JPH04500668A - プラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト表面抗原の対立遺伝子変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト表面抗原の対立遺伝子変異体 いるサルワクチン化の研究によって示されている。１１６１−表面ラベル化の研 究（４，５）により同定された抗原はメロゾイト表面膜上に存在しているようで あるが、一方、免疫血清によって免疫沈澱させたこれら抗原の位置（６，８）は さらに微妙である。シゾント（分裂体）中で主に合成され、プロセッシングされ てシゾント成熟時にＭｒ８８．４２および１９ｋＤａのタンパク質（ｉｏ、　１ １）を生成するプラスモジウム・ファルシパルムの１つの高Ｍｒの抗原（９）は 、主メロゾイト表面抗原への前駆体である（ＰＭＭＳＡ　；ＭＳＡＩとも呼ばれ る）。

この群の抗原は、サイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ）サル中のマラリアにある程度の免 疫を与える（１２）。これらは、いくつかのプラスモジウム・ファルシパルム株 （９，１３−１５）およびプラスモジウム種（１６，１７）において記載されて いる。

国際特許Ｎｏ、ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２２７の明細書には無性血液段階のプラ スモジウム・ファルシパルムの第２のメロゾイト表面抗原が開示されており、こ れは以下を特徴と１．ている：（ｉ）約４１，０００〜５３．０００の範囲の相 対分子質量Ｍｒ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定）を有し；（ ｉｉ）ミリスチン酸と一体化した糖タンパク質であり；（ｉｉｉ）始めは拡散し た細胞質局在で存在し、成熟シゾントではメロゾイトの表面膜に局在し；そして （ｉｖ）インビトロで寄生生物の増殖を阻害する無性血液段階のＰ。

ファルシパルムに対するいくつかのモノクローナル抗体によって認識される。

この第２のメロゾイト表面抗原にはＧＹＭＳＳＡ、ＱＦ　１２２、Ｍｒ　４５， ０００Ｍ５ＡおよびＭＳＡ２の名称が付与されている。

本明細書においては、後者の名称をこの第２のメロゾイト表面抗原を指すのに用 いる。この抗原を発現するクローン（Ａｇ５１３）はＰ。

ファルシパルムのｃＤＮＡ配列を発現するλ−Ａ■ｐ３クローンのライブラリー から単離した。Ａｇ５］３のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列は、先の 特許の明細書に、Ａｇ５１３によってコードされている抗原の大きさおよび物理 的性質がＱＦ１２２のものと同一であるということを示す実験詳細、ＱＦ１２２ に対するモノクローナル抗体がＡｇ５１３と強く反応するが他のＰ、ファルシパ ルム抗原を発現するｃＤＮＡクローンとは反応しないというコロニー免疫検定に よって確認した結果と共に記載されている。

比較的大きいメロゾイト表面抗原ＰＭＭＳＡまたはＭＳＡＩは、一連の保存およ び可変ドメインからなる異なる単離体由来の対応するタンパク質によって大きな 抗原多様性を示すことがわかった。同様に、比較的小さいメロゾイト表面抗原Ｍ ＳＡ２も顕著な抗原多様性を示すことがわかった。

Ａｇ５１３のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列は、国際特許出願Ｎｏ、 ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２２７の図６に示されている［これに記載されている配 列はＰ、ファルシパルム単１１１体ＦｃＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）から導かれ たものである］。Ｐ、ファルシパルムの他の単離体でここに行った尚一層の配列 決定の研究によってＭＳＡ２の対立遺伝子変異が明らかになり、種々の単離体か ら導かれた配列はＮ−末端の４３アミノ酸およびＣ−末端の７３アミノ酸の領域 に高度な相同性を有していた。この研究によって、ＭＳＡ２の対立遺伝子変異体 に少なくとも２つの「族」が存在すること、および全ての変異体に共通する保存 領域由来のある種のペプチドが免疫原性であり、従って合成ペプチドワクチンの 基礎となりうることが確かめられた。

あらゆる合成ワクチンにおいて、免疫原に対する抗体は真正分子を認識し、かつ 保護を与えるために必要な生物学的性質を保持していなければならない。マラリ アは、ペプチドに基づくワクチンの研究に有用な系であることがわかった。スポ ロゾイト周囲のタンパク質の４アミノ酸サブユニツ）（ＮＡＮＰ）の種々大きさ の合成反復に対して生成させた抗体は、いくつかの検定系において天然タンパク 質と効率的に反応し、インビトロでスポロゾイトとその標的細胞の相互作用を阻 害し、そしてスポロゾイトの感染性を中和した（１９）。

同様に、血液段階抗原ＲＥＳＡ／Ｐｆ１５５のＣ−末端反復（ＥＥＮＶＥＨＤＡ ）に対し”で生成させた抗体は、天然タンパク質と反応すること、およびインビ トロで寄生生物の侵入を効率的に阻害することがわかった（２Ｇ）。最近になっ て、Ｐ　ａｔｔａｒｒｏｙｏら（２１）は、無性段階のＰ、ファルシパルムによ るチャレンジに対して一部ヒトを保護するようである担体不含の合成ペプチドに 基づくワクチンを調製した。これら研究者は、Ａ、　ｔｒｉｖｊｒａｔｕｓサル において部分的保護を誘導することが予め示されていたペプチドを使用した。ま た、ＲｉｃｈｍａｎオよＵ　Ｒｅｅｓｅ（２２）は、Ｐ、ファルシパルムの熱シ ョックタンパク質由来の担体不含のペプチドが天然タンパク質に対して反応性で ある抗体を生成させうろことを示した。

本発明によれば、Ｐ、ファルシパルムの一部のメロゾイト表面抗原であって、 （ｉ）約４１，０００〜５３，０００の範囲の相対分子質ｊ１Ｍｒ（ＳＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動で測定）を有し：そして（ｉｉ）保存されたＮ− 末端およびＣ−末端配列を有する複対立遺伝子形態のＭＳＡ２を含有すること を特徴とする抗原が提供される。

特に、本発明の抗原は、約１５残基の疎水性コアを有するシグナル配列を含むＮ −末端の４３アミノ酸配列、およびグリコジルホスファチジルイノ／トール膜ア ンカーの付着のためのシグナルであると推定される長さが約１７残基の第２の疎 水性の高い配列を含むＣ−末端の７４アミノ酸配列に高度の相同性（９０％以五 の相同性）を示す。本発明の抗原のさらに別の特徴は、長さ、数および順序が異 なっていることもある中心部に位置する反復配列の存在である。

また、本発明は、上に一般的に記述（７た少なくとも２つの対立遺伝子形態のＭ ＳＡ２またはその抗原性フラグメントを薬学的に許容し、うる担体または希釈剤 および所望によるアジュバン（・と共に含有するワクチン組成物、ならびに上に 一般的に記述したワクチン組成物を宿主に投与することからなるＰ、ファルシパ ルムに対して宿主を活性に免疫する方法をも包含するものである。

本発明に従う特にｆｒ要な抗原性フラグメントは、保存性のＮ−末端およびＣ− 末端領域由来の７ラグメントである。特に、これら領域由来のある種のペプチド が、Ｐ　ファルシパルムの異なる株からの無傷のＭＳ　Ａ　２を用いる免疫蛍光 または免疫ブロッティング分析で適切に反応する抗体を誘導することがわかった 。この態様においては、本発明は、無傷のＭＳＡ２を認識する抗体を誘導しうる 合成ペプチドであって、 （ｉ）　５ＮＴＦ　ＩＮＮＡ　（Ｅ７１）；（ｉｉ）ＱＨＧＨＭＨＧＳ　（Ｇ５ ）；および（ｉｉｉ）ＮＴＳＤＳＱＫＥ　（Ｇ１２）；からなる群から選ばれる アミノ酸配列またはその抗原として活性な部分からなるか、またはそれを含有す ることを特徴とするペプチドを提供するものである。

さらに、本発明は、無傷のＭＳＡ２を認識する抗体の産生を誘導するためのワク チン組成物であって、上に一般的に記述したような少なくとも１つの合成ペプチ ドを含有することを特徴とする組成物にも及ぶものである。このワクチン組成物 は、さらに薬学的に許容しうる担体または希釈剤および所望によるアジユバント を含有していてもよい。また、本発明は、上に記したワクチン組成物を宿主に投 与することからなる、無傷のＭＳＡ２を認識する抗体の産生を誘導することによ り宿主を活性に免疫する方法にも及ぶものである。

本発明のさらに別の態様においては、Ｆｅ１２、Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌまた はその他のＭ　Ｓ　Ａ　２の変異体に対する特異的な抗体を誘導しうる合成ペプ チドであって、ＭＳＡ２中の配列反復の１つに対応するアミノ酸配列からなるか もしくはそれを含有するか、または（ｉｖ）ＭＡＮＥＧＳＮＴ　（Ｅ８７）；（ ｖ）　ＡＮＥＧＳＮＴＮ　（Ｅ８８）：（■１）ＮＥＧＳＮＴＮＳ　（Ｅ８９） ；および（ｖｉｉ）ＳＳＥＮＰＮＨＮ　（Ｇ３４）；もしくは抗原として活性な その部分からなる群から選ばれることを特徴とするペプチドが提供される。

ＭＳＡ２の特異的な変異体に対する特異的な抗体反応を誘導するこれら合成ペプ チドは、単独で、またはＭＳＡ２の別の変異体に対する免疫応答を得るために本 明細書に記した他の任意の合成ペプチドとワクチン組成物中で組合せて用いるこ とができる。

本発明の合成ペプチドは、任意の適当な方法によって、例えば化学合成によって 、または周知の組換えＤＮＡ法を用いる適当な宿主細胞中での適当なヌクレオチ ド配列の発現によって製造することができる。

本発明の合成ペプチドの免疫原性を高めるために、これらをジフテリアトキソイ ド（ＤＴ）などの適当な担体タンパク質に結合させるか、またはコンジユゲート させてもよい。

一般的に言って、本発明に係るワクチン組成物は、本明細書中に一般的に記した ＭＳＡ２対立遺伝子変異体の異なる族由来の抗原またはその抗原性のフラグメン トを含有する複数成分ワクチンであってよい。別法では、このワクチン組成物は 、異なるＭＳＡ２対立遺伝子変異体に代表的な可変領域、または保存領域もしく はそのフラグメントに対応するｌまたはそれ以上の抗原性ペプチドを含有してい てよい。

また、本発明は、上に一般的に記したｌまたはそれ以上の対立遺伝子形態のＭＳ Ａ２の抗原性を有するポリペプチドまたはその抗原性のフラグメントとして発現 されつるヌクレオチド配列の全部または一部を含有する組換えＤＮＡ分子、また は該組換えＤＮＡ分子を含有する組換えクローニング媒体もしくはベクターまた は宿主細胞を包含するものである。適当な宿主細胞には、例えば細菌および酵母 が含まれるが、本発明は、例えば組換えワクシニアウィルスまたは組換えバキュ ロウィルスを用いて哺乳動物または昆虫セルライン中で発現させることにも及ぶ ものである。この態様においては、本発明は、該組換えＤＮＡ分子中に含まれる ヌクレオチド配列の全部または一部を発現させることにより製造される合成ポリ ペプチド、およびそのような合成ポリペプチドを少な（とも１つ含有するワクチ ン組成物にも及ぶものである。

本発明に導く研究において、対立遺伝子形態のＭＳＡ２の完全なヌクレオチド配 列はＰ、ファルシパルムの５つの単離体（Ｆ　Ｃ２７、Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　 １．３Ｄ７、ＭＡＤ７１およびＫｌ）から得た。また、ＭＳＡ２の２つの異なる 単離体を融合タンパク質および非融合タンパク質として大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 中で発現させ、発現されたタンパク質の免疫原性を証明した。

本発明のさらに別の特徴は、以下に挙げる実施例の詳細な説明によって明らかに なるであろう。

実施例Ｉ Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１．３Ｄ７、ＭＡＤ７１およびに１単離体中のＭＳＡ２ 遺伝子に対応するＤＮＡを、国際特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２２７ の図６に示されているＡｇ５１３（ＦＣ２７クローン）配列の最初と最後の３０ ヌクレオチドから導いたＤＮＡプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　 ＣＲ）法によって増幅した。次ＬＮで、増幅したＤ　Ｎ　Ａを既知方法による配 列分析にかけた。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、Ｔ　ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ （Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）から単離したＴａｑポリメラーゼを 用（飄、Ｓ　ａｉｋｉら（２４）の記載に基づいて行った。ＰＣＲプライマーと して用０たオリゴヌクレオチドは翻訳されたＦｅ１２　ＭＳＡ２遺伝子配列の最 初と最後の３０ヌクレオチド（ヌクレオチド９４−１２３および８５９−８８８ ）に対応しており、遺伝子を２５ＰＣＲサイクルで増幅した。この反応混合物は 、５０鳳Ｍ　ＫＣＩ、１０ｍＭトリスＣ１（ｐＨ８。

３）、ｌ　、　５　ａＭ　ＭｇＣ１＊、０．０１％（ｗ／ｖ−）ゼラチンの最終 審１５０μＣｉ、１１００ｎの全ゲノム寄生生物ＤＮＡ、１μＭのそれぞれのプ ライマー、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰを含有していた。

このＰＣＲ生成物をゲル精製し、適当なＭ１３ベクターに連結し、開示（２５） のように鎖成長停止法によって配列決定した。

また、既に開示されているようにして、ＰＣＨによって増幅したＤＮＡの試料を ニトロセルロース上にドツトプロットし、オリゴヌクレオチドプローブとハイブ リダイズさせた（２６）。この５°脱ホスホリル化したオリゴヌクレオチド（５ ０ｐＭ）プローブを、１５０μＣｉ［ｙ−”Ｐ］ＡＴＰ（＞５０００Ｃｉ　ｍモ ル−’　；　Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下にポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ■）とともにインキュベートすることによって 末端ラベルした。添付した図７のドツトプロット・ハイブリダイゼーシヨンに用 いたプローブは次のようである。プローブＡ：翻訳されたＦｅ１２　ＭＳＡ２対 立遺伝子の開始コドンを含む最初の３０塩基対（ｂｐ）に対応する５゛保存領域 プローブ。プローブＢ　：　Ｆｅ１２　ＭＳＡ２対立遺伝子の９６ｂｐ反復の最 初の２１ｂｐに対応するＦＣ２７反復に特異的なプローブ。プロ−ブＣ：　３Ｄ ７およびＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１のＭＳＡ２遺伝子由来の３Ｄ７／　Ｉ　ｎｄ ｏｃｈｉｎａ　１反復に特異的なプローブ（ＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧ ＧＴＡＧ）。

プローブＤ　：　３Ｄ７およびＩ　ｎｄｏｅｈｉｎａ　ｌのＭＳＡ２遺伝子中に は見い出されるがＦｅ１２のＭＳＡ２遺伝子中には見い出されない２０ｂｐ配列 に対応する３Ｄ７およびｒ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１反復と境界を接するプローブ （ＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣ）。プローブＥ：ＦＣ２７ＭＳＡ ２対立遺伝子の最後の３０ｂｐ（停止フドンを含む）に対応する３′保存領域の プローブ。添付した図８のハイブリダイゼーシコンに用いたプローブは次のよう である。プローブ１：Ｆｅ１２のＭＳＡ２遺伝子由来の反復特異的なプローブ（ ＡＴＣＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＣ）。プローブ２：　３　Ｄ　７　／　Ｉ　 ｎｄｏｃｈｉｎａ　ＩのＭＳＡ２遺伝子由来の反復特異的なプローブ（ＧＧＴＧ ＧＴＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧ）。プローブ３　：ＭＡＤ７１のＭＳＡ２遺 伝子由来の反復特異的なプローブ（ＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡ）。

結果を添付の図面に示［、た。これら図面は次の通りである。

図１は、Ｐ、ファルシパルムの３Ｄ７クローン化ラインのＭＳＡ２の、開始コド ンから停止コドンまでのヌクレオチド配列および翻訳されたポリペプチドを示す ものである。示されているように、２つの反復配列、即ち６回現れるＧＧＳＡＦ ｉ復、および塩基２８３で始まるトレオニン反復配列が存在する。

図２は、Ｐ、ファルシパルムのＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１ｆｌｌ［体の完全ナヌ クレオチド配列および翻訳されたポリペプチドを示すものである。ここでは、Ｇ ＧＳＡ反復の数は１２コピーまで広がり、比較的少数のトレオニン反復を含有し ている。

図３は、Ｐ、ファルシパルムのＭＡＤ７１単離体のＭＳＡ２の完全なヌクレオチ ド配列および翻訳されたポリペプチドを示すものであり、これは６回現れるＡ　 Ｇ　Ａ　Ｖ　Ａ　Ｇ　Ｓ　Ｇ反復配列を含んでいる。

図４は、Ｐ、ファルシパルムのに１単離体のＭＳＡ２の完全なヌクレオチド配列 および翻訳されたポリペプチドを示すものであり、１コピーの単離体ＦＣ２７の ＭＳＡ２中に見い出される３２アミノ酸の反復（国際特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／Ａ Ｕ８７１００２２７の図６を参照）、および４回現れるＴＴＴＥＳＮＳＲ３ＰＰ ！反復を含んでいる。

図５は、別種ＭＳＡ２ポリペプチドの推定アミノ酸配列を比較するものである。

図６は、３つのコンピューター調製の「対角線」ヌクレオチド配列比較を示すも のであり、それぞれは以下を示す：（ａ）３Ｄ７配列をそれ自体と比較するもの であり、上の方のブロックはＧＧＳＡ反復を示し、下の方のブロックはトレオニ ン反復を示す： （ｂ）　Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１配列をそれ自体と比較するものであり、ＧＧ ＳＡ反復の拡大、およびトレオニン残基の２次反復ブロックの減少を示している ； （Ｃ）　Ｉ　１ｄｏｃｈｉｎａ　ｌとＦＣ２７配列を比較するものであり、これ らの配列が５°および３゛末端にそれぞれ４３アミノ酸および７４アミノ酸の保 存領域を有していることを示す。

図７は、保存されたＮおよびＣ−末端配列、ＦＣ２７反復配列、３Ｄ７反復配列 および３Ｄ７反復境界配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを、インビトロ で長期培養したＰ、ファルシパルムの１４の異なる単離体由来のＤＮＡ（ポリメ ラーゼ連鎖反応で増幅）とハイブリダイズさせたときのドツトプロットの結果を まとめるものである。これらの結果は、複対立遺伝了形態のＭ　Ｓ　Ａ　２が存 在することを示している。また、この図面はこれら単離体の一部とモノクローナ ル抗体８Ｄ８８／７７．８Ｇ　１０／４８および８　Ｆ　６／４９（国際特許出 願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２２７を参照）との反応をも示している。これ らの抗体は、ＦＣ２７反復配列のプローブとハイブリダイズする単離体とのみ反 応する。

図８は、Ｆｅ１２．３Ｄ７およびＭＡＤ７ｉ反復配列に基づくオリゴヌクレオチ ドプローブを、インビトロ培養で最近樹立したＰ。

ファルシパルムの１６の単離体由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡとハイブリダイズさせた ときのドツトプロットの結果をまとめるものである。

ここでもこれらの結果は、異なる対立遺伝子形態のＭ　Ｓ　Ａ、　２が存在する こと、および全ての単離体が３種の異なる反復プローブの少なくとも１種と反応 することを示す。一部のＤＮＡ調製物は１以上のプローブと反応した。このこと は、混合感染（例えば、ＫＦ１９３１またはＫＦ１９３４）、または３Ｄ７とＭ ＡＤ７１反復型の間のＭＳＡ２配列中間体（例えば、ＫＦ１９０５）を示すもの であるのかＰ、ファルシパルムのＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ単離体のＭＳＡ２を 、Ｓ　ｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍのグルタチオンｓ−トランス フェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として大腸菌中で発現させた。発現構 築物は、ＭＳＡ２遺伝子の５ｓｐｌフラグメント（２７）を発現ベクターｐＧＥ Ｘ−３Ｘ　（２８）の５ＩＩｌａ１部位に連結することによって調製した。これ を行う際には、アミノ末端シグナル配列およびカルボキシ末端疎水性トメイノは 組換え分子から除外した。この融合タンパク質はＩ　ＰＴＧ誘導の大腸菌細胞の 可溶性分画中に局在化され、これをアフィニティークロマトグラフィーを用いて 細菌性タンパク質から単離した（２８）。Ｍ製したタンパク質は、図９に示した ように、Ｍｒ〜７０，０００の主の成分とＭｒ　〜４５．　ＯＯＯおよびＭｒ　 〜３０．　ＯＯＯの従の成分からなっていた。この図は、精製したＭ　Ｓ　Ａ、 　２融合タンパク質のクーマツシープルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを 示すものである（レーン１：分子量マーカー：レーン２：０．５μｇのＭＳＡ２ 融合タンパク質；レーン３：２μｇのＭＳＡ２融合タンパク質；レーン４：４μ ｇのＭＳＡ２融合タンパク質）。

全精製タンパク質の約９０％であると概算されるＭｒ〜７０，０００の成分は、 Ｍ　Ｓ　Ａ　２　（Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１単離体）およびグルタチオンＳ− ）ランスフェラーゼに対する抗体と反応し、従って、この成分はＧＳＴに融合し たＭＳＡ２遺伝子の５ｓｐｌフラグメントによってコードされているポリペプチ ドに対応しているものと結論される。

比較的小さいフラグメントはＭｒ〜７０．０００成分のタンパク質加水分解産物 である。

記載（２８）されているようにして、アフィニティー精製融合タンパク質を活性 化された因子Ｘで切断し、次いで逆相ＨＰＬＣで切断タンパク質を分離すること によって、この融合タンパク質のＭＳＡ２成分（図１０、レーン３）を単離した 。この切断して精製した産物（図１０、Ｌ／−ン２）はＳＤＳ　ＰＡＧＥでＭｒ ６０，０００の単一バンドとして移動した。この分子はＭＳＡ２に対する抗体と は反応するが、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼに対する抗体とは反応しな い。この成分の実体の明確な証明を、Ａ　ｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ気相タンパク質配列決定機Ｍｏｄｅｌ　４７０　Ａを用い、製造元の指示に従 って１２０Ａ　ＰＴＡ分析機を用い、精製抗原のＮ−末端のアミノ酸配列を測定 することによって得た。得られた配列は次のようであった： ＧＩＰＩＫＮＥＳＫＹＳＮＴＦＩＮＮ。

これは、ベクター（２８）の因子Ｘ切断部位の後の最初の３個のアミノ酸、およ び図２のヌクレオチド５８−６０によってコードされているインロイシンで始ま るＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ株のＭＳＡ２の１４個の連続したアミノ酸を示している 。また、切断して精製し、たタンパク質についてアミノ酸分析を行った。製造元 の指示に従ってＷａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ−Ｔａｇアミノ酸分析システムを用いて これを測定した。測定した組成は、実験誤差の範囲内でアミノ酸配列から予想さ れる組成と一致した。

「天然に近い」非融合形態のＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ単離体のＭＳＡ２を発現 させるために、完全長の遺伝子をｐＫ　Ｋ　２２３°／　３　（２８ｃ）中にサ ブクローンし、Ｉ　ＰＴＧ誘導した大腸菌細胞中で発現させた。翻訳はＭＳＡ２ のＡＵＧから開始させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥに続くウェスタン分析は、この産物 がＭｒ４６，０００および５０，０００の２つのバンドで現れ、ＰＮＧマラリア 免疫個体由来の血清と反応することを示した。このことは、図９ａのオートラジ オグラフに示されている。この図でレーン１はＩ　ＰＴＧ誘導の細胞を表し、レ ーン２は誘導していない細胞を表し、そしてレーン３は１４Ｃラベルした大きさ の標準を表す（２つのバンドを矢印で示す）。

また、ベクターとしてｐＧ　Ｅ　Ｘ　−２Ｔ　（２ｇ）を用い、同様の方法を用 いて、単１？１体ＦＣ２７由来のＭＳＡ２遺伝子の５ｓｐｌフラグメントをＧＳ Ｔ融合タンパク質として大腸菌中で発現させ、アフィニティークロマトグラフィ ーによって単離した。精製した融合タンパク質をトロンビンで切断した後にＭＳ Ａ２成分を単離した。また、Ｐ。

ファルシパルムのＦＣ２７株由来のＭＳＡ２も非融合タンパク質として大腸菌中 で発現させた。Ａｇ５１３　（２５）の６６６ｂｐの５ｓｐＩフラグメントを単 離し、バクテリオファージＴ４の遺伝子３２タンパク質の５°および３°調節配 列（ＡＴＧを含む）を含有するベクターｐＲＤ　Ｂ　Ｓ　（２８ａ）の５ｓａＩ 部位に挿入して、ＭＳＡ２遺伝子の暗号配列がｐＲＤ　Ｂ　ｇ中の遺伝子３２タ ンパク質遺伝子のＡＴＧとフレーム内になるようにした。得られたプラスミドを Ｃ１ａＩおよびＤｒａｌで順次消化した。ＭＳＡ２配列の５ｓｐｌフラグメント と境界を接している遺伝子３２タンパク質遺伝子の５′および３゛領域を含有す る９２２ｂｐのフラグメントを単離し、ｐＬ　Ｋ　５７　（２８ｂ）の唯一の５ ｓａＩ部位にサブクローンした。次いで、発現のためにこのプラスミドを大腸菌 細胞に導入した。このプラスミド−宿主の組合せをＢＴＡ　１８９３と命名し、 発現された抗原をＡｇ１６０９と命名した。

イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣを組合せて用いてＡｇ１６０ ９を大腸菌タンパク質から精製した。この分子は、ＳＤＳ　Ｐへ〇ＥでＭｒ５０ ，０００の単一バンドとして移動しく図１０、レーン４）、ウェスタンプロット 分析でＭＳＡ２に対する抗体と免疫反応性であった。発現されたＩ　ｎｄｏｃｈ ｉｎａ　Ｉ　Ｍ　Ｓ　Ａ　２　分子と同じようにして、Ｎ−末端アミノ酸配列分 析を行い、次の配列を得た： ＸＸＸＸＸＸＸＸ５ＸＸＩＫＮＥＳＫＹ［配列中、Ｘはアミノ酸を信頼して特定 することができない位置を示すコ。

しかし、Ａｇ１６０９の最初の１１アミノ酸はクローニングベクターから導かれ るものと予想された。次の７アミノ酸は先に記載（２５）されているＦｅ１２の ＭＳＡ２配列中の適切な７アミノ酸に一致する。また、アミノ酸分析によって、 組換えタンパク質の組成がＦｅ１２のＭＳΔ２に予想されるものであることを確 認した。

さらに、単離体ＦＣ２７由来のＭＳＡ２遺伝子の保存Ｃ−末端領域（参照文献２ ５の図３中のヌクレオチド６６１−８８５）をｐＧＥＸ−２Ｔ中で発現させ、ア フィニティークロマトグラフィーによって単離した。初めにこのヌクレオチド配 列を、付加されるＢａ■Ｈｌリンカ−とともに、ブライマーオリゴヌクレオチド としてＡＡＧＧＡ丁ＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣおよ びＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡを用いるＰＣＨ によってＦＣ２７ゲノムＤＮＡから増幅した。この増幅ＤＮＡは、そのＮ−末端 残基を突然変異してアラニンをメチオニンに置換したことを除き、ＭＳＡ２の全 ７４アミノ酸保存領域を含有していた。このＤＮＡをゲル精製し、ＢａｍＨＩで 消化し、ＢａｍＨＩ切断したｐＧＥＸ−２７ベクターに連結した。

実施例３ Ｍ５Ａ２−ＧＳＴ融合タンパク質（Ｆ　Ｃ２７およびＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ の両形態）および非融合タンパク質としてのＦｅ１２のＭＳＡ２（Ａｇ１６０９ ）の免疫原性をウサギにおいて試験した。抗原としてＡｇ１６０９（これは、Ｆ Ｃ２７０ＭＳＡ２で免疫したウサギの全反応、およびＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ のＭＳＡ２で免疫したウサギの不変領域への反応を測定する）およびウシ血清ア ルブミンに結合させた合成ペプチド（ＧＧＳＡ）ｓ（これは、Ｉ　ｎｄｏｃｈｉ ｎａ　ｌのＭＳＡ２で免疫したウサギの反復特異的な反応を測定する）を用い、 ＥＬＩＳＡによって抗体の反応を測定した。モノホスホリル脂質Ａ／Ｂ　ＣＧ細 胞壁骨格／スクアレン（ＲＩＢＩ）およびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ ）をアジュバントとして用いた。この結果を図１１〜図１３に示す。

ＭＳＡ２のＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ型に対する最も良好な反応はＦＣＡをアジ ュバントとして用いたときに得られた（図１１および図１２）：良好な反応がＡ ｇ１６０９に対して検出され（血清の１＋１０．ＯＯＯ希釈で）、ＧＧＳＡ反復 配列に対して高い反応（１：１００．０００）が検出された（図１２）。ＲＩＢ Ｉを用いると、Ａｇ１６０９に対して測定される反応はＦＣＡを用いて得られる 反応のおよそ半分であった。対照的に、ＧＧＳＡペプチドに対して測定される反 応はＦＣＡを用いて得られる反応に比べると極めて低い（約３０倍異なる）もの であり、１：１０００を越える血清希釈においては容易に検出することができな かった。

ＭＳＡ２のＦｅ１２型の両度異型による良好な反応はＦＣＡによって得られ、１ ：１００．ＯＯＯ希釈の血清で検出された（図１３のＡｇ１６０９のデータ）。

ＲＩＢＩを用いると、Ａｇ１６０９に対する反応は一部のウサギについてＦＣＡ を用いて得られる反応よりも低いが、それでも１：１０．ＯＯＯ希釈では全ての ウサギにおいて検出可能であり、１：１００，０００では４動物のうちの２動物 で検出可能であった。

Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ配列のＮ−末端不変領域由来の４１オクタペプチド（ Ｅシリーズ：Ｅ６５〜Ｅ１０４．）ならびにＣ−末端不変領域由来の２７オクタ ペプチドおよび可変領域由来の１０ペプチド（Ｇシリーズ：６１〜Ｇ２７　：Ｇ ２８〜Ｇ３７）を、ベンズヒドリルアミン樹脂（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　５ｙｓｔｅａａｓ）上で誘導体化（ｔＢＯｃ）アミノ酸（ＯＩＩｌｎｉＢ ｉｏｃｈｅａｉｃａｌｇ）を用いるＨ　ｏｕｇｈｔｏｎ（２９）が初めて開示し た同時複数ペプチド合成法を用いて合成した。

免疫原性試験に用いるペプチド配列 ＦＣ２７単離体（Ｆｅ１２）およびＩ　ｎｄｏｅｈｉｎａ　１単離体（Ｉ　Ｃ） 由来のＭＳＡ２の配列を１文字アミノ酸コードを用いて図１４に示す。

配列の開始部分の小文字は成熟タンパク質において切断される共通のＮ−末端リ ーダー配列を示し、一方、配列の最後の小文字は膜においてアシル化されてアン カーされたときに成熟タンパク質から切断されると考えられている共通のアシル 化部位配列の一部を示す。

成熟タンパク質の推定のアミノ酸配列を大文字で表す。配列の陰影を付けた部分 は、重複ペプチドまたは単離ペプチドを合成して免疫原性試験のために担持タン パク質（ＤＴ）に結合させた領域を示す。

Ｎ−末端ペプチド（Ｅシリーズ）は、示されているように一度に１個の残基でず らし、ＦＣ２７配列の可変領域に伸長させた。Ｃ−末端ペプチド（Ｇシリーズ） は、一度に２個の残基でずらし、共通の切断アシル化領域に伸長させた。また、 陰影を付けて表示した単離ペプチドはＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ配列の可変領域から 選択した。ＦＣ２７配列は阻害性のＭａｂ８　Ｇ　１０／　４８および９Ｅ３／ ４８（国際特許出願Ｎｏ。

ＰＣＴ／ＡＵ　８７１００２２７を参照）によって認識される２コピーの５ＴＮ Ｓエピトープ（閉込められている）を含有しているが、■ｎｄｏｃｈｉｎａ　１ 配列は含有していない。

ペプチドの切断および抽出 ペプチド樹脂バッグ（それぞれのバッグは最初は１００ｍｇのベンズヒドリルア ミン樹脂を含む）のそれぞれからの切断を、複数ＨＦ切断集合装置（Ｍｕｌｔｉ ｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ）において、無水ＨＦ：アニソール： チオアニソール：ジメチルスルフィド（７：Ｑ、　５　：Ｑ、　５　：２）を用 いて０°Ｃで１時間行った。次いで、この混合物を真空乾燥し、バッグを冷無水 エーテルで洗浄し、１０％酢酸で抽出し、粗製のペプチドを凍結乾燥した。粗製 ペプチド（６０〜８５％の線間）の収量は平均で３０ｍｇであった。

ペプチドの精製 粗製の合成ペプチドを２０１Ｍジチオトレイトール含有の５％ア七トニトリルに 溶解し、対イオンとして０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニト リル勾配を用いる逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製し、た。

担体夕と、バク質へのペプチドの力・１ブリング付加されたＮ−末端システィン を含んでペプチドを合成して担体タンパク質へのカップリングを容易にし、ヘテ ロ２官能性試薬マレインイミドカプロイルオ牛シスクシンイミド（ＭＣＳ）を用 いてＤＴにカップリングさせた。高純度のＤＴをＣｏｍａ＋ｏｎｖｅａｌｔｈ　 Ｓ　ｅｒｕｍＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、　Ａｕ５ｔｒ ａｌｉａ）から入手し、Ｌｅｅら（３０）が記載している方法を用いてＭＣ５で 誘導体化した。ＭＣ３活性化したＤＴタンパク質の溶液を、担体中のマレインイ ミド基のモル当量の１．４倍に等しい量の乾燥して精製して完全に還元したペプ チドに直接加え、Ｎ、下、室諷で一晩、ゆっ（りと撹拌した。次いで、このコン ジュゲートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対してこれを数回交換して透析した 。このコンジュゲート度を、消去式Ｅ　１ｅａｎｓ法（３１）を用いてペプチド との反応の前後にマレインイミド基を滴定することにより測定した。また、同じ 化学を用いてペプチドをウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）にコンジユゲートさ せた。

また、この両方において、担体タンパク質それ自体との比較におい゛ＣＣ担体タ ンバクーベブチド付加体の見掛は分子量の増加を観察することによって（ＳＤＳ ／ＰＡＧＥ　８％ゲル）、カップリング度をモニターした（３２）。ＥおよびＧ 系列の両ペプチドに対して、ペプチドの担体タンパク質に対する見掛はモル比は 、ＤＴ付加体については７〜１ｏの範囲であり、ＢＳＡ付加体については８〜１ １の範囲であった。

ペプチド−ジフテリアトキソイドコンジュゲートによる免疫６〜７週齢の雌性Ｂ ａ１ｂ：／ｃマウスから前以て採血し、次いでＦＣＡエマルシロン中のペプチド −ＤＴコンジュゲートを注射あたり２０μｇペプチドで腹腔内投与して免疫した 。１力月後、動物に不完全フロインドアジ５バントとともに第２の注射を行った 。最後の注射の２週間後に、動物から採血し、その血清を５６°Ｃで１時間加熱 することによって不活性化した。免疫学的分析を行う前に、不活性化した血清を ５％ミルク粉末のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で連続的に希釈した。

抗体の滴定 平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｇ＋ｕｎｏｌｏｎ−ＤｙｎａＬｅｃｈ）のウェル を、ペプチド−ＢＳＡ付加体の５μｇ／ｍｌ溶液で一晩被覆し、ＰＢＳ中に５％ スキムミルク粉末を含む溶液でプロ・２りし、ＰＢＳですすぎ、次いで免疫前の 血清、または５％ミルク粉末のＰＢＳで連続希釈した対応するペプチド−ＤＴコ ンジュゲートで免疫したマウス由来の血清のどちらかと共にインキユベートした 。ＰＢＳでさらにすすいだ後に、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート させた抗−マウスグロブリンおよび基質２，２′−アジノージ（３−エチルベン ズチアジンンスルホネー））（ＡＢＴＳ）を、製造元の指示（Ａｓｅｒｓｈａｓ 。

Ｕ、　Ｋ、　）に従うて連続して加えた。０および３０分に自動マイクロプレー トリーダーを用いて４１０ｎ＠での吸収を直接測定した。対照のプレートは、擬 カップリングＢＳＡ、即ちペプチドを添加せずにＭＣ８と反応させ、β−メルカ プトエタノールでブロックしたＢＳＡで被覆した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング寄生生物処理した赤血球を洗浄し、 １％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で可溶化した。プロテアーゼ阻害物質を加えた（ ペプスタチン、ロイペプチン、キモスタチンおよびアンチパインをそれぞれ５μ ｇ／ｉ＋１）。

Ｌａｅｍｍｌｉの方法（３３）に従って、デタージェント可溶性のタンパク質を ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。分離の後、寄生生物タンパク質を 電気泳動によってニトロセルロース紙に移し、Ｔｏｗｂｉｎらの方法（３４）に 従って、マウス抗体およびＩｔ５ｉ−ラベルしたヤギ抗−マウス抗体と、または ウサギ抗血清およびｌ！Ｓｉ−ラベルしたプロティンＡと免疫反応させた。

図１５（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、Ｉ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　ｌ　Ｍ　Ｓ　Ａ 　２の保存Ｎ−末端領域［Ｅシリーズ、図１５　（ａ）］、Ｃ−末端領域［Ｇシ リーズ、図１５　（ｂ）］および可変領域［Ｇシリーズ、図１５（ｃ）］由来の ペプチドに対する抗−ペプチド力価を示すものである。結果は、相同なペプチド −ＢＳＡ付加体をプレート被覆抗原として用い、このプレートを表示した希釈度 で抗血清とインキュベートしたときの固相ＥＬＩＳＡ検定における４１０ｎｍで の吸収で表す。ペプチドの大部分は、このプロトコールを用いてＢａ１ｂ／ｃマ ウスに供すると免疫原性が高い。しかし、ＥＬＩεＡにより担体タンパク質（Ｄ Ｔ）単独に対して試験したときに、全ての被験血清が高（１／１０’）力価の抗 −ＤＴ抗体を有していたので、免疫に用いたペプチドそれ自体の配列に関係して いると考えられる顕著な反応の変化が存在する。この抗−Ｄ　Ｔ反応は、幾分可 変性ではあるが、抗−ペプチド反応とは関係してい図１６は、Ｎ−末１Ｍ５Ａ２ ペプチド（Ｅシリーズ）由来の血清を擬カップリングＢＳＡ（即ち、ＢＳＡ−Ｍ Ｃ３）に対して試験したときの抗体力価（１０１血清希釈におけるＡ　４１　（ １で表す）を示すものである。明らかに、ペプチド−ＤＴ付加体の一部は極めて 高い抗−リンカ−抗体を誘導した。この抗−ＢＳＡ−ＭＣＳ反応は、ペプチド− ＤＴフンジコゲートのリンカ−領域に類似するチオスクシンイミドカプロイルア ミド（ＴＳＣ）と共に血清をプレインキコベートすることによって阻害すること ができた。Ｅシリーズのペプチドについては、抗−ペプチド量と抗−リンカ−反 応の間に存意の関係は存在しなかった（Ｐ＝０．５３）。

適当な免疫蛍光を誘導するＭＳＡ２ペプチド図１７は、アセトン固定したシゾン トとインキュベートしたときにメロゾイト表面反応抗体を誘導する、被研究ペプ チドーＤＴコンジ１ゲートを示すものである。試験を行った不変領域ペプチドの 中で、Ｎ−末端部分由来のペプチドＥ７１ならびにＣ−末端部分由来のペプチド Ｇ５、Ｇ７、Ｇ１２およびＧ２１だけが、Ｆｅ１２およびＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ 　１の両寄生生物に対する表面反応性抗体を誘導した。ペプチドＥ８７．８８お よび８９はＦＣ２７寄生生物のみに対する■ＦＡポジティブ抗体を誘導し、一方 、ペプチドＧ２８およびＧ３４はｔ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１寄生生物のみに対す る抗体を誘導した。

適当な免疫プロッティング反応を誘導するＭＳＡ２ペプチドＭＳＡ２のＮ−およ びＣ−末端不変領域由来のペプチドＥ７１、Ｇ５およびＧ１２だけが、Ｆｅ１２ およびｒ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１の両寄生生物由来のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分離して ウェスタン・プロットしたＵＳＡ７はＦｅ１２とのみ反応する抗体を誘導し、一 方、ペプチドＧ３４はＩ　ｎｄｏｃｈｉｎａ　１のＵＳＡ２とのみ反応する抗体 を生成した。また、Ｅ７１、Ｇ５およびＧ１２を接種した動物由来の血清は、大 腸菌において産生させた組換え完全長ＦＣ２７ＵＳＡ２に対してポジティブな免 疫プロ・ノティング反応を与えた。図１８は、ＵＳＡ２　ペプチド＝ＤＴコンジ ュゲートを接種することによって誘導した血清が示す免疫プロッティングパター ンを示すものである：（ａ）Ｓ　Ｄ　Ｓ／　Ｐ　ＡＧ　Ｅで分離したＦＣ２７抽 出物に対してプローブした； （ｂ）ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離したｒ　ｎｄｏｃｈｉｎａ抽出物に対してプロー ブした。

レーン１：Ｅ７１接種体の血清の１／１００希釈；レーン２：Ｇ５接種体の血清 の１／１００希釈；レーン３：Ｇ１２接種体の血清の１／１００希釈；レーン４ ：Ｇ３４接種体の血清の１／１０−０希釈：レーン５：阻害性のＭａｂ　８Ｇ　 １０／　４８上清；およびレーン６　：　Ｅ７１接種体の前採血。

参照文献 １　、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　ｃ、　Ｈ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｇ、＾、　＋　 Ｌａｎｇｈｏｒｎ、　Ｊ、およびＣｏｈｅｎ、　Ｓ。

（１９７７）　Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２８．２７６−２７９ ゜２　、　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　Ｇ、　Ｈ，、Ｒｉｃｈａｒｄｓ、　１．　Ｈ， 、Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｇ、　Ａ、およびＣｏｈｅｎ、　Ｓ。

（１９７７）聾胚君！、　ｔ３３ｓ−ｔ３ａｇ。

３、５ｉｄｄｉｑｕｉ、１１．Ａ、　（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９７， ３８８−３８９゜４、　Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｒ，Ｒ，およびＢｏｌｄｅｒ、Ａ、Ａ 、　（１９８３）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５８゜１６４７−１６５３゜ ５　、　Ｈｅ１ｄｒｉｃｈ、　Ｈ，Ｇ、　ｒ　５ｔｒｙｃｈ＋　ｗ、およびＭｒ ｅｍａ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｋ、　（１９８３）Ｚ、　Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ　６ ９．７１５−７２５゜６　、　Ｒｅｅｓｅ、　Ｒ，Ｔ、　＋　Ｍｏｔｙ　Ｌ　Ｍ 、　Ｒ，およびＨｏｆｅｒ−１１ａｒｂｉｎｅｋ、Ｒ，（１９８１）Ａ１．Ｊ、 Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｈｙｇ、３０．１１６８−１１７８゜７　、　Ｐｅｒｒｉｎ ＋　Ｌ、　Ｈ，ｒ　Ｄａｙａｌ、　Ｒ，およびＲｅ１ｄｅｒ、　Ｈ，（１９８１ ）Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｔｒｏｐ、Ｍｅｄ、Ｔｌｙｇ、　７５，１６３−１ ６５０８　、　Ｈｏｖａｒｄ、　Ｒ，Ｆ、およびＲｅｅｓｅ、Ｒ，Ｔ、　（１９ ８４）　Ｍｏ１ｅｃ、ＢｉｏｃｈｅｔＰａｒａｓｉｔｏｌ、１０，３１９−３３ ４゜Ｒｉｖｅｒｃｏｓ−Ｍｏｒｅｎｏ、　Ｖ、　、　Ｎ１ｃｈｏｌｌｓ、　Ｓ、 　Ｃ，＋　Ｈｉｌｌｍａｎ、　Ｙ、　＋　Ｄａｖｅｙ＋　Ｌ、　r、　＋ Ｔｉｚａｒｄ、　ｋｌｌ几、　Ｖ、　、　Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｒ，Ｔ、およびＦ ｒｅｅｍａｎ、　Ｒ，Ｒ，（１９８５）６２４−６２９゜ １１、　Ｌｙｏｎ＋Ｊ、Ａ、、Ｇｅ１ｌｅｒ、Ｒ，■、、　Ｈａｙｎｅｓ、　Ｊ 、　Ｄ、　＋　Ｃｈｕｌａｙ、　Ｊ、　Ｄ、および１ｅｂｅｒ、　Ｊ、　Ｌ、　 （１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　 ８３．２９８９−２９９３゜１２、　Ｐｅｒｒｉｎ、Ｌ、Ｈ，、Ｍｅｒｋｌｉ、 Ｂ、ルｏｃｂｅ、　ｋｌｌ、　Ｃｈｉｚｚｏｌｉｎｉ、　ｃ、　、　Ｓｍａｒｔ 、　Ｊ。

およびＲｉｃｈｌｅ、Ｒ，（１９８４）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６０，４４ １−４５Ｌ。

１３、Ｍａｃｋａｙ、　Ｍ、　、　Ｇｏｍａｎ、　Ｍ、　、　Ｂｏｎｅ、　Ｎ、 　＋　ＴＪｙｄｅ、　Ｊ、　Ｅ、　、　５ｃａｉｆｅ、　ＪA　、　Ｃｅｒｔａ 、　Ｕ、　＊ Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，およびＢｕｊａｒｄ、Ｈ，（１９８５）　Ｅｍ ｂｏ、Ｊ、　４．３８２３−３８２９゜１４、　ＭｃＢｒｉｄｅ、　Ｊ、　Ｓ、 　、　Ｎｅｗｂｏｌｄ、　Ｃ，１，およびＡｎａｎｄ、　Ｒ，（１９８５）ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６１．１６０−１８０゜Ｉｓ、　ｆｅｂｅｒ、　Ｊ、　 Ｌ、　、　Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ、　ｔ　Ｍ、およびＬｙｏｎ、　Ｊ、　Ａ、　（ １９８６）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．３３１１−３３２３゜１６． 　Ｈｏ１ｄｅｒ、　Ａ、　Ａ、およびＦｒｅｅｍａｎ、　Ｒ，Ｒ，（１９８１） 　Ｎａｔｕｒｅ　２９４．３６１−３６４゜１７、Ｅｐｓｔｅｉｎ、　Ｎ、　ｒ 　Ｍｉｌｌｅｒ、　ｔ、、　Ｈ，、Ｋａｕｓｈｅｌ、　Ｄ、　Ｃ，、Ｕｄｅｉｎ ｙａ、　１．　Ｊ、　。

Ｒｅｎｅｒ、　Ｊ、　、　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｒ，ｒ　Ａｓｏｆｓｋｙ、　Ｉｉ、 　、　Ａｉｋａｖａ＋　１およびＨｅ５ｓ、　Ｒ几、（１９８１）　Ｊ、Ｉａ＋ ｍｕｎｏ１．　Ｌ２７，２１２−２１７゜１８、Ｋ１１ｅｊｉａｎ、＾、　（１ ９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７７ 、３６９５−３６９９K １９、　Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ａ、ら（Ｉｉ７）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ２ｇ、２５７−２５９゜２０、　Ｂｅｒｚｉｎｓ＋に、ら（１９８６）　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＩＪｓ＾）　８３．１０６５−１ ０６９゜ ２１、　Ｐａｔｔａｒｒｏｙｏ、ｔＥら（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　３３２． １５ｇ−１６１゜２２、　Ｒｉｃｈ＋＋ａｎ、Ｓ、Ｊ、およびＲｅｅｓｅ、Ｒ， Ｔ、　（Ｉｉ８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ。

（ＵＳＡ）　８５．１６６２−１６６６゜２３、　５ａｕｌ、Ａ、ら、”Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅ１ｏ ｐｔｎｅｎｔ″中、　Ａｌａｎ　ｌ＋ｉｓｓ　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＣ印 刷中）。

２４、５ａｉｋｉ、　Ｒ，ら（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｓ　２３０，１３５０ −１３５４゜２５、　Ｓｍｙｔｈｅ、　Ｊ、　Ａ、ら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８５．５１９５−５１９９ ゜ ２６、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｍ、　Ｇ、ら（１９８ｇ）　ｏｌ、ｃｅｌｌ　Ｂ ｉｏｌ、　８．２６６４−２６６７゜２７、　Ｓａ＋ｙｔｈｅ、　Ｊ、ら（１９ ８９）　”Ｖａｃｃｉｎｅｓ　’８９’中、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＵＳＡ。

２８、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、　Ｂ、およびＪｏｈｎｓｏｎ、に、Ｓ、　（１９８ ８）　Ｇｅｎｅ　６７．３１−４０゜２８ｃ、　Ｂｒｏｓ　ｉｕｇ、　Ｊ、およ び）Ｉｏｌｙ、Ａ、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅ　 ｉ、　ＵＳＡ８１、６９２９゜ ２９゜Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｒ，Ａ、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８２．５１３１−５１３５゜ ３０、　Ｌｅｅ、　Ａ、　Ｃ，Ｌ、ら（１９８０）　Ｍｏ！、　１ｍｍｕｎｏ１ ．　’　１７．７４９−７５６゜３１、５ｅｄｌａｅｋ、　Ｊ、およびＬｉｎｄ ｓａｙ、Ｒ，ｆｌ、　（１９６ｇ）＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５゜１９２ −２０５゜ ３２、　Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｌ、ら、　ｊ、　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ（印刷中）。

３３、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｊ、に、（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） 　２２７，６８０−６８５゜３４、　Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，ら（］９７９）　Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（１；ＳＡ）　７８．４３５０− ４３５４K （以下、余白） ５ＵＢＳＴ汀υＴＥ　５Ｈｆｆｌｌ：ＴＰａｔｏＡ（ｔｏ　＋−＊＋＊　−−− 平稙′１４′−）′Ｏ−７“ ＤＬｋ　ｔ、ｙｏｒｈｍ　ｖ−６４嬢 国際調査報告 Ｉｎ＋＊ｒｐ＠τ＋＋ｅｅａｌ　ＡＩＢ＋’　−ｕｉｏｎ　ｈａ、ｐＬ：’ｆｉ ｇ　６６沖竿

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して約４１，０００ 〜５３，０００の範囲の相対分子質量Ｍｒを有し；そして（ｉｉ）保存されたＮ −末端およびＣ−末端配列を有する複対立遺伝子形態のＭＳＡ２を含有する； ことを特徴とする群から選ばれるプラスモジウム・ファルシパルムのメロゾイト 表面抗原またはその抗原性フラグメント。
2. ２．図１、図２、図３もしくは図４に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記 載の抗原またはその抗原性フラグメント。
3. ３．請求項１もしくは請求項２に記載の抗原またはその抗原性フラグメント、お よび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含有するワクチン組成物。
4. ４．少なくとも２種類の対立遺伝子形態のＭＳＡ２またはその抗原性フラグメン トを含有する請求項３に記載のワクチン組成物。
5. ５．抗原性フラグメントまたはフラグメント群が、保存されたＮ−末端および／ またはＣ−末端領域を含有するか、またはそれから導かれる請求項３または請求 項４に記載のワクチン組成物。
6. ６．アジュバントをさらに含有する請求項３に記載のワクチン組成物。
7. ７．請求項３に記載のワクチン組成物を宿主に投与することからなるプラスモジ ウム・ファルシパルムに対して宿主を活性に免疫する方法。
8. ８．請求項１もしくは請求項２に記載の抗原またはその抗原性フラグメントの抗 原性を有するポリペプチドとして発現されうるヌクレオチド配列の全部または一 部を含有する組換えＤＮＡ分子、または該組換えＤＮＡ分子を含有する組換えク ローニング媒体もしくはベクターまたは宿主細胞。
9. ９．請求項８に記載のヌクレオチド配列の全部または一部の発現によって製造さ れる合成ポリペプチド。
10. １０．請求項９に記載の合成ポリペプチド、および薬学的に許容しうる担体また は希釈剤を含有するワクチン組成物。
11. １１．請求項１０に記載のワクチン組成物を宿主に投与することからなるプラス モジウム・ファルシパルムに対して宿主を活性に免疫する方法。
12. １２．（ｉ）ＳＮＴＦＩＮＮＡ； （ｉｉ）ＱＨＧＨＭＨＧＳ；および （ｉｉｉ）ＮＴＳＤＳＱＫＥ； からなる群から選ばれるアミノ酸配列または抗原として活性なその一部からなる か、またはそれを含有することを特徴とする、プラスモジウム・ファルシパルム の無傷のＭＳＡ２を認識する抗体を誘導することができる合成ペプチド。
13. １３．ＭＳＡ２中の反復配列の１つに対応するアミノ酸配列、または （ｉｖ）ＭＡＮＥＧＳＮＴ； （ｖ）ＡＮＥＧＳＮＴＮ； （ｖｉ）ＮＥＧＳＮＴＮＳ；および （ｖｉｉ）ＳＳＥＮＰＮＨＮ； からなる群から選ばれるアミノ酸配列、または抗原として活性なその一部からな るか、またはそれを含有することを特徴とする、プラスモジウム・ファルシパル ムのＭＳＡ２のＦＣ２７、Ｉｎｄｏｃｈｉｎａｌまたは他の変異体に対する特異 的な抗体を誘導することができる合成ペプチド。
14. １４．請求項１２または請求項１３に記載の合成ペプチドの少なくとも１つ、お よび薬学的に許容しうる担体または希釈剤を含有するワクチン組成物。
15. １５．合成ペプチドの少なくとも１つが担体タンパク質に結合しているか、また はコンジュゲートしている請求項１４に記載のワクチン組成物。
16. １６．担体タンパク質がジフテリアトキソイドである請求項１５に記載のワクチ ン組成物。
17. １７．アジュバントをさらに含有している請求項１４または請求項１５に記載の ワクチン組成物。
18. １８．請求項１４に記載のワクチン組成物を宿主に投与することからなるプラス モジウム・ファルシパルムに対して宿主を活性に免疫する方法。