JPH04500726A - パーヒューシブクロマトグラフィー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パーヒユーシブクロマトグラフィー　゛本発明は、クロマトグラフィー分離を極 めて高い効率で行なう方法及び材料、すなわち、高ｄ１分解（ｒｅｓｏｌｕ−ｔ ｉｏｎ）及び単位容積のクロマトグラフィニマトリックス当りの高い処理量の両 方を特徴とする吸着クロマトグラフィー技法に関する。一層詳細には、本発明は 、クロマトグラフィー、特に分取り”ロマトグラフィーにおいて有用なマトリッ クス用の新規な幾何学、並びにクロマトグラフィー分離を従来達成されていない 効率で行なう方法に関する。

何年もの間、装入材料、疎水性／親水性相互作用、水素結合、キレート化、免疫 在学結合及びこれらの作用の組合わせに基いた、個々の溶質の表面に対する親和 力の差が、クロマトグラフィー手順においそ、溶質のＩＲ合物を分離するのに用 いられてきた。液体クロマトグラライ−（ｊｃ）は、何十年もの間、分析分離の 分野を支配してき、しばしば実験室規模の分取分離用に用いられてきた。液体ク ロマトグラフィーは、供給混合物を収着性粒子の充填床上に通すことを伴う、溶 液が、逐次収着剤表面を通って化学環境が変わることにより、収着された種がｉ 択的に溶離されることになる。液体は、これらの系の中の粒子間の間隙のある空 間を流れる。

液体クロマトグラフィー用に用いられる媒体は１表面積対合積比の高い軟質粒子 からなるのが代表的である。

かかる粒子は、平均（＋５ｅａｎ）直径が数百オングストローム（人）或はそれ 以下程度の小さい細孔を多数有することにより、活性表面積の９５％或はそり以 上が粒子内部にある。このような材料は、特に有機体のような比較的に小さい化 学化合物の分離において、極めて良好な結果を得てきたが、大きい分子を分解す るのに、限界があることはよく認識されている。液体クロマトグラフィー材料は 、また、幾何学的、化学的及び機械的性質に基いた操作上の束縛を竺徴とする１ 例えば、軟質ＬＣ粒子は、約５０ｐｓ＋　（３，５ｋｇ／ｃｍ″）を越える圧力 損失では、多孔質粒子が容易に破砕されることから、実施することができない。

最近、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣＩが、特に分析用途用にポピユ ラーになってきた。　ＨＰＬＣは、平均直径が　１００μｍ程度の軟質、粒状、 ゲル様材料を用いる代りに、シリカのような無機材料或はスチレンジビニルベン ゼンコポリマーのような硬質ポリマーで作られた１０〜２０μｍの剛性多孔質ビ ーズを媒体として用いるのが代表的である。　ＨＰＬＣは、カラム操作圧力損失 を大きくして、分解分離を幾分早くかつ高くさせる。

発展中のバイオテクノロジー産業から出現する生成物は、現在クロマトグラフィ ーに新しい問題を提起している。これらの生成物は、分子量が１０’〜１０＠ダ ルトンの範囲内の大きくかつ変わりやすい蛋白質であるのが典型的である。この ような生成物は、しばしば、細胞破片、種々の溶質、栄養成分、ＤＮＡ　、脂質 、サツカリド、同様の物理化学的性質を有するたんば〈種を含む何百もの汚染種 を含有する混合物から精製される。収穫液中の蛋白質生成物の濃度は、１ｍｇ／ Ｉ程に低いことが時にはあるが、１００ｍｇ／ｌ程度であるのが普通である。特 に、蛋白質は大きい程極めて壊れやすくなり、それらの配座は、生物学的機能に とって必須である。大きい蛋白質は、構造が複雑でありかつ壊れやすいことから 、相対的に低い流体剪断で、好ましくは、最少かつ短い時間だけ表面と接触させ るだけで処理しなければならない、プロセス液中にプロテアーゼが存在する場合 、精製をできるだけ迅速に行なうことが必須になることがしばしばある。

クロマトグラフィー技法の主要な性能尺度は生産性及びピーク分解である。生産 性は比処理量に関係し、単位時間当り、単位容積のクロマトグラフィーマトリッ クス当り処理することができる溶質の質量の尺度である。生産性は、ｌ）単位容 積のマトリックス当りの表面積、２）収着剤表面への溶質質量移動速度、３）吸 着及び脱着速度、及び４）マトリックスを通る流体流速が増大することにより向 上するのが普通である。

分解は、系が達成することができる精製度の尺度であり、分離する混合物中の溶 質の中での親和力の差異によりかつ系の分散への固有の傾向（バンド展開）によ って特定される。前者の変数は、プロセス液中の溶質の性質及びクロマトグラフ ィー媒体の相互作用性表面の化学的性質によって調節される。バンド展開は、主 に、クロマトグラフィーマトリックスの幾何学及びクロマトグラフィー手順の間 に得る質量移動速度によって調節される。

分解は、理論プレート高さが減少するにつれて、或はプレート数が増大するにつ れて、向上する。プレート高さはマトリックス幾何学的係数に関係するバンド展 開の間接的尺度であり、該係数は流れ、拡散及び収着速度論の不衡平に影響を与 える。

分取りロマトグラフィー用にデザインしたマトリックスにおいて、生産性を最大 にさせかつバンド展開を最小にさせることが望ましいのは明らかである。しかし 、クロマトグラフィーマトリックスのデザインは、固有に、目標の中のトレード オフに至る従来回避し得ない束縛を特徴とする０例えば、表面積対容積の比が大 きいことの要件は、処理量にとって大切であり、実用的に言えば、マトリックス を微孔質にすることを必要とする。このような微孔質粒状物質は、呼称細孔寸法 が粒子の表面積と逆の関係にあること及び呼称粒子直径が所定の充填カラムにつ いての圧力損失を指図することを特徴とする。流れを速くしかつ微孔質粒子を小 さくして操作することは、高い操作圧力を要しかつバンド展開を促進させる。

粒子の寸法を大きくすると、背圧が減少する。細孔の寸法を大きくすることは、 表面積を減少させ、かつ粒子寸法を増大させることと共に、生産性を相当に減少 させるに至る。硬質粒子を高圧と共に用いるならば、生産性の増加が達成され得 るが（例えば、）ＩＰＬｃ）　、プレート高さ、すなわちバンド展開の尺度はマ トリックスを通る液体の流量に比例する。すなわち、高表面積多孔質粒子を用い る場合、流体速度を増すにつれて、プレート高さが増大しかつピーク分解が低下 する。

バンド展開の現象は、下記の関数によって説明するのが普通である： Ｈ＝Ａｕ””　＋Ｂ／ｕ＋Ｃｕ　（１式）式中、Ａ、Ｂ及びＣは特定のクロマト グラフィーカラムについての定数であり、Ｕは床を通る流体の速度であり、Ｈは プレート高さである。Ａ項は、縦方向拡散によって引き起こされるバンド展開の 尺度、すなわち、カラムの軸に沿ってのろい分子拡散があることを説明する項で ある。Ｂ項は、カラムを通過する流体が多くの具なる通路を取り得ることを説明 する。これは、しばしば「渦拡散」と呼ばれる。Ａ及びＢ項は、所定のマトリッ クスにおいて低い流体流速でのバンド展開現象を支配する。

高い速度では、これらのファクターのバンド展開への寄与は最小であり、現象は ０項によって支配される。この項は、スタグナント移動相物質移動、すなわち、 マトリックスの粒子の細孔への遅い物質移動速度を説明する。

溶質フロントがカラムの中を所定の速度で通るにつれて、いくらかの溶質が細孔 に浸透してフロントより後で溶離することになる。

０項に帰し得るバンド展開度は、粒子直径、細孔内部の溶質拡散係数、細孔寸法 、及び細孔の外部の溶質速度に関係する。より詳細に言えば、０項は下記式によ って決められる； 式中、Ｃは定数であり、ｄは粒子の直径であり、Ｄ　６ｆｔは細孔内の溶質の有 効拡散係数である。処理量を最大にするには、流体速度を高くすべきであるが、 前記式から明らかな通りに、速度を増すことは、細孔拡散による物質移動限界を 増大させ、よって、バンド展開の増大及び動的充填キャパシティの減少に至る。

また、バンド展開は粒子寸法の二乗の関数として増大することを注記する。すな わち、大きい粒子の間隙の中で液体流量を多くして用いることによって所定の圧 力損失において処理量を増大させようと試みることは、遅い粒子内拡散によって 引き起こされるバンド展開の幾何学的増大を生じる。

また、２式から、バンド展開は、有効拡散定数を増大させることによって減少さ せ得ることも明らかである。

拡散速度が、溶質の分子量の逆関数であり、濃度勾配に依存するのは、もち論で ある。すなわち、高分子量を有する蛋白質は拡散定数１０”’〜１０−”ｃ　ｍ 　’　、７秒の範囲を有するのが典型的である。このため、蛋白質のクロマトグ ラフィー分離は、低分子溶質の場合に遭遇されないバンド展開のレベルを生じ得 る。その上、粒子の細孔を通る有効拡散率は、自由溶液における拡散率に比べて 小さい、これは、溶質の分子直径に匹敵する、例えば、溶質の約ＩＯ或は２０倍 以下の平均直径を有する細孔において、拡散が妨げられるためである。又、溶質 が粒子を通り過ぎる流体から粒子の中に拡散しなければならないことから、有効 な拡散率は理想と異なる。事実上、拡散方向に垂直な方向であるものにおいて対 流流れを増大させることは、理想より幾分小さい有効拡散速度を生じる。

有効拡散率は、又、収着剤の表面に溶質を充填する間に、低下される。この現象 は、吸着された蛋白質による細孔の入口の吸蔵によると説明されてきた。蛋白質 分子は、多孔質マトリックスの中に拡散し始めるとき゛、典型的には、細孔の入 り道の回りに−ある、遭遇する最初の部位・において収着すると考えられる。し ばしば、高分子溶質の大きさが細孔の直径に比べて大切になるのが実情である。

よって、数分子が収着された後に、細孔の入口は吸蔵し始め、溶質の拡散による 細孔内部への通過が妨げられる。この吸蔵現象の結果、収着剤粒子の内部への溶 質の物質移動゛は更に低下される。　・多“孔質粒゛子におけるスタグナント移 動相充填によって引き起こされるプレーと高さへのマイナス作用の多くは、粒子 寸法、よって、細孔長さを減少させることによって軽減され得る。しかし、上述 した通りに、この方策は圧力損失を増大さ゛せて操作することを必要とする。

最近、Ｆ、Ｅ、　Ｒｅｇｎｉｅｒによって、比較的大きい細孔を有するクロマト グラフィー粒子は、大きい分子を一層速く拡散させることによって、性能を高め 得ることが提案された。細孔を増大させれば、細孔入口の目詰まりの問題を軽減 させ、細孔効果によって比較的妨げられない粒子中への拡散を可能にさせると考 えられた。

対流プロセスによって支配される種々のクラスのクロマトグラフィー系がある。

このタイプの系は、収着剤表面をあるタイプの床を延通ずる流路に沿って分布さ せて成る。床は、非多孔質粒子で構成されてもよくもしくは非多孔質粒子集合体 、ファイバーマット、或いは加工孔を定める材料の固体シートからなる層系とし て具体化してもよい、非多孔質粒子系の流路は、拡散支配される系の場合のよう に、粒子間の間隙のある空間によって形成される。ファイバーマットでは、ファ イバー間の空間が流路を形成する。エツチング、レーザービームカッティング或 は他の高エネルギープロセスによって形成される流路は、典型的には、膜をずっ と延通ずるのに対し、前者のタイプの流路は一層曲がりくねっている。

これらの系では、溶質は対流流れによって収着剤表面に運ばれる。流路の大きさ がしばしば極めて大きい（０，２〜２００μｍ）ことから、溶質は、収着剤表面 に接触しないで比較的長い距離を移送され得る。流れは通常層流であり、揚力が 溶質を流路壁から転じさせる。溶質の固相への物質移動に対するこれらの欠点は ひどくなり、高流量に重大な障害をもたらし得る。すなわち、流路を長くして、 溶質が相互作用接触を避けながら、収着剤マトリックスの中を押し流されるのを 確実はしなければならない、流路の直径を小さくすることは、必要とする操作圧 力損失を増大させる。速度を減、しるならば、処理量が減少するのは明らかであ る。対流輸送系のなお別の欠点は、かかる系が有する表面積が固有に比較的小さ く、よって、上述したタイプの他の系に比べてキャパシティが小さいことである 。

粒状収着剤から細孔を除けば、分離を極めて速く達成させることができる１例え ば、２μｍ非多孔質粒子カラムは、７つの蛋白質の混合物を１５秒より短い時間 で分離することができる。しかし、このアプローチは、下記の表において驚くべ き程に立証される通りの高分子材料の精製についての要求が提示するエンジニア リング問題を解決することができない。

非多孔質粒子カラムの特性 粒子寸法　１０　５．０　２．０　１．Ｑ　Ｏ，６０，１０，０５（μｌ１１） 表面積　０．６　１．ロ　３．１　６．３　１０　６３　１０５（ｍ”／ｓｌ） 圧力損失　１７　６８　４２６　１７００６８００１７０００　６８０００（ｐ ｓｉ／床高さ１ｃｍ） （１，２）　（４，８）　（２９，９１（＋２０１　（４８０）　（＋２００） 　（４８００）（ｋｇ／ｃ＋ａ”／床高さ１ｃａ＋） これらのデータが示す通りに、小さい粒子は、充填カラム中に存在しようと或ｉ ま膜中に存在しようと、大きい表面積及び大きい装填キャパシティをもたらすの に十分な粒子寸法で、極めて重大な圧力問題を有する。対照して、５〜１００μ ｍの範囲の３００人細孔直径粒子は表面積７（１−９０ｍ″／１を有し、Ｉ、　 ０００人材料は４０〜６０ｍ”／＋１程度の面積を有する。

クロマトグラフィーサイクルは４つの具なる段階、すなわち、吸着、洗浄、溶離 及び再平衡からなる。各段階における速度制限工程は、移動性流体と静止マトリ ックス表面との間の分子の移動である。最適効率は急速な、好ましくは瞬間的な 物質移動及び高流体ターンオーバーによって促進される。蛋白質をステップ濃縮 する場合、収着剤充填の間に、床における移動相の速度が増すにつれて、収着さ れる分子は少なくなる。その結果、いくらかの蛋白質が流出物中に失われ或は「 漏出」として失われていることになる。漏出濃度が、例えば入口濃度の５％に限 られるならば、その限界は、床が許容する最大法速度を定める。その上、床速度 の増大は単位表面積当りのローディングを減少させる。

上述した分析から明らかな通りに、根本的と考えられる束縛が、既存のクロマト グラフィー材料のデザインにおいて目的の間のトレードオフを指図してきた。生 産性及び分解の両方を最大にさせるクロマトグラフィーマトリックス幾何学が現 われてこなかった。

本発明の目的は、改良されたクロマトグラフィー材料のデザインの基礎となるエ ンジニアリング原理を提供すること、かかる材料を提供すること、及び改良クロ マトグラフィー法を提供するにある。別の目的は、新規なりロマトグラフィー分 離方式（本明細書中、パーヒユージョンクロマトグラフィーと言う）を実施する ための、驚く程に高い生産性及び優れたピーク分解を高い流体流量であるが、管 理可能な圧力損失で達成することを特徴とする、所望の通りに銹導し得るクロマ トグラフィー粒子及びマトリックスを提供するにある。別の目的は、複雑な混合 物から関心のある高分子生成物を分離及び精製する改良法を提供するにある。別 の目的は、対流支配される及び拡散支配される両方のクロマトグラフィー系の欠 点を克服するにある。なお別の目的は、有効なプレート高さが相当の範囲の高流 体流速にわたって実質的に一定であり、かつ更に高い速度において適度に増大す るにすぎないクロマトグラフィー手順並びにマトリックス幾何学を提供するにあ る。

発明のこれらや他の目的及び特徴は、本明細書中下記の記載から明らかになるも のと思う。

１囲立１１ 今、限界流体速度を越えるクロマトグラフィー分離に利用する場合に、対流物質 輸送と拡散物質輸送とを結び付けた混成物質輸送系（本明細書中、パーヒユージ ョンと言う）を経て作動するクロマトグラフィーマトリックス幾何学を創案し得 ることを見出した。マトリックス材料は、分解を有意に落さないで、生産性をオ ーダーの大きさで増大させる点で、驚くべきものである。その上、驚くべきこと に、生産的操作を比較的低いカラム圧力損失で可能にする比較的大きい粒子を用 いて、最も顕著な改良が達成される。パーヒユージョンクロマトグラフィーは、 バンド展開と流体速度との連結を解き、従来無い処理量と分解との組合せを達成 するのに成功し、かつ圧力損失を決めるものと物質移動を決めるものとの連結を 解く。

パーヒエ−ジョンクロマトグラフィーは、急速分析用に、また分取関係において も用いることができる。おそらく、それの最適な利用は、ポリペプチド、蛋白質 、多糖、等のような大きい生物学的に活性な分子の分離及び精製においてである 。その技術は、拡散定数がずっと大き（かつ物質移動が固有に一層速い小さい分 子については、利点が小さくなる。しかし、糖やアルコールのような低分子物質 の場合でさえ、パーヒユージョンクロマトグラフィーは、特に、大きい粒子をク ロマトグラフィーマトリックス材料として用い、拡散が作用しなければならない 距離が比較的大きい場合に、有利に利用することができる。

これらの目的を達成するキーは、少なくとも第−及び第二細孔集合、すなわち「 第一」及び「第二」相互連絡細孔集合であって、第一細孔集合の部材は第二細孔 集合の部材に比べて大きい平均直径を有するものを定めたマトリックス材料の入 手可能性である。マトリックスは、また、分離する溶質と可逆的に相互作用しか つ第二細孔集合の部材と流体連絡するように配置された表面領域を定める。第− 及び第二細孔集合の大きさは、溶質の混合物をマトリックスの中に限界速度を越 えて通す場合に、両方の細孔集合を通して対流流れが銹起されるように調節する 。パーヒユージョンクロマトグラフィーの域は、流体流れの速度が増大して、第 二細孔集合の部材を通る対流流れがそれらの細孔を通る溶質の拡散速度を越える レベルになる際に、始まる。従来のクロマトグラフィー技術を越える利点は、最 初は余り大きくないが、空塔庄速度が増大するにつれて、生産性の顕著な増大が 達成される。

第−及び第二細孔集合の各々の内の部材の平均直径は相当に変わることができる 。実際、一種の好ましいマトリックス材料は、対流流れを可能にする複数の相互 連絡細孔部分集合（５ｕｂｓｅｔ）及び対流が起きる細孔と通じるルーピング細 孔或はブラインド細孔を含む一層小さいサブ細孔（５ｕｂｐｏｒｅ　）を有する 第二細孔集合を含む、サブ細孔は最も有意にマトリックスの表面積に寄与する。

溶質／マトリックス相互作用のほとんどはこれらのサブ細孔内で行われる０表面 と相互連絡細孔部分集合の部材との間の物質移動は、拡散によって行われる。こ のタイプの幾何学は広い平均細孔直径分布を有する第二細孔集合を生じる。別の 実施態様では、第−及び第二細孔集合の内の一方或は両方は、集合における細孔 の９０％の直径が集合にお番ブる全ての細孔の平均直径の１０％の範囲内に入る ような狭い細孔直径分布を有する細孔を含む、好ましい実施態様では、サブ細孔 は約７００オングストロームより小さい平均直径を有する０分離する溶質の流体 混合物をマトリックスの中に、ｆａ質が第二細孔集合の部材の内の一つの内から 表面領域に及び表面領域から拡散する時間が、溶質が領域を対流により流れて通 過する時間の約１０倍以下になるような速度で通すのが好ましい。

このタイプのマトリックス幾何字はいくつかの利点を有する。第一に、十分な潔 さのマトリックスでは、圧力損失は、主に、第一細孔集合の一層大きい平均直径 によって決まるが、液体は全て第二細孔集合の中を多数回通る。第二に、好まし い充填粒子マトリックス実施態様では、粒子内スタグナント移動相束縛に関し、 パーヒユーシブマトリックス挙動は、直径の極めて小さい充填非多孔質粒子或は 多孔質粒子のマトリックスの様に挙動するが、それでも、圧力及び速度要件はず っと大きい粒子床の特性を示す、第三に、収着剤表面と移動相との間の物質移動 は、主に、対流流れによって行われる。それでも拡散は起きなければならないが 、拡散路はずっと短くなるので、この束縛は最小になる。

発明のクロマトグラフィー法では、流体混合物、溶離剤、等を、マトリックスの 中に１０００ＣＩｌｌ／時間より大きい、好ましくは１５００ｃｍ／時間より大 きい床速度で通すのが好ましい、収着された全たんば〈質１．　Ｏｍｇ、しばし ば２、Ｏｍｇｌ　ｌ剤マトリックス１ｍｌ／分を越える生産性が常習的に達成さ れる。好ましい充填粒子マトリックスでは、粒子は平均直径少なくとも約８．０ μｍ、好ましくは２０μｍ以上を有するのが好ましい、大ざっばに言えば、おお よそ球形の粒子の間の間隙によって定められる細孔の平均直径はおよそ粒子直径 の部分の−になるので、第一細孔集合を含むこれらの間隙のある細孔は平均直径 約３．０μｍ程度を有することになり、一層大きい粒子の場合、７〜２０μｍ又 はそれ以上を有することになる。この実施態様における第二細孔集合は、粒子内 の通し細孔（ｔｈｒｏｕｇｈｐｏｒｅ）からなる、有効なバーヒユーシブクロマ トグラフィーは、粒子の平均直径対第二細孔集合の平均直径の比を７０より小さ く、好ましくは５０より小さくすることを要する。第−及び第二細孔集合の大き さは、床を通る実用的流速において、第一細孔集合、すなわち粒子間の間隙を通 る対流流速対第二細孔集合、すなわち粒子における通し細孔の比がｌθ〜１００ の範囲内になるようにするのが好ましい。

発明のクロマトグラフィーマトリックスは、本明細書中に開示するエンジニアリ ング原理を具体化するために特にデザインした充填粒子、膜様構造及び加工ミク ロ構造の床を含む種々の形態を取ることができる。しかし、好ましい形態は、平 均直径が１０μｍより大きい粒子であって、それらの各々が約２．０００人より 大きい平均直径を有する複数の通し細孔を定めるものの充填床である０粒子は、 通し細孔と直接流体連絡する大きい内部溶質相互作用性表面積を供する硬質固体 を含む、現行で好ましい粒子は多数の相互接着したポリマー球（本明細書中、「 ポロン」と呼ぶ）を含み、これらは−緒になってサブ細孔及び通し細孔を含む間 隙のある空間を定める。サブ細孔は平均直径３００〜７００人の範囲を有するの が好ましい０発明のクロマトグラフィー粒子及びマトリックスを作成することへ のこのアプローチは、又、通し細孔とサブ細孔との間を連絡し、中間平均直径を 有する分枝（ブランチング）細孔を定める粒子の製造を可能にする０通し細孔、 サブ細孔及び任意の相互連絡細孔は異方性であるのが好ましい。

この粒子加工技法において、ボロンから粒子を製作するに、小さいボロンクラス ターを作り、次いでクラスターを集合させ、次いで可能ならば集合体を凝集させ て顕微鏡的寸法、例えば４０μｍより大きい粒子を形成するのが好ましく、これ らは必要に応じてそれら自体で相互接着されて一体のマトリックスとなり得る。

このアプローチは、平均直径の具なる複数の通し細孔部分集合及びサブ細孔を含 む第二細孔集合を生成するに至る。いずれの通し細孔の逐次部分集合の平均直径 の比もＩＯより小さいのが好ましい、最も小さい通し細孔の部分集合の平均直径 対サブ細孔の平均直径の比は、２０より小さいのが好ましい０本明細書中、相互 接着された或は充填された粒子間の間隙と規定する第−細孔集合及び最も大きい 通し細孔の部分集合の平均直径の比は、７０より小さいのが好ましく、５０より 小さいのが一層好ましい。

発明のこれらや他の目的並びに特徴は下記の図面、配備及び請求の範囲から明ら かになるものと思う。

の　ｔ　フ　日 図　ＩＡ、ｌＢ、ＩＣ，ＩＤ及び図２は、バーヒユージョンクロマトグラフィー を説明するのに有用な粒子／マトリックス幾何学の略図であり： 図３は、拡散支配された、対流支配された及びバーヒユーシブクロマトグラフィ ー系の領域を示す、生産性対流体速度（Ｖｓ−ｍ）及び操作圧力（ΔＰ）のグラ フであワ　。

図　４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、バーヒユージョンクロマトグラフィーを実施するた めのマトリックスを製造するのに有用なマクロ多孔質クロマトグラフィー粒子の 走査電子顕微鏡写真であり、４ＡはＩＯ，０００Ｘであり、４Ｂは２０．０００ ｘであり：４Ｃは５０．０００Ｘであり：図４Ｄは、図４　Ａ−４Ｃに示す粒子 構造を用いてバーヒユージョンクロマトグラフィーする間に支配していると考え られる流体力学を示す略ダイヤグラムであり。

図５Ａはクロマトグラフィーカラムの略断面であり；図５Ｂは、図５Ａに示す円 Ｂの略詳細図であり；図５０は、バーヒユージョンクロマトグラフィーマトリッ クス要素の一理想化構造を示す略ダイヤグラムであり　。

図６は、慣用のクロマトグラフィーとバーヒユージョンクロマトグラフィーとの 間の速度論的挙動の差異を示す、出口濃度／入口濃度対プロセス容積（ミリリッ トルで表わす）の溶質漏出カーブであり； 図７は、代表的なバーヒユーシブカラムの吸着キャパシティと慣用の拡散カラム とを比較する、所定の容積の坏についてのキャパシティ（＋ｍｇで表わす）対空 塔流体流速の棒グラフであり。

図８は、所定の拡散係数及び粒子寸法においてｌＯより大きいベクレ数を達成す ることができる最大及び最小細孔寸法を示す　、床速度（Ｃ１／時間で表わす） 対通し細孔寸法（オングストロームで表わす）のグラフであり二図９は、本明細 書中に開示する仮定を与えて、種々の■１０．におけるバーヒユーシブ領域を示 す、最小細孔平均直径（オングストロームで表わす）対粒子直径（μｍで表わす ）のグラフであり。

図１Ｏ〜２９はバーヒユージョンクロマトグラフィー系の性質を立証する種々の データを提示するグラフである。

それぞれのドローン図における同様の参照文字は、対応する部分を示す。

■ 本明細書中、初めに、バーヒユージョンクロマトグラフィーの必要なマトリック ス構造の性質及び理論的支持並びに操作パラメーターを開示し、次いで、クロマ トグラフィー法を特定の例に最適化し及び適応させるのに有用なエンジニアリン グ原理、バーヒユージョンクロマトグラフィーの実施において有用な特定材料の 開示、及び現在入手可能な材料を用いたバーヒユージョンクロマトグラフィー手 順の例を開示することにする。

広義には、本発明に従えば、バーヒユージョンクロマトグラフィーは、多孔度に 関しニモード或は複数モードの幾何学を特徴とする特にデザインしたマトリック スの中に流体を限界レベルを越える速度で通して実施する。

恐らく、新しい手順に関する最も根本的な観察は、対流支配される系及び高いプ レート高さのキャパシティ特性並びに拡散支配される系のバンド展開特性の両方 の損失を回避することが可能であることである。これは、粒体の床の中の間隙に よって定められ、圧力損失及び床を通る粒体流速を決める大きい細孔の集合、並 びに直径の小さい細孔、例えば異方性通し細孔、の集合を有するマトリックスの 中にクロマトグラフィー流体を押し通すことによって、達成することができる。

小さい方の細孔は、個々の粒子に浸透しかつクロマトグラフィー流体を、クロマ トグラフィー流体中の溶質と相互作用性の粒子内の表面領域に対流によって送達 させる働きをする。

第−及び第二細孔集合の相対的大きさは、床を通る手頃に達成し得る流体速度に おいて、対流流れが大きい方の細孔のみならず、小さい方の細孔においても生じ るようにしなければならない、細孔を所定の圧力で通る流体速度は細孔半径の二 乗の関数であるので、実用的な流体速度、例えば４００〜４．０００　ｃｍ／時 間において、二つの細孔集合の平均直径はかなり近くなければならないことが認 められ得る。大ざっばに言えば、球形粒子の間の間隙によって定められる細孔の 平均直径は粒子の直径の約三分の−である。すなわち、例えば、平均直径ｌＯμ ｍ及び平均通し細孔直径１．０００人を有する粒子は、細密充填してクロマトグ ラフィー床を形成する場合、平均直径およそ３〜４μｍ及び０．１μｍを有する 細孔の第−及び第二細孔をそれぞれ定める。このように、大きい方の細孔の平均 直径は小さい方の細孔の平均直径の３０〜４０倍程度である。これらの状況下で 、流体の有意のフラクションが粒子内の小さい方の細孔を対流によって通る前に 、極めて大きな圧力損失が必要とされる。

これらのタイプの材料を用いた実験は物質輸送速度論に対してバーヒユーシブ増 進を示さなかった。すなわち、試験した流速において、ｌＯμ園粒子中への物質 輸送は拡散によって支配されるようである。別の言い方をすれば、通し細孔内の 対流流れは、物質輸送速度になんら有意に寄与しない、一層慣用の固体クロマト グラフィー媒体、例えばほとんどのシリカベースの材料、寒天、デキストラン、 等のようなずっと小さい細孔（通常、およそ５０〜３００人）及び一層大きい粒 子寸法（２０〜１００μｌ）を有するものは、実際、パーヒユーシブモードにお いて作動させることができないのは明らかである。単に、二次ミクロ細孔内に有 意の対流流れを生じる実用的系において実際的流速が達成され得ないだけである 。平均直径の一層大きい通し細孔、或は一層特には、第一細孔集合と第二細孔集 合との平均直径比の一層小さいものが、パーヒユージョンクロマトグラフィーを 実施するのに要求されるのが普通である。

パーヒユージョンクロマトグラフィーの性質及びそれに必要とされるマトリック ス幾何学は、図ＩＡ−ＩＤを参照すれば一層良く理解されるものと思う、これら は、マトリックスの一領域を略断面で示す種々のタイプのクロマトグラフィーマ トリックスにおける流体流れを大ざっばにモデル化した略図である０図の「上方 」側から主流路１０によりクロマトグラフィー粒子或は領域に接近し、図の「下 方」側から出る。かかる粒子或は領域は、溶解された溶質を含有する流体移動相 に粒子をバイパスさせる、囲む流路を有しても或は有しないでもよい０粒子は、 それら自体、点により表わされる溶質相互作用性表面領域を多数含み、これらに 溶質分子が接近しなければならない、これらの領域の性質は活性表面の化学に依 存する０本発明の方法は活性領域の性質に無関係であり、種々の特定の実施態様 において、カチオン性或はアニオン性交換、疎水性／親水性相互作用、キレート 化、アフィニティークロマトグラフィー、水素結合、等に適した表面の形態を取 ることができる。プレート高さを低くしかつバンド展開を最小にさせるには、相 互作用性表面領域と流体移動相との間の急速な物質移動を必要とする。キャパシ ティを大きくするには、物質移動を速くさせかつ多数の相互作用性領域、すなわ ち高表面積を存在させることの両方を必要とする。溶質は対流及び細胞内拡散の ２つの機構によって輸送される。前者は細孔寸法、圧力損失、細孔の長さ及びく ねり並びに細孔の入口及び出口の回りの局部幾何学によって決められ、後者は、 主に、種々の溶質の分子の大きさ、細孔の大きさ及び濃度勾配の関数である。

２つのタイプの対流支配されるクロマトグラフィー系におけるマトリックスとの 溶質相互作用の機構を図ＩＡ及び図ＩＢによって開示し、拡散支配される系を図 １０によって開示し、パーヒユーシブ系を図ＩＤによって開示する。

図　ＩＡは密接充填非多孔質粒子を含むクロマトグラフィーマトリックスを示す ０粒子の内部は溶質分子の接近を阻む、溶質分子にとって利用可能な唯一の相互 作用性表面要素は、粒子の外部表面の回りに配置されたものである０図ＩＢは、 通し細孔及び相互作用性表面領域を壁に沿って配置させた膜様クロマトグラフィ ー「粒子」（実際は、固体マトリックスにおける領域）を示す０図ＩＢの幾何学 はフィルター床及びポリマーウェブ形態学（例えば、紙及び膜フイルタ−）並び に非多孔質繊維或はチューブの束に類似している０図ＩＡ及び図ＩＢの形態学で は、クロマトグラフィーマンドレルの外表面だけがマトリックスのキャパシティ に寄与する。これらの幾何学の表面積対容積比は比較的小さく、従って、固有に 低い生産系である。流路ｌＯが十分長ければ、溶質分子が対流流路から相互作用 性表面要素に拡散しなければならない距離が小さいことから、極めて早い分離及 び高い分解が、漏出なしで達成されることができる。相互作用性表面要素（表面 領域）の数を、粒子寸法を減小させて（図　ＩＡ）或は細孔直径を減小させる（ 図ＩＢ）ことによって増大させようとする試みは、操作圧力を高くするトレード オフになるのは持ち論である。床を通る流体速度を最適を越えて増大させると、 性能を下げる。

図１Ｃでは、相互作用性表面要素は、粒子の内部の回りに配置され、粒子の単位 容積当たりでは、数がはるかに多くなる。ここで、マトリックスの内部への接近 は、小さい細孔１２を経て可能である。溶質は、これらの細孔の中を拡散による だけで、或は拡散に極めて遅い対流を結び付けた組合わせによって通ることがで きる。この場合、対流は総括物質輸送速度論に対して有意の影響を与えない、よ って、溶質分子は遅い拡散プロセスによって流路ｌＯから粒子の内部に移動され る。この束縛は、粒子を小さくする、よって拡散によって移動させる必要のある 距離を短くすることによって、軽減させることができる。しかし、再び、これは 、要する操作圧力損失を大きく増大させて達成される。蛋白質のような高分子の 場合、細孔内の有効拡散率は、上述した通りに、細孔表面障害及び吸蔵作用によ って、更に低下される。

このような多孔質粒子が十分に充填される、すなわち、溶質分子が細孔に沿って 拡散して、今すべての相互作用性表面領域を占めている場合、マトリックスは洗 浄され、ついで溶離が始まる。これらの突然の状態の変化は、溶質に粒子を排除 させる。これは、再び、遅い拡散によって達成される。溶質は、粒子の中央から 徐々にリング流路に達し、対流によって運び去られる０粒子を拡散によって「空 にする」際のこの遅れはクロマトグラフィーパルスに与える後（ｔｒａｉｌｉｎ ｇ）テールの支配的原因であり、分解を低下させる０粒子が充填され及び未充填 になり得る速度がクロマトグラフィープロセスの速度論を決める。溶質の逃散が 速い程、すべての溶質がクロマトグラフィーカラムの排出に達する時間は短くな り、よって、だらだらつながる（　ｇｔｒａｇｇｌ　ｉｎｇ）テールが短くなり かつバンド展開が小さくなるのは明らかである。流路ｌＯにおける流体速度を最 適レベルを越えて増大させることは、処理量にプラスの効果を与えず、プレート 高さを増大させかつ分解を低下させる。

図ＩＤはパーヒユージョンクロマトグラフィーに適したマトリックス粒子をモデ ル化する０図示する通りに、マトリックスは、比較的大きい平均直径を有する流 路１０（粒状マトリックス実施態様において粒子間の間隙によって定められる） に加えて、また、本発明で粒子体によって定められる通し細孔として具体化する 第二細孔集合１４も含む、細孔１４の平均直径は、図ＩＣに示す慣用のクロマト グラフィー粒子の拡散輸送細孔１２に比べてずっと大きい、細孔１０及び１４の 平均直径の比は、実際的にクロマトグラフィー系において達成することができか つ細孔１４内の対流流れを細孔１４を通る拡散速度より速くさせる粒体速度限界 が存在するようにする。

正確に言えば、パーヒユージョンのこの限界が生じる点は多くの要因によるが、 主に、第−及び第二細孔集合、ここではそれぞれ細孔１０及び１４の平均直径の 比に依存する。その比が大きい程、速度限界は高くなる。

実際、限界に相当する床速度は、粒子内対流が輸送速度論に影響を与え始める点 における速度である。ずっと大きい速度では、対流が支配し、相当の性能向上が 観測される。

細密充填された１０μｍ粒子を含むマトリックスでは、細孔１０（粒子間の細隙 を含む）の平均直径は３μｍ程である。直径約１．０００人（０，１μｍ）の通 し細孔を有するかかる１０μｍ粒子は実用的流速でパーヒユーズ（ｐｅｒｆｕｓ ｅ）せず、２０００〜１０．０００人（０，２ａｍ−１，０μｍ　）の範囲内の 細孔を複数有する１０μｍ細孔は床を通る高い流体速度の範囲内（およそ１００ ０ｃｍ／時間又はそれ以上）でよくパーヒユーズする。　１，０００人平均直径 通し細孔を有する細密充填粒子を含むマトリックスでは、第−細孔集合対第二細 孔集合の平均直径の比は約３．３１０．１或はおよそ３３である。相当する４、 　０００人平均直径通し細孔粒子の場合、その比はおよそ８．３である。これら の数は大よそでありかつ多くの仮定に依存するが、パーヒユージョンクロマトグ ラフィー領域を操作上実用的な流速で利用することを可能にさせるのに有効な第 −細孔集合及び第二細孔集合の平均直径の比は、この範囲、すなわち８〜３３の 内のどこかにあると考えられる。

再び図ＩＤを参照して、粒子内及び相互作用性表面流域の付近の領域への物質輸 送は、対流によって支配されることに注目すべきである。拡散物質輸送は、溶質 を細孔１４及び相互作用性表面流域に及びこれらから移動させるのになお必要と されるが、拡散性輸送が生じなければならない範囲の距離はきわめて大きく減少 される。これより、床は、バンド展開及び物質移動速度論に関して、隣接する通 し細孔間の平均距離（例えば、現在入手可能な材料の場合、ＩＯμｍ程度）にほ ぼ等しい直径の極微細な粒子で構成されるように挙動する。床は、表面積対容積 の高い比及び速い速度論を有する。しかし、操作圧力損失は、第一細孔集合を構 成する流路ｌＯの一層大きい寸法によって決まるので、本質的にこれらの性質と の連結が解かれる。

マトリックスを通る速度が小さい場合、図ＩＤに概略で示す粒子のようなパーヒ ユーシブ粒子は、拡散境界の慣用のクロマトグラフィー材料と同様に挙動する。

対流流れは、低い速度では、本質的に、細孔１０の一層大きい第一集合に限定さ れる。細孔１４内の対流流れは無視し得る程に極めて小さく、粒子内から流路ｌ Ｏへの輸送は拡散によって行なわれる。細孔が一層大きくなると、細孔内の吸蔵 作用及び拡散障害が幾分軽減されるので、拡散速度を一層最適なものにさせる。

床における流体速度（及び圧力損失）を増すにつれヒユーシブ様式での動作が始 まる点が来る。この流速は、４．０００人オングストローム細孔を有する１０μ ｍクロマトグラフィー粒子の場合、細孔拡散率１０−’ａｍ”／秒を有する溶質 について、約３００ｃｍ／時間である。この限界を越＾ると、圧力損失及び速度 の増大は、単位容積のマトリックス当たりの処理量の増大を、従来クロマトグラ フィー系において達成されないものにさせるのが認められることになる。約６０ ０ｃＩ１１／時間において、従来達成された最も高い値にほぼ等しい生産性が観 測される。　１０００〜４０００ｃｍ／時間において、驚くべき生産性が達成さ れる。

その上、これらの生産性は、予想されるバンド展開の増大、すなわち、分解の低 下無しで達成される。

この挙動は、クロマトグラフィー系の一般的挙動を支配する長く確立された物理 的原理を見掛は１破るものであるが、高い速度におけるバンド展開への主因は粒 子内のスタグナント移動相物質移動、或は上述したｒＣ項」であることを想起す ること、すなわち、パーヒユーシブ系において、下記の通りである： しかし、Ｄ　Ｋｔｆは、マトリックスを通る低い流体速度では、細孔１４へのか つ表面領域と接触する溶質の有効拡散率の尺度であり、パーヒユーシブ様式では 、対流支配項となる。一般に、Ｄｗｔｔは、拡散要素（細孔拡散率）及び対流要 素（細孔速度×粒子直径）の合計と近似することができる。このようにして計算 すれば、Ｄ　ｗｔｔは、２つの輸送様式について種々の駆動力を無視した控え目 の推定イ１になる。パーヒユーシブ様式で作動させる任意の所定流体速度及び床 幾何学について、第二細孔集合内の流体速度対床における空塔流体速度の比は、 下記によって与えられることになる： 式中、αは定数である。これより、第二細孔集合の部材内の流体速度はＱＶｂｅ ４となり、０項によるプレート高さは事実上下記になる・ Ｕは床における流体の速度を表わすので、プレート高さは下記になる： Ｈ＝ｃ　’　ｄ　（５式） これより、０項は、パーヒユーシブ様式では、実質的に床速度に無関係になる。

上述した通りに、拡散は、依然対流流路と収着性表面領域との間の物質移動に関 与することになることから、０項は完全には無関係にならない、系は、ある高い Ｖ・、−において、もう一度サブ細孔への拡散による物質移動抵抗によって速度 論的に縛られるようになる。

溶質が細孔を通る物質移動の一つの尺度は、特性ペクレ数（Ｐｅ）によって与え られる。ペクレ数はＶ　Ｌ／Ｄに等しい無次元量であり、■は細孔を通る対流速 度であり、Ｌは細孔の長さであり、Ｄは細孔を通る溶質の拡散率である。従来技 術の系では、クロマトグラフィー材料の細孔内の対流対拡散輸送の比を記載する ベクレ数は、全ての状況下で常に１よりずっと小さかった。パーヒユーシブクロ マトグラフィーでは、第二細孔集合におけるペクレ数は常に１より大きい。

図２を参照すれば、断面で表わすマトリックス５の領域の概念上のモデルは、３ つのタイプの細孔、すなわち第一細孔集合１０の部材、第二細孔集合の部材を含 む通し細孔１４及びサブ細孔１６を有する。これらは、下記に挙げるペクレ数Ｐ ｅｌ、ＰｅＩ　Ｉ％Ｐｅｌ　Ｉ　Ｉによってそれぞれ特性表示される： 式中、Ｃは床のボイド容積であり、ｄ、は粒子の直径（粒子にわたる代表流路長 さ平均はくねりについての補正を含む）であり、Ｌ−はサブ細孔の深さであり。

Ｄ　ｔｒｒは通し細孔内の有効拡散率であり、Ｄ＋は通し細孔における制限拡散 率であり、Ｄ、はサブ細孔における制限拡散率である。

クロマトグラフィーの速度論は、高いＰｅ　１．低いＰｅ１１．高いＰｅ１ｌＩ と逆の関係になるのが普通である。すなわち、有効拡散率が増大すると、もしく は粒子寸法が減少するか或はＶ　１１．、が減少すると、クロマトグラフィー性 能は高められる。高いＰｅＩにおいて、高い対流速度は溶質を通し細孔を通り越 して押し流し、これより物質移動を低下させる。他方、第二細孔集合においては 、高いペクレ数が好ましい、ＰｅＩＩが高い場合、対流速度が粒子を通る物質輸 送における支配的機構として拡散に取って代わるにつれて、物質移動が増大する 。サブ細孔１６内では、低いペクレ数が望ましい。

Ｐｅ１ＩＩが低い場合、サブ細孔内の活性表面への拡散は粒子を通る流れより速 くなり、その結果として、動的キャパシティは高いままである。

移動相速度の増大は拡散系の性能を低下させるが、パーヒユージョンによりその 影響はずっと小さい０代わりに、床速度を増大させると対応する最高速度の増大 を生じ、これは支持体内部の物質移動速度論を制御する。すなわち、マトリック ス、適当な流量、圧力損失、及び流体速度の適切な幾何学的関係によって、系の 物質輸送特性が、極めて高い処理量及び高い分解能分離の両方に有利になる領域 が得られる。

図３は、１秒当り、マトリックス　１１当りの溶質のミリグラムで表わす生産性 の床速度及び圧力損失に対するグラフである。そのグラフは、拡散支配されたク ロマトグラフィー系、対流支配された系及びパーヒユーシブ系の間の挙動の差異 を示す０図示する通りに、従来の拡散制限系においては、速度及び圧力を増すに つれて、生産性は、最大に達するまで上昇し、それ以上のＶｌｏ、の増大は生産 性の損失に至り、典型的には、床速度約４００ｃｍ／時間になるかなり前に漏出 或は動荷重キャパシティの損失に至る。対流支配される系では、ずっと高い流体 速度及び圧力損失を用いることができる。十分な長さの床の場合、生産性は、恐 ら＜　４，０００　ａｍ／時間程に高い流体流速まで定常的に増大するが、生産 性の増加は、表面積及び結合容量が固有に小さいことにより、適度になる。パー ヒユージョン系の場合、床速度の増大は、最初、拡散支配される系と同様に生産 性を増大させる。しかし、限界法速度を越え、通し細孔におけるベクレ数が１よ り大きくなり、或は対流流速が細孔内の拡散流速を越える場合に、パーヒユーシ ブ領域に入る。それ以上の速度の増大は、細孔内の対流を増大させかつ物質輸送 を増大させる働きをする。ある高い流量において、溶質分子が通し細孔に及び通 し細孔から相互作用性表面領域に拡散するのにかかる時間が、溶質分子が対流に よって領域を移動して過ぎるのにかかる時間よりずっと長くなることから、パー ヒユーシブ系は拡散支配される系になる。しかし、拡散が輸送機構として作用し なければならない距離は、従来の拡散支配される系に比べてずっと小さくなる。

こうして、最適なバーヒユーシブ性能は、少なくともサブ細孔拡散時間が通し細 孔対流時間の１０倍程に長くなる床速度中続く。

バーヒユーシブ速度論がクロマトグラフィー床収着に与える関係を評価するため に、既存のモデルを変更して用いて収着プロセスをシミュレートした。カラム収 着挙動は、溶出液濃度対時間のプロットからなる溶質「漏出」カーブの形で示す のがしばしばである。所定のカラムについて、収着性表面への原料の流速を十分 に小さくして溶質と収着剤との接触時間を十分に長くさせて有限の物質移動に勝 るようにさせるならば、平衡収着が達成される。この場合、カラムに充填した溶 質の初期量が収着され、溶質はカラム溶出液に現われない、溶質がカラムに十分 に負荷されて収着剤相を飽和する場合、溶質はそれ以上収着されることができず 、溶出液中の溶質濃度は原料の濃度に匹敵する。実際、拡散支配される系では、 物質輸送速度が遅いことにより、収着は平衡限界からそれる。

図６は、従来の拡散境界されるクロマトグラフィー系とパーヒユーシブクロマト グラフィー系との間の基本的差異を示す、漏出（出口濃度／入口濃度）対処理容 積のグラフである。カーブは、原料蛋白質濃度５園ｇ／ｌ、収着剤３゜２５ＩＩ １１．カラムの長さ　５．４ｃｍ及び幅１．１ａｌ１１．カラムボイドフラクシ ョン０．３５．有効表面積４０ｍｇ／マトリックス１ｍｌ及び収着定数１ａｌ／ ａ＋ｇとして計算した０図６に示す通りに、従来のクロマトグラフィー手順では 、床速度の増大は、カーブを理想からそらせる作用を有する。１００ｃｒｎ／時 間において、漏出カーブは、溶質／収着剤平衡が確立されることから、殆ど完全 に垂直である。線状法速度が増大するにつれて、物質移動速度が支配し始め、早 期の溶質漏出が起きる０例えば、５００、ｌ、　０００及び２０００ｃｍ／時間 についてのカーブを比較のこと、極めて高い床速度、例えば、５．０００ｃｍ／ 時間では、溶出液溶質濃度の即時増加によって示される通りに、原料溶質のフラ クションがカラムを収着されずに通過することから、早期の溶質漏出がひどくな る。

対照的に、マトリックスがパーヒユーシブな同じシミュレーション条件を有する 同様のカラムの場合、予測的溶質漏出カーブはずっと急になりかつ平衡収着限界 と同様になる。この予測された挙動は実験によって証明された。これについては 下記に検討する。

分取りロマトグラフィーでは、前端カラムローディングは、溶質溶出液濃度が原 料濃度の１０％に達する点において停止されるのが典型的である。その点までに 処理加工される原料の量がカラムキャパシティを定める。このキャパシティ環は 系における総括生産性の重要な決定因であり、拡散粒子カラムにおいて床速度が 増大するにつれて減小するのが典型的である。すなわち、高い、例えば２５００ ｃｍ／時間を越える床速度では、初期溶質漏出は原料の１０％を越え、これより 、カラムキャパシティは事実上０である。対照的に、図７に示す通りに、バーヒ ユーシブ粒子カラムのキャパシティは、収着速度論が速く、よって、早期溶質漏 出がずっと高いレベルにおいてのみ起きるので、相当の流量範囲にわたって実質 的に一定のままである。

パーヒューシブマ　瞥ツ　スエンジニアーングパーヒュージョンクロマトグラフ ィーを実施するために適したマトリックス材料の製造において達しようとする根 本的なエンジニアリング目的の内の多くは、前述の記載から、当業者にとって明 らかであると思う、すなわち、パーヒユージョンクロマトグラフィーを実施する のに必要とされるものは、ニモード或は好ましくは多モードの細孔構造並びに単 位容積当たりできるだけ大きい表面積を有する、加圧下で破砕しないマトリック スである。材料にニモード流動性をもたらす第−及び第二細孔集合は、互いに対 し、高いｖ−０−において両線孔集合を通る対流流れを可能にさせるような平均 直径を有しなければならない、マトリックスにサブ細孔をもたらすことは、パー ヒユージョンクロマトグラフィーを実施するのに必要とされないが、単位容積の マトリックス材料当たりの表面積が固有に増大されることにより、好ましい。

マトリックスは種々のアスペクト比（高さ対断面積）の多孔質の一体固体の形態 を取ることができる。断面積は数ミリメートルから数デシメートルの範囲にする ことができ、マトリックス深さも同様の範囲にすることができるが、高い流体流 速の場合、早期漏出及び「スプリットビーク」現象として知られているものを防 ぐために、深さ少なくとも　５ＩＩＩｍが推奨される。マトリックスの構造は硬 買の不活性材料からなり、次いでこれを当業者に知られている化学を用いて誘導 体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）　ｊ、て相互作用性表面領域とするのがよい、別 法として、構造を、それ自体適当な溶質相互作用性表面を有する無機或は有機材 料で作ってもよい、適当なマトリックスの製造方法は、単にカラムに充填するだ けの粒子の製造を含む、これらを、必要に応じて当分野において知られている方 法で処理して接触する隣接粒子間に結合をもたらしてもよい、適したマトリック スは、又、クロマトグラフィー表面になる多孔質粒子を含有するファイバーマッ トを作ることによって作製してもよい、これらを、ファイバー間の間隙が第−細 孔集合及び第二細孔集合の粒子における通し細孔を構成するように、所望の通り にスタックし或はその他の方法で配置するのがよい、マトリックスは、又、レー ザードリリング技法、溶媒浸出、転送、等を用い、例えば複数の異方性、微細細 孔、一層大きい細孔な、例えばシート様材料或は粒子において作って作成し、こ れらを−緒にスタックし或は凝集させてクロマトグラフィー床としてもよい。

発明のマトリックスを製造する現時点で好ましい方法は、慣用の懸濁、乳化或は 混成重合技法を用いて作るずっと小さい「ビルディングブロック」粒子（本明細 書中、「ボロンＪと言う）から好ましくは直径　５〜１００μｍの範囲内を有す る粒子を作成することを伴う０粒子を作成した後に、高表面積粒子を化学で処理 して、例えばアフィニティクロマトグラフィーで免疫グロブリンを結合させるの に適した共有結合された反応性基、スルホネート或はカルボキシル基のようなア ニオン基、アミン或はイミン、第四アンモニウム塩、等のようなカチオン基、種 々の炭化水素、及び慣用のクロマトグラフィー媒体において有用であることが知 られているその他の成分を有する親水性表面を付与して、相互作用性表面領域を 作るのが好ましい。

直径＋Ｏｒ＋ｍ〜１．０μｍの範囲のボロンから所定の寸法及び所定の多孔度の 粒子を製造する方法は知られている。

粒子は、例文ば下記のようなポリマーから作られるニジビニルベンゼンで架橋し たスチレン、或は下記のような材料を含１＋種々の関連したコポリマー：ｐ−ブ ロモスチレン、ｐ−スチリルジフェニルホスフィン、ｐ−アミノスチレン、塩化 ビニル、種々のアクリレート及びメタクリレート、を好ましくは高度に架橋させ かつ銹導体にし得るようにデザインし、例えばグリシジル成分或はエチレンジメ タクリレートを共重合させたもの。

合成触媒材料を製造するのに開発された技法の内の多くが、バーヒユージョンク ロマトグラフィーマトリックス粒子を作るのに適応させることができるのが普通 であ特表千４＝５００７２６　（１３） る。選定した平均直径及び選定した多孔度を有する粒子を製造する手順について は、例えば、下記を参照のこと：ロームアンドハースカンパニー、にｕｎｉｎ、 　ＰｏｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ　Ｉｏｎ 　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｒｅ５ｉｎｓ　；Ｊ、Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｊ、　バート Ｃ，１６号、　１４５７〜１４６９ページ　（１９６７）、にｕｎ等、ｔｈｅ　 Ｐｏｒｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ　Ｔｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｒｅ５ｉｎｓ　：　Ｊ、ＰｏＩｙｒａｅｒ　Ｓｃｊ、パート ＡＩ、６　巻％　２６８９〜２７０１ページ　（＋９６８）、　Ｍａｃｒｏｒｅ ｔｉｃｕｌａｒ　Ｒｅ５ｉｎｓ　ＩＩＩ　：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃ ｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｙｒｅｎｅ−ＤｉｖｉｎｙｌｂａｎｚｅｎｅＣｏ ｐｏｌｙｍｅｒｓ　；及び１９８０年　１月２９日に　Ｕｇｅｌｓｔａｄに発行 された米国特許４．１８６．１２０号、当業者に知られているこれらや他の技術 は、乳化及び懸濁重合の条件或はＵｇｅｌ−ｓｔａｄ特許に開示されている混成 技法を開示しており、これらは重合によって実質的に球形のボロンの製造を可能 にする。これらの直径数〜数百オングストローム程度の所定の寸法の均一な粒子 を相互接着させて、パーヒユージョンクロマトグラフィーを実施するのによく適 した多数の異方性通し細孔、ブラインド細孔及び種々の一層小さい通し細孔を含 む所望の平均的大きさの一層大きい複合粒子を製造する。これらの従来技術を用 いて従来作られたクロマトグラフィー粒子と本発明の実施において有用な粒子と の間の差異は、パーヒユージョンクロマトグラフィーについて必要とされる通し 細孔の寸法にある。

パーヒユージョンクロマトグラフィーを実施するのに適した粒子の出所の一つは 、英国、５ｈｒａｐｓｈｒｒｅのＰ［ｌＬＹ−ＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＰＬ）である、　ＰＬは、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンのボロン を、重合の間にランダムに凝集させて粒子を形成させてなるクロマトグラフィー 媒体の系統を販売している。　ＰＬは、平均直径８〜１０μｍ及び粒子−平均細 孔直径１０００〜４０００人を有する粒子からなる　２種の「マクロ多孔質」ク ロマトグラフィー媒体を製造し、次いで市販した。実際、粒子の平均細孔直径は 、通し細孔とサブ細孔との平均を表わし、これよりこれらの材料のバーヒユージ ョン特性に対して殆ど意味を持たない０本書に名前を挙げる発明者は、これらの 粒子が、ｒ　１０００人」粒子の場合２０００人を越え、かつｒ　４０００人」 粒子の場合６０００人を越える平均通し細孔直径を有することを見出した。これ らのタイプの粒子幾何学が、本明細書中に開示する適度の高い流量条件でパーヒ ユーズさせることができる。

逆相クロマトグラフィー用に有用と言われるＰＬ粒子の一つのタイプは未処理の ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）である、それの相互作用性表面は 、蛋白質における疎水性バッチと相互作用する疎水性ポリマー表面である。第二 の粒子タイプは相互作用性表面要素をポリエチレンイミンで誘導体化しかつアニ オン交換に有用なカチオン表面として作用する０両方のタイプの粒子は、Ｆ、　 Ｅ、　Ｒｅｇｎｉｅｒが開始した、蛋白質のような大きい溶質の粒子的拡散を、 細孔寸法を大きくすることによって増大させよつとする前進的努力において製造 された０本書に名前を挙げる発明者は、これらの粒子をパーヒユーシブクロマト グラフィー領域の知見において用いた。

これらの材料は、ポリエチレンイミン誘導体化材料について商品名ＰＬ−３ＡＸ 　４０００で、未読導体化材料について商品名ＰＬＲＰ−３４０００で販売され ている。これらの材料はパーヒユージョンクロマトグラフィー用に最適とは言え ないが、これらの材料の充填床における間隙のある空間及び粒子における通し細 孔によって定められる細孔は、パーヒユージョンクロマトグラフィーを実用的流 れ条件下で達成するのに遺した比率を有する。

図４Ａ　、４Ｂ及び４Ｃを参照すれば、ＰＬのｌＯμ、４．０００人多孔質粒子 の走査電子顕微鏡写真を示す０図４０に示す通りに、材料は直径およそ１５００ 〜２０００人の相互接着されたボロンを多数含み、これらは、明らかにランダム に凝集されて不規則高表面積及び多数の通し細孔及びサブ細孔を生じている。

図４０に示す通りに、適したｖ塾、−において、クロマトグラフィー流体は粒子 内の曲がりくねった通路の中を対流によって移動する。バーヒユーシブ細孔は、 異方性であり、ランダムに枝別れし、任意の所定の点で直径が変り、物質輸送が 拡散によって支配される多数のブラインド細孔になる。ブラインド細孔及びルー ピング細孔（サブ細孔）は、ボロンの直径より相当に小さい（ｌ／３程度）平均 直径、及びボロンの直径のフラクション程に小さいからボロンの直径の５〜ｌＯ 倍の範囲になることができる深さを有するのが普通である。

図　５Ａ及び５Ｂは幾何学のスケール倍率を概略で例示する０図５Ａは、複数の 粒子２０の各々が隣と接触しかつ間隙２２を定めるのを示すクロマトグラフィー カラムの断面であり、間隙２２は、発明を具体化するこのマトリックスの形態で 、第一細孔集合を構成する、粒子は、例示する通りに、直径およそ１０７４２０ メートルである１間隙の平均直径は広い範囲になるが、粒子２０の平均直径の１ ／３程度になるのが普通である１図５＾における円Ｂを、図５Ｂにおいて１０倍 にして相互関係を示す１図５Ｂでは、床の微細構造をおよそ　１マイクロメート ルのスケールで示す６粒子はブランク円２４として示すボロンのクラスターを含 む、ボロンクラスターの間の間隙は通し細孔１４を定める。ここで、クラスター ２４を構成する個々のボロンを点によって示す１次の詳細のレベル、すなわち０ １μｍ或は１０００オングストローム（図示せず）で、ポロンクラスター２４は おおよそ球形のボロンの凝集を構成するのが見られる。このような構造では、凝 集体２４を構成するボロンの間の間隙は、図　ＩＣに概略で示すような慣用のク ロマトグラフィー媒体の拡散支配された粒子に類似している。これらにおいての み、物質輸送は拡散依存性である。

一層小さい粒子の凝集体から作る上述したタイプのクロマトグラフィーマトリッ クスが、いくつかの幾何学的長さのスケールにわたって自己類似性を示しかつこ れより　Ｍａｎｄ　１ｅｂｒｏｔ命名法において「フラクタルス（ｆｒａｃ−ｔ ａｌｓ）　Ｊであることは認められよう。

所定の蛋白質を分取分離するための理想的なパーヒユーシブクロマトグラフィー マトリックスは、サブ細孔を拡散輸送を可能にする大きさにさせてなる。すなわ ち、ボロンの間の間隙は、分子量の一層大きい蛋白質のために、一層大きくすべ きである。これは、一層大きいボロンを凝集させることを必要とする。幸運にも 、ミセル１、乳化、懸濁及び「膨潤乳化」重合を利用する既知の重合技術、及び 不混和性混合物のホモゲナイゼーションを含む種々の技術が知られている。これ らの技術は、例えば、上述した参考文献及び　Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｌａｔｅｘ　Ｐ ａｒｉｃｌｅｓ。

（Ｂａｎｇｓ、Ｌ、　Ｂ、　、５ｅｒａｄｙｎ、インコーボレーティド、１９８ ７）に開示されている通りに、種々の寸法の粒子の製造を可能にする。これらの 方法を用いて２００人から約２０μｍまでの範囲の均一な平均直径の粒子を作る ことができる。上述したＰＬ　１．０００及び４．０００材料の場合、クラスタ ー２４はそれぞれ　１μ閤及び２μｍ程度である。

細孔構造に関して、他モードであるＰＬ　４，０００材料と対照に、一層理想的 なパーヒユーシブ粒子は種々の直径の通し細孔及びサブ細孔の集合を多数含む、 このような粒子において、ニモードの細孔寸法分布は、２つの別個の細孔寸法を 有する粒子を等比率で混合することにより、或はこの特徴を重合段階で作り出す ことによって達成することができる０通し細孔部分集合の間の平均直径比を１０ より小さくし、最も小さい通し細孔集合とサブ細孔との間の平均直径比を２０よ り小さくし、第一細孔集合、すなわちマトリックスを構成する粒子の間の間隙と 最も大きい通し細孔部分集合との間の平均直径比を７０より小さく、好ましくは ５０より小さくするのが理想的である。多モードの材料は、５００人ポロンを凝 集させておよそ　１μｍのクラスターを形成し、立ち変わって、これらを凝集さ せて１０μｍの凝集対を形成し、立ち変わって、これらを凝結させて１００μｍ の粒子を形成することによって製造することができる。このようなデザインで、 １μｍクラスターは平均直径が数百オングストローム近辺の間隙を有することに なる。これらはサブ細孔を定めかつ極めて大きい表面積をもたらす、これらの細 孔内の拡散輸送が距離０．５μＩ或はｓ、　ｏｏｏ人を越えなければならないこ とになるのはめったに無い、１０μ−の凝集体を構成するｌｕｍクラスターの間 の間隙は、対流流れが拡散細孔を与えるのを可能にさせる。これらは直径０．３ μｍ程度である。立ち変わって、これらの通し細孔には１００μｍ粒子を構成す る１０μ−粒子の間の間隙によって定められろ一層大きい細孔が与えられる。こ れらは平均直径３５μｌ程度を有する。

前記から、第−及び第二細孔集合並びにそれらの相対的大きさに関する検討が理 想化したものであり、実施において達成し得るが、必ずしも最適でないことを認 識すべきである。しかし、この理想化は、パーヒユージョンクロマトグラフィー 系の本性及び性質を理解するのに有用である。実施において、両方の細孔集合、 特に第二細孔集合は、平均直径が広い範囲になることができる。

図５０を参照すれば、異なる形態のパーヒユーシブクロマトグラフィー媒体を、 不透質材料３０が人工的に作った通し細孔１４からなるとして例示する０図示す る通りに、細孔は、対流流れのための中央流路並びに細孔の内壁３４から延在し かつ大きい表面積を定める薄い半径方向のフィン３２を含む、低い流体速度では 、溶質相互作用性表面に接近するのに、半径方向に向けたフィン３２と対流細孔 １４との間の拡散が必要とされよう、圧力が高くなれば、通し細孔１４内かつ半 径方向フィン３２の間の空間内を軸方向に対流流れを生じ、壁及びフィンに配置 した溶質相互作用性表面に極めて接近した溶質の対流輸送が可能になる。

別の形態のパーヒユーシブマトリックス（図示せず）は、膜或は中空繊維におけ る比較的均一な細孔のような流れ流路の内壁に、溶質相互作用性表面積を含む微 細な粒子を付着させてなる。サブ細孔は粒子間の間隙、流れ流路による第二細孔 集合、及び例えば、膜の表面に対して接線方向に或は繊維ハンドルにおける中空 繊維の間に配置された他の流路による第一細孔によって定められる。このような 構造を製造する技術はよく知られている、この一般的なタイプの既存の構造とバ ーヒユーシブクロマトグラフィー用にデザインするものとの間の差異は、両タイ プの流路において対流流れを促進させるために、第−及び第二細孔集合の大きさ を本明細書中に記載する通りにデザインすること仁ある。

以上から、発明のマトリックスを多くの特定の形態で具体化し得ることは、明ら かである０発明のマトリックスは、無機材料並びにポリマーから製造することが できる。

バーヒユーシブマド１−　ス　・の 上述した通りに、バーヒユーシブ領域に入るには、通し細孔ベクレ数（ＰｅＩＩ ）はｌを越えなければならない、しかし、高いＰｅ１Ｉ、少なくとも５．最も好 ましくはｌＯより大きいのが好ましい、バーヒユーシブ挙動は、又、内表面積に 依存する。従って、サブ細孔或は相互作用性表面をもたらすその他の形状に容易 に接近することは重要である。このようなマトリックスのデザインのパラメータ ーの具体例として、所定のボロン直径を有する上述したタイプの粒子の凝集体形 成を調べることが重要になり得る。

所定の粒子寸法（Ｄ、）について、粒子ボイドフラクションが一定ならば、流れ 流路（ｄ、）が大きい程、粒子当りの流れ流路は少なくなり得る。その上、流れ 流路が大きくなる程、それを形成するのにクラスターを大きくしなければならず 、これより、表面積に接近するのに要する拡散浸透が深くならなければならない 、孔を少なくするが大きくして用いることの利点は、バーヒユージョンが比較的 低い床速度及び対応する圧力損失において、効果を現すことである。パーヒユー ジョンは床速度に依存し、速度の上限は収着剤粒子の圧力許容限界によって指図 される。この束縛は、粒子直径が大きい場合、有為性が低くなる。これについて は下記に説明する。

図８は、呼称直径１０μｍ粒子床についての、床速度（ｃｍ／時間）対細孔直径 （入）のグラフである。グラフは、ｌＯμｍ粒子、粒子内流れ流路の直径が粒子 寸法の１／３であり、かつ特性細孔拡散時間が対流時間より短いことを仮定して 、通し細孔ペクレ数ｌＯを達成するための最小及び最大通し細孔寸法を示す、す なわち、例えば、ｌＯμｍ粒子は、Ｉ、　０００ｃｍ／時間において、ペクレ数 ｌＯ又はそれ以上を達成するために、平均細孔直径が約ｓ、　ｏｏｏ人より大き いことを必要とする。「最大細孔寸法」と表示するカーブは、種々の床速度であ って、それらにおいて、細孔を通る対流流れが非常に速いので、サブ細孔に入る 及びサブ細孔から出る溶質拡散が余り遅くて相互作用性表面への有効な物質移動 を生じさせることができないような速度について、最大平均通し細孔直径を表わ す、バーヒユージョンを確立する（Ｐ　ｅ　Ｉ　Ｉ　＞１０）のに要する最小法 速度は、通し細孔平均直径が増大するにつれて減小することに注意すること、ま た、パーヒユージョンは、慣用の多孔質媒体（＜　ＳＯＯ人細孔寸法）において 有意の程度に起きないことにも注意すること。

図９は、直ぐ上で検討した同じ仮定を行って、ベクレ数（Ｐｅｌｆ）を１０より 大きくするのに要する、１，０００〜５，０００　ｃｍ／時間の範囲の、種々の 床速度について、種々の直径の粒子（μ霞で表わす）について必要とされる最小 細孔直径（数千オングストロームで表わす）を示す、パーヒユージョンが、直径 の一層大きい粒子に関して用い得ることは、明らかである０例えば、５００人拡 散細孔になる、１μｍの流路を有する５０μｍ粒子は、８００ｃｍ／時間を越え る床速度において、バーヒユーシブ様式で作働する。

バーヒユーシブクロマトグラフィーマトリックスの流れ特性の分析は、サブ細孔 に至る大きい通し細孔を有する大きい粒子を用いることによって、極めて有意の 利点が得られことを示唆する。一定の床速度において、粒子寸法０．１を、次い で通し細孔寸法ｄ、１を有する床をスケールアップすることによって、分解能を 保つ、すなわちプレート高さを一定に保とうとする場合、一層大きい粒子（０１ ２）及びそれらの細孔（ｄｐｚＪは、下記式によって与えられるニ プレート高さ一定かつ全圧力損失一定においてスケールアップするには、下記の 関係： 及び一般に下記の関係がある。

前記の関係の研究から明らかな通りに、線状粒子寸法／細孔寸法スケールアップ は、同じ分離を一層速くかつ一層低い圧力損失で行なうのを可能にさせる。この 挙動は、現行のクロマトグラフィー理論及び実施に基すけば、反直観的である。

このスケールアップ概念を説明するために、１０式から、細孔を５倍増大させる ことによって、５０μｍバーヒユーシブ粒子のプレート高さは、１０μｍパーヒ ユー２１粒子の２５倍大きい速度及び同じ圧力損失におけるプレート高さに等し くなることに注目すること、一層大きい粒子を用い、圧力損失を一層小さくし、 床速度を同じにして作働させるためには、細孔寸法を更に一層大きくして、スケ ールアップ時に一定のプレート高さを取るようにしなければならない（９式参照 ）、２５倍低い圧力損失において同等の分解能分離を達成するには、細孔寸法を 約１１倍増大させることを必要とする。　１１式から、例えば、５０μｍ粒子を 用いることにより、５倍の床速度の増加、５倍の圧力損失低下及び５倍の細孔直 径増加が、ｌＯμｍ粒子に比べて、同じ分解能を一層速くかつ一層低い圧力損失 で達成することは、明らかである。

下記の表は、６つのケース研究についてこれらの関係を示す、各々のケースにお いて、！欄は５倍の粒子寸法の増大を要する。ケースＡでは、一層大きい粒子の 細孔寸法は変えないままにしかつ同じ空塔法速度を用いる（４欄）、このケース では、一層大きい粒子の床は、一層小さい粒子の床に比べて、圧力低下ｌ／２５ で作動しく３欄）かつ！／２５の通し細孔速度を有する（５欄ン、シかし、一層 大きい粒子の通し細孔におけるベクレ数は一層小さい粒子のベクレ数の１７５に すぎず、プレート高さは１２５倍増大し、分解能を大きく減小させる。

ケースＢでは、細孔寸法は一定のままであり（２欄）かつ空塔法速度を５倍増大 させる（４欄）、このケースでは、圧力低下は細孔速度のように１１５にすぎな い、ベクレ数は一定のままであるが、プレート高さは２５倍増大する。

ケースＣでは、細孔寸法及び操作圧力は一定のままであり、床速度は一層小さい 粒子床の２５ｆｆｊになる。細孔を通る速度も又一定のままであり、ベクレ数は ５倍増大し、プレート高さも同様の倍率増大する。

ケースＤでは、粒子の通し細孔を粒子直径と同じ倍率スケールアップし、圧力低 下を保ち、空塔法速度を２５倍増大させるに至る。従って、通し細孔流体速度は ５倍増大し、ペクレ数は２５倍増大し、プレート高さは一定のままになる。

ケースＥでは、通し細孔の直径を１２５（粒子直径に対して　５）倍増大させる 。これより、圧力低下は、同じ床速度で、一層小さい粒子のケースに比べて２５ 倍高くなる０通し細孔における流体速度が５倍大きくなると、ベクレ数は２５倍 増大し、プレート高さは同じままである。

最後に、ケースＦでは、通し細孔を粒子寸法と同じようにしてスケールし、床速 度を５倍にして操作する。このケースにおいて経験する操作圧力は１１５にすぎ ない。

それでも、通し細孔における流体速度はベースケースの５倍であり、ベクレ数は ２５倍増大し、プレート高さ、すなわち分解能は一定のままである。

老 ＋２３４５６７ 星　ｍｌ　ＡＰ２　１）１）国」　Ｕ Ｄ、Ｉ　ｄ、Ｉ△ＰＩ　ＶａＩ　ＶｔＩ　ＰｅＩＩＩ旧＾　５　１　１／２５　 １　１／２５　１１５　１２５Ｂ　５　１　１１５　５　１１５　１　２５Ｃ５ １１２５１５５ Ｅ　５　１２５　２５　１　５　２５　１Ｆ　５　５　１１５　５　５−　２５ 　１上記の解析において、ベクレ数の比を示す６欄は、生産性が拡散粒子より勝 って達成される利点を表わす、プレート高さ比は、分解能が、一層小さいパーヒ ユーシブ粒子に勝って達成される利点（不利）を表わす、すなわち、ケースＤ、 Ｅ及びＦでは、通し細孔の極めて有為な増大及び／または圧力損失の低下が、一 層小さい粒子の分解能を保ちながら達成される。

よって、発明を具体化するクロマトグラフィー系においてパーヒユーシブ様式の 溶質輸送を最も良く利用するために、多くのトレードオフをなし得ることは、明 らかである。また、平均直径３００〜７００オングストロ一ム程度のサブ細孔に なる一層大きい通し細孔を有する、大きい、例えば直径約４０μ■より大きい粒 子が、極めて有望なマトリックス材料のクラスを表わすことは、明らかである。

紐１ パーヒユージョンクロマトグラフィーの利点は、上述した市販されている粒状媒 体（ＰＬ　１，０００及びＰＬ　４．０００）を未処理で及びポリエチレンイミ ンで誘導体化しての両方を使用して、かつ又、ＰＬ　４，０００材料と同様であ るが、一層大きい粒子直径を有する、Ｐｏ１ｙ＋ｓｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ。

Ｌｔｄ、製の原形材料によっても、十分に立証した。蛋白質精製及び分離の仕事 において一般的に遭遇するタイプの蛋白質の合成混合物を用いて試験を行なった 。

バンド展開は、従来のクロマトグラフィーと具なり、パーヒユーシブクロマトグ ラフィー領域における高い流速によって、悪化されないという証拠を図ＩＧに示 す、　ＰＬ４、０００材料を充填した５０ｍｍＸ　４．６ｍｍカラムの蛋白質ア ウトプットを光学的吸収によって検出して調製したこれらのクロマトグラムは、 例えば、蛋白質ＯＶＡ　（オボアルブミン）及び５ＴＩ（大豆トリプシンインヒ ビター）の分解能は、図１０の左から右に、ｆ　ｍ１７分（３５０ｃｍ／時間） 、２ｍｌ／分（７５０ｃｍ／時間）、及び４１７分（１４００ｃｍ／時間）にお けるのと同様であることを極めて明瞭に示す、これらのクロマトグラムは、それ ぞれ、分解能６．０．６．５及び６．２を達成した。

図１■は、パーヒユーシブクロマトグラフィーが、高い床速度及び浅いカラム幾 何学において、蛋白質の高い分解能及び極めて速い分離を生じ得ることを例示す るデータを示す１図１１は、長さ　５＋ｍ　Ｘ幅６＋ａｍのカラムにより、ＰＬ 　４，０００材料を流速３１７分で使用して得られた。４つの試験の蛋白質の分 解は　１分より短い時間であることを注記する。

図１２は、試験蛋白質混合物の分離について、非多孔質媒体対パーヒユーシブ媒 体の性能を比較するものである。　ＰＬ　４，０００材料（右）は、ＰＬ材料の 寸法がずっと大きい（１０μｍ対３μ譜）にもかかわらず、非多孔質粒子（左） に匹敵するように機能するのが見られる。これは、分解が、典型的には、粒子直 径の二乗と逆関係にある拡散媒体と対照をなす。

図１３Ａ〜＋３Ｄは、ＰＬ　４．０００未誘導体化粒子（逆相）を用いた、床速 度、それぞれ９００．１２００．１５００及び１２００ｃｍ／時間において、そ れぞれ９０．８０．６０及び４０秒より短い時間での６つの蛋白質の高分解分離 を示す、これらのクロマトグラムは、６ＩＩＩＩｍ×５ｆｆｉ−カラムで、トリ フルオロ酢酸及びアセトニトリルの勾配に関して得られた。クロマトグラム１３ ０は、一層急な勾配を用いることによって達成された。

図１４は、対流輸送がパーヒユーシブクロマトグラフィー手順に寄与することの それ以上の証拠を供する０図１４は、ＰＬ　４．０００材料を充填した２５０ｍ ｍＸ　４．５ｍｍカラムを使用し、２５０ｍＭ　ＮａＣｌで溶離して調整したリ ゾチーム（Ａ）及び酸性ホスファターゼ（Ｂ）についてのプレート高さカーブ（ Ｈ対流速）を開示する０例示する通りに、プレート高さカーブは、低い移動相速 度では、従来のマトリックス材料と区別することができない、すなわち、プレー ト高さは、約１ｍｌ／分より低いところでは、流速が増すとともに増大するのが 見られる。しかし、酸性ホスファターゼの場合、　１〜２ｍ１７分の範囲、及び リゾチームの場合、　２〜３１７分の範囲の高い移動相違度では、プレート高さ カーブは実際平坦である。極めて高い速度、すなわち、酸性ホスファターゼの場 合約７００〜８００ｍ１／分及びリゾチームの場合約１１００ｍｌ／分を越える ところでは、プレート高さは再び上昇するが、その割合は、慣用の媒体において これらの条件下で優勢である厳しい拡散制限について予想されるよりもずっと小 さい。

図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれ拡散支配されるポリマービーズ（モノビーズ、 Ｐｈａｍａｒｃｉａ　）及びＰＬ　４，０００材料の場合の種々の線状流速につ いてのプレート高さを比較する。モノビーズは、圧力制限のために、約１２００ ｃｍ／時間より大きい速度では、使用することができなかった。

ＰＬ　４，０００材料の場合のバンド展開は、２５００ｃｍ／時間程に高い線状 速度では、最小におけるその値の２倍より小さい、対照して、図１５Ａのこのス タグナント物質移動制限領域を外挿することによって、この値は、慣用のモノビ ーズ媒体についての最小の４倍近くになる。

パーヒユーシブクロマトグラフィーの高い輸送速度論特性の一分技は、短いサイ クル時間である。しかし、パーヒユーシブ向上は、又、同じサイクル時間で分解 能を増大させるのに用いることもできる。これは、図　１６＾。

１６８及び１６ｃにおいて、ＰＬ　４．０００材料を使用した複雑な蛋白質混合 物の分離を示すクロマトグラムにより例示される　、その手順は、３５０ｃｍ／ 時間において（１６Ａ）、拡散制限される（通し細孔におけるペクレ数は　ｌよ り小さい）６分離は、４０ｍＭ　ＣａＣ１ｇ／分の急勾配に関してかなりである ６図１６Ｂに示す通りに、サイクル時間は、床流速を４３００ｃ＋ｎ／時間に増 大させることによって相当に短縮させることができる１図１６Ｇに例示する通り に、法線状速度４３００ｃｍ／時間を用い、勾配を１２ａ＋Ｍ　ＣａＣ１ｘ／分 と一層浅くすることによって、一層短い時間フレームで、ずっと高い分解能を得 ることができる。

図１７Ａ及び１７Ｂは、ＩｇＧクラス　ｌ及び２の分離について、床速度を１０ 倍より大きく増大させることによって、ピーク分解能が影響されないことを示す ０図１７Ａのクロマトグラムは、ＰＬ　４，０００材料の３０Ｘ　２．　Ｉｍｍ ＋カラムに関して行なった。マウス腹水からの免疫グロブリンを、それぞれ流体 速度３００ｃｍ／時間及び４３００ｃｍ／時間を表わす、流速それぞれ０．２ｍ ｌ／分及び２．５ｍｌ／分において、勾配４０ｍＭ　ＣａＣ１ｇ／分で分離した 。

図　１８Ａ〜１８Ｆは、旦０匹旦溶解質からのベーターガラクトシダーゼをＰＬ 　４．０００　（＾、　Ｂ、　Ｃ）及びＰＬ　１，０００（Ｄ、Ｅ。

Ｆ）材料で精製して得られたクロマトグラムである０図示する通りに、全サイク ルをパーヒユーシブ様式で（１２００ｃｍ／時間、１８Ｃ，１８Ｆ）、１５分よ り短い時間で行なって、典型的な６０分サイクル３００ｃｍ／時間（１８＾、　 １Ｂ！１１で得られるのと本質的に同じ分解性能を生じることができる。ベータ ーガルビークに陰影を付ける。

図１９＾、Ｂ、Ｃ及び０は、ベータラクトグロブリン及びオボアルブミンを含有 する試験蛋白質混合物を、ＰＬ　１，０００及びＰＬ　４，０００材料の強イオ ン交換変種で分離することによって生成された４つのクロマトグラムを示す、こ の試験混合物を、上述した粒子を充填しかつ０．５及び２．５１７分で作動させ るカラムで分離した。８ミクロン粒子の場合、分離はＯ，５ａｉ１／分（１９Ａ 、　１９Ｂ）及び２．５ｍｌ／分（１９Ｃ，１９０）において同じである０図１ ９Ｅ及び１９Ｆに示す通りに、ＰＬ　４，０００材料は、５．０ｍｌ／分におい て、ＰＬ　１，０００に比べて、−眉高い程度にパーヒユーズすることから、一 層良好に機能した。それでも、共に混合物を適当に分離した。

実験によって十分に裏付けられた従来の液体クロマトグラフィーの教示するとこ ろは、「粒子寸法を大きくすれば、所定の流速において、分解能が低下すること になり、流速を増大させるにつれて、分解能の損失は一層速い速度で増大される 」ということである、しかしながら、上述した通りに、パーヒユーシブマトリッ クスを用いた場合、パーヒユージョンの度合いは第−及び第二細孔集合の相対的 寸法に依存し、これらは、言い換えると、特定の媒体について、相対的粒子直径 及び通し細孔寸法にな変る。従って、大きい粒子を用いた場合のパーヒユーシブ 領域における分離性能は、流速にそれ程依存しないことが予期される。

この仮定の正当なことは、図１９と図２０とを比較することによって立証される ０図２ＯＡ及び２０Ｂは、それぞれＰＬｌ、　０００及びＰＬ　４，０００粒子 （共に平均粒子寸法２０μｍを有する）を使用し、蛋白質サンプルを　０．５ｍ ｌ／分で用いて得られた０図２０Ｃ及び２０口は、ＰＬ　１，０００及びＰＬ４ 、０００材料（共に粒子寸法２０μＩ）を用い、２０ａｉ１／分で実施した０図 ２０Ｅ及び２０Ｆは、それぞれの材料を用いて５、　ｈｌ／分で実施した。デー タは、　ＰＬ　４，０００材料が、０．５　ｓｏ１／分において、ＰＬ　１，０ ００材料に比べてわずかに良好に作動し、流速があまりに低くてパーヒユージョ ンを銹起し得ないところで作動した場合は、予想される通りに、共に８μ鳳粒子 寸法の対抗品に比べて作動が劣っていたことを示す、これらの２つの材料の間の 性能の差は、２．０ｍｌ／分では広がり、ＰＬ　１，０００材料が分解能を相当 に失い、他方ＰＬ　４，０００材料は依然ピークを分離することができる。　５ ．０ｍｌ／分（１５００ｃ＋ｓ／時間）では、２０μｍ４０００オングストロー ム材料は依然これらのピークを分解することができ、他方ＰＬ　１，０００材料 は殆ど完全に性能を失う、２つの材料の性能の差は、８μ亀では２０μ−の場合 に比べて小さい、というのは、一層小さい粒子の場合、共にパーヒユーズする（ 異なる程度に）が、一層大きい粒子の場合、ＰＬ　１．０００材料はＰＬ　４， ０００材料に比べて、殆どパーヒユーズしないと予想されるからである。

最後に、図２１及び２２は、パーヒユーシブ粒子と、従来の多孔質、拡散支配さ れる粒子との漏出挙動の差について前に検討した計算の実験による証明を与える ０図２１は、５Ｘ５Ｄｍｍカラムで、モノビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い 、ＢＳＡを分離して作成したものである０図２１は、漏出カーブに、１５０ｃｍ ／時間において、平衡条件化で作動させる拡散カラムについて予想される通りに 、印影を付けることを示す、流体速度を増して３００ｃｍ／時間にすると、平衡 カーブからのずれが始まり、９００ｃｎ＋／時間において、早期漏出がはっきり 明らかになる。対照して、図２２に示す通りに、ＰＬ　４，０００を同じカラム で用いて同じ蛋白質を分離すると、漏出カーブは３００．１５００及び２７００ ｃ園７時間において本質的に同等である。

発明は、発明の精神及び本質的特徴から逸脱しないで他の特定の態様で具体化す ることができる。よって、他の実施態様は下記の請求の範囲内である。

ＦＩＧ、　７ 細孔直径ｔ＋ｏ−’＋ ＦＩＧ、　８ 粒子直径（μｍ） ＦＩＧ、　９ ＹＱ 秒 ＦＩＧ、ｌｌ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、　ｌ５Ａ ＦＩＧ、　１５Ｂ 時間（分）　時間（分） ＦＩＧ、　１６Ａ　ＦＩＧ、　１６８ 時間（分） ＦＩＧ、　１６Ｃ ＦＩＧ、　１７Ａ　ＦＩＧ、　１７Ｂ ＦＩＧ、　１９Ａ　ＦＩＧ、　１９８ ＦＩＧ、　１９ＣＦＩＧ、　１９Ｄ ％８ Ｆｌ、Ｇ、１９Ｅ ｏ、ｏｏ。

ＦＩＧ、　１９Ｆ ＦＩＧ、　２０Ａ　ＦＩＧ、　２０８ ＦＩＧ、　２０ＣＦＩＧ、　２０Ｄ ＦＩＧ、　２０Ｅ ＦＩＧ、　２２ 国際調査報告 １＋＋ｅ＋＋ａ貴−＊ｉ＋Ａｓ＋＋４＋署ｉト１−４１−・−１１１ｆｆＡＩｓ ＋ｌ鴫＝）ｌＣココ−）Ｑ３０

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．（Ａ）通し細孔及び溶質相互作用性表面領域を内部に定める複数の粒子を充 填してクロマトグラフィーマトリックスを形成し、 （Ｂ）溶質の流体混合物をマトリックスの中に十分な速度で通して、通し細孔を 通る溶質拡散速度より大きい通し細孔を通る対流流体流速を誘起させる工程を含 むクロマトグラフィー法。
2. ２．（Ａ）相互連絡した第一及び第二細孔集合であって、第一細孔集合の部材は 第二細孔集合の部材に比べて大きい平均直径を有するもの、及び 溶質と可逆的に相互作用する第二細孔集合の部材と流体連絡する表面領域 を定めるクロマトグラフィーマトリックスを供し、（Ｂ）溶質の流体混合物をマ トリックスの中に十分な速度で通して、両細孔集合を通る対流流体流れを誘起さ せかつ第二細孔集合内の溶質拡散速度より大きい第二細孔集合内の対流流速を誘 起させる 工程を含むクロマトグラフィー法。
3. ３．クロマトグラフィーマトリックスが表面領域を構成する複数のサブ細孔を定 める請求項１或は２の方法。
4. ４．前記流体混合物をマトリックスの中に、前記溶質が第二細孔集合の部材内か ら表面領域に及び表面領域から拡散する時間が、溶質が該領域を対流により流れ 過ざる時間の１０倍以下になるような速皮で通す請求項３の方法。
5. ５．Ａ．相互連絡した第一及び第二細孔集合であって、これらの各々は、溶質の 混合物をマトリックスの中に流すための複数の細孔を流体中に配置させてなるも の、及び マトリックスにおいて溶質を収着する第二細孔集合の部材と流体連絡する表面領 域 を定めるクロマトグラフィーマトリックスを供し、Ｂ．溶質の流体混合物をマト リックスの中に、両細孔集合を通る対流流体流れ、 第二細孔集合を通る流体流速より大きい第一細孔集合を通る対流流体流速、及び 第二細孔集合の部材内の落質の拡散速度より大きい第二細孔集合を通る対流流体 流速 を生じさせる流体流速で通して流体混合物から溶質を該表面領域に負荷させ、 Ｃ．溶離剤をマトリックスの中に通して溶質の内の選定した一種に富むフラクシ ョンを溶離させる工程を含むクロマトグラフィー法。
6. ６．前記第二細孔集合の部材及び前記表面領域の相対的大きさが、第二細孔集合 の部材を通る流れを、溶質が第二細孔集合から表面領域に及び表面領域から拡散 する時間が、落質が該領域を対流により流れ過ぎる時間に匹敵する或はそれより 短くなるような速度にさせる請求項５の方法。
7. ７．工程Ｂ或はＣを，流体混合物或は溶離剤をマトリックスの中に１５００ｃｍ ／時間より大きい床速度で通して行う請求項５の方法。
8. ８．工程Ｂ或はＣを，流体混合物或は溶離剤をマトリックスの中に１０００ｃｍ ／時間より大きい床速度で通して行う請求項５の方法。
9. ９．工程Ｂ或はＣを，比生産性，少なくとも全収着たんばく質１ｍｇ／収着剤１ ｍ１／分を生じさせるマトリックスを通る流体流速で行う請求項５の方法。
10. １０．工程Ｂ或はＣを，比生産性，少なくとも全収着たんばく質２ｍｇ／収着剤 １ｍ１／分を生じさせるマトリックスを通る流体流速で行う請求項５の方法。
11. １１．工程Ａにおいて供するマトリックスが８μｍより大きい平均直径を有する 充填粒子を含み、前記第二細孔集合が２０００Å大きい平均中間直径を有する粒 子内の通し細孔を含み、粒子の平均直径対細孔の平均直径の比が７０より小さい 請求項５の方法。
12. １２．粒子の平均直径対細孔の平均直径の比が５０より小さい請求項１１の方法 。
13. １３．前記細孔集合の内の一つが、細孔の９０％が平均細孔直径の１０％の範囲 内に入るような狭い細孔直径の分布を有する細孔を含む請求項２又は５の方法。
14. １４．前記細孔集合の内の少なくとも一つが、種々の平均直径を有する複数の部 分集合を一緒に含んで広い細孔直径の分布を生じる請求項２又は５の方法。
15. １５．工程Ｂの後に、前記溶質の内の選定した一種を捕集する追加の工程を含む 請求項１、２又は５の方法。
16. １６．前記サブ細孔が７００Åより小さい中間直径を有する請求項３の方法。
17. １７．前記表面領域が、平均直径が７００Åより小さいサブ細孔を含む請求項５ の方法。
18. １８．工程Ｂ或はＣにおいて、流体をマトリックスの中に、通し細孔或は第二細 孔集合におけるペクレ数が５より大きくなるような速度で通す請求項１、２又は ５の方法。
19. １９．通し細孔或は第二細孔集合におけるペクレ数が１０より大きい請求項１８ の方法。
20. ２０．８μｍより大きい平均直径を有しかつ２．０００Åより大きい平均直径を 有する複数の通し細孔を定める、バーヒュージョンクロマトグラフィー用に適し たマトリックスを製造するための充填用粒子。
21. ２１．平均直径を有し、並びに複数の通し細孔及び通し細孔と流体連絡する溶質 相互作用性表面領域を定める硬質固体を含み、粒子の直径対通し細孔の平均直径 の比が７０より小さい、バーヒュージョンクロマトグラフィー用に適したマトリ ックスを製造するための充填用粒子。
22. ２２．前記通し細孔を含む間隙のある相互接着したポロンを複数含む請求項２０ 又は２１の粒子。
23. ２３．複数の通し細孔の部分集合及び種々の平均直径のサブ細孔を定める相互接 着したポロン凝集体を含む請求項２２の粒子。
24. ２４．通し細孔の任意の逐次部分集合の中間直径の比が１０より小さい請求項２ ３の粒子。
25. ２５．更に、３００〜７００Åの範囲内の平均直径を有する通し細孔と流体連絡 するサブ細孔を含む請求項２０の粒子。
26. ２６．前記表面領域が３００〜７００Åの範囲の平均直径を有するサブ細孔を含 む請求項２１の粒子。
27. ２７．通し細孔の内の最も小さい部分集合の平均直径対サブ細孔の平均直径の比 が２０より小さい請求項２４の粒子。
28. ２８．第一細孔集合の平均直径対通し細孔の最も大きい部分集合の平均直径の比 が７０より小さい請求項２３の粒子。
29. ２９．４０μｍより大きい平均直径を有し、平均粒子直径対通し細孔の平均直径 の比が１０より大きい請求項２１の粒子。
30. ３０．更に、通し細孔とサブ細孔との間を連絡する分枝細孔を定めかつ通し細孔 及びサブ細孔の平均直径の平均の平均直径を有する請求項２１の粒子。
31. ３１．相互連絡した第一及び第二細孔集合であって、これらの各々は、溶質の混 合物をマトリックスの中に流すための複数の細孔を流体中に配置させてなるもの 、及びマトリックスにおいて溶質を収着する第二細孔集合の部材と流体連絡する 表面領域 を定める１０μｍより大きい平均直径を有する複数の充填粒子を含み、 第一及び第二細孔集合の部材並びに表面領域の相対的大きさは、流体をマトリッ クスの中に所定の速度で通す場合に、 両細孔集合を通る対流流体流れ、 第二細孔集合を通る流体流速より大きい第一細孔集合を通る対流流体流速、 第二細孔集合の部材内の溶質の拡散流速より大きい第二細孔集合を通る対流流体 流速、 溶質が該領域を対流により流れ過ぎる時間に匹敵するか或はそれより短い落質が 第二細孔集合から表面領域に及び表面領域から拡散する時間 を生じさせるように決められ、 それで、マトリックスを通る流体流速の範囲であって、それにわたってマトリッ クスの有効プレート高さが実質的に一定になるものが存在するクロマトグラフィ ーマトリックス。
32. ３２．相互連絡した第一及び第二細孔集合であって、これらの各々は、溶質の混 合物をマトリックスの中に流すための複数の細孔を流体中に配置させてなるもの 、及びマトリックスにおいて溶質を収着する第二細孔集合の部材と流体連絡する 表面領域 を定め、 第一及び第二細孔集合の部材並びに表面領域の相対的大きさは、流体をマトリッ クスの中に所定の速度で通す場合に、 両細孔集合を通る対流流体流れ、 第二細孔集合を通る液体流速より大きい第一細孔集合を通る対流流体流速、 第二細孔集合の部材内の溶質の拡散流速より大きい第二細孔集合を通る対流流体 流速、 溶質が該領域を対流により流れ過ぎる時間に匹敵するか或はそれより短い溶質が 第二細孔集合の部材から表面領域に及び表面領域から拡散する時間 を生じさせるように決められ、 それで、マトリックスを通る流体流速の範囲であって、それにわたってマトリッ クスの有効プレート高さが実質的に一定になるものが存在する一体クロマトグラ フィーマトリックス。
33. ３３．相互連絡した第一及び第二細孔集合であって、これらの各々は、溶質の混 合物をマトリックスの中に流すための複数の細孔を流体中に配置させてなるもの 、及びポリエチレンイミン或はジビニルベンゼン架橋されたポリスチレン表面と 異なる溶質相互作用性表面を含み、マトリックスにおいて溶質を収着する第二細 孔集合の部材と流体連絡する表面領域 を定あ、 第一及び第二細孔集合の部材並びに表面領域の相対的大きさは、流体をマトリッ クスの中に所定の速度で通す場合に、 両細孔集合を通る対流流体流れ、 第二細孔集合を通る流体流速より大きい第一細孔集合を通る対流流体流速、 第二細孔集合の部材内の溶質の拡散流速より大きい第二細孔集合を通る対流流体 流速、 溶質が該領域を対流により流れ過ぎる時間に匹敵するか或はそれより短い溶質が 第二細孔集合の部材から表面領域に及び表面領域から拡散する時間 を生じさせるように決めちれ、 それで、マトリックスを通る流体流速の範囲であって、それにわたってマトリッ クスの有効プレート高さが実質的に一定になるものが存在するクロマトグラフィ ーマトリックス。
34. ３４．第一細孔集合を構成する間隙のある容積を定める複数の界面粒子を含み、 該粒子の各々は、第二細孔集合を構成する複数の通し細孔及び表面領域を構成す る複数のブラインド細孔を定める請求項３１、３２又は３３のマトリックス。
35. ３５．前記粒子が複数の異方性通し細孔を含む請求項３４のマトリックス。
36. ３６．前記粒子が接着された、実質的に球形のポロンを含む請求項３４のマトリ ックス。
37. ３７．第一細孔集合を通る対流流体流速対第二細孔集合を通る対流流体流速の比 が、１０：１〜１００：１の範囲内である請求項３１、３２又は３３のマトリッ クス。
38. ３８．前記溶質が第二細孔集合の部材から表面領域に及び表面領域から拡散する 時間が、溶質が該領域を対流により流れ過ぎる時間の１０倍以下である請求項３ １、３２又は３３のマトリックス。