチド との免疫学的反応を発生させる可能性のある、請求の範囲１８に記載の一定量の 抗体； −有利には、上述の抗体とポリペプチドの間の免疫学的反応の形成に適した培養 基、 −有利には、前記免疫学的反応の際に抗体とポリペプチドの間で形成される免疫 学的複合体の検出を可能にする試薬、 を含む、請求の範囲２１及び２３に記載の試験管内検出方法の利用のための必要 品又はキット。
25. ２５．−場合によっては、請求の範囲２０に記載の少なくとも１対のプライマ； −請求の範囲１乃至８のいずれか１項に記載の核酸とのハイブリッド形成反応を 発生させる可能性のある、請求の範囲１９に記載の一定量のヌクレオチドプロー ブ； −有利には、前記プローブ及び核酸の間のハイブリッド形成反応の形成に適した 培養基、−有利には、前記ハイブリッド形成反応の際に核酸とプローブの間で形 成されたハイブリッド形成複合体の検出を可能にする試薬、 を含む、請求の範囲２２及び２３に記載の試験管内検出方法の利用のための必要 品又はキット。
26. ２６．炎症病性又は感染性の疾病、特に急性膵炎及びキニンが病原的役割を果た している疾病の治療のための化合物において、請求の範囲９乃至１５のいずれか １項に記載のポリペプチドと薬学的に受容できる賦形剤の会合を特徴とする化合 物。