JPH04500683A - メタロプロテイナーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４９厘核スル真核宿主における請求項１２に記載のＤＮＡ配列の発現のポリペ プチド産物。 １５、メタロプロティナーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーション及び生物 学的特性を有するポリペプチドの反核又は真核宿主発現をコードする精製単離さ れたＤＮＡ配列。 １６、請求項１５に記載のｃＤＮ＾ＤＮＡ配列、請求項１５に記載のゲノムＤＮ Ａ配列。 １８、　ＤＮＡ配列がヒトメタロブロティナーゼ阻害物質を特徴とする請求項１ ５に記載のＤＮＡ配列。 １９、大腸菌細胞中での発現にとって好ましい１つ以上のコドンを含む請求項１ ８に記載のＤＮＡ配列。 ２０、第２図に示した配列を有する請求項１５に記載のＤＮＡ配列。 ２１、酵母細胞中での発現にとって好ましい１つ以上のコドンを含む請求項１５ に記載のＤＮＡ配列。 ２２、検出可能な標識物質と共有結合する請求項１５に記載のＤＮＡ配列。 ２３、天然のメタロプロティナーゼ阻害物質のポリペプチドフラグメント又はポ リペプチド類縁体をコードするＤＮＡ配列。 ２４、メチオニルメタロブロティナーゼ阻害物質を特徴とする請求項２３に記載 のＤＮＡ配列。 ２５、請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含む生物学的に機能するプラスミド又は ウィルスＤＮＡベクター。 ２６、請求項２５に記載のＤＮＡベクターで安定的に形質転換又はトランスフェ クションした原核又は真核宿主細胞。 ２７、請求項１５に記載のＤＮＡ配列の原核又は真核宿主細胞における発現のポ リペプチド産物。 ２８、第２図に示したアミノ酸配列の一部分又は全部を有し且つ天然のメタロプ ロテイナーゼ阻！物質の１つ以上の１ｎｖｉｔｒｏ生物学的活性を有する合成ポ リペプチド。 ２９、第２図に示したアミノ酸配列の一部分又は全体の二次構造コンフオ＝メー ションの一部分又は全部を有し且つ天然のヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質の 生物学的特性を有する合成ポリペプチド。 ３０、天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質の一次ｍ造コンフォーメーションの 一部分又は全部と生物学的特性の１つ又は複数とを有するポリペプチドの製造方 法であって、請求項２５に記載のＤＮＡベクターで形質転換又はトランスフェク ションした原核又は真核宿主細胞を適当な栄養条件下で増殖させ、前記ベクター 内でのＤＮＡ配列発現の所望のポリペプチド産物を単離することを含む方法。 ３１、いずれのヒトタンパク質とも結合していない精製単離されたグリコジル化 又は非グリコジル化形態のヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質。 ３２、請求項１に記載の有効量のポリペプチドと、医薬的に許容し得る希釈剤、 アジュバント又はキャリヤーとを含む医薬組成物。 ３３、Ｉｌｉ乳動物体内における腫瘍細胞の広がりを阻止する方法であって、請 求項１に記載のポリペプチドを有効量投与することからなる方法。 ３４、　Ｉｌｉ乳動物の慢性関節リウマチを治療する方法であって、請求項１に 記載のポリペプチドを有効量投与することからなる方法。 ３５、　ａ　）　［Ｎｅｔ−’］メタロプロテイナーゼ阻害物質、及びｂ）Ｉつ 以上のシスティンがアラニン又はセリンで置換されているメタロプロテイナーゼ 阻害物質の中から選択されるヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質の類縁体をコー ドするＤＮＡ配列。 ３６、請求項３５に記載のＤＮＡ配列の原核又は真核宿主細胞中における発現の ポリペプチド産物。 ３７、メタロプロテイナーゼ阻害物質０．５ｍｇ当たり０．５ｎｇ以下の発熱物 質を積度９５％以上Ｔｈ。 ３８、メタロプロテイナーゼ阻害物質と特異的に結合する抗体。 ３９、抗体がモノクローナル抗体である請求項３８に記載の抗体。 明細書 メタロプロテイナーゼ阻害剤 本願は、参考として本明細書中に包含する１９８９年５月１９日出願の特許出願 第３５５，０２７号の部分継続出願である。 本発明は一般にメタロプロティナーゼ阻害剤及びこのような因子をコードするポ リヌクレオチドに関する。特に、本発明は哺乳類の新規なメタロプロテイナーゼ 阻害剤（Ｍｌ）、その断片及びポリペプチド類縁体並びにそれらをコードするポ リヌクレオチドに係る。 より結合組織は動的平衡状態に維持される。細胞外結合組織のマトリックスは主 としてコラーゲンからなり、その他にプロテオグリカン、フィブロネクチン、ラ ミニン及び他の少量成分が存在する。 内在する結合組織及び細胞生理学的ｐＨでマトリックス巨大分子のほとんどを分 解しうる侵入炎症細胞から中性メタロプロテイナーゼが放出されることによりマ トリックスが分解される。 プロテイナーゼには、哺乳類の組織コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びプロテオグ リカナーゼ；白血球のコラゲナーゼ及びゼラチナーゼ［ＭｗＢｂ７ら、Ｂｉｏｃ ｂｓｔ　１．　２８３．２１１９−２２１　（１９８２）　；Ｈｉｌ＋ｂｓ　ラ 、３．８ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、２６０．２４９３−２５００　（１９１１５）］ 　；　７クロフアージのコラゲナーゼ及びエラスターゼ［Ｗ＠ｒｌ＋ら、Ｊ、Ｅ ｘｐ。 Ｍｅｄ、　１４２．３４６−３Ｎｌｌ（１９７５）；　Ｂｓ＋ｄｔら、Ｂｉ＋＋ 山ｍ、　Ｊ、　１９３．　Ｎ９−６０５（１９８１）　］　；及び腫瘍のコラゲ ナーゼ［Ｌ’１ｏＨｓら、Ｐｒｏｃ。 Ｎ１１１．　Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　７６　２２６８−２２７２　（１９７ ９）；　ＬｉｏｔｌＡら、コラゲナーゼ及び、正常なまた病的な結合組織代謝回 転におけるその役割についての一般的な総蜆はＣｏ１１ｓ（ｅｕｓｔ　ｉｎ　Ｎ ｏｒｍＩｌ＊ｎｄ　Ｐ＊１ｈｏｌｏ！１ｃＩＩ　Ｃｏ＋＋＋！ｃ目ｖｔ　Ｔｉｔ ｏｅｓ、　Ｄｅｖｉｄ　Ｅ、　Ｗｏｏｌｌ！７とＪｏｈｎ　Ｍ、Ｅｙｕｓｏｍ　 ＠５Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ７　＆　Ｓｏｎ　Ｌｔｄ、　（１９Ｂｇ）を参照のこと 。 ５個以上の異ナル型ノコラーゲ：／（Ｌｌｌ、ＩＩＩ、ＴＶ。 ■５等）があり、これらは組織間で異なる分布を示す。種々の型のコラーゲンの 間にはかなり相同性や構造上の同一性がある。 特定のコラゲナーゼは特定の型のコラーゲンに特異的である。 コラゲナーゼ及び他のマトリックス分解メタロプロテイナーゼの阻害については 、実際の酵素、基質及び阻害機構に応じて阻害剤が一つのみの、数個の、または 全てのコラゲナーゼ及びメタロプロテイナーゼに作用しうることが可能である。 結合組織分解による疾患の根本的な原因としては、マトリックス特異性メタロプ ロテイナーゼがこれら疾患の病因に根本的な役割を有することが指摘されている 。このような疾患には栄養障害性表皮水庖症；関節リウマチ；角膜、表皮及び胃 腸管の潰瘍；歯周病；気腫；骨の疾患；並びに腫瘍の転移及び侵入を含んでおり 、発明の詳細な説明の項により詳しく述べている。 結合組織分解及びこのような分解が関与する疾患に関する研に限定されていた（ このメタロプロテイナーゼのグループについて最も広範に研究された）。しかし 、コラゲナーゼ単独に比べてコラゲナーゼと他のマトリックス分解メタロプロテ イナーゼとが同時に作用することにより結合組織分解を悪化させるであろうと考 えられる。 培養結合組織由来の粗製培地中で天然の特異的コラゲナーゼ阻害剤が発見された 。ＴＩＭＰ（組織のメタロプロテイナーゼ阻害剤）として公知のメタロプロテイ ナーゼ阻害剤は物理化学的特性及びコラゲナーゼとの相互作用の生化学について 研究されており［ＭＷｒＰｈＴら、Ｊ、　Ｂｉｏｔｈｒｔ　１９５．　１６７− １７０　（１９８１）　；ＣＩＷ＄１ＯＩｌ　ら、　１．Ｂｉｏｃｂｎ、２１１ ．　３１３−３１８（１９０）ＨＨｒｉｃｋｌｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅ ｍ、　２５８．　１２２５２−１２２５８（１９１１３）　］　、またその遺伝 子の細胞培養モデル中で、ＴＩＭＰはコラゲナーゼ分泌腫瘍細胞系の移動を阻止 できた［Ｔｈｏｒｌｅｉｒｓｓｏｎら、Ｊ、　Ｎ１１１．　ＣｌｌＩＣ，Ｉｌｌ ＄１゜６９、　１０４９−１０５４　（１９８２）］　、　Ｔ　Ｉ　ＭＰ（７） 注入ニヨリｖウスＢ１６−Ｆされた［Ｓｅｂｗｌｌｘら、Ｃ＞ｃｎｔｒ　Ｒｅ５ ｕｒｃｈ　４Ｂ、５５３９−５５４５（１９８８）］。 ト白血球からのメタロブロティナーゼ阻害剤の精製を報告している。 Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｋら［Ｃｓ＋ｃｔｒ　Ｒ５５ｔｓ＋ｃｋ　４６．３５８０−３ ５８６　（１９＄６）］はウシ大動脈内皮細胞由来のならし培地中で２つのコラ ゲナーゼ阻害剤の存在を示した。 Ｍｗｒｒｓｙら［）、Ｂｉｏｌ、Ｃ１５ｓ、　２６１．　４１５４−４１５９　 （１９１１６）］はウシ軟骨由来のコラゲナーゼ阻害剤の精製及び部分的なアミ ノ酸配列を報告した。本発明のウシＭｌのアミノ末端アミノ酸配列はＭｗｒｔＢ らがウシ軟骨由来コラゲナーゼ阻害剤について報告したものと非常に類似してお り（最初の３８残基については９４％相同であり）、アミノ酸組成も同様である 。ＭｗｒｒＢら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅ■９、上記）はウシ軟骨由来阻害剤は初めの２３残基についてヒトＴＩＭ Ｐと６５％以上相同しており、アミノ末端配列は「極めて類似コしていると指摘 した。本研究がなされるまで、ＴＩＭＰが単離された同じ種からＴ’ＩＭＦに関 連するまたは相同する他の分子は単離されなか−）た。本研究で、同じ種（ウシ ）、実際には同じ細胞のならし培地から、２つのメタロプロテイナーゼ阻害剤が 単離精製され、徹底的にその特性が明らかにされた。従って、これらの阻害剤は 、示されるように、ウシのＴＩＭＰＩ同体に関係はしているが、両者ともがウシ ＴＩＭＰ相同体ではありえないことはあきらかである。また示されるように、そ の内の１つ（ビーク２由来）は恐らくウシＴＩＭＰであろう。従って、他方（ピ ーク■由来）は新規の他の分子に違いない。この発見により、ヒトゲノムでコー ドされるＴＴＭＰ以外の相同の阻害剤が存在することが先ず明らかである。この ヒト遺伝子、すなわちヒトＭＩ遺伝子は実施例３に示す。 本明細書に記載のもののようなメタロプロティナーゼ阻害剤が治療上重要である ことが証明され、従って市販規模の量を入手する必要がある限り、天然細胞の培 養物からの単離は適切な材料源とはならないと思われる。 発明の概要 本発明により、新規なメタロブロティナーゼ阻害剤（Ｍｌ）及びＭＩＩ縁体が提 供される。また、ＭＴの全体または一部をフードするＤＮＡ配列、このようなり ＮＡ配列を含有するベクター及びこのようなベクターで形質転換またはトランス フェクションされた宿主細胞も提供される。組換えＭＩの製造法及び疾患の治療 法も本発明に包含する。更に、Ｍｌ含有医薬組成物及びＭＩに特異的に結合する 抗体も提供される。 図面の簡単な説明 ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ ＡＧＥ）を示す全図面では、左に示す数字は示した数の１０３倍の分子量を有す る標準の移動位置を示していることを特記しておく。これらのマーカーはホスホ リラーゼｂ（Ｍ　ｒ　９７．４００）　、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　；Ｍｒ ６６．２００）、オボアルブミ：／　（Ｍ　ｒ　４２．７００）　、炭酸脱水酵 素（Ｍ　ｒ　３１．０００）、大豆トリプシン阻害剤（Ｍ　ｒ　２１．５００） 及びリゾチーム（Ｍ　ｒ　１４．４１１０）である。同じゲルにかける他の試料 に未還元のものがあるときでも、これらの標準は常時還元された。 第１図はウシメタロプロテイナーゼ阻害剤のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示 している。 第２図はヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示 している。 第３図はビーク■から誘導されたウシメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＭＩ）の精 製に使用されＭｌイオン交換クロマトグラフィーを示している。 第４図はビークＩから誘導されたウシメタロプロテイナーゼ阻害剤（Ｍｌ）の精 製に使用された等電点クロマトグラフィーを示している。 第５図はビーク■から誘導されたウシメタロプロテイナーゼ阻害剤（Ｍ　！　） 及びビークＩＩから誘導されたウシメタロプロテイナーゼ阻害剤の５ＤＳ−ＰＡ ＧＥを示している。Ａは銀染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥであり、Ｂは５ＤＳ−ゼラ チンＦＡＧＥであり、Ｃはイムノブロッティングした５ＤＳ−ＰＡＧＥである。 第６図は５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥにかけたゼラチン分解性プロテイナーゼに対 するＥＤＴＡ及びビーク■由来ウシメタロブロティカーゼ阻害剤（Ｍｌ）の作用 を示している。 第７図は特異的コラーゲン切断に対するピークＩ由来ウシメタロブロティカーゼ 阻害剤（Ｍｌ）の作用を示すオートラジオグラフィーを示している。 第８図は大腸菌（Ｅｔｅｂｅｒｔｃｈｉ畠ｃｏｌｉ）内で組換えヒトメタロプロ テイナーゼ阻害剤を発現させるためのプラスミド構築図を示している。 第９図はリポソーム結合部位、開始メチオニンコドン及び成熟蛋白質の最初の４ ２個のアミノ酸用のコドンを含む、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）内での組換えヒト メタロプロテイナーゼ阻害剤の発現に使用するために構築した合成りＮＡ断片を 示している。 第１０図は酵母菌内での組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の発現に使用し たベクターを示している。 第１１図は酵母菌分泌突然変異体の単離に使用したベクターを示している。 第１２図は哺乳類細胞の発現ベクターｐＤＳＲα２−Ｍ１の構造を示している。 第１３図はウシメタロプロテイナーゼ阻害剤及び大腸菌内で産生された組換えヒ トメタロプロテイナーゼ阻害剤（Ｍｌ）の５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥを示してい る。 第１４図は５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥにかけたゼラチン分解性プロテイナーゼに 対するＥＤＴＡ及び大腸菌産生組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤（Ｍｌ） の作用を示している。 第１５図はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒトメタロ プロテイナーゼ阻害剤が、転移細胞が分泌するメタロプロテイナーゼによる１型 コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンの分解を阻害することを示している。 第１６図は平滑筋細胞によって沈着された結合組織マトリックスの、腫瘍細胞の 存在下で生じる分解に対する大腸菌由来の組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害 剤の作用を示している。 第１７図は平滑筋細胞によって沈着された結合組織マトリックスの、腫瘍細胞の 存在下で生じる分解に対するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の 組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の作用を示している。 第１８図は腫瘍細胞の増殖及び接着に対する組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻 害剤の作用を示している。 第１９図は平滑筋層への腫瘍細胞による侵入に対する組換えヒトメタロプロテイ ナーゼ阻害剤の作用を示している。 現在の所好ましい本発明の実施態様を説明する以下の詳細説明を考慮すると、本 発明の多くの態様や利点が当業者に明らか本発明によると、新規な蛋白質メタロ プロテイナーゼ阻害剤（ＭＩ）及びこのようなＭＩの全部及び部分をコードする ＤＮＡ配列が提供される。このような配列には、選択した哺乳類以外の宿主が発 現するのに「好適な」コドンの導入；制限エンドヌクレアーゼ酵素により切断す るための部位の供給；及び容易に発現されるベクターの構築を促進する他の先端 、末端及び中間ＤＮＡ配列の供給を含む。本発明は、１つ以上のアミノ酸残基の 同−性及び位置の点で天然のものとは異なる（すなわち、ＭＩに特有の全残基を 含有していない欠失類縁体；特有の残基１つ以上が他の残基で置換されている置 換類縁体；及び１つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間部分に 付加されている付加類縁体）、そして天然型の特性の全部または一部を有するＭ ｌのポリペプチド類縁体または誘導体をコードするＤＮＡ配列も提供する。 本発明の新規なりＮＡ配列には、天然のＭｌの一次構造コンホメーションの少な くとも一部と生物学的特性の１つ以上を有するポリペプチド産物を原核または真 核宿主細胞内で確実に発現させるために有用な配列も含んでいる。本発明のＤＮ Ａ配列は特に＝　（ａ）第１図及び第２図に示すＤＮＡ配列またはその相補鎖ｉ 　（ｂ）　（実施例３に開示したハイブリッド形成条件またはより厳しい条件で ）第１図または第２図のＤＮＡ配列またはその断片とハイブリッド形成す名Ｄ　 ＮＡ配列；及び（Ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ、第１図または第２図のＤ ＮＡ配列とハイブリッド形成するＤＮＡ配列を包含する。（ｂ）及び（Ｃ）には 、対立形質変異型のＭｌをコードする及び／または他の哺乳動物種由来のＭＩを コードするゲノムＤＮＡ配列並びに、微生物宿主中でのメツセンジャーＲＮＡの 転写及び翻訳を促進するコドンを含有しうるＭＩＳＭｌ断片及びＭＩ類縁体をコ ードする製造し得るＤＮＡ配列が特に含まれる。このような製造し得る配列はＡ Ｉ　ｔｏｎらのＰＣＴ出願公表ＷＯ３３１０４０５３の方法により容易に構築で きる。 本発明のもう一つの態様によると、Ｍｌポリペプチドをコードする本明細書に記 載のＤＮＡ配列はこれまで入手できなかった哺乳類蛋白質のアミノ酸配列に関す る情報を提供する点で貴重である。ＤＮＡ配列は種々の組換え技術によりＭｌを 大量合成するために有用な物質としても貴重である。換言すれば、本発明が提供 するＤＮＡ配列は新規で有用なウィルス及び環状プラスミドＤＮＡベクター、新 規で有用な形質転換及びトランスフェクシヨンされた原核及び真核宿主細胞（培 養により増殖する細菌及び酵母菌細胞及び哺乳類細胞を含む）、並びにＭｌ及び その関連産物を発現できるこの正うな宿主細胞を培養増殖させる新規で有用な方 法を生じさせるのに有用である。 本発明のＤＮＡ配列はＭｌ及び関連蛋白質をコードするヒトゲノムＤＮＡ及びｃ ＤＮＡ、並びに他の哺乳類のゲノムＤＮＡ配列の単離に際し標識プローブとして 使用するに適した物質でもある。ＤＮＡ配列は（例えば、昆虫細胞中での）蛋白 質合成の種々の変法またはヒト及び他の哺乳類での遺伝子療法にも有用であろう 。本発明のＤＮＡ配列はＭＩ及びＭｌ生成物の大量生産用の真核「宿主」として 働きうるトランスジェニックな噛乳動物種を開発するために有用であることが期 待される。一般に、ＰｓｌｍＨｗｒら、５ｃｉｓ＋＋ｃｅ　２２２．　８０９− １１１４　（１９８３）を参照のこと。 本発明は対立形質変異体を含む天然Ｍｌの一次構造コンホメーシ譬ン（すなわち 、アミノ酸残基の連続配列）の一部または全部と、１つ以上の生物学的特性（例 えば、免疫学的特性及びｉｎ　ｖ＋ｔｒｏの生物学的活性）と、物理的性質（例 えば、分子量）とを有する精製単離したポリペプチド産物を提供する。本明細書 で使用している「精製単離した」という表現は実質的に均質であるかまたは（例 えば５ＤＡ−ＰＡＧＥで１つのバンドとなるように）明らかに均質になるまで精 製したことを意味している。これらペプチドは天然から精製した生成物、または 化学合成手法による生成物、またはゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングまたは 遺伝子合成で得られた外因性ＤＮＡ配列の（例えば、培養物中の細菌、酵母菌、 高等植物、昆虫及び哺乳類細胞による）原核または真核宿主での発現による生成 物であることも特徴とする。典型的な酵母菌（例えば、Ｓｓｃｃｂｓｒｏｍ７ｃ ｔｓ　ｔｅｒｓｔｉｓｉｚｅ）または原核生物（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　）宿主 細胞中での発現産物はいかなる哺乳類蛋白質とも結合していない。を椎動物（例 えば、ヒトではない哺乳類（例えば、ＣｏＳまたはＣＨＯ）または鳥類）での発 現産物はヒトのいかなる蛋白質とも結合してない。使用する宿主により、未発明 ポリペプチドは哺乳類または他の真核生物の炭水化物でグリコジル化されること もされないこともある。本発明のポリペプチドは（位置−１の）初めのメチオニ ンアミノ酸残基も含有してよい。 本発明は、Ｍｌの天然の対立形質型　（Ｉｌｌｅｌｉｃ　ｌｏｒｍｓ）の他に、 ＭＩのポリペプチド類縁体及びＭＩの断片のような他のＭｌ産物も包含する。上 記のＡｌｔｏｎらの公表された出願（ＷＯ８３１０４０５３）の手順に従って、 １つ以上の残基の同一性または位置について本明細書中に特定したものとは異な る一次コンホメーシジンを有する（例えば、置−１末端及び中間の付加及び欠失 ）ポリペプチドの細菌での発現に関してコードする遺伝子を容易に設計し、製造 できる。あるいは、よく知られている特定部位の突然変異誘発手法によりｃＤＮ Ａ及びゲノム遺伝子を容易に修飾でき、これを使用してＭＩの類縁体及び誘導体 を生成することができる。このような生成物はＭｌの生物学的特性の少なくとも １つを有するであろうが、他の点では異なっていることもある。例えば、本発明 の提起した生成物には、例えば欠失により短くなったもの；または加水分解に対 しより安定な（従って、天然のものよりより強いまたは持続した作用を有しつる ）もの；または１つ以上の０−グリコジル化可能な部位を欠失するよう変化した もの（その結果、酵母菌産生産物に関してより活性が高くなりうる）；または１ つ以上のシスティン残基が欠失したまたは例えばアラニンまたはセリン残基で置 換されており、細菌系から活性型でより容易に単離される可能性のあるもの；ま たは１つ以上のチロシン残基がフェニルアラニンで置換されており、多かれ少な かれ標的蛋白質にまたは標的細胞のレセプターに容易に結合するものを含んでい る。また、ＭＩ内の連続したアミノ酸配列または二次コンホメーシヨンの一部の みを複製するポリペプチド新井も含まれ、この断片はＭｌ活性の１つ（例えば、 レセプター結合）を有し、他（例えば、メタロプロテイナーゼ阻害活性）は有し ていなくてもよい。１つ以上のいずれの本発明生成物も治療用途［ＷｅｉｌＩｄ ら、８１ｗ１４４、　１７３−１７５　（１９Ｈ）］　マタｌｔＭＩ拮抗作用（ Ｄ７ツ（ｒイ（Ｆ）ヨウナ他の目的の用途を有するためにこの活性を必要としな いことは特記すべきである。例えばＭＩの過剰産生の場合に、競合拮抗剤が非常 に有用でありうる。 本発明のＭＩ断片及びポリペプチド類縁体の適用の可能性のうち、天然の蛋白質 、糖蛋白質及び核蛋白質中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製している合成 ペプチドの免疫学的活性について報告されている。より詳細には、比較的分子量 の小さいポリペプチドが、ウィルス抗原、ポリペプチドホルモン等のような生理 学的に重要な蛋白質の免疫反応と期間及び程度が同様である免疫反応に関与する ことが示されている。このようなポリペプチドの免疫反応には、免疫学的に活性 な動物中での特Ｗｅｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎｇ口、Ａｃ５ｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ 　７７、　５１９７−５２００（１９８１１）；Ｂａｒｏｎ　ら、　Ｃｅ１ｌ　 ２８．　３９５−４０４（１９８２）：　Ｄｒ！ｓｓｍｘｎ　ら、　Ｎ５ｌｉｒ ｅ２９５．１８５−１６０　（１９ｇ２）　；及びＬｅｒｎｅｒ、　５ｃｉｅｎ 口１ｉｃＡｓｓｒｉｃｏ　２４８゜６６−７４　（１９８３）参照のこと。また 、ペプチドホルモンの二次構造はほぼ有するが、その−次構造コンホメーシッン は有していないこともある合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性に関するＫ １１ｓｅｒら［５ｅｉｅ＋＋ｃｅ　１２３．　２４９−２５５　（１０４）］　 も参照のこと。 本発明は、ヒトのＭｌのｃＤＮ、ＡまたはゲノムＤＮＡ配列の蛋白質コード鎖と 相補的なりＮＡ部分がコードする種のポリペプチド、すなわち、Ｔｒｒｍｏｎｌ ｕｏら［Ｎｗｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１２．　５０４９−５０５９　（ １９８４）］が記載している「相補的逆蛋白質（ｃｏｓｐｌｎｕｌｘＢ　１ｎｖ ｅｒｌｔｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）　Ｊも包含する＠また、本発明には、有効量 の本発明ポリペプチド生成物とＭＩ療法に有用な好適な希釈剤、保存料、可溶化 剤、乳化剤、助剤及び／または担体とからなる医薬組成物も含む。このような組 成物は種々のバッファ成分（例えば、丁＋１ｓ−ＨＣＩ、酢酸塩、燐酸塩）、ｐ Ｈ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｖｔｔｎ　８ Ｌ　Ｐｏ１７ｓｏ＋ｂｔ’ｌｔ　８０）　、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸 、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、Ｔｂｉｍｔｒ＋ｏｌ　、ベンジ ルアルコール）及び増料剤（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加 物；蛋白質へのポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合（例えば、 参考として本明細書に含まれる米国特許第４．１７９．３３７号明細書参照）； ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の様なポリマー化合物の粒状製剤またはリポソー ムへの材料の導入を含んでいる。 度及びｉｌｌマｉｗｏクリアランス速度に影響を与えよう。 本発明はＴＩＭＰの様な他のメタロプロテイナーゼ阻害剤または低分子量の化学 的阻害剤を含有する組成物も含む。本発明は疾病状態の進展に影響する他の薬剤 例えばＭｌと同様に癌の転移を妨げるラミニン及び／またはフィブロネクチン由 来のペプチドを含有する組成物も含む。 本発明のポリペプチド生成物は検出可能なマーカー物質（例えば、　■による放 射性標識）と結合させて「標識コし、固体組織及び血液または尿のような液体試 料中でのＭＩの検出及び定量に有用な試薬を提供することもできる。本発明の核 酸生成物も検出可能なマーカー（例え１し放射性標識及びビオチンのような非放 射性標識）で標識することができ、これをハイブリッド形成過程で使用して染色 体地図内のヒトＭＩ遺伝子の位置及び／または任意の関連遺伝子ファミリーの位 置を決定することができる。それらはまたＤＮＡレベルでのヒトＭｌ遺伝病の同 定に使用されるし、また隣接遺伝子やその病気を同定するための遺伝子マーカー としても使用できる。 医薬処方物中に使用したときのＭｌは病因を軽減させ、マトリックス分解を特徴 とする結合組織の疾患に有効な治療法を提供する。また、メタロプロテイナーゼ 阻害剤はメタロプロテイナーゼ活性によりマトリックス損失が過剰になる疾患全 ての治療及び、手術または他の傷害状態後の傷の治癒の促進に有用である。 本発明のポリペプチド生成物は、コラゲナーゼの過剰産生に関連する栄養障害性 表皮水庖症のような種々の疾患の治療に、単独または他の薬剤と併用で、有用で ある［Ｂｔｏｅｒら、Ｊ、Ｅｘｐ。 ２６３９−２６５１　（１９６ｇ）　］は、切除したリウマチの模膜組織を培養 す−１２３９（１９７７）　］の、ヒトリウマチ滑模膜ラゲナーゼに対する単一 特異性抗体を使用したイムノローカリゼイシジンの研究に導いた。この研究では 、関節侵食部位（軟骨−パンヌス接合部）で、高レベルの免疫反応性コラゲナー ゼが検出されたが、軟骨細胞を伴う軟骨中及び、再吸収部分の前面から離れた部 位の溝膜中では検出されなかった。ヒトのリウマチ関節由来の多くの他の異なる 調製物を使用して、並びに変形性関節炎、ライター症候群、偏性痛風、若年性関 節リウマチ及び強皮症のような他のタイプの関節炎を特徴とする組織を使用して もコラゲナーゼが示された。 歯を支える器官に影響する歯周病では、コラーゲン分解酵素の上昇及びコーラー ゲン及び結合組織の破壊が明らかである［Ｖ、−Ｊ、Ｕｌｔｉｏ、Ｐｒｏｔ＊ｉ ＋５ｓｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｔｌｔｍｍｓ目ｏＩｌｕｄ　Ｔｗｍｏｔ　ｌａｗ■ｉｏ ｎ、ｐｐ、２１１−２２３、）１．　Ｔｓｃｈｔｓｃｈｚ編、Ｗｓ目ｔｒ　ｄｅ 　Ｇｒｗ７１ｅｒ＆　Ｃｏ、、Ｂｅｒｌｉｎ、！１．Ｙ、（１９１１ｇ）参照］ 。 コラゲナーゼは角膜、表度または胃腸管の潰瘍を含む潰瘍に関与しており　［Ｂ ｔｏｖｎ　ら、　Ａｍｅｒｉｃｔｎ　Ｊ、ｏｒ　ＯｐｂｌｈｓｌｍｏｌｏＢ　７ ２゜１１３９−１１４２（１９７１）　］　、実際にメダロブロテ゛イナーゼ阻 害剤が角膜潰瘍の治療に使用されている［５ｌｓｎｓｋ７ら、Ａ＋＋ｓｌｓ　ｏ ｊＯｐｈ＋ｂ＊１ａｏｌｏｌＦ　２．４１１８−４９１（１９７０）　］。 腫瘍の侵入及び転移の分野では、ある種の特定の腫瘍の転移能はコラゲナーゼの 合成及び分泌能の上昇［Ｌｉｏｌｌｓら、Ｎｇｌｓｒｔ２１４、６７−６８（１ ００）　］　、及びメタロプロテイナーゼ阻害剤の有意な量の合成及び分泌が不 能であること［Ｈｉｅｋｓら、ｌｓｌ、　−Ｊ。 Ｃｓ＋＋ｃｅｒ　３３．０５−８４４（１９８４）　］と関連する。これらの過 程は組織部位から結合組織層（基底膜）を介して循環系へのまたはその反対の腫 瘍細胞の通過に関連し、これはＭＩで遅延させることができよう。同様に、Ｍｌ は原発腫瘍の除去の間、化学療法及び放射線療法の間、汚染された骨髄の採取の 間、及び癌性腹水のシャンティング（ｓｈｕ＋１ｉＢ）の間に腫瘍細胞の広がり を阻止する治療上の用途も有する。 骨髄が関与している多くめ進行癌での骨髄移植の使用を限定している要因は適切 な浄化手法がないことである。例えば、浄化が不適切な骨髄細胞の注入による転 移性間質性肺炎が示されている［Ｇｌｏｒｉｔｗｘら、Ｃｒａｔｅｒ　５８．　 ２Ｈ６−２Ｈ９（１９８６）ＨＧｎｕｅら、Ｃｇｎｃｓｒ　６２．２１２５−２ １２７（１９ｇｇ）’］　。未浄化骨髄注入の間にＭｌを投与することにより、 高価な浄化手法を開発する必要性診断では、腫瘍試料中でＭｌが産生されないこ とと転移の可能性との相関関係が予知の指標及び可能な予防療法の指標として有 用である。 癌細胞及び／または周辺の正常細胞の両者でコラーゲンの沈着が増加する（また は分解が阻害される）ことにより腫瘍が多かれ少なかれ封入されまたは繊維性と なることもある６Ｍｌで封入の増加を促進することにより確実な腫瘍切除に役立 つ。 過剰のコーラーゲン分解が関与しつる、従ってＭＥを使用できる他の病的状態に は、気腫、骨のパリエツト病、骨粗しよう症、強皮症、床ずれでの骨または組織 の圧迫萎縮、コレステリン腫、及び傷の異常な治癒が挙げられる。Ｍｌは、例え ば癒合過程中のコラーゲンの代謝回転を調節するための、他の傷治癒促進剤の助 剤としても使用できる。 Ｍｌは造血過程において赤血球増強活性（すなわち、初期赤血球プロジエニター の分化の刺激）に基づいた役割を演するた己免疫疾患（例えば、関乃リウマチ、 多発性硬化症）のような免疫学的な障害の治療にも使用できる。 Ｍｌ及び７／またはＴＩＭＰは、その結合組織分解の阻止能及び毛細管内皮細胞 増殖の阻止能により、例えば腫瘍の予防または腫瘍進行の遅延化において脈管形 成の阻止が有用な場合に使用できる。 本発明はメタロプロテイナーゼ阻害剤と特異的に結合する抗体にも関する。下記 実施例６はポリクローナル抗体の作製を記載している。本発明のもう一つの実施 態様はＭＩに特異的に結合するモノクローナル抗体である。一般に種々の抗原決 定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含んでいる従来の抗体（ポリクローナ ル）調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の１つの抗原決定基に 対するものである。モノクローナル抗体は抗原−抗体結合を使用する診断及び分 析アッセイ法の選択性及び特異性を改善するのに有用である。モノクローナル抗 体の第二の利点は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンに 汚染されていないことである。モノクローナル抗体は培養したハイブリドーマ細 胞の上清またはバイブ７６）］が最初に記載したハイブリドーマ手法は多くの特 異的抗原に対するモノクローナル抗体を大量に分泌するハイブリッド細胞系を作 製するために広く使用されている。 次の実施例は本発明を更に説明するものであるが、本発明の範囲の限定を意図し たものではない。 実施例　１ ウシ大動脈内皮細胞ならし培地からのメタロプロテイナーゼ阻害剤の精製／特性 化 １、ならし培地 ＭＩＴＯ＋血清増量剤（２％、ｖ　／　ｖ　；　Ｃｏ１１ｘｂｏ＋ｘｔｉｗｅ　 １ｌｅｕｕｅｈＩｎｃ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）　、ペニシリン（１００ Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｒｒ＋１）を補ったウシ胎児 血清（２％、ｖ　／　ｖ　）を含有するイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）中で ウシ大動脈内皮細胞（細胞系ＮＣＡＣＩ２；　Ｄｅ　Ｃ１ｕｃｋら、Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅ５ｅｉｒｃｈ　、上記）を培養した。継代１０と２０の間の細胞を８０ ０ｃｍ２の回転ビン（ＣｏＧＩＩ’ｒ）中で増殖させた。ならし用に、集密度８ ０−９０％の培養物を血清を含まない培地で４−５時間かけて３回洗い、次に血 清を含まない新鮮な培地の存在下で４８時間インキュベートした。培地を集め、 ４℃で１０分間、５．０ＧＯＸ　ｇで遠心し、アジ化ナトリウム（０，０２％、 Ｗ　／　Ｖ　）添加後４℃に維持した。ならし後、細胞をトリプシン処理し、培 地で１：４に希釈し、再ならし用に集密度８０％まで増殖させた。 ２、阻害アッセイ ］ｏｈｎｓｏｎ−１ｉＩＩｔ　［＾ｕ１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１０４．　１７５ −１８１　（１９ＢＧ）　コ　に記載の放射性標識コラーゲンフィルムアッセイ を使用して測定した阻害活性により精製作業をモニターした。使用した基質は１ ４Ｃ−アセチル化したラット皮膚コラーゲン（約３００ｃｐｍ／μｇ）であり、 これはウェル当り２０μ＋　（６，０００ｃｐｍ／ウェル）で９６ウエルのマイ クロタイタープレートに載置した。コラゲナーゼ源は約８単位／ｍ１（１単位は ３７℃で１分間当たり１μｇのコラーゲンを分解する酵素量である）のコラゲナ ーゼ活性を有する１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ ＴＰＡ）処理したウザギ模膜繊維芽細胞からの血清非含有ならし培地である。プ ロエンザイムは２２℃で３０分間のトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）で活性化され 、次に重量が５倍過剰の大豆トリプシン阻害剤でトリプシンを不活化した。種々 の量の試験すべき試料を、ｐＨ７，５のＴ＋目−ＨＣＩ（５０ｍＭ）及びＣａＣ ｌ２　（１０ｍＭ）も含有する最終容量２００μｍ中の活性化酵素（４０ｍＵ） と共にインキュベニトした。次に、これらの混合物を［１４Ｃ］　コラーゲンを 含有する各ウェルに加えた。３７℃で３時間インキュベートした後、上清を取り 出し、ベータシンチレーシ１ンカウンタで計測した。 試験試料を含有するときに放出された放射活性とコラゲナーゼのみを含有すると きに放出された放射活性とを比較して阻害率を計算した。全ｃｐｍ値からバック グラウンド（バッファのみの場合）のｃｐｍ値を差し引いた。阻害剤が存在しな いときには、全放射性標識基質の６０−７０％が分解された。阻害剤１単位は、 用量−阻害曲線から決定して、２単位のコラゲナーゼを５０％阻害する量と定義 する。 抗ゼラチナーゼ活性アッセイについては、１４Ｃ−標識コラーゲンを６０℃で２ ０分間熱変性させ、試験管内でアッセイを実施した［Ｍｕ＋ｐｈ７９、Ｂｉｏｃ ｂｕ＋、　１．　’１９２．５１７−５２５（１９８０）　］　、抗ＩＶ型コラ ゲナーゼ活性は、マウスのＥｎｇｌｅｂｒｅｌｂ−Ｈｏｌｅ−５ｖｓ＋ｍ腫瘍か ら抽出した（　１４　Ｃ］プロ１ル標識ＩＶ型コラーゲンを使用して、記載（Ｄ ＩＣ１ｓ＋ｃｋ　ら、Ｃｘｏｃｕ　Ｒｅ８１、上記；及びＤｔＣｌｔｒｃｋ、＾ ｒｃｂ、Ｂｉｏｔｂｔｍ、Ｂｉｏｐｈ７．、上記）のように測定した。 ３、精製 特記しない限り全ての精製作業は４℃で実施した。 ａ、濃縮 分子量分画範囲１０．０［１０のポリスルホン膜カセット（全膜面積５ｆｔ２） を具備したＭｉｌｌｉｐｏｕ　Ｐｔ１ｌｉｃｏｎクロスフロー限外濾過装置を使 用して２０リツトルの培地を４５０ｍ１の容量に濃縮した。次に、＾ｍ１ｃｏｎ 　ＹＩＪＩＯ膜を具備した＾ｍ１ｃｏｎ　ＴＣＦ　１０クロスフロー限外濾過ユ ニツトを使用して試料をさらに６４ｍ１まで濃縮した。次いで、非イオン界面活 性剤Ｂｒ１ｉ−３５を１０％（Ｗ／Ｖ）保存液から加えて最終濃度０，０５％（ Ｗ／Ｖ）とし、ＴＮＣ／Ｂｒ１ｉ−３５バツフｙ　［５ｉＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、２００１Ｍ　Ｎ＊Ｃｌ、　０．０５％（ｖ／ｙ）Ｂ＋１ｉ−３５，ｌＯｄ　Ｃ ｅＣｌ３．　ｐＨ７，５］に対して試料を透析した。 ｂ、ゲル濾過 透析した試料（６０ｍｌ）を２０ｍ１ずつ３つに分け、その各々を４℃のＴＮＣ ／Ｂｒ１ｉ−３５バツフｉで平衡化した５ｓｐｂＩｄｅｘ　Ｇ−１００ゲル濾過 カラム（５Ｘ９１ｃｍ）にかけた。流速は６０ｍ１／時であり、１３ｍ１ずつ画 分を集めた。各カラムについて、木賃的にＤｅ（ｌｅｔｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅ５ｃ８ｒｅｈ　（上記）に記載されたものと同じクロマトグラフィー・プロ フィール（２８０ｎｍでの吸光度及びメタロプロテイナーゼ阻害剤活性）が得ら れ、見かけの分子量７０．０００−７５．０００及び３０．０００−３５．　Ｇ ｏｏに対応する２つの阻害活性のビークが認められた。ゲル濾過カラムの各々か らの活性画分を集めてピーク■物質（分子量が大きい）とビーク物質ＴＩ（分子 量が小さい）を得た。 Ｃ，ビークＩの精製 １、陰イオン交換 ゲル濾過からのビークＩ物質０１２　ｉｆ　；上記３ｂ）を２ｉＭ７山−）ＩＣ Ｉ、　１ｍＭ　ＣｒＣｌ２．０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｂｒ１ｉ−３５，ｐＨ７， ５に対して透析し、２つに分けて、同じバッファで平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ陰イ オン交換カラム（ＰｈｕＩｌｌｓｃｉｓ；　１ｍ１）クロマトグラフィーにかけ た。次に、同じバッファ中の０−０．５ＭのＮａＣｌの濃度勾配をかけ（全濃度 勾配容量６’０ｍ１）、結合した物質を溶出した。クロマトグラフィーは室温で 実施した。流速は１ｍ１／分、分画量は１ｍｌであった。第３図は得られた溶出 プロフィールを示す。活性は指示した画分からのアリコート（１５μｌ）を使用 して、上記２に記載のように測定したコラゲナーゼ阻害を表す。試料をかける間 に集めた画分は示していない。これらの画分には阻害活性はなかった。 ２、等電点クロマトグラフィー 阻害活性を有するＭｏｎｏ　Ｑカラムからの両分を合わせ、そのブー）しく１２ ｍ１）　’ｅ　２５ｍＭ　ｂｉｓ　丁由４ＣＩ、　Ｉｄ　ＣｌＣ１２，０，０５ ％（ｖ／ｗ）Ｂｒｉｉ−３５，ｐＨ７，４に対して透析し、同じバッファで平衡 化した１！ｏｎｏ　Ｐ等電点りｏｖトゲラフイーカラム（ＰｈｘｒｍｇｃｉＢ　 ４ｍ１）に室温でかけた。試料をかける間に集めた画分中には阻害活性は存在し なかった。１０倍に希釈し、ＨＣＩでｐＨ４に調整したポリバッファ７４　（Ｐ ｂｔｒｉｔｅｉｇ　）溶液を使用してｐＨ勾配を作ることにより結合した物質を 溶出した。１ｍｌの画分を０．５ｍｌ／分の流速で集め、直ちに、ＬＭ　Ｔｒｔ ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）５０μｌを加えてＴｒｉｓ−ＨＣＩ中５０ｍＭとし 、さらに２ＭのＴｒｉｓ塩基を加えてｐＨ７，５に滴定した。溶出プロフィール は第４図に示す。指示した画分からのアリコート（５μＩ）の阻害活性を上記２ に示したように測定した。約ｐＨ５，５で溶出される−４５）に阻害活性のピー クがあった。これらの後者の画分をプールし、１ｔｏｎｏ　Ｐ開始バッファに対 して透析し、最初の試料と同様にＭｏｎｏ　Ｐカラムで再びクロマトグラフィに かけた。回収した活性はまた速く溶出するピーク（約ｐＨ５，５）と遅く溶出す る部分とに再び分配され、始めのピークが回収活性の約１／３を占めた。この２ 回目のＭｏｎｏ　Ｐで後から溶出される物質を再度クロマトグラフィーにかける と、活性は同様に再分配された。 ３回のＭｏｎｏ　Ｐカラム全てからの初期に溶出される両分（ｐＨ５，５のピー ク）を合わせた。 ３、ゲル濾過 Ｍｏｎｏ　Ｐカラムからの合わせたプール（１５ｍｌ）を、固定アングルロータ で５０００Ｘ　ｇで遠心されたＡｍ１ｃｏｎ　Ｃｔ＋＋ｔｔｉｃｏｎ　１０　ユ ニットを使用して３ｍｌに濃縮した。次に、濃縮した試料を、５ｈｌｌｌＴｒ目 −ＨＣｌ、　２０ｈＭ　Ｎ５ＣＩ、　１０１Ｍ　ＣｓＣ１２，ｐＨ７，５で平衡 化したＳ！ｐｂｘｄｅｘ　Ｇ−１００ゲル濾過カラム（１，５ｘ９４ｃｍ）にか けた。２．１１の画分を流速５ｍ１／時で集めた。阻害活性の１つのピークが回 収され、カラム検量に使用した分子量マーカー（ミオグロブリン、Ｍ　ｒ　ＩＴ 、　Ｇｏｏ　；オボアルブミン、Ｍ　ｒ　４４．０００　；ガンマ−グロブリン 、Ｍ　ｒ　１５８．　Ｏｆ）“０）に対して２４．　Ｇｏｏの見かけの分子量で 溶出され、約１．５ＳＯＵ／ｍｇの比活性を有していた。 ピーク■から誘導された阻害剤の精製では、この段階では物質が最初の５ｚｐｈ ｘｄｅｘ　Ｇ−１００カラムでのピーク■の活性について正しい７０．０００− ７５．０００よりむしろ２４．０００の見かけの分子量で挙動するため、第２回 目の５ｓｐｂｘｄｅｘ　Ｇ−１００ゲル濾過ステツプが有用であることは特記す べきである。 ピーク■から誘導された物質の精製のまとめを第１表に示す。 第１表。（次ページ参照）。ウシ大動脈内皮細胞からの２つのメタロプロテイナ ーゼ阻害剤の精製。ステップ１及び２の後、阻害剤は指示したように別々に精製 された。回収率及び精製度はステップ２の５ｅｐｈｓｄｅｘ　Ｇ−１００ピーク の各々について、夫々１００％と１の値を割り当てて２つの阻害剤について別々 に計算した。 脚注： ａ　特記しない限り、標準としてＢＳＡを使用するＢｒ＊ｄｌｏ＋ｄの方法［Ａ ｕ１．Ｂｉｃｃｈ、７２．２４８−２５４（１９７６）　］　テ測定。 ｂ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色したバンドの強度に基づき概算。 第　１　表 １、限外か過で 濃縮した ならし培地　６４　１．２７　９０７　７．２　−　−２、５ｅｐｂｓｄｃｘ　 Ｇ−ＬＯＧ ビークＩ由来の阻害剤 ２．１　ピークＩ　３１２　２２．５　２０２　９　（１００）　（１）２、１ ．１ ＭｏｎｏＱ　１７　２．２　１２１　５５　５９　Ｇ２、　ｔ、　２ Ｍｏｎｏ　Ｐ　３　〜０．１　６２　〜６２０　３０　８６２、１．３ Ｓｅｐｈｘｄｃｒ Ｇ−１００１２〜０．０２ｂ３１　〜１．５５０　Ｉｓ　１７２２．２　ピーク ＩＩ ！、２．１　４７０　１６．４　６９５　４２　（１（ｔｏ）　（１１ヘパリン − ５ｓｐｈ＊ｒｏｓｅ　７．５　２．６　３３０　１２６　４７　３關ｏｎｏ０　 １２　Ｇ、１６　２９２　１．７１１０　４２　４２ｄ、ピークＩＩの精製 １．ヘパリン−セファ０−ス ゲル濾過からのピークＩＩ物質（４６５ｍｌ；上記３ｂ）を２５ａ＋Ｍ　カコ’ ）ルＷＩナト！Ｊ　ラム−ＨＣｌ、ｌ０ＭＭ　ＣＩＣＩ２．　０．０５％（ｖ＃ ）Ｂｒｉｉ−３５，ｐＨ７，５に対して透析し、このバッファで平衡化したヘパ リン−セファロースカラムクロマトグラフィーにかけた。 カラムを洗ったあと、同じバッファ中のＩＭ　Ｎ＊ＣＩ　までの直線濃度勾配に より結合物質を溶出した［Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｃｋ、＾＋ｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｔｍ。 Ｂｉｏｐｈ７富、ユせ、２Ｂ−３７（１９１１８１参照］。 ２゜陰イオン交換 ヘパリン−セファ０−スからの活性画分を合わせ（全量７．５ｍ　ｌ　）　、２ ｈｉＪ　Ｔ＋１ｓ−ＨＣｌ、ｌｄ　ＣＩＣＩ２．　ｐＨ７，５に対して透析した 。次に、物質を分けて、上記（ｃ、１）のように２つの別々な１Ｊｏｎｏ　Ｑカ ラムクロマトグラフィーにかけた。回収した活性の８０−９０％は試料をかける 間に集めた画分（未結合）に存在し、約１．７８０Ｕ／ｍｇの比活性を有する高 度に精製されたビークＩＩ由来の阻害剤物質を表していた。活性の残部は塩勾配 で初期（約０．０６５Ｍ　ＮａＣりに溶出された。 ピークＩＩから得られた物質の精製のまとめは第１表に示す。 ４、ビーク■由来及びピークＩＩ由来の阻害剤の特性化ａ、　Ｌｘｃｍｍｌｉの 方法［Ｎｔｌ＋＋ｔｅ　２２−７．６８０−６８５（１９７０）　］により５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥを実施した。スタッキングゲルは４％（Ｗ／Ｖ）のアクリルアミド を含有し、分離ゲルは１２．５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドを含有していた。 試料は、還元または非還元条件、すなわち処理バッファ中に２−メルカプトエタ ノールを含むまたは含まない条件で調製した。電気泳動実施後、ゲルを銀染色［ Ｍｏｒｒｉ＋ｓｃ７．＾ｎｔｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１７，３０７−３１０（ １９８１）］またはイムツブｏ−７テイング［Ｂｕｎｅｌｌｅ、Ａｕ１．　Ｂｉ ｏｃｂｅｍ、１１２゜１９５−２０３（１９８１）　３　した。 １、ピーク■由来の阻害剤 ５ｅｐｂｓｄｕ　Ｇ−１００カラム（上記０．３）からの活性画分は全て、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにかけ銀染色すると明らかになるかなりはっきりした主要なバンド を含有し、移動するこのバンドは見かけ上の分子量２４．０００−２８．０００ ’（還元）及び１９．０００−２２．口００（非還元）を示す。このバンドは前 のステップ（上記ｃ、２　；　Ｍｏ５ｓ　Ｐ）からの活性画分でも明らかであっ た。この位置に活性と物質のバンドとがこのように同時に溶出されることはバン ドが活性蛋白質を表しているという結論と一致する。このバンドは第５図Ａのレ ーン１及び２に見られる。これらのゲルでは、最終的なゲル濾過プール（上記ｃ 、３；第３；、ステップ２．　１．　３）１００μｍを載置した。レーン１は還 元型、し〜ン２は非還元型であった。還元型と非還元型の移動の違いは恐らく非 還元型の場合の鎖内ジスルフィド結合の存在を反映している。 第５図Ｃ，レーン１は同様の試料（２５０ｍＵ　；非還元）についてのイムノブ ロッティングした５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示している。イムノブロッティング の一次抗体はウシ血管平滑筋細胞由来のＴＴＭＰに対するウサギポリクローナル 抗体（ＤｔＣｌｓｒｅｋ、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｕ＋、　ＢｉｏｐＪ、　、 上記）を１　：　５００希釈−次抗体の使用で可視化されるバンドは１つもなか った。第５図Ｃル−ン３はウシ血管平滑筋細胞由来のＴＩＭＰ（１６０ｍＵ；非 還元）はこの抗体の使用により可視化されることを示していることと示しておく 。 ２、ビークＩＩ由来の阻害剤 ＭｏＩＩｏ　ＱりＯ？トゲラフイー（上記６．２１表１、ステップ２゜２．２； ７５μｌ載置）からの未結合物質についての銀染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥを第５ 図のレーン３（還元型）及び４（非還元型）に示す。染色物質は分子量範囲３０ ．０００−３４．０００　（還元型）及び２７．０００−３１．０００　（非還 元型）を表すかなり広範な領域にわたり移動する。 第５図Ｃのレーン２は、ピークＩＩ由来の阻害剤（２４０ｍＵ載置；非還元型） はウシ血管平滑筋細胞ＴＩＭＰに対する抗体を使用するイムノブロッティングを 用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥで可視化されることを示している。 ｂ、５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥ 銀染色で可視化されるような５ＤＳ−ＰＡＧＥの主要なバンドは、ゼラチン分解 酵素阻害活性養育する蛋白質を同定する５ＤＳ−ゼラチンポリアクリルアミドゲ ルを使用しても同じ分子量位置で可視化される［Ｈｅｒｒｏｎら、］、　Ｂｉｏ １．　Ｃｈｅｔ　２６１．２８１４−２１１１８（１９８６）；　Ｄｅ　Ｃ１ｅ ｒｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅｓｒｅｂ　、上記；及びＤｅ　Ｃ１ｃｒｅｋ 、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｔｍ、　Ｂｉｏｐｂ７．、上記参照］。この方法では 、１０％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド及び０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンを含むゲル を使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥに試料をかける。次に、２．５％（ｗ／ｖ）　Ｔｒ ｉ！ｕ　Ｘ−１００を２回替えてゲルを３時間インキュベートしてＳＤＳを除去 し、ウサギ滑膜繊維芽細胞からの酢酸ｐ−アミノフェニル第二水銀（ＡＰＭＡ） で活性化したならし培地１０ｍ１中、３７℃で１時間インキュベートしてゼラチ ンを分解し、次に５０ＭＭ　Ｔ山−ＩＣ！、ｌｌ１１Ｍ　Ｃ＊ＣＩ２゜ｐ）Ｉ７ ．　Ｓ中で一晩インキュベートした。次いで、ゲルをクーマシーブルーで染色し 、メタノール：酢酸：水（５０：１０：４０）で脱色した。コラゲナーゼ／ゼラ チナーゼ阻害活性を有するバンドは未分解のゼラチンを示す暗（青）域として現 れる。次の試料（すべて非還元型）についてこの方法を使用した結果を第５図Ｂ に示す：レーン１、部分的に精製されたピークｌ由来の阻害剤（５０ｍＵ載置） ；レーン２、ピークｌ由来の阻害剤（２４０ｍＵ載置）；レーン３、ウシ血管平 滑筋細胞ＴＩＭＰ（１６０ｍＵ載置）。前記のように、暗域はゼラチン分解酵素 阻害活性を有する蛋白質を表す。結果はさらに、精製された馬製物中の主要な銀 染色バンドはメタロプロテイナーゼ阻害剤活性を有する蛋白質を表すという結論 を支持している。 Ｃ，プロテイナーゼ試料の５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥゼラチナーゼ、トリプシン またはプラスミン阻害活性について調製物をさらに調べるために、プロテイナー ゼ含有試料を５ＤＳ−ゼラチンゲル（上記）上で電気泳動した。次に、２．５％ （ｗ／ｖ）丁ｒｉｔｏｎ　ｌ−１００を２回替えて、その中でゲルをインキュベ ートしてＳＤＳを除去し、次いで阻害活性について調べる調製物を含むまたは含 まない５ｈｉＪ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ、　１０ｓｌｊ　ＣｓＣ１２，ｐＨ７，５ 中で一晩インキユベートし、クーマシーブルーで染色し、そして脱色した（上記 の５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥ法と同様に）。第６図参照。この図のレーン１．２ 及び３については、電気泳動した試料は各々、ＴＰＡ処理したウサギ溝膜繊維芽 細胞からのＡＰＭＡ活性化ならし培地（コラゲナーゼ活性１．２’ｍＵＨ本実施 例の２節を参照のこと）、ウシトリプシン（０，０１Ｍｇ）及びヒトプラスミン （０，０３Ｍｇ）であった。標識した「ＭＩＪの場合には、ピークｌ由来の阻害 剤（０，２Ｕ／ｍｌ）も含めてゲルを一晩インキュベートシた。透明域は電気泳 動したプロテイナーゼ試料のゼラチン分解活性を示している。「対照」例と比較 すると［ＭＩｊはコラゲナーゼを阻害する（「対照」レーン１でＭｒ約６８，０ ００及び９２．０００で透明域）が、トリプシンまたはプラスミン（メタロプロ テイナーゼではない）を阻害しないことを特記する。同様に、第６図では、予想 通り、（２０ｍＭ含む）キレート剤［ＥＤＴＡＪはコラゲナーゼを阻害したが、 トリプシンまたはプラスミンを陽害しなかったごとが判る。 ｄ１種々のコラゲナーゼ及びメタロプロテイナーゼの阻害第２表はピークｌ由来 の物賀がコラゲナーゼ、ゼラチンゲル及びＩＶ型のコラゲナーゼを阻害したが、 細菌のコラゲナーゼを阻害しなかったことを示している。 第　２　表 種々のコラゲナーゼに対するピークｌ由来阻害剤の作用ピークｌ由来 酵　素　基　質　の阻害剤の量　阻害率（ｍｕ）　（％） Ｉ型コラ−ゲナーゼ　Ｃ＠識■型 ＋　、ｄ コラーゲン　５０　１００ ゼラチナーゼ１　１４Ｃ標識■型 コラーゲン、　２００　９０ 熱変性１ ｂ　１４ 細菌コラゲナーゼ　Ｃ標識Ｉ型 ＋　、ｄ コフーゲ７　２００　０ Ｉｖ型コラゲナーゼ　Ｃ標識ＩＴ型 ＋　−ｄ コラーゲン　２００　６６ ａ　ＴＰＡ処理したウサギ溝膜繊維芽細胞からのトリプシン活性化ならし培地（ ４０ｍＵ　；実施例１．２節参照）。 ｂ　Ｃｌｏｓｊｒｉｄｉｕｍ　ｈｉ＋ｌｏｌｌｌｉｃｗｍ由来のＩＩＩ型（３４ ｍＵ）（＾ｄｙｇｎｃｅ　Ｂｉｏ＋５ｃｊｎｒｅＣｏｒｐ、、　Ｌ７ｎｂ＋ｏｏ ｋ、　ＮＪ）　。 Ｃマウス細網細胞肉腫細胞系からのトリプシン活性化ならし培地（１０４倍濃縮 した培地Ｓｏμｌ　；　Ｄｅ　ＣＩｃ＋ｃｋ、＾ｒｃｈ。 Ｂｉｏｃｈｓｍ　、　ＢｉａｐＪ、　、上記参照）。 ｄ　実施例１．２節参照。 ｅ　６０℃で２０分間熱変性。 ｅ、ピークｌ由来の阻害剤の非存在下及び存在下でのＩ型（古典的な）コラゲナ ーゼにより生じた１４Ｃ−標識コラーゲン分解産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥを第７図 に示す。１４Ｃ−標識Ｉ型コラーゲン（３０，０００ｃｐｓ）を種々の添加物と 共に、実施例１の２節の阻害アッセイについて記載した条件下、２２℃で１６時 間インキュベートした。次に、ＥＤＴＡ　（２０ｍＭ）を加えてメタロプロテイ ナーゼ反応を阻止し、試料を勾配ゲル（５−１５％アクリルアミド）を使用する ５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルをＡｗ！ｏ＋ｌ５ｏｒ　（Ｎｓ口ｏｎｘｌ　Ｄ ｉＢｅｏｓｉｌｉｃｓ、　Ｍｕｖｉｌｌｅ、　ＮＪ　）中でインキュベートし、 乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。 第７図：レーン１、添加なし；レーン２、ＴＰＡ処理したウサギ模膜繊維芽細胞 からのＡＰＭＡ活性化ならし培地（実施例１．２節に記載のように調製した、コ ラゲナーゼ活性４０ｍＵを含有した培地５μｍ）；レーン３、レーン２と同様の 試料で、さらに部分的に精製したビークＩ由来の阻害剤（５０ｍＵ）を含む。図 中、ＴＣ及びＴＣｂは全長のαコラーゲンポリペプチド鎖を単一に特異的に切断 した３／４長及び１／４長の断片を表し［Ｇ＋ｏｓｓ　ら、　Ｂｉｏｃｂｔｍｉ ｓｌＢ　５４．　１１９７−１２０４（１９６５）　］　、βは二量体α鎖を表 す。この結果は、ピークＩ由来の阻害剤の阻害活性はＣ０ＯＨ末端から４分の１ に位置する、咄乳類コラゲナーゼの特徴である単一のペプチド結合切断に対する ものであり得ることを示している。 ｆ、熱、酸、還元−アルキル化及びトリプシン処理に対する感受性について、精 製したピークＩ由来及びビーク１１由来物質を特性化した。結果を第３表に示す 。 第３表 ピークＩ由来及びピーク！■由来の阻害剤の安定性。阻害剤試料（２Ｕ／■Ｉ） は、用量−阻害曲線から決定した残存抗コラゲナーゼ活性についてテストする前 に、指示したように処理された。 ビークＩ由来　ビーク１１由来 の阻害剤　の阻害剤 （＾）熱’　３７℃　０　１１ ５０℃　０１１ ８０℃　４９３０ １００℃　５９４４ 、ｂ （Ｂ）トリプシン　ｌ：１　１０　０ １０＋１　２８　２１ ５０：ｌ　１Ｇ０　１００ （Ｃ）酸　ｐＨ４，５，２２℃、ｌｈ　０　０（ＤＪ　還元−７／Ｌ４ル化’　 ｔｏｏ　１００ａ　阻害剤試料は指示した温度で１時間インキュベートした。 未処理試料と比較して阻害活性の損失を計算した。 ｂ　試料は指示したトリプシン：阻害剤比（ｗｏｗ）で、３７℃で１時間インキ ュベートした。次に、５倍重量過剰の大豆トリプシン阻害剤で反応を止めた。ト リプシン−大豆トリプシン阻害剤混合物の存在下、３７℃で１時間インキュベー トした試料と比較して活性の損失を計算した。 Ｃ２−メルカプトエタノール（２０ｍＭ）を加えて、４℃で１６時間試料を還元 し、ヨードアセトアミド（２０ｍＭ）により、３０℃で１時間アルキル化した。 同じ温度でインキュベートした試料と比較して活性の損失を決定した。２−メル カプトエタノール及びヨードアセトアミドはコラゲナーゼ活性に影響しなかった 。 実施例　２ ビークＩ由来及びピークＩｆ由来の阻害剤のアミノ末端アミノ酸配列分析；ピー クＩ由来の阻害剤のアミノ液組成分析＾ｍ１ｃｏ口Ｃｅｎ１ｒｉｅｏａ　１Ｇ限 外濾過ユニツトを使用して、ピークＩ由来の阻害剤（４，８ｍ１Ｈ表１、ステッ プ２．　１．　３）を濃縮し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７，８）中に 導入した。ポリブレンを前もって循環しておいたシークエンサーカートリッジの ガラスファイバーディスク上に試料をスポットした。 試料を含有するガラスファイバーディスクをＮ２流下で乾燥させた。＾ｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　ＣＮ３．　Ｃ＾）が提供する標 準プログラムを使用して、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｓｅｓ　４７７型蛋 白質シークエンサーにより、発表された方法［Ｈｅｖｉｃｋら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、２５６．　７９９０−７９９７（１９Ｂり　］に従ってアミノ末端ア ミノ酸配列分析を実施した。Ｂｒｏｗｎｉ！ｓ逆相Ｃ−１８カラムを使用する１ ２０型オンラインＰＴＨ−アミノ酸分析機で放出されたフェニルチオヒダントイ ン（ＰＴＨ）−アミノ酸を分析した。得られたクロマトグラムを９００型デニタ モジユールで解析した。 平均反復収率９４％で約１５８ｐｍｏｌの初回収率が得られた。 ４２位でアミノ酸指示を得た。繰り返し配列決定すると、さらに３つのアミノ酸 （４３−４５位）が指示された以外指示は初回の配列決定のものと完全に同一で あった。第４表は指示されたアミノ末端アミノ酸配列を示す。 第４表 ビークｌ由来ウシ阻害剤のアミノ末端配列１　２　３　４　５　６　７　Ｂ　９ 　１０１１　１２　１３（Ｃｙｓ　）−５ｅｒ−（Ｃｙｓ　）−５ｅｒ−Ｐｒｏ −Ｖａ　１−Ｈ１５−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ａｌ　ａ−Ｐｈｅ−（Ｃ ｙｓ@）− Ａｓｎ−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｖａ　１−１１　ｅ−Ａｒｇ−Ａｔ　 ａ−Ｌｙｓ−Ａ１　ａ−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ− Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＪｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−−−−−残基１．３ 及び１３に関しては、°これらのサイクルで何ら他の指示がなされ得ず、また使 用した配列決定法ではシスティンは検出できないため、これらをシスティンと指 示した。 配列を比較するために、精製したピークＩＩ由来の阻害剤調製物（２，２５ｍ１ ；第１表、ステップ２．２．２．ビークＩ由来の阻害剤について記載したように 調製した）もアミノ末端配列分析にかけた。第５表に示す配列が得られた。 第５表 ピークＩＩ由来ウシ阻害剤のアミノ末端配列（Ｃｙｓ　）−Ｔｈｒ−（Ｃｙｓ　 ）−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈ１Ｓ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｎ−Ｔｈｒ−Ａ１　 ａ−Ｐｈｅ−（Ｃｙｓ　j− Ａｓ　ｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−１１　ｅ−Ａｒｇ−Ａ１　ａ −Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａ１ａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−（Ａ ｓｎ）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ− Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−［Ｌｅｕｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−５ｅ ｒ−ＩＧ］幻−Ｐｈｅ−−−初回収量は約２８０ｐｍｏｌであり、平均反復収率 ！家９２％であった。残基１．３及び１３は上記理由からシスティンと指示され た。残基３０も回収されず、続く配列（Ａｓｏ−Ｇｌａ−Ｔｂｒ、、、） がＡｓｎに結合されたグリコジル化部位と一致すると思われるためにアスパラギ ンと指示された。４３及び４８位（括弧内）の指示は完全に確実なものではなか った。 これらの様々な分析（実施例１及び２）に基づき、ピークＩＩ由来の物質がウシ ＴＩＭＰであることはほぼ確かである。 ヒトＴＩＭＰは非常によく特徴付けられており、クローン化されている（Ｄｏｃ ｂｅｒ１７ら、Ｎｌ１ｕｒｃ、上記；　ＣｌｒｍｉｃｂＩｅｌら、Ｐｒｏｃ。 Ｎ５ｔ１．　ＡＣ墨ｄ、Ｓｃｉ、υＳ＾、上記）。ヒトＴＩＭＰのアミノ末端配 列とビークＩＩ由来の物質を比較すると、最初の２９個の残基についての相同性 は９３％であり、最初の４９個の残基についての相同性は８０％である（第６表 参照）。また、単離したウシのビークＩｆ由来の物質はＴＩＭＰの生化学的性質 の多く、すなわち、種々の精製ステップでの行動、５ＤＳ−ＰＡＧＥでの挙動、 及びイムノブロッティングを使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でのウシ平滑筋ＴＩＭ Ｐに対する抗体による認識（実施例１）を有している。 ピーク夏由来の物質（ＭＩ）はＴＩＭＰとはアミノ酸配列が明らかに違う（第６ 表）が、ＴＩＭＰとの相同性はある。最初の２９個の残基についての相同性は６ ５％であり、最初の４５個の残基についての相同性は４７％である。これらの分 子のクロマトグラフィーでの挙動及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動度は異なり、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ後のイムノプロットにおいてウシ平滑筋ＴＩＭＰに対する抗体 はピーク■由来物質を可視化しない（実施例）。この新規なビークｌから得られ た阻害剤をメタロプロテイナーゼ阻害剤（Ｍｌ）とする。 最初の４５個の残基については、ピークＩ由来及びピークＩＩ由来のウシ阻害剤 は互いに５１％の相同性を有している。 第６表 （１）ヒトＴＩＭＰ’、（２）ピークＩ！由来のウシ阻害剤（Ｔ　ＩＭＰ）　ｂ 及び（３）Ｌ”−りｌ由、！ｌＤウシ阻害剤（Ｍｌ）’１　峠　ＴＩＭＰ　にＭ Ｔ　に１４ＹＫ　Ｇ　Ｆ２　？１／　ＴＩＭＰ　にＭ　（Ｌ）　Ｋ　Ｍ　Ｐ　Ｓ 　（Ｇ）　Ｆ−佛・３　ウＶＭＩ　ＫＲＩＹ ａ　Ｄｏｃｋｓ目ｙら、ＮｌｌＨｅ％上記；、Ｃｓｒ＋ａｉｃｈｓｅｌら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎ１１ｌ。 Ａｃ５１．　Ｓｃｉ、　υＳ＾、上記から。　９ｂ、ｃ　実施例２に記載の配列 分析から。 ピーク■由来のウシ阻害剤（Ｍ　Ｉ　）のアミノ酸組成を第７表に示す。＾ｍ１ ｃｏｎ　Ｃｅ＋＋ｔ＋１ｃｏｎ　１０限外濾過ユニツトを使用して、ビークＩ由 来の阻害剤試料（１，２ｍｌ；第１表、ステップ２゜１．３）を濃縮し、５０ｍ Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７，ｌｌ）中に導入した。次に、試料を乾燥させ 、Ｌ益ら［Ｊ、　Ｃｈｒｏｍｘｌｏ！。 ３６８、２１５−２３１　（１９８６）　］が記載した方法によりアミノ酸組成 を分析した。これは、試料の酸加水分解（２４時間）後に生じるフ用して１分子 当たりの平均残基数を算定した。これらの分析の各々について、出発試料の１０ 分の１から得られる量の物質を使用した。１分子当たりの残基数を計算するため に使用した全アミノ酸の値（１７８）は成熟ウシＭ１ついての遺伝子コード配列 から得た（実施例３、第１図）。 茶７表 ピーク■由来のウシ阻害剤（Ｍｌ）のアミノ酸組成分析Ｌｙｓ　１５．５　Ｊ６ 　１フ Ｈｉｓ　３．６　４　４ Ａ　ｒ　ｇ十Ｔｈ　ｒ　１５．９　１６　Ｇ＋６＝１２Ａ　ｓ　ｘ　’　２２． ９　２３　２２Ｓｅｒ　ＩＯ’、９　１１　１Ｇ Ｇｌｘ’　１９．４　１９　１９ Ｐｒｏ　８．１　８　１２ Ｇｌｙ　１４．２　＋４　１３ Ａ　ｌ　ａ　１５　１５　１６ Ｖａｌ　９　９　８ １／２−Ｃｙ　ｓ　ｎ　ｄｂ（１２） Ｍｅｔ　３．１　３　５ １１ｅ　１４．６　１５　１９ Ｌｅｕ　１０．８　ＩＩ　７ Ｔｙｒ　７．１　？　？ Ｐｈｅ　７．７　８　？ ｌｌｌ　１７９　１’１８÷１２＋４＝　１９４ａ　Ａｒｇ及びＴｈｒは使用し た方法では分離できなかった。 ｂ　測定せず。 Ｃ成熟ウシＭｌポリペプチドの遺伝子コード配列からの値；実施例３、第１図参 照。 実施例　３ ウシ及びヒトのメタロプロテイナーゼ阻害剤遺伝子のクローニング 上記のように、ウシメタロプロテイナーゼ阻害剤のアミン末端アミノ酸配列を決 定し、ＤＮＡのセンス鎖（またはｍＲＮＡ）とハイブリッド形成するために３つ のプローブを設計し、ＤＮＡ合成装置（＾ｐｐｌｉｓｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｅｍｓ 　３８０　Ａ型及び３８０Ｂ型）で合成した。最初のプローブはアミノ酸４＝１ ９に対応する領域を認識するために、Ｌｗｂ！ｓの方法［Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉ ｏｌ、１８３、■−１２（１０５）］により長い非縮重プローブとして設計され 、これは次のようなものである： ＾ＣＡＧＧ　３’　。 第２及び第３プローブは４倍縮重の位置にイノシン塩基を含む縮重グローブとし て設計した。第２プローブはアミノ酸２１−３０に対応する領域を認識し、次の 通りである：（Ｔ）　（Ｔ）　（Ｔ）　（ＴＩ Ｓ’　ＧＴＣｌＡＣ（Ｃ）丁Ｃ（Ｃ）丁Ｔ　（Ｃ）ＴＴ　ＧＴＴ　ｌＡＣＩＧＣ （Ｃ）ＴＴ　ＩＧＣ３’　。 括弧は、プローブ調製において多数のオリゴヌクレオチドに導く、２つの塩基の 導入を示している。第３プローブはアミノ酸３２−４１に対応する領域を認識し 、次の通りである＝（Ａ）（＾）　（＾）（Ａ） ５’　ＣＴＴ　ＩＡＴ　ＩＧＧ　（Ｇ）ＴＴ　ＩＣＣ（Ｇ）ＴＡ　ＩＡＴ　（Ｇ ）ＴＣ（Ｇ）ＴＴ　ＩＣＣ３’ウシ大動脈内皮細胞から単離したｍＲＮＡで作製 したλｇ目１ｃＤＮＡライブラリーはＣＬＯＮＴＥＣ）Ｉ　Ｌｘｂｏｔ＆ｔｏｒ ｉｔｓ、Ｉｎｃ、　（Ｐｓｌｏ　Ａｌｔｏ。 Ｃ＾）から購入した。約１０６個のファージを、宿主細菌株Ｙ１０９０を有する ８枚の２３ｘ２３ｃｍ平方のプレートに載せた。 各プレートからの２つのリフトをＧｕｅＳｃｒｅｕ　Ｐｌｕｓ（Ｄｕｐｏｎｌ） 　ハイブリゼーシ５ントランスファー膜上に置いた。１組の膜を３２Ｐ−ホスホ リル化プローブ２とハイブリッド形成させ、他の組の膜は３２Ｐ−ホスホリル化 プローブ３とハイブリッド形成させた。６ＸＳＳＣ，５ＸＩｌｅｎｈｘｔｄｔ＠ 、０．５％（ｖ／ｙ）　ＳＤＳ、５０　ｔｔ　ｇ／ＩＩのせん断、変性させたニ シン精子のＤＮＡ中、５０−５５℃で一晩ハイブリッド形成させた。約５５℃で 、５ｘ　ＳＳＣ，０，５％（ｖ／マ）　ＳＤＳ中でフィルターを洗った。オート ラジオグラフィー後、両方のプローブとハイブリッド形成した３つのクローンを 同定した。 各々について単離プラークが得られるまでこれらのクローンを再度スクリーニン グした。ＰｒｏｍｐｔからのＬｓｍｂｄｓＳｏｔｂ　ＰｈｉｓＡｄｓｏｒｂｅｎ ｌを使用して３つのクローンの各々についてミニλフアージ調製物を作製した。 数個の制限酵素を使用して３つのクローンを制限エンドヌクレアーゼで消化する と、３つのクローン全部が同一であり、製造元によるｃＤＮＡライブラリー増幅 によりそれらのクローンが得られたことを示した。サザンブロッティング分析に より、同じ制限断片はプローブ２及び３のみとだけではなくプローブ１とも同様 にハイブリッド形成することが判った。 制限エンドヌクレアーゼ分析により、ｃＤＮＡクローニングの間に右側のＥｃｏ ＲＩ部位が消失したことを示した。従って、消失したＥｃｏＲ１部位から約１キ ロペニス（ｋ　ｂ）のλｇｔ１１中の左側のＥｃｏＲ１部位から８８１１部位の ｃＤＮＡＤＮＡ含金断片ｃ　１９にクローニングしてｐＵＣＢＭ＋を生成させた 。次に、５ｘＢｅｒらのジデオキシ法ＣＰＩＯＣ，Ｎ暑ｔ１．　Ａｃｘｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　１４．　５４６３−５４６７（１９７７）］を使用して、両方向の 重なり合った制限断片をｐＵｃＢＭＩからＭ１３膳ｐベクターにクローニングし て遺伝子の配列を得た。第１図に示すように、遺伝子は２６個のアミノ酸のリー ダー配列を有する１９４アミノ酸の成熟蛋白質をコードする。成熟蛋白質の最初 の４５個のアミノ酸は精製蛋白質（実施例２）について決定したアミノ末端配列 と正確に一致する。さらに、成熟ウシＭＩポリペプチドの遺伝子コード配列から 決定したようなアミノ酸組成はピークＩ由来のウシ阻害剤（実施例２、第７表参 照）について実験的に得たものに一致し、クローニングした遺伝子が実施例１の 精製したＭ！ポリペプチドに相当するという証拠をさらに提供する。第１図の遺 伝子によりてコードされた配列に基づく、成熟ウシＭｌポリペプチド鎖の分子量 は２１．６９３である。 ヒトＭｌ遺伝子配列用にヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために 、ウシメタロプロテイナーゼ阻害剤をコードする領域のアンチセンス鎖配列と正 確に一致する４つの長いオリゴヌクレオチドプローブ（５１−ｍｅｒｓ）をＤＮ Ａ合成　゛装置（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７＋ｌｓｍ＋　３８０　Ａ型及び３ ８０Ｂ型）で製造した。４つの配列は次の通りであったニブローブ１ ５’　ＣＧＧ　ＧＴＣＣＴＣＧＡＴ　ＣＴＣＣＡＧ　人＾Ａ　ＣＴＣＣＴＧ　Ｃ ＴＴ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＴＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＧ　Ｃ７人　３′　。 プローブ２ ５’　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＧＧＣＣＴＣＧＴＧ　ＴＣＣＧ丁ＴＧ＾丁　ＧＴＴ　Ｃ ＴＴ　ＣＴＣＣＧＴ　ＧＡＣＣＣＡ　ＧＴＣＣＡＴ　ＣＣＡ３′。 プローブ３ ５’　ＧＣＡ　ＣＴＣＡＣＡ　ＧＣＣＣＡＴ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧ 　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣ３’　。 プローブ４ ５’　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＧＣＣＧＴＡ　ＧＡＴ　ＧＴＣＧＴＴ　ＧＣＣＡＧＡ　 ＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＣＴＧＣ３’　。 ヒト心臓組織（胎児大動脈）から単離したｍＲＮＡを用いて作製されたλ１１１ 　ＣＤＮＡライブラ１）−をＣＬＯＮＴＥＣＨＬｒｂｏ＋ｓ！ｏｒｉｅｓ、ｌ＋ ｃ、から購入した。宿主細菌株Ｙ１０９０を有する８枚の２３Ｘ２３ｃｍ平方の プレートに約１０６のファージを載せた。 ＧｅＩＩｅＳｃｒｅ＊ｎ　Ｐｌ■ハイブリダイゼーシタントランスファー膜上に 各プレートからの２つのリフトを載せた。上記のハイブリッド形成及び洗浄条件 を使用して、１組の膜は３２Ｐ−ホスホリル化したプローブ１と２の混合物とハ イブリッド形成させ、２組目の膜は３２Ｐ−ホスホリル化したプローブ３と４の 混合物とハイブリッド形成させた。３つのクローンが両組のプローブとハイブリ ッド形成し、単離プラークが得られるまで、これらのクローンを再スクリーニン グした。上記のようにミ冊λファージＤＮＡ調製物を作製し、ＤＮＡを制限エン ドヌクレアーゼ消化した。３つのクローンは同様であったが長さが異なり、従っ てクローンの１つをλｇｔｌｌから、両方向のＥｃｏＲＩからＥｃｏＲＩまでの Ｍ２Ｓ　ａ＋ｐ９にサブクローニングした。次に、このＥＣ０ＲＩ断片をＭ２Ｓ 　ｉｐ９からＰＵＣ１９ヘクローニングしてｐｕｃ　ＩＩＭ＋を生成させた。Ｓ ｇｎｇｅｒのジデオキシ方法（Ｐ＋ｏｃ、Ｎｇｌｌ、　Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、上記）を使用して、Ｍ２Ｓ　ｍｐ９中の元のクローン及び、両方向でｐｔ＋ ｃ　）ＩＭ＋からＭＩ３　ｍｐベクターへクローニングした他の重なり合テイナ ーゼ阻害剤遺伝子と同様に、別の２６アミノ酸のリーダー配列を有する１９４ア ミノ酸の蛋白質をコードする。２つの遺伝子は成熟蛋白質に対応する１９４アミ ノ酸の１１で異なるアミノ酸をコードする。第２図の遺伝子コード配列に基づく 成熟ヒトＭｌポリペプチドの分子量は２１，７３０である。 実施例４ にお番　ヒトメ　ロプローイ　−ゼ　のリーダー配列のアミノ酸１のＮｃｏ１部 位と、成熟タンパク質のアミノ酸４２のＢａｍＨ１部位と、終結コドンの下流の Ｓｔυ１部位３ヌクレオチドとを用いて、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に成熟ヒト メタロプロティナーゼ阻害タンパク質を発現させた。 先ずＮｃｏｌからＳｔｕ　Ｉまでのフラグメントを、ｐｃＦＭ　１１５６　ｐｔ 、からなる発現ベクター（ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを用い て５ｓｔ１１部位で平滑化したもの）中のＨｃｏｌがら５ｓｔｌｒまでの部位に クローン化してｐＨ５６ＨＨＩＩを形成したく第８図）、　７ラスミＦｐＣＦＭ 　１１５６　ｐＬ４．ｔ７ラスミ）’ｐＣＦＭ　８３６（本明細書に参考として 含まれる米国特許第４，７１０，４７３号参照）から誘導することができ、その 場合はＴ４ポリメラーゼ酵素での末端充填（ｅｎｄ　ｆｉｌｌｉｎｇ）によって ２つの内因性Ｎｄｅ　１制限部位を破壊し、次いでプラントエンド連結反応を行 って、合成ｐｔ、プロモーターを含む非反復＾ａｔｌｌ制限部位及びＣＩａｌ１ Ｍ＠部位間のＤＮＡ配列をｐｔ、プロモーターを含むｐｃＦＨ８３８（米国特許 第４，７１０，４７３号参照）由来の類似のフラグメントで置換し、且つ非反復 Ｃ１ａｒｖ１限部位及びＫｐｎｌ制限部位の間の小さいＤＮＡ配列を下記のオリ ゴヌクレオチドで置換する。 挿入するｐＬプロモーターＤＮＡ配列は下記の通りである。 写 リポソーム結合部位と開始メチオニンコドンと成熟ヒトＭｌの最初の４２個のア ミノ酸のコドンとを含む合成りＮ＾フラグメントを構築した（第９図）、先ず、 このフラグメントをＭ１３ｍｐＨ中のＸｂａｌがらＢ＋ｉｍｔｌ　Ｉまでの部位 にクローン化して。 サンガーのジデオキシ法（前出のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ ＾参照）により配列を確認した０次いでこの肋ａｌ〜ｂ１ＥｌフラグメントをＭ １３　ｍｐＨがらｐＨ５６ＨＭＩＩにクローン化してｐＨ５６１ｆＭＩ２を形成 した（第８ズ）。 このプラスミドを、染色体上に温度忌受性λＣｌリアレッサーを含む大腸苗株Ｆ Ｍ５　（＾ＴＣＣ寄託ｎｏ、５３９１１）に取入れて形質転換を起こした。この プラスミドは、λＰＬプロモーター／オペレータ領域を含み、温度感受性レプリ コンを有する。 ｐ１１５６８Ｍ１１２を抱えた大腸菌株ＦＭ５を２８℃で培養するとプラスミド コピー数が１０〜２０コピー／ａｔ胞に維持され、λｐＬプロモーターからの転 写が温度怒受性リプレッサーによって調節される。４２℃で増殖させるとコピー 数が増え、λｐｔプロモーターにおいてリプレッションが解除される１組換ヒト メタロプロテイナーゼ阻害物質はブロモ−゛ターの活性化及びプラスミドの増幅 の結果とし、て高温で蓄積され始める。 λｐＬプロモーターはリポソーム結合部位及びヒトメタロプロテイナーゼ阻害物 質のメチオニン開始コドンのすぐ上流に位置する。転写終結因子ｔ−ｏｏｐは遺 伝子の３″端末の近傍の２つの翻訳停止コドンのすぐ下流に位置する。プラスミ ドａｌ１５６８８１２を抱えた菌株Ｆ１４５を、Ｔｓｉｉらのデュアルフィード （ｄｕａｌ−ｆｅｅｄ）培地（Ｊ、ｒｎｄｕｓｔ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　２， １８１−１８７（１９８７））を用いて増殖させた。誘導は６００ｎｍでの光学 密度（ＯＤ＊ｏｏ）が約３０になった時点で温度を４２℃にすることにより実施 しな、ｉｋ終ＯＤ、。。は約６０であった。、１１換ヒト旧は１５ｍｇ１０Ｄ− リットルのレベルまで発現された。ヒトＭｌは、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ（Ｊ潤重量 ０．ｌｈａｇの細胞と等価の装入量；還元）及びクーマシーブルー染色の後で、 精製ウシＭｌ（実施例１）のバンドと共に移動するＭｒ２４，０００〜２８，０ ００の顕著なバンドとして示された。当業者には明らかなように、発現には他の 大腸菌宿主細胞を使眉することもできる。 ｇＡ施例５ ヒ　メ　ロブロー　−ゼ　の ヒト旧は不溶性、不活性形態（いわゆる封入体）で大腸菌中に発現される。活性 Ｍｒの単離には、封入体Ｎｒの可溶化、精製、折たたみ及び酸化（ジスルフィド 形成）という手続きが必要である。このような手続きの一例を下に挙げる。 プラスミドｐＨ５６ＨＭＩ２を抱えた大腸菌株ＦＭ５を実施例４の方法で増殖さ せ、その細胞ペースト約４００ｇ（湿潤重量）をΦ １．５１のＨ２Ｏ中に懸濁せな、この材料をＭａｎｔｏｎ−Ｃａｕｌｉｎホモジ ナイザーに３回通し、その後４℃、約４．ＯＯＯｘｇで４５分間遠心分離した。 上滑を除去し、廃棄した。ベレットを１，５１のＨｚＯ（４℃）中に再懸濁させ 、前述のごとく遠心分離した。上滑を除去し、廃棄した。ベレットを１２０ｍ１ のＨ２Ｏ中に再懸濁させ、ｐＨ９，５ノ２Ｏ−）４　ト！Ｊ　ス−ＨＣｌ　ｒｌ ｏ倍Ｃ：希釈Ｌ　７’、：　、　ｐＨヲ（１８ＮｉＯＨで）１１．５に調整し、 この混合物を氷上に１５分間放置し、４℃、１１，３００ｘｇで３０分間遠心分 離した。上滑をｐ［！９．５の２０ｍＭ　）リスーＨＣＩｒ４倍に希釈したａｐ ｌを（ＩＮ　Ｎａ０Ｈｔ’）１（１−１０，５に調整し、この混合物を室温で一 晩撹拌した。 この混合物のｐＨを（ＩＮ　Ｉ’ｌＣ１で）８．５に下げ、この混合物をｐＨ８ ，５の２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ中で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦａｓ ｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｗａｃｉｉ）イオン交換カラム（カラム容積１５０＋ａ ｌ）にかけた、結合した物質をトリス−）ＩＣ＋バッファ中０〜０．３ＨＮａＣ Ｉの２１グラジエントで溶離した。　１２ｍ１のフラクションが８ｍｌ／分の流 速で回収された０回収したフラクションのアリコート（２ｈ＋）を５ＯＳ−ＰＡ ＧＥ（１５％ｗ／ｖアクリルアミド、非還元）にかけ、クーマシーブルー染色し た。　Ｍｌポリペプチドに対応するかなり鮮明なバンド（Ｍｒ約２２，０００〜 ２３，０００）を含むフラクション３８〜５４をプールした（２０２ａ　Ｉ　） 　、やはりＭｌポリペプチドを表すと考えられるが移動性が少し遅く且つ５ＯＳ −ＰＡＧＥ上でのバンド形成もそれほど鮮明ではない物質がグラジェントの後期 で溶離されたが、これはプールに入れながった。 ＤＥＡＥ−セファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ処理の後でプールした物質を（ＹＭ ５１１を有する）＾＋５ｉｃｏｎ撹拌セルを用いて３０ｍ１に濃縮した。　ｐｔ ＋を（５０％酢酸で）５．４に調整し、この混合物をｐ）１５．４の２０＋＊Ｍ 酢酸ナトリウムに対して透析した。この物質を最終量が４５−１になるまでＩｔ 、０で希釈し、ｐＨ５，４の２０ｍＭ酢酸ナトリウム中で平衡化したＣトセファ ロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）イオン交換カラム（カラム容 量１１１）にかけた、酢酸ナトリウムバッファ中０〜０．４Ｍ　ＮａＣｌの２０ ｍ１グラジエントを用いて結合物質を溶離した。１１１ずつのフラクションが流 速０．１ｍｌ／分で回収された。このフラクションのアリコート（１０ＩＩｌ） を前述の５ＤＳ−ＰＡにＥで分析し、ＭＩを含むフラクション［フラクション１ １−１１−１８（８］をプールし、次いでリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で平衡化 した５ｅｐｈａｅｒｙｌ　Ｊ−Ｚｏｏ　ＨＲゲルｒ−過ラム（カラム容量３００ ｍ　ｌ　）に直接かけた。４１のフラクションが流速２０１７時で回収された。 このフラクションのアリコー）（２３ｕｌ）を再び前述の５ＤＳ−ＰＡにＥで分 析した。フラクション５４〜６０はＭＩを含んでいた。純度を最大にすべく、フ ラクション５６〜５９だけをプールした（１６如１）、　５ＯＳ−ＰＡＧＥで評 価されるプールの旧純度は、５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅ及びクーフシ−ブルー染色後の ゲルの視覚検査で９０％以上と判定された。　ＢＳ八を標準として用いてＢｒａ ｄ−ｆｏｒｄの方法（前述の＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）で測定したプール中 の総タンパク質は約８１であった。この物質の阻害活性は、実施例１のセクショ ン２で説明した１型コラゲナーゼ阻害アッセイによって測定したところ約４２４ Ｕ／＋ｌ（比活性的８６５０／ｍｇ）であった、大腸菌誘導しトＭＩの阻害活性 は他にも幾つかの方法で立証された（実施例１１）。 前記したヒトＭＩ調製物の試料（約６．５ｕｇ）を実施例２に記載の方法で１８ サイクルを通してアミノ末端アミノ酸配列決定にかけた。初期収率は１３５ｐ論 ｏ１、平均反復収率は９４％であった。得られた主要配列は、成熟しトＭＩ遺伝 子のヌクレオチド配列から予想したものと正確に合致していた（実施例３１、第 ２図）。 この物質を、ウシＭＩに関する実施例１の方法又は当業者実施例６ ヒ　メ　ロブロー　ナーゼ　に　ウ　ボ１０−　ル　′ ２種類のメタロプロテイナーゼ阻害物質調製物を用いてウサギポリクローナル抗 血清を形成した。第１の調製物（１８目、７日日及び２１日目の注射に使用）は 下記のように調製した。プラスミドａｌ１５６　ＨＭＩ２を有する大腸菌株ＦＭ ５　（実施例３）からの細胞ペースト約１４ｇ（湿潤重量）を５０踵１のＨ２Ｏ 中に懸濁させ、フレンチプレスに２回通した。遠心分離によって得たベレットフ ラクションを、ナトリウムサルコシル（ｓｏｄｉｕｌＰｓａｒｋｏ−ｓｙｌ）（ ２％ｗ／ｖ）、トリス−ＨＣｌ　（５０ａ＋Ｍ）、ジチオスレイトール（５０ｍ Ｍ）を含むｐＨ８，５の最終！１０ｍ１の溶液中に再懸濁させ、５０℃で１０〜 １５分且つ室温で２時間、インキユベートシてＭｌを可溶化した。この混合物を 遠心分離にかけると旧を含む上滑フラクション（７，２ｍりが得られた。これを ｐＨ８の２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、１％（、／ｖ）ナトリウムトラクロイルサ ルコシン中で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラム（カラム容量２ ６５ｍ　ｌ　）でゲル濾過にがけた。ｇ、９ｓｌずつのフラクションが流速１４ １７時で回収された。Ｍｌを含むフラクション６５〜７５（３１＋１）［５ＯＳ −ＰＡＧＥ及び銀染色によって判定、このフラクションのアリコート（０，ｈｌ ；還元）を１２．５％（１１／ｖ）のアクリルアミドを含むゲルにか（すた］を ブールし、ｐ）１８の２０ｍＭ　）リス−〇ＣＩに対して完全に透析し、（ＹＭ ｌｏｌｌＫを有する）Δｍ１ｃｏｎ撹拌セルを用いて６．５ｓｌに濃縮し、０， ４５ｐフイルタで濾過した。この調製物のＭＩ濃度は約ｌａｇ／ｍｌであった。 第２の調製物（３５日目及び５６日目の注射に使用）は、旧を０．４〜０．５ｍ ｇ／ｌの濃度で含む実施例４の調製物である。 これらのＭＩｌ［物を３匹の二二、−シーラント白ウサギ（初期体重５〜８ボン ド）に注射しな、各ウサギは一日日に、０．２ｍｇの旧を等量の完全フロインド アジュバント中に乳濁させたもので免疫した。ウサギ当たり合計２１以下の調製 物（Ｍｌ：アジュバンント１：１〉を後半部に沿って６箇所以上に皮下注射した 。同様の手順で、但し不完全フロインドアジュバントを用いて、（７日目、２１ 日目、３５日目及び５６日目に）ブーストした。 最初の注射の前日に耳静脈穿刺によってウサギの血液を採取しく免疫前血清）、 ２８日目及び６３日目にも同様の採血を行った。血液を真空チューブに集め、室 温で１６時間凝固させた。血餅な除去し、血清を２２００ｒｐｍで１０分間回転 させて残りの赤血球を完全に除去した。血清にアジ化ナトリウムを最終濃度０． ０１％（、／ｖ）で加え、−２０℃で貯蔵した。 固相ラジオイムノアッセイを用いて血清のタイターを調べた。この測定について は、５ｅｌｃｔｅｃｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ７、　Ｂ　、 　Ｂ　、　Ｍ　ｉ　ｓ　ｈ　ｅ　ｌ及びＳ、Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉ編、Ｆｒｅｅｍａ ｎ、５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）の３７３〜３９７ページに記載のＴ ｓｕらの“５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”、並 びにｂ→工ｉｄｏｍ−ａ　Ｔｅｃｈｎｏ上幻Ｕ−ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｅｉｅ ｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｌｉｃｉｎｅ、Ｔｉｍｏｔｈｙ　＾、Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（１９８５）、２９〜３６ページを参照された い、メタロプロテイナーゼ阻害物質をｐＨ９，２の炭酸塩−重炭酸塩バッファ中 で０．５μ５７５０μｌに希釈し、ポリスチレンのウェル内で（５０９１／ウエ ル）室温で２時間インキュベートした。抗原溶液を傾瀉した０次いでウェルに５ ％（ｗ／ｖ）ＢＳ＾を室温で３０分間充填してプラスチック上の残りの結合部位 をブロックした。 ５％（ｗ／ｖ）ＢＳ八を傾瀉により除去した後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳ八を含むＰ ＢＳで希釈したウサギ血清をウェル内に加えた（５０！ｌ／ウエル）、室温で２ 時間インキュベートした後、０．０２％（ｗ／ｖ）のＴ替ｅｅｎ　２０を含むイ ミダゾール緩衝塩水でウェルを洗浄した。 １２ＳＩで標識したプロティンＡ　（１００，，０００ｅｐ鋤１５０ｕｌ）をウ ェル内に加え、室温で３０分間インキュベートし、その後２回目の洗浄を行った 。ウェルをたたいて水を切り、ガンマ−計数器で計数した。ｅｐＨｌ値を抗血清 希釈度に対するグラフで示し、５０％タイター（抗血清が最大結合数の半分と結 合する希釈度〉を測定した。２８日目の採血によって得た血清は１：２００〜１ ：２５００のタイターを示した。６３日目の採血によって得た血清は１：８００ 〜１：４５００のタイターを有していた。 これらの抗血清を５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ＋イムノブロッティング操作にも使用した 。実施例８及び９に示すように、この抗体はウシＭｒ、大腸菌発現組換ヒトＭｌ 及びＣ１（０細胞発現組換ヒト旧の調製物中で予想Ｈｒのタンパク質バンドを認 識した。 実施例７ 、　に　４　ヒトメタロプローイ　−ゼ）　のヒトＭＩ遺伝子をｐｕｃ　）ＩＭ Ｉから得た（実施例３）、このに■遺伝子はｐｕｃ　ＨＭＩから５８６塩基対（ ｂｐ）温Ｉ〜兆且ＩＤＮ＾フラグメントとして単離された。、ＨｉｎｄＩＩＩ及 びｂ土Ｉ付着端を有する合成りＮＡリンカ−を用いてＭｌ遺伝子をベクターｐＵ ｃ１１９αＧ４中で酵母肝α１に融合させた（第１０図＾）。 使用した合成りＮＡリンカ−は下記の通りである。 ＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡ（並圃ＸＸＩＡＣＣＴＧＴ？ＣＴＣＴ 　（エエ）ベクターｐｔｌｃ１１９αＧ４は酵母グリセルアルデヒド−３−ホス フェートデヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ−Ｐ）とこれに続く酵母接合因 子αのプレプロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）配列（αＦ−Ｓ）及び転写終結配列（αＦ− Ｌ）とを含む。 ベクターｐｌＪｃ１１９αＧ４は詳細には下記のものからなる（第１０図＾参照 ）： ■、旺坦ＩＩＩ、江ＩＩ、塾生■及びむ土■部位を欠失したｐＵｃ１１９：　ｐ ｔｌｃ１１９をＬ坦■■Ｉ及びジｔｌｌで消化し、次いでＳｌヌクレアーゼ処理 でプラントエンドを形成し、その後連結反応させた。得られたプラスミドを更に ５ｓｔＩ及びＳ＋ｎａＩで消化し、次いでＳｌヌクレアーゼ処理し、その後連結 反応させて、ＨｉｎｄＩＩｌ、５ａｌＩ、鎧工Ｉ及びむ工■部位を欠失させた。 その後、発現カセットを残りの非反復ＢａｍＨＩ部位に導入した。 Ｉｌ、発現カセットは下記のものからなる：（ｉ）酵母グリセルアルデヒド−３ −ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ−Ｐ）［Ｂｉｔｔｅｒら 、Ｇｅｎｅ　３２，２６３−２７８（１９８４）コを含む６７５ｂｐのＬ辷因− ＩＩＩＳ−ＢａｍＨＩフラグメントであって、ＨｉｎｄＩ１１部位を除去しＢａ ｍ１’ｌＩ部位を加えたもの、これは、ＨｉｎｃｌＩＩＩでの消化とそれに次ぐ ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントでの末端充填とによって行った。 末端充填ＨｉｏｄＩ１１部位を含むＤＮＡフラグメントをｐＵｃ１９のＳｅａ　 １部位にプラントエンド連結反応させた。 （ｉｉ）ＣＰＤ−α−因子リンカ− （！１ａｕ３Ａ）　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｐｈｅ　ｐｒｏ　ｓｅｒ　ｉｌａ　ｐｈｅ 　セｈｒ　ａｉａＧＡＴＣＡＣＡＣＡ’Ｘ’ＡＡＡ？ＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧ　Ａ ＧＡ　ＦｒτＣＣＴ　ＴＣＡ　Ａｒ１”ｆｆｉ’　ＡＣＴ　ＧＣＡＴＧ’！’Ｇ ＴＡ？Ｆ！’Ａ’！？ＴＧ’！’？’Ｍ’ＡＣτＣＴ　入ＡＡ　ＧＧＡ　八ＧＴ 　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＴＧ　（旦！！Ｉ）（ｉｉｉ＞ｐαＣ３に由来するα因子プ レプロリーダー配列を含む２１８ｂｐのＰｓｔｌ〜Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント ［Ｚｓｅｂｏら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２６１．５８５８−５８８５（１９８６）　ＨＢｉｔｔｅｒら、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−餉ｏ１．１５主、５１６−５４４（１９８７）］ 。 （ｉｖ）α因子プレプロリーダーを下記のようなα因子終結配列 に接続するためのリンカ−６ （ｖ）　ραＣ３に由来する約２５０ｂｐの襲土Ｉ〜Ｂａｍ１ｌｌフラグメント のα因子終結配列であって、ガ土■部位が（ｉｖ）で述べたリンカ−への接続の 後で破壊されたもの。 α因子−Ｍｌｌ遺伝子会合、ｐＵｃ１１９αＧ４をＬ組ＩＩＩ及びむ土Ｉで消化 し、次いで合成りＮＡリンカ−及びＭＩ　ＤＮＡフラグメントと連結反応させる ことにより実施した。得られたプラスミドｐＵｃ１１９αに４−４−１ｌは第１ ０図＾に示すように酵母グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼプロ モーター（ＣＰＤ−Ｐ）と、これに順次続く酵母ＭＦα１遺伝子からのα因子プ レプロリーダー、前述の合成りＮＡリンカ−、ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物 質遺伝子ＤＮ＾セグメント及びα因子転写終結因子とを含む、前述のエレメント を含む１８００ｂｐのＢａａ＋ＨＩ　ＤＮＡフラグメントをｈ見８１での部分的 消化によってｐＵｃ１１９αＧ４から単離し、酵母−大腸菌シャトルベクターｐ ＹＥ３のｈ見）Ｉｆに挿入してプラスミドｐｙＥａαＧ４−ＨＭＩを得たく第１ ０図Ｃ）。 プラスミドｐＹＥ３は第１０図Ｂに示した。このプラスミドは下記のものからな る。 ・１　、２５００ｂｐのＢａｍ）１１〜Ｓａ上Ｉ　ＬＥ旦ζ遺伝子セグメントを シリ−旧及び５ａｌｌでの消化により欠失させ、次いでヤエナリ（ｖｈｕｎｇ− ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理によりプラントエンドを形成し、その後連結反応さ せたｐＧＴ４１中の酵母２ｕ（Ｂ形態）プラスミド［Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒら、　 Ｃｅｎｅ　２３，２２１−２３２（１９８３）コ。 ＋！、下記の配列 ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＴＡＣＣＣＧＧ　ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣ ＡＧＡ’ｌ’Ｃ’！’　ＧＧ　ＣＴＡＴＡＧ　ＣＴＡ　ＣＣＡＴＧＧ　ＧＣＣＣ ＴＡＧＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＴＣＴＡＧＡ　ＣＴＴＡＡＥｃｏＲＸ　ＥｃｏＲＶ　 Ｃ１ａＩ　Ｋ３２ＨＩ　Ｓｍａｌ　ＢａｍＪ（Ｉ　５ａＬＸ　褐往ｒＩＥｃｏＲ Ｉをもつポリリンカーを第１０図Ｂに示すように＜１）で述べた変形２ｕプラス ミドのＥｃｏＲ１部位に挿入した。 １１１、（ＩＩ）で述べたポリリンカーのシ１−１１及びＥｃｏＲ１部位に挿入 したＴＲＰ　１道伝子を含む８５２ｂｐのｈ±１１〜ＥｃｏＲＩフラグメント［ Ｔｓｃｈｕｓｐｅｒら、Ｇｅｎｅ　１０，１５７−１６６（１９８０）］。 プラスミドｐＹＥ３αＧ４−１１８１を大腸菌株ＤＨ５α中で増殖させ、プラス ミドＤＮＡを単離し、このＤＮＡをＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株Ｅに４５° に取入れて形質転換を起こした。当業者には明らかなように、別の酵母宿主細胞 を使用することもできる。 菌株ＥＧ４５°（前出）は酵母株５Ｅ７−６の突然変異体である０株ＳＥ７−６ （ＭａｔＬ、　扛己次失、乱４−３、Ｇ＾し、阻吐）は標準的酵母遺伝子工学技 術によって形成した。この株は、（１）ＰＥＰ４遺伝子中の突然変異を含むＹＳ ＤＰ４（＾ＴＣＣ２０７３４）、（２）ガラクトース上で増殖できる株［Ｌ、Ｇ ｉｕｒｅｎｔｅから入手したＢＨＧＩ−７＾、Ｇａｕｒｅｎｔｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７９．）４１０−７４１４（１９８２） 及びＣｅ１ｌ　３６，５０３−５１１＜１９８４）参照］、（３）″ＴＲＰＩ遺 伝子を欠失した株（ＹＮＮ２８２　Ｙｅａｓｔ　にｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　 Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃ＾）及び（４）銅に感応する株（ｘ３６５ ６７Ｄ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、Ｂｅｒｋｅｌ ｅｙ、Ｃ＾）を含む幾つかの酵母株の交配から誘導された。　５ＥＴ−６の選択 は、ガラクトース上で増殖する能力及び異種タンパク質を効果的に分泌する能力 に基づいて行った。 ＥＣ：４５°を単離するために、株５Ｅ７−６を１ラスミドｐｃＯＮ　（Ｇ）Ｐ ／Ｐテ形質転換しり、　７　ラスミ）’　ｐｃＯＮ（Ｇ）Ｐ／Ｐは増幅可能コピ ー数システムを含む（第１１図）、このプラスミドはＴＲＰＩ　ＡＲＳＩ酵母Ｄ Ｎ＾セグメントを介してトリプトファンプロトトロフィーを選択することにより 酵母宿主細胞中に形質転換できる（前出のＢｉｔｔｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、参照）１通常の条件では、このプラスミドは細胞当たり１つのコ ピー数で安定である。銅含有培地で増殖するとＣＵＰプロモーター　（ＣＵＰ− Ｐ）から転写が誘導され、そのため動原体（ＣＥＮ３）機能が阻害される。　Ｃ ＵＰ−ＴはＣＵＰ終結領域である。従ってコピー数が増加し、プラスミドの安定 性が減少する。銅を除去すればプラスミドは安定する。コ、ビー数は通常細胞当 たり１つに戻る。しかしながら、Ｔｎ５遺伝子を介してＧ４１８耐性に関して選 択すると［Ｊｉｍｉｎｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ　２８ヱ、８６９−８７１　（１９ ８０）丁［酵ｔＰＧにプロモーター（ＰＧＫ−Ｐ）によって制御されるコ細胞当 たり５〜１０個のプラスミドコピーを含む細胞が得られる。 これらの細胞は安定した状態で維持される。 ＥＧ４５°の形質転換は、プラスミドＤＮ＾をＢｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーに より９００ボルト、２５マイクロフアラドで５ミリ秒間酵母細胞中にエレクトロ ポレーション（ｅｌｅａｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）することによって実施した。 エレクトロポレーションした細胞を、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基（Ｄｉｒ ｃｏ）８．７ｇ＃と、グルコース２％（ｗ／ｖ）と、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉ ｎｏ　ａｃｉｄ）（Ｄｉｒｅｏ）０．５％（ｗ／Ｖ）と、寒天２％（ｗ／ｖ）と を含む５Ｄ−Ｃ＾＾寒天上に配置し、３０℃で増殖させることによって形質転換 細胞を得た。 これらの形質転換細胞を供給バッチ式発酵（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔ ａｔｉｏｎ）を用いる１５１発酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ＞で増殖させた。 ａ　微量金属溶液及びビタミン溶液はＴｓａ　ｉらのＪ、Ｉｎｄｕｓｔ−ｒｉａ ｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２，１８１−１８７（１９８７）に記載のものと同じ である。 培地のｐｉｔは６．０に維持し、温度は２５℃に維持した。溶解酸素はエアレー ション、背圧及び撹拌によって調節した。 細胞はＯＤａ。。が８５〜９５になるまで増殖した。 実施例８ ゛　ヒ　ロ　ロー　−ゼ 【 酵母発現組換ヒト旧を含む培養培地を遠心分離によって回収し細胞ペーストを除 去した。上清フラクションを５ＯＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）及び銀染色にかけた 。　ｐＹＥ３αＧ４−）１旧を含む酵母（株ＥＧ４５’）形質転換細胞によ１て 産生された上清では約２６，０００（２４，０００〜２８，０００）のＭｒで移 動するバンドが観察された。このバンドによって表されるポリペプチドは上清１ １当たり約２５〜５０ｍｇで存在していた。　ＭｒＺ８，０００バンドは対照発 酵槽上清中には観察されなかった。　Ｍｒ２６，０００バンドは５ＤＳ−ＰＡに Ｅ上でウシ内皮細胞ならし培地から精製した旧と同じ移動度を有していた（実施 例１）、　ＭＩ含有酵母上清のアリコート（１０ｕｌ）を非還元条件で５ＤＳ− ＰＡＧＥ及び銀染色にがけたところ、Ｍｒ２６，０００バンドは存在せず、代わ りにＭｒ２２，００（１−２３，０００バンドが観察された。　Ｍｒ２２，００ （１−２３，０００バンドによって表される物質は上滑１１当たり約２〜５Ｂで 存在し、対照上清中には見られなかった６Ｍｒ２６，０００バンド（還元）及び Ｍｒ２２．０００〜２３，０００バンド（非還元）がヒト旧を表すことを証明す るために、大腸菌中で産生じたヒトＭＩに対してウサギ体内で産生されたポリク ローナル抗体（実施例６）を使用した。 この抗体調製物と、ビオチニル北枕ウサギイムノグロブリン、アビジン及びビオ チニル化西洋ワサビペルオキシダーゼを含むＶｅｃｔａｓｔＩｌｉｎ　ＡＢＣキ ット（Ｖｅｃｔｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とを用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥ 及びイムノブロッティング（前出のＢｕｒｎｅｔｔｅ、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅ ＋ａ、参照）を行った。Ｍｌ遺伝子含有プラスミド（１０ｕｌ）でトランスフヨ クションした酵母株に由来する上清には免疫反応性バンドが観察されたが、対照 上清には観察されなかった。［還元試料ではＭｒ２８　、０００及びＭｒ１８． ０００バンドが存在し、非還元試料にはＭｒ２２，０００−２３，０００バンド が存在していた。　Ｍｒ１８，０００（還元）バンドはＭＩのタンパク質分解フ ラグメントであると推測される。］この抗体はイムノプロット（ｉｍｍｕｎｏ− ｂｌｏｔ）で、ウシ内皮細胞ならし培地から精製したＭＩ（３５０ｓ＋Ｕ）及び 大腸菌産生ヒトＭｌ（０，ｈｇ）とも反応した。これは、酵母上清中に観察され たバンドが確かにヒト旧を表すという事実を意味する。 実施例９ １、発現ベクターの形成 発現プラスミドを形成すべく、ヒトＭＩの完全なコーディング配列［第２図の２ ６アミノ酸リーダーをコードする配列を含む］を含むｐＵＣＨＭＩ（実施例３） のむ且■〜ＥｃｏＲＩフラグメントを先ずＮｃｏｌからＥｃｏＲＩ制限部位まで ｐｃＦＭ　１１５６にサブクローニングしてプラスミドｐ４１５６　ＨＭＩＮＲ を得た。プラスミドｐｃＦＭ１１５６は、２つの内因性Ｎｄｅｌ制限部位を破壊 し、Ｔ４　ＤＮ＾ポリメラーゼで末端充填を行い、次いでプラントエンド連結反 応を行って非反復す工！及びし！■制限部位間の小さいＤＮ＾配列を下記のオリ ゴヌクレオチドで置換することにより、プラスミドρＣＦ３８３６　（本明細書 に参考として含まれる米国特許第４，７１０，４７３号参照）から誘導した。 ヒト８１　ｃＤＮ＾はプラスミドｐＨ５８ＨＮＩＮＲから０．６５ｋｂ　Ｒｉｎ ｄＩＩＩ〜５ｔｕｌフラグメントとして得た０次いでこのフラグメントを発現ベ クターｐＤＳＲα２にクローン化し、プラスミドｐＤＳＦα２−Ｍ１を形成した 。 プラスミドｐＤＳＲα２は下記の重要な特徴を有する（第１２図の地図を時計方 向に見ながら説明する）。 （ａ）Ｓ■４０初期プロモーター／エンハンサ−及び複製開始点；む工１１部位 （ＳＶ４０ヌクレオチド地図座１［＃２７２）と註組ＩＩＩ（地図座標＃５１７ ２）部位との間のＳＶ４０配列からなる。　［ＤＮＡ　ＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅ ｓ、　Ｊ、Ｔｏｏｚｅ編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ。 Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８１）、ｐｐ、８０１− ８０４コ。 （ｂ）ヒトＴ細胞１型白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）のＬＴＲ（ｌｏｎｇｔｅ ｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）のｒＲ，エレメントと「Ｕ５」配列の一部分とを 含む２８７ｂｐフラグメント、このフラグメントはＩ［、の正確な５′末端（位 置３５４）でＵ５配列中のし且３＾部位（位置６２０）まで存在する［５ｅｉｋ ｉら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０，３６１Ｂ−３６ ２２（１９８３）コ。 （ｃ　）　ＳＶ４０１６Ｓ、１９Ｓスプライスドナー／アクセプターシグナルか らなるフラグメント（ＢａｍＨＩリンカ−で接続された地図座標＃５０２−５６ ０及び＃１４１０−１４９８）　。 前記３つのセグメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の構造は公知のベクターｐＣＤ −ＳＲａ　［Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８，４６６−４７ ２（１９８８）］と同じであるが、下記の点が異なっている。（１）セグメント （ａ）の５′末端で、Ｈｉｎｄｌ１１部位がＤＮ＾ポリメラーゼ■のフレノウフ ラグメントを用いて行われた末端充填連結反応により破壊されている。（２）セ グメント（ａ）及び（ｃ）の間に元来存在するＸｈｏ１部位がセグメント（ｂ） の挿入によって破壊されている。　（３）（ｃ）セグメントの３゛末端で、元来 のＰｓｔ１部位がＨｉｎｄＩＩｒ部位に変わっている。 （ｄ　）　２．４ｋｂの５ａｉｌ〜石旧フラグメント上にある転写終結／ボリデ ニル化（ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル、このフラグメントはウシ下 垂体糖タンパク質ホルモンα−ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）のαサブユニットの ３′部分から得た。最終エクソンの冒頭のＢｓｔＸＩ部位を５ａ１１部位に突然 変異させた。このフラグメントの３°末端は最も近傍の下流し」−旧部位まで続 いていた・、この２．４ｋｂフラグメントをｐＵＣベクターにサブクローニング し、次いで発現ベクターを更に構築すべくガ±Ｉ−ＳｍａＩフラグメントとして 取出した。 （ｅ）内因性マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）ブロモ−ターと、ｃ ＤＮ＾ＤＮＡィング配列と、　Ｚ、５ｋｂのＥｃｏＲＩ〜註ｎｄｌｌｌフラグメ ントとして最初にプラスミドｐＭｇｌ　［Ｇａ５５ｅｒら、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ 　ｌ　、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、ＵｓＡ″７９．６５２２−６５２６＜１９８２）コ から得た全てのＤＨＦＲ転写終結／ポリアデニル化シグナルとを含むマウスＤ） ＩＦＲミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、　２つの末端制限エンドヌクレアーゼ 部位、即ち５’　ＥｃｏＲＩ及び３’Ｈｉｎｄｌｌｌは両方とも発現ベクターの 構築時に破壊された。 （ｆ　）　Ｈｉｎｄ１１部位（地図座標１２４４８）からＥｅｏＲ１部位（地図 座標＃４３６２）まで延び且つアンピシリン耐性マーカー遺伝子と大腸菌中での プラスミドの複製開始点とを含む「無毒」のｐＢＲ３２２配列。 複数のサブクローニングステップを通してこれら６つのＤＮＡセグメント［（ａ ）〜（ｆ）］が最終的に連結反応し、その結果発現ベクターｐＤＳＲα２が得ら れた０元来の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の幾つかは操作中に破壊されるか 又は変化した。プラスミドｐＤＳＲα２−Ｍ１の最終構造を第１２図に示すが、 この円形構造にはこれらの変化が明白に示されている。 ２、トランスフェクション条件 ＤＨＦＲ欠失（ＤＨＦＲ−）ｆ−ヤイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞［Ｃ ｈａｓｉｎ　＆υｒｌａｕｂ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾７ ７．４２１６−４２８０（１９８０）］をルーチン操作に従って、５％（ν／Ｖ ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２９２１ｇ／ｍｌ）、非必須アミ ノ酸〈１００μＨ）、ヒボキサンチン（１３，６μｇ／ｍｌ）、チミジン（７， ６ｕｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシンスルフ ェート（１００ｕｇ／ｍｌ　）を加えてイーグル培地を改質したダルベツコの培 地中に維持した。 リン酸カルシウム沈澱法の一変形方法［Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７．２７４５−２７５２（１９８７）］に従い、百万個の 細胞（トランスフェクションの一日前に６０ｍｍ皿上にプレートした）を別個に ｚｏ、ｇのｐＤＳＲα２−旧１１又はｐＤＳＲα２−８１１４（２つの別個に単 離したプラスミド）プラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフ ェクションがち３日後に細胞を８つの１００ｍｍ皿に分けた。この時点で、ヒボ キサンチン及びチミジンを含まず且つ１０％（Ｖ／Ｖ）透析ＦＢＳを含む培地を 使用してトランスフェクション細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を選択した０ 選択を確実に行うべく培地は２〜３日おきに取り替えた。トランスフェクション から２週間経過した時点で、２４個の安定なトランスフェクション細胞を各皿グ ループから選択し、Ｍｌ遺伝子の転写及び翻訳を分析した。 ３、組換ヒト＋４１遺伝子から転写したｉ＋ＲＮへの分析トランスフェクション したＣＨＯ細胞に由来する全細胞質ＲＮＡをＲｅ５ｅｎｄｅｚらの方法［Ｊ、Ｃ ｅ１ｌ　、Ｂｉｏｌ、１０３．２１４５−２１５２（１９８６）］で調製した。 細胞ＲＮ＾（）、５ｕｇ）を１％ホルムアルデヒド−ホルムアミド変性アガロー スゲル電気泳動によって分離し、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜上に移動 させた。放射性標識した、ｐＤＳＲα２−８１１１のＬ眩ＩＩＩ〜む且エフラグ メントを用いて、Ｌｉｎらのハイブリダイゼーション条件［Ｃｅｎｅ　４４，２ ０１−２０９゜（１９８６）］でヒト８１転写物を同定した０分析した７つの個 々の安定クローンのうち４つに、単一のＲＮ＾バンドが観察された。 メツセージのサイズは構造から予想した通り１．５ｋｂであった。 ４、タンパク質の分析及び定量 実施例８で説明したような５ＤＳ−ＰＡにＥとヒトＭｌに対する抗体でのイムノ ブロッティングとによって、組換ヒトＭｌの同定及び定量を行った。安定なトラ ンスフェクションしたクローンに由来するならし培地（無血清、１０〜ＳＯＵ＋ アリコート）を分析した。その結果、トランスフェクションしたＣＩＯ細胞は抗 体によって認識され得るＭｒ２６　、０００　（２４、０００〜２８．０００＞ （還元）タンパク質を分泌することが判明した。このタンパク質は大腸菌産生組 換ヒトＭｌと共に移動する０ＭＴ発現度の最も高いトランスフェクション細胞は 、集密的１００＋ａｍ［ｌｉ培養皿上で増幅なしに約ｌ餉ｇａ１／日で産生じた 。 ５、発現の増幅 トランスフェクションしたＣＩＯ細胞クローンによるＭＩ発現をメトトレキセー ト［Ｋａｕｆｗａｎ及び５ｈａｒｐ、Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、１５９゜６０ １−６２１（１９８２）］を用いて濃度を段階的に増加させながらくメトトレキ セート濃度１０ｎＭ、３０ｎＭ、１１００ｎ及び３００ｎＭで）増幅させた。　 １０ｎＨメソトレキセ一ト増幅にかけたトランスフェクションクローンからは、 実施例１０で説明するようなローラーボトルで増殖すると、６〜７日目日日収時 に２０〜３０ｍｇ／ｆという高濃度でＭＩを含むならし培地が得られた。　３０ ０ｎＭ増幅段階の後では、ローラーボトルでの培養時に５０〜６０ｍｇ／ｌとい う高い濃度の［を得ることができた。 ６、生物学的活性のアッセイ 実施例１で説明した■型コラゲナーゼ阻害アッセイによってトランスフェクショ ンＣ）１０細胞上清中に活性を検出することができた。結果は実施例１０（表８ ）に示す。 実施例１０ イニーズハムス　−　で　れｔ・　ヒトメロプローイナーゼ　の 実施例９で説明したように、ヒト旧遺伝子を保有する発現ベクターでトランスフ ェクションし且つ１０ｎＭメトトレキセート増幅段階（実施例９）にかけたＣＩ Ｏ細胞を下記のように無血清培地中でローラーボトルで増殖させた。！！を初に スピナーフラスコ内で細胞を、透析したウシ胎児血清（５％ｖ／ｖ）とグルタミ ンと非必須アミノ酸とを加えたダルベツコ改質ＭＥＮ並びにＦ１２栄養培地を含 む培地で増殖させた。　ＭＥＮ及びＦＩＺ培地は５０：５０（ｖ：ｖ）で使用し た１次いで細胞を、同じ培地が入っている８５０ｃｍ”ローラーボトルに移した （２ｘｌＯ’細胞／ボトル）、３７℃で３〜４日おいた後、細胞単層をＰＢＳで 洗浄し、新しい培地（１５０〜２００ｍ１／ボトル、前記と同じであるが血清は 含まない）を加えた。６〜７日後にならし培地を回収゛し、新しい培地に取り替 えた。６〜７日後に、ならし培地をもう一度採取した。 以下の操作は、特に指示のない限り総て４℃で行った。 ２０１のならし培地に、アジ化ナトリウム（最終濃度０．０２％ｗ／ｖ）とプロ テアーゼ阻害物質ペプスタチンＡ（最終濃度１１Ｊｆ／−１）と塩化フェニルメ タンスルホニル（ＰＭＳＦ、　！終濃度０．６ｍＭ）とを加えた。この培地を濃 縮し、分子量分画範囲−ｉｏ、ｏｏｏのポリスルホン膜カセット（膜面積５ｆｔ ”）を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎクロスフロー限外−過装置 を用いて、ｐＨ７，５（ＨＣＩ″′Ｃ調整）の１ｍＭイミダゾール、１８８ａＣ １に対して一過した。ポンプ速度は約５００ｍ１／分、−過速度は約１００ｍ１ ／分であった１回収した試料の最終量は１１であった。この試料を、Ｃｕ５Ｏ， 溶液をカラムに通すことによってＣｕ”で飽和し且つｐＨ７，５のｂ＋８イミダ ゾール、１８８ａＣｌバツフアで平衡化したキレ−ティングセファロースＦａｓ ｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（カラム容量４００ｍ１）にかけた 、流速は８００ｍ１／時にした。 試料を通した後、カラムを約１１のイミダゾール開始バッファで洗浄した。カラ ムに結合したＨＩを開始バッファから２０＋ｍＭイミダゾール、ＩＮ　ＮａＣ１ 、ｐｉ（７，５までの直線グラジェント（総量２０１）で溶離した。４２０〜６ ００１フラクシヨンを気め、アリコート（フラクション量の０．０００３３％） を５ＯＳ−ＰＡＧＥ（１２，５％ｗ／Ｖ、アクリルアミド、還元）及び銀染色に かけた。前記グラジェントで溶離量１８１０〜２４１０簡１を表す６００１のフ ラクションはＭＩポリペプチド（Ｍｒ約２６，０００のバンドとして可視化）の 大部分を含んでいた。このフラクションを＾ｍ１ｃｏｎ　ＹＭ１０膜を有する＾ ―１ｃｏｎ撹拌セルを用いて約１００ｍ１に濃縮し、ｐＨ８，５の２０＠Ｈトリ ス−ＨＣｌ、ｂ＋ｌ’ｌ　ＣａＣ１ｔに対して透析し、同じバッファで平衡化し たＱ−セファｏ−スＦｉｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イ時であった。 試料をかけた後で、カラムを約１００ｍ１の開始トリス−ＭＣＩバッファで洗浄 した。カラムに結合した旧を開始トリス−ｆｌｃＩバッファ中０〜０．５８　Ｈ ａＣＩの直線グラジェント（総グラジェント量１２００ｍ　ｌ　）で溶離した。 　１２．６μｍずつのフラクションを系めた。このフラクションのアリコート（ １μｍ）を前述のごと＜：　５ＤＳ−ＰＡＧＥで再分析し、Ｍｌを含むもの（グ ラジェントのフラクション２５〜３２）をプールしく総量１００＋ｓｌ）、前述 のごとくΔｍ１ｃｏｎ撹拌セルを用いて４０−１に濃縮し、ＰＢＳで平衡化した ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｓａｅｉａ）ゲルヂ過カラム（ ５ｘ　１４６ｃｓ＋）にかけた、１３１ずつのフラクションを流速８０＋Ｉ／時 で藁めた。このフラクションのアリコート（２ｕｉ＞を前述のごと＜　５ＯＳ− ＰＡＧＥで再分析し、Ｍｌを含むもの（フラクション８１〜９４）をプールした （１８０ｍｌ）、プールの旧の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色で９５％以上 と判定された。精製操作を表８にまとめて示す。 表８ ＣＨＯｆ　Ｌ声　か　のヒト　Ｍｌの ａ　指示のない限り、ＢＳ＾を基準としてＢｒａｄｆｏｒｄの方法（前出の＾ｎ ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、参照）で測定した。 ｂ　１１１ｇ７ｍｌ溶液の２８０ｎｍでの吸光度の値を１．８２として八２．。 １．により測定した。 Ｃ活性はコラーゲンフィルムアッセイで測定した（実施例１、セクション２）。 精製物質の阻害活性はＩ型コラゲナーゼ阻害アッセイ（表８）と他の幾つかの組 」ｕｎＪ法（実施例１１）及び正立１勉法（実施例１２）とによって立証された 。 このヒト旧調製物の試料（約２７ｕｇ＞を、実施例２で説明した方法に従い２０ サイクルを通してアミン末端アミノ酸配列決定にかけた。初期収率は９２３ｐｍ ｏｌ、平均反復収率は９０〜９３％であった。得られた主要配列はヒトＭｌ遺伝 子のヌクレオチド配列に基づいて成熟しトＭｌについて予想されたものと全く同 じであった（実施例３、第２図）。 ＣＨＯ細胞ならし培地からのヒトＭｌの精製に有用な方法としては更に、陽イオ ン交換クロマトグラフィー［例えばｐＨ４，５でＣトセファロースＦａｓｔ　Ｆ ｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用］、疎水性相互作用クロマトグラフィー［ 例えばフェニル−セファロースＣＬ−４８（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）を使用コ、 及び当業者に公知の他の方法が挙げられる。 実施例１１ ヒ　旧−に　番　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　’　！この実施例に記載のデータは、大腸 菌誘導組換ヒトＭＩ［指示のある場合は実施例５と同様に調製し、その他の場合 は使用大腸菌誘導物質を本質的には実施例５と同様であるが、相異点として、ジ チオエリトリトール（５ｓＭ）を実施例５に記載のｐｉｆｌｌ、５処理の間存在 させ、且つこの物質を一晩ｐＨ１１に維持し次いでＣａＣＩａ中で２ｍＭにし、 ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーにかける前に遠心分離によって清澄 化する方法で製造した。この物質は、実施例１、セクション２で説明したｌ型コ ラゲナーゼ阻瞥アッセイで測定して約３８９Ｕ／ｍｌの阻害活性を有していたく 比活性は約３５５０／ｍ　１．）　］又は実施例１０と同様に製造したＣ）１０ 誘導組換ヒトＭｌを用いて得たものである。 １、Ｉ型コラゲナーゼ阻害、　５ＯＳ−ゼラチンＰＡＣε；試料としてプロテイ ナーゼを用いる５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥ　、特異的コラーゲン開裂の阻害。 大腸菌誘導ヒトＭＩを５ＤＳ−ゼラチンＰＡＧＥでも分析した（第１３図；実施 例１、セクション４ｂで説明した方法）、第１３図の説明は以下の通りである（ 試料は総て非還元であった）：レーン１、ウシ内皮細胞に由来するビークＩＩ誘 導阻害物質（２４ｍＵ）　； レーン２、ウシ内皮細胞に由来するビークＩ誘導阻害物質（ＭＩ）（５０ｓ＋Ｕ ）　； レーン３、大腸菌から製造したヒトＭｌ（実施例５．９２＋ａＵ）　；レーン４ 、大腸菌から製造したヒトＭＩ（実施例５．４２０醜Ｕ）； レーン５及び６、バッファのみのレーン。 レーン１〜４の暗域の存在から、大腸菌で産生した組換体を含む前述の総ての阻 害物質調製物は、この方法によって判定される阻害活性を有する予想通りの分子 量のタンパク質を有することが明らかである。 プロテイナーゼを試料とする５ＯＳ−ゼラチンＰＡＧＥ方法（実施例１、セクレ チン４ｃ）を大腸菌産生組換ヒト旧の分析にも使用した（第１４図）、第１４図 では、「対照ｊという印のあるレーンが阻害物質を加えずに一晩インキユベート したものであり、ｒＥＤ丁＾Ｊという印のあるレーンが２０ｍＭ　ＥＤＴＡを存 在させてインキュベートしたものであり、　ｒｒＭＩ」という印のあるレーンが 大腸菌産生ヒトＭｌ（実施例４の調製物、４２３ｍＵ／ｍ　ｌ　）と共にインキ ュベートしたものである。−晩のインキュベーションに先立って電気泳動した試 料は、レーン１、ヒトプラスミン、５０■；レーン２、ウシトリプシン、０．３ μｇ；レーン３、転移性１瘍細胞に由来する１００倍に濃縮し且つへＰＨ＾活性 化したならし培地［Ｉｖ型コラゲナーゼ源としてのｅ−Ｈａ−ｒａｓ−）ランス フェクションラット胚線維芽細胞；　Ｃａｎｅ、Ｒｅｓ。 ４７．１５２３−１５２８（１９８７＞に記載のＧａｒｂｉｓａらの方法で製造 したならし培地］、５μｍ；レーン４、丁Ｐ＾処理したウサギ模膜線維芽細胞に 由来するへＰＨ＾活性化ならし培地（４−ｕのコラゲナーゼＩ活性を載置した、 実施例１、セクション２参照）３組換ＭＩは明らかに１型及びＩｖ型コラゲナー ゼを阻害するが、プラスミド及びトリプシン（これらはメタロプロテイナーゼで はない）は阻害しない、　ＥＤＴＡも予想通りコラゲナーゼを阻害する。 大腸菌で産生した組換ヒトＭｌは哺乳動物コラゲナーゼの特徴である特異的コラ ーゲン開裂も阻害する（実施例１及び第７図参照）、これを立証する実験を、本 質的に実施例１、第７図に示した方法に従い、インキュベーションで組換ヒ）　 Ｍｌ（実施例５）を約２１ｇ／ｍｌ用いて行った。結果は、内皮細胞に由来する ウシ旧について第７図に示したものと同じであった。 Ｃｌｌ０細胞で産生じたヒトＭＩは約１５３７０／ｍｌの阻害活性を有していた （比活性は実施例１、セクション２で説明したＩ型コラゲナーゼ阻害アッセイで 測定して約１０６７０／ｍｌであった）。 この比活性及び以下に説明する他のアッセイでの比活性は、ＣＨＯ，！Ｉ胞由来 の組換ヒトＭｌの方が大腸菌由来の組換ヒトＭｌより大きい、この差は、大腸菌 誘導調製物のポリペプチド鎖の一部分が天然コンフォーメーションになく、不正 確なジスルフィド結合も有し得るという事実に起因すると考えられる。また、当 業者は、大腸菌誘導ヒト［がＣＨＯ細胞誘導ヒトヒトに比肩し得る比活性を有す るように大腸菌誘導ヒト旧の可溶化、折たたみ、酸化（ジスルフィド結合形成） 及び精製を行う方法を開発し得ると考えられる。 ＣＨＯ細胞からの組換ヒトＭＩはまた、５ＯＳ−ゼラチンＰＡＧＥ及び増乳動物 コラゲナーゼに特徴的な特異的コラーゲン開裂の阻害によって判定される阻害活 性も有していた。いずれの場合も、得られた結果は大腸菌からの組換ヒトＭｌに ついて先に述べた結果と類似していた。 （以下余白） ２、転移性細胞によって分泌されるメタロプロテイナーゼの阻害 転移性の極めて高いｃ−Ｈａ−ｒａ’ｓ）ランスフェクションラット胚ｍ胞（４ Ｒ）［Ｐｏｚｚａｔｔｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３，９４７−９５０（１９８ ６）］に由来する無血清ならし培地をメタロブロティナーゼ源として使用した。 第１５図に示した実験は、ＣＨＯ細胞がらの組換ヒトＭｌが４Ｒ細胞によって分 泌されるメタロプロテイナーゼによるＩ型及びＩＶ型コラーゲンの分解を完全に 阻害することを立証するものである。第１５図の説明は前記の通りである。ペニ シリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｐｇ／ｍｌ）を含む ＨＥＭで４８細胞を増殖させた。２４時間のインキュベーションの後で前記培地 を回収し、ＹＭＩＯ膜を有する＾−１ｃｏｎ撹拌セルを用いて１００倍濃縮し、 八ＰＨ＾（１ｍＭ、３７℃、３０分）で処理してメタロブロティナーゼを活性化 した０次いで、Ｉ４Ｃ標識したラット皮膚■型コラーゲン［６，ＯＯＯｅｐｍ／ ウェル（比放射能３００ｃｐｍ／μｇ）；ウェル当たりの添加培地量５０．１； 第１５図＾］又は１４Ｃ標識しなＩＶ型コラーゲン［２，１１００ｃｐ／ウエル （比放射能３０，０ＯＯｃｐｓ／ＩＩｇ）　；ウェル当たりの添加培地量１００ ．１　、第１５図Ｂ］でコーティングしたミクロタイターウェルに、組換ヒトＭ ｌを増量的に存在させながら、前記活性化培地のアリコートを加えた。インキュ ベーションは５ｏＩＩＭトリスーＨＣｌ、２００ｍＨＮａＣ１，１０１１８ＣＩ ＬＣ１２、ｐ［１７，５、及びＩＯＪ　Ｎ−エチルマレイミＦ　＋２ａ＋Ｍ　Ｐ ＭＳＦを含む総量２０ｈｌｒ、３７℃で３時間（ＩＶ型コラーゲン）又は１６時 間（ＩＶ型コラーゲン）行った。 上清に放出された放射能を測定し、結果を阻害物質が存在しない場合の放出放射 能に対する％（阻害％）で表した。 ３、大腸菌誘導組換ヒトＭｌ（表９）及びＣＨＯ［胞誘導組換ヒトＭｌ（表１０ ）はどちらも、腫瘍細胞の存在下で起こる１型コラーゲンの分解を阻害した。腫 瘍細胞としてはｃ４ｉ−ｒａｓ　）ランスフェクシミンラット胚線維芽細胞（４ Ｒ＃胞）を使用した。 この細胞は大量のメタロプロティ、ナーゼを分泌し且っコラーゲン及び結合組織 を盛んに分解するがらである（ＡＩｖａｒｅｚら　、　Ｊ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、１９９０）。 表　９ ４Ｒに　Ｉ　コー−ンの　にΔ」しｌｉｆ創１１遺上」」士２生月− 腫瘍細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（血清プロティナーゼ阻害物質を不活性化 すべく酸処理したもの）とペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン （１００ｕｇ／ｓｌ）とを加えたイーグル最少必須培地２００．　Ｉの存在下で 、−４（：１ｉｌ識したラット皮膚Ｉ型コラーゲ’／　（１５，ＯＯＯｅｐｍ／ つｘ　ル；比放射能３００ｃｐｍ／ＩＪ＆）上４：１０’／ミクロタイターウェ ルでプレートされた。 ３７℃で２４時間後にＩ型コラーゲンの分解を上滑に放出された放射能の測定に よって調べた。μヒフ２４時の値は３つのウェルの平均値士凛準偏差を表す。 表　１０ ４Ｒに　Ｉ　コー−ンの　に　ＣＨｏ　・　４換よニド壓！１！月− 実験の詳細は表９と同じである。 ４、大腸菌誘導組換ヒトＭｌ（表１１；第１６図）及びＣＨＯ細胞誘導組換ヒト ヒト（表１２；第１７図）はどちらも、腫瘍細胞の存在下で起こるラット平滑筋 細胞によって沈着される結合組織マトリクスの分解を阻害した。この場合も４Ｒ ［胞を使用した。 前記マトリクスは糖タンパク質とＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンとを高度に架橋し た天然の形態で含む［Ｊｏｎｅｓ及びＤｅＣｌｅｒｅｋ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、４０．３２２０−３２２７（１９８０）］。 表　１１ ４Ｒに　７１　スの　に・　− ヒトＭｌの 培養ラット平滑Ｈａ胞によって形成される［’Ｈ］プロリン像識マトリクスを説 明のように調製した（前出のＪｏｎｅｓ及びＤｅＣｌｅｒｃｋ、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、）＊これらのマトリクスは［３Ｂ］プロリンを糖タンパク質形態で１ ５％、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン形態で８５％含んでいた。　４Ｒ細胞を、表 ９で説明した培地を２ｍｌ入れた３５ｓ＋ｗ皿当たり２ｘｌＯ’細胞の割合でマ トリクス上にプレートした。培地は旧を指示濃度で含む新しい培地と毎日取り替 えた。マトリクスの分解は上清に放出された放射能の測定によって調べたａ　ｃ ｐｓ／皿で示した結果は、６日後に４つの皿について調べた累積［”Ｈ］プロリ ン放出（無細胞のバッフグラウンドに関する前記放出）の平均値である。 第１６図は表１１で説明した実験の累積分解を一日毎に示している。第１６図で は符号がＨＩｉ度に下記のように対応する二〇＋’ｕｇ／ｍｌ；ｏ、０．１μｇ ／＋Ｉｌ；　１１Ｊｇ／輸１；　、１０ｐｇ／ｍｌ；　、２５ｕｇ／ｌ。 表　１２ ４Ｒこ　４　７　１　スの　に　ＣＩ（０−ヒトＭＩの 実験の詳細は表１１ど同じである。この実験では、阻害物質の存在が細胞の増殖 に全く影響しないことが判明した。これは、トリプシン処理してから６日目に存 在する細胞の数を計数することによって調べた（６日目の細胞数の欄参照）。 第１７図は表１２で説明した実験に間する累積分解を一日毎に示している。第１ ７図では符号が使用ＭＩ濃度に下記のように対応する：ｏ、Ｏｐｇ／ｍｌ；ｏ、 ０．０５ｕｇ／ｍｌ；　、０．５μｇ／ｍｌ；　、５Ｂ／曽１：、５μｇ／閤１ ；、５μｓ／ｍｆ（但し４日目及び５日目にのにみ添加）。 ５、腫瘍細胞の増殖及び接着に対する組換ヒトＭｌの作用前記セクション３及び ４の結果を説明すべく、腫瘍細胞の増殖又は接着に対するＭｌの作用を下記の実 験によって更に調べる。１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを加えたＨＥＭ　２ｍｌ中に３ ５ｍｍ皿当た９ｌ０４個の割合で４Ｒ細胞をプレートした。大腸菌誘導組換ヒ） ＭＩを培養物に毎日加えた。トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉ−ｚｉｔｉｏｎ ）とＣｏｕ　ｌ　ｔｅｒ計数器での計数とによって細胞の数を測定した。結果を 第１８図へに示す、この図では「細胞７皿」の値が２つの皿の平均信士標準偏差 を表し、符号が種々の使用旧濃度を表す（ｏ、Ｏｕｇ／ｍｌ：ｏ、ｌｕｇ／−１ ，，１０μｓ／ｍｌ）、旧は明らかに腫瘍細胞の増殖には影響しなかった。 この実験では、Ｃ）１０細胞誘導ヒト組ｆｉｌｌが再構築基底膜調製物［Ｍａｔ ｒｉｇｅｌ”（Ｃｏｌｌａｂｏｒｉｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒ ｄ、Ｍ＾）］への４８細胞の接着を阻害しないことも判明した。ミクロタイター ウェルを５０μｇのＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングし、０．１％（ｗ／ｖ）Ｂ Ｓ＾とペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００ｕｇ／＋Ｉ ）とを加えたｚｏｏｕ＋の１４ＥＭ中にウェル当たり５０，０００個の細胞を加 えた。指定の時点（第１８図Ｂ）で非接着細胞を穏やかなピペッティング／ＰＢ Ｓでの洗浄で除去し、計数した。 残った接着細胞をトリプシン処理により除去し、計数した。 「接着細胞％」（第１８図）の値は総細胞数に対する接着細胞の％であり、３つ のウェルの平均信士標準偏差を表す、符号はＭＩ（ｏ）の不在及び１０μｇ／＋ ＊１（ｏ）での旧の存在を表す。 ６、腫瘍細胞による平滑筋細胞層への侵入の阻止この作業はＪｏｎｅｓらの方法 ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４１．４６１３−４６２０（１９８１）］に従って行 った。ラット平滑筋細胞（Ｒ２２クローンＦ）を３５１皿（培地量２−１）当た り２ｘｌＯ’細胞でプレートし、毎日アスコルビン酸（５０ｕｇ／ｍｌ）を加え ながら２週間増殖させた。 次いで、４Ｒ細胞を加え（２ｘｌＯ’細胞／皿）、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（酸 処理したもの）を加えたＭＥＮの存在下で平滑筋細胞と共に培養した。共培養の ２１日後に培養物を０．１５８　ＨａＣＩで洗浄し、その場でｐＨ７，３の０． ＩＭゾリン塩バッファ中２％（ｗ／Ｖ）のグルタルアルデヒドにより固定した。 固定された培養物を複数の段階的エタノール洗浄によって脱水し、Ｅｐｏｎ　： ＾ｒｉｌｄｉｔｅ（５０：５０）中に埋め込んだ、厚い切片を表面と直角に切断 し、トルイジンブルーで染色し、光学票微鏡で調べた。結果な第１９図に示す。 この図では、Ａが前記平滑筋細胞を表し、Ｂが平滑筋細胞＋４Ｒ細胞を表し、Ｃ が已にＣＨＯ細胞誘導組換ヒトヒトを１０μｇ／＋ａ　ｌの濃度で２日毎に加え たものを表す、Ｂでは腫瘍細胞（矢印）が平滑筋細胞層の両側に存在しているが 、Ｃでは平滑筋細胞層の上部にしか存在していない、従って、Ｍｌが腫瘍細胞に よる平滑筋細胞層への侵入を阻止するのは明白である。 この実施例のセクション１〜６のデータ、並びに大腸菌産生ヒトに■に対するポ リクローナル抗体を用いてウシＭＩ、酵母発現組換ヒトＭＩ及びＣｌｌ０細胞発 現組換ヒトＭｌについて行った５ＯＳ−ＰＡＧＥ及びイムノプロット分析から、 実施例３で説明した単離／クローン化ウシ及びヒト遺伝子がＭＩの遺伝子を表す ことは明白である。 実施例　１２ ｉｎ　ｖｉｖｏマ　スモールにお番　ヒ　Ｍｌに　のＢ１６マウス黒色腫細胞［ Ｆｉｄｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ　２４２，１４８−１４９（１９７３）］を注射し た後で肺への転移を起こしたマウスモデルを使用した。８１６細胞（クローンＦ １０）はＤｒ、Ｊ、Ｆｉｄｌｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ。 Ｔｅｘｔｓ）から入手し、先ずＣ５７ＢＬ６マウスで皮下増殖させ、腫瘍−次作 小結節からｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養した。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ第２継代後の細胞を 冷凍ストックとして貯蔵した。冷凍ストックの細胞を、ピルビン酸ナトリウム（ １ｍＭ）、非必須アミノ酸（０，１＋＊Ｍ）、Ｌ−グルタミン（１＋ｓＭ）、ヘ ニＥ／　！Ｊ　’／　（２００Ｕ／ｍ　Ｉ　）、ストレプトマイシン（２００ｐ ｇ／ｍｌ）、ＭＥＮビタミン溶液（１％、ｖ／ｖ）及び１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ を加えたＨＥＭ中で２日間培養した。気密に近い状態の（ｓｕｂｃｏｎｆ　１ｕ ｅｎｔ）培養物を短時間（１〜２分）トリプシン処理し、血清含有培地中に萬め 、ＦＢＳ中に最終濃度５ｘ１０’細胞／＋＊ｌで懸濁させた。トリバンブルー排 除によって調べた細胞生存率は９７％であった。 モデルに使用した動物はＪａｅｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｉｎ ｅ）から入手したＣ５７ＢＬ６　Ｊマウスであり、実験を開始する前に動物施設 で１週間観察した。Ｍｌ処理動物（９）にはＣＨＯ細胞誘導組換ヒトヒト（実施 例１０の方法で製造したもの、滅菌ＰＢＳ中４．４５ｍｇ／輸１）を腹腔内に注 射しな（注射１回当たり０，２５鵬１＝１．１ｍｇ／注射）、対照動物には０． ２５纏ｌノ滅菌ＰＢＳを注射した。 注射は腫瘍細胞を注射する１３時間及び１時間前（７匹の動物）又は腫瘍細胞の 注射と同時（２匹の動物）に行った０次いで総ての動・物に、旧注射（処理動物 ）又はビヒクル注射（対照動物）を１２時間間隔で、腫瘍細胞注射後合計５．５ 日にわたって行った。各マウスの尾の側方静脈に８１６黒色腫細胞を注射した（ ０．２５ｓｌ中１．２５ｘ　１０’個の細胞）、総ての注射をＨＩ処理動物と対 照動物との間で交互に行った。、Ｗ癌細胞を注射してから２週間後にＣＯ７安楽 死で動物を殺し、肺を検査してＢｏｕｉｎ溶液注射後の表面腫瘍コロニーの存在 を調べた。各肺を５つの別個のローブに切り分け、各ローブ上のコロニーを解剖 用詔微鏡で数えた。結果を表１３に示す。 表１３ Ｍｌ　マウス　・詔マ　スに８１６　ｆ一本　腫瘍細胞を注射する１３時間前及 び１時間前にＭｌで処理しなかった２匹の動物。 表１３の結果は、旧処理によって肺腫瘍小結節の発生が実質的に大幅に減少する （Ｗｉｌｅｏｘｏｎランクサムテスト（ｒａｎｋｓｕ＋ｓ　ｔｅｓｔ）で０．０ １＜　ｐ　＜０．０５）ことを示している。 実施例１３ ヒ　メ　ロプローイナーゼ　の告　゛ 組換ヒト旧の赤血球増強活性を、ＢＦＵ−Ｅ（ｂｕｒｓｔ　ｆｒｏ＋ｓｉｎｇｕ ｎｉｔｓ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）のワンステップｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ［Ｄ ｕｋｅｓら、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉ（ｅｍａｔｏｌｏｇｙ　１３，５ ９−６６（１９８５）］によって立証した。正常ボランティアドナーがら末梢血 を入手し、ヘパリン処理した。４００ｘｇで３０分闇Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑ ｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で遠心分離することにより単核細胞を除去した。ダ ルベツコ培地をｌ５ｅｏｖｅに従って改質した培地、即ち０．８％＜ｗ／ｖ＞の メチルセルロースと３０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清と１．２７Ｕ／ｍｌのエリ スロポエチン（＾１４−ＥＰＯ，ＰＣグレード組換体、＾−ｇｅｎＩｎｅ、）と を含む培地中で細胞を３５−纏皿当たり４．１ｘｌＯ’個で培養した。細胞をブ レーティングする前に、組換ヒトＭＩ（ＣＩＯ細胞から誘導したもの、実施例１ ０に従って調製）を指定濃度（表１４）で加えた。９５％の空気と５％のＣＯ２ とを含む湿潤雰囲気中３７℃で１０日間インキュベートした後、３つ以上の赤血 球サブコロニー又は単一の赤血球蓄積物（細胞数＞　３００）からなるコロニー をＢＦｔｌ誘導コロニーとして計数した。各ＢＦＵ−Ｅ測定毎に、５つの同一条 件下の皿の容量の２０％にあたる中心部におけるコロニーを計数した。結果を表 １４に示す。 表　１４ ＣＨＯ；　ヒトＭＩのＢＦＵ−Ｅ′ この活性は該アッセイにおけるＭｌ濃度が≧１ｎＨの場合に明らかである。 以上、本発明を好ましい実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれらの実 施例には限定されず様々な変形が可能である。以下の請求の範囲によって規定さ れる本発明の範囲にはこれらの変形も含まれると理解されたいよ　８′　品　乱 　ｇ　；乱　３七　むｇ　ｙ、Ｂ　、；４３　と８奮　８８　ぼ　乱　Ｂ７５七 　ぢ巴　汐：　ζコ　＝２２８　乱　乱　ぼ　８　！七　日　ご：　召８　七… 　「　＆　乱　ｇ　８　討　；♂　８　＝２　ＩＣυ　０　噂　ラ　υ　りυ　 −い　−０いい　Φづ８　「　七　ｇ　品　乱　３七　ε谷　２答　シ「Φ＝２ コブ　−０　りＣ７１コゆ　φい　−−φ　０Ｓ１ａＪ：Ｕ　Ａｍ　ｒ４１１３ 　：１１１　−υ　づ　−（！Ｉｔｙ＋？ｍ　ＩＣｔｓＬ）ＩＦ＋Ｊｓ　＜ａｓ 　ｕ　ａｓ乃ロ　Ｑ、（Ｊ　ψ−ら０　喝０ロトＣ００８；宙＝乱ご３；乱四乱 霊Ｇよ　♂　Ｂ′！＞ぼ　Ｅ欧り乱　巳「５ぼ　ピ乱　詠　よ−ＩＩＣＩ　Ｅ− ４４Ｊ　ロｃｙ＋＞ｏｕυ　（υ　Ｆ２Ｏ＞ｔ７Ｉｏｏ　ｕｈｙｕ　ｍｕ　ｈａ 　ｃ　。 ６写躬、Ｃ２，５ｓＢ玲♂に　３Ｂ 二♂　；ε工ぼ　普８　々乱　けｇ　瓢　写＜―〉うＬｌ（Ｊ　ｃ／）ａ、＋　 ｔＪｏ１ｈ４ＪＪＪ　４Ｊ二Ｂ　二Ｂ　姻ｌ二３３藁　二８工巳ざ　藁１−１ａ ５　Ｈ２Ｏｆ；４４Ｊｖ−ｈ４−　ぺ喝　ぺＣ７１−ｈＯｒ；ｐｕ４Ｊ　ｏ、ｕ 。ψυ　鴎０　Ｃ０−υ　りひ　−≧コ　ミＶ堀♂　汐Ｅ’１３ＢＢ　己巳　ぼ ト−ΦＯｌａｌ：Ｆ　Ｏ（Ｊ　−Ｃ）０７３％１３　４ｐ　ｓｊ　ＪＪ８−ｔ７ ＩＰ−１４Ｊ　飄噂　−０噂シト−φ　ニー　υ　〜（ｊ■　１−１１１１！　 −−山０１どべ唖　山ｐｇｔｕｉ二層３１胎訂３１昌五甘Ｈ゛ ｄυｏ、４Ｊユ〇−いづつく ｅｙｔｍｕ　υ　＄＋１（７＋　、＜ＱＩＡａ　ψｍ　ａｇｏ、−。 Ｏζ　）　ω　（（Ｊ　＜ＣＰ＜ラ　ＣΣめ　べひ　＾Ｑ　５　Ｃ）　ｕ　ｍｒ ｙｔ　Ｔ：Ｐｏ　Ｃ：ＪＪ　＞ｍ　ｗｃ　ｋｌ口ｕ　ＯＣ）　ｔｏ　−〇　Ｑｙ 　ｃｕｅ　−ｓＱ、６ｓｕ　ａｌＵｒｙ＋ｃｐａＩＩ７１＜ひ　べｇ　＜ｒａ　 Ｃ５ひ　Ｈづ　φυｔ’ｃ＋　ＪＪ　ｏ　ｏ　＞ｏ　コラ　ω−１０１１「答よ 「己よ！七七８；品３２；よ よ＝　８　ぼ鱈Ｆ　９二「１ｓｊ月「 ｏ　−υ　（ＪＩＥ輻　トづ　べΦ　〉Φ　Ｈｇ３　？帽ｏ　ｔｙｔ　ｅｙｔ　 ｅＦＩａ　ｃｅｒｔ。ｃｔｙｓ　ｓｍ　：ｙｍ　５ａｐ０１！！ｅｌ’１＜　ロ 　−ロ、−ｍ　−Ｃ３？ｍ　％喝［Ｆ］　い　い　ラ　功　＜ｙ　ｔｓｏ　ｕｏ ’ｉ　Ｇひ　ト−ｕ　ｍ　Ｏ’ｌ　ＯＯｏ：ｊｅＩ′ＩＨｅ　Ｈ？　ｋ４Ｊ　Ｃ ０８ｇ品Ｅ　８７酎四巴斗ご＝２ ０　噌　１：ｒｌｏ　Ｃ７１コラ　０■　り■　αラ　Φ−「ぼ「「　ざ討＊８ ＝乱四８８ （Ｊ　（Ｊ　ｍ　Ｏｏ　’：５ｃｐｕｏ　ＱｌｓＣ：Ｕ　Ｏｕ「七Ｂ’　８　８ 　七Ｂ”：ｒ　Ｂ　Ｃ８ラ　−Ｏｕ　い　コｙ、ｎｏ　−φ　−一　〇８８　よ 　８　よ　３七１四乱　躍谷　≧コ　ご：討　、５Ｂ　・瓢藁零尺Ｂ　８　二「 品巳３”ＥＨづ　ＨｌｃｌＥ−４４Ｊ−一勺　ベ−べφ−山υ　い　、υコロ　 Φｏａｓφ　−Ｑ　Ｃ０φ−αＱ　φ　ｄ！七七シぼ≧コニ２　むｙ芝乱ぼ藁 切う０コ０　りひ　Ｃ０りφ　Ｃ０α○　ラ　いご＝孤七！七＝七己巳芝ｉ芝品 ：七 ｔａｔｙ＋　ｕＯ’ｂｕ　Ｊ−１ｐ　ロ　−ν　コロ　乃　０ご＝酌αぼ８Ｃ冨 翼ぼ３七　謬　ぼ ＞“　Ｃ０７い　■　雪Ｂｇ印品芸士　：　藁ロー［Ｆ］　−ＪＪ＞〜 ｃｏｏｔｙｔ　Ｈｃ　１．２１６　９ＩＯ＞ｍｗ＜ｃ　山ＡＪ　（Ｊ　ｍシ乱ヰ 　虱Ｈｍｇ吐ぽ：ぼ３品 吋　工ｕ　ｌ−２ｓｊ　（ＪａＪ　？ｕ　−ｄ　（ｊψ　０　φＦ−４ＪＪ　シ ラ　−ｔ７Ｉ　■０口１０　Ｃ０αひ　唖　−ｍｕ　ｅＤＪ＋１−１６　細ｅｎ ｔｎｌｌｌｌ　＋ＪＪ　＋Ｃｍ　。 〉Φ　工Ｃリ０　べ０−べい　＋ｍＧ（Ｊ　ロ　Ｑ、Ｗｉ　５４＋、ａＭ劃「誕 ジ□計二１看Ｓ甘ぎ猿μ具酋５目訂コ比左目卦且 −艷−ｏ、ｕｂｕ　φい　り０　Ｃ００υ　０〜二Ｂ′門、工ぼ汐＝七日とけ８ は 一〇　＞い。：ｊひ　切ｕ　ａｇｏ　Φυ　−φ　Ｏゆ九ｌ＝別むｇご七四乱「 七 ＞ＣＰ　シー　−０コΦ　■　−ψ　醋う　噂　−一〇’ｌ　ＡＬＩ４　Ｊ：Ｕ 　−１６ｐｐｍ　＞ｅ　＋−４Ｃ）　Ｃ６υ＜ｒＩ７Ｉｔ３ｍ　ｈｍ　、ｏｔｙ 　ｃａｎ　−ｇ　＜ｃｙｔ　（Ｊ　ｃｙｔ　ＣＪＥＩＩＪＪ　ｔ６ｕ　Ｑ＋Ｏｔ ｌｌｔ）　０ａｔ）　ｌｌ＄ｃ）ｃ＋：１ｑｃ）　Ｏｔｅｌ　４Ｊ＞う０ｒ−４ （Ｊ　＊帽　＞Ｑｌ　１帽　四３起α写　七　８　椙υ−べＯ’ｌ’ｌ：ｔＦ　 ＣＪ４Ｊ　ｄ：Ｑ２８０ｎｓでの吸光度　（□） ＦＩＧ、　６ 対ｍ　ＥＤＴＡ　Ｍｌ ＦＩＧ、　７ ２００＝−１−臂〕β ＦＩＧ、１０−Ａ ＦＩＧ、　１Ｏ−Ｂ ＦＩＧ、　１Ｏ−Ｃ ＦＩＧ、１１ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１４ 対照　ＥＤＴＡ　ｒＭＩ ＦＩＧ、　３５−Ａ ＦＩＧ、　１５−Ｂ 阻害剤ｍ（μ９） ＦＩＧ、　１６ 日数 ＦＩｏ、　１７ Ｅｌ数 ＦＩＧ、１８−Ａ 日数 ＦＩＧ、　１８−Ｂ ８５間（分） ＦＩＧ。１９ Ａ 国際調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．天然のメタロプロティナーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーションと生 物学的特性とを有する精製単離されたポリペプチド。
2. ２．ポリペプチドが外因性ＤＮＡ配列の原核生物発現又は真核生物発現の産物で ある請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．いずれの哺乳動物タンパク質とも結合していないという特徴も有する請求項 １に記載のポリペプチド。
4. ４．外因性ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である請求項２に記載のポリペプチド。
5. ５．ポリペプチドがウシメタロプロテイナーゼ障害物質である請求項２に記載の ポリペプチド。
6. ６．外因性ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である請求項２に記載のポリペプチド 。
7. ７．外因性ＤＮＡ配列が自律的に複製するＤＮＡプラスミド又はウイルスベクタ ーに担持されている請求項２に記載のポリペプチド。
8. ８．第２図に示すようなヒトメタロプロティナーゼ阻害物質又は該阻害物質の天 然の任意の対立形質変異体の一次構造コンフォーメーションの一部分又は全部を 有する請求項１に記載のポリペプチド。
9. ９．天然のメタロプロティナーゼ阻害物質の免疫学的特性を有する請求項１に記 載のポリペプチド。
10. １０．天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性を有 する請求項１に記載のポリペプチド。
11. １１．検出可能な標識物質と共有結合するという特徴も有する請求項１に記載の ポリペプチド。
12. １２．天然のメタロプロティナーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーションの 少なくとも一部分と生物学的特性の１つ又は複数とを有するポリペプチド産物を 原核又は真核宿主細胞中で発現させるのに使用されるＤＮＡ配列であって、（ａ ）第１図もしくは第２図に示したＤＮＡ配列又はこれらの配列の相補鎖、 （ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ又はそのフラグメントとハイブリッド形成するＤ ＮＡ配列、 （ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡとハイ ブリッド形成するＤＮＡ配列の中から選択されるＤＮＡ配列。
13. １３．ポリペプチド産物を発現するように請求項１２に記載のＤＮＡ配列で形質 転換又はトランスフェクションした原核又は真核宿主細胞。
14. １４．原核又は真核宿主における請求項１２に記載のＤＮＡ配列の発現のポリペ プチド産物。
15. １５．メタロプロティナーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーション及び生物 学的特性を有するポリペプチドの原核又は真核宿主発現をコードする精製単離さ れたＤＮＡ配列。
16. １６．請求項１５に記載のｃＤＮＡ配列。
17. １７．請求項１５に記載のゲノムＤＮＡ配列。
18. １８．ＤＮＡ配列がヒトメタロプロティナーゼ阻害物質をコードする請求項１５ に記載のＤＮＡ配列。
19. １９．大腸菌細胞中での発現にとって好ましい１つ以上のコドンを含む請求項１ ８に記載のＤＮＡ配列。
20. ２０．第２図に示した配列を有する請求項１５に記載のＤＮＡ配列。
21. ２１．酵母細胞中での発現にとって好ましい１つ以上のコドンを合む請求項１５ に記載のＤＮＡ配列。
22. ２２．検出可能な標識物質と共有結合する請求項１５に記載のＤＮＡ配列。
23. ２３．天然のメタロプロティナーゼ阻害物質のポリペプチドフラグメント又はポ リペプチド類縁体をコードするＤＮＡ配列。
24. ２４．メチオニルメタロプロテイナーゼ阻害物質をコードする請求項２３に記載 のＤＮＡ配列。
25. ２５．請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含む生物学的に機能するプラスミド又は ウイルスＤＮＡベクター。
26. ２６．請求項２５に記載のＤＮＡベクターで安定的に形質転換又はトランスフェ クションした原核又は真核宿主細胞。
27. ２７．請求項１５に記載のＤＮＡ配列の原核又は真核宿主細胞における発現のポ リペプチド産物。
28. ２８．第２図に示したアミノ酸配列の一部分又は全部を有し且つ天然のメタロプ ロテイナーゼ阻害物質の１つ以上のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性を有する合成ポ リペプチド。
29. ２９．第２図に示したアミノ酸配列の一部分又は全体の二次構造コンフォーメー ションの一部分又は全部を有し且つ天然のヒトメタロプロティナーゼ阻害物質の 生物学的特性を有する合成ポリペプチド。
30. ３０．天然のメタロプロティナーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーションの 一部分又は全部と生物学的特性の１つ又は複数とを有するポリペプチドの製造方 法であって、請求項２５に記載のＤＮＡベクターで形質転換又はトランスフェク ションした原核又は真核宿主細胞を適当な栄養条件下で増殖させ、前記ベクター 内でのＤＮＡ配列発現の所望のポリペプチド産物を単離することを含む方法。
31. ３１．いずれのヒトタンパク質とも結合していない精製単離されたグリコシル化 又は非グリコシル化形態のヒトメタロプロティナーゼ阻害物質。
32. ３２．請求項１に記載の有効量のポリペプチドと、医薬的に許容し得る希釈剤、 アジュバント又はキャリヤーとを含む医薬組成物。
33. ３３．哺乳動物体内における腫瘍細胞の広がりを阻止する方法であって、請求項 １に記載のポリペプチドを有効量投与することからなる方法。
34. ３４．哺乳動物の慢性関節リウマチを治療する方法であって、請求項１に記載の ポリペプチドを有効量投与することからなる方法。
35. ３５．ａ）［Ｍｅｔ−１］メタロプロテイナーゼ阻害物質、及びｂ）１つ以上の システインがアラニン又はセリンで置換されているメクロプロテイナーゼ阻害物 質の中から選択されるヒトメタロプロティナーゼ阻害物質の類縁体をコードする ＤＮＡ配列。
36. ３６．請求項３５に記載のＤＮＡ配列の原核又は真核宿主細胞中における発現の ポリペプチド産物。
37. ３７．メクロプロテイナーゼ除害物質０．５ｍｇ当たり０．５ｎｇ以下の発熱物 質を含み且フ純度９５％以上のＭＩを含む製剤。
38. ３８．メタロプロティナーゼ阻害物質と特異的に結合する抗体。
39. ３９．抗体がモノクローナル抗体である請求項３８に記載の抗体。