JPH04500860A - 分析的アッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中の分析対象測定のためのアッセイに関するものである。

生物学的液体中に存在する分析対象の迅速な分析のための多くの型式のアッセイ 要素がこの分野で知られている。特に興味あるものは、例えば、血液、血清また は血漿の液滴が適用され、試薬層に移動または拡散する乾燥多層分析要素である 。存在する分析対象と試薬（類）との間の相互作用の結果として、該試料中の分 析対象の存在に対応して該要素中に検出可能な変化が生じる。該検出可能な変化 は、色変化であることができ、これは目視的に、または濃度計等によって分光測 定的に読取られる。

蛍光標識生物活性種の存在に基づく他のスキームにおいては、蛍光出力信号が生 成され得、分光的蛍光測定的に読取られる。このようなアッセイ要素は、自動化 分析装置での使用に適用され得ることから極めて興味深い。

自動化分析装置において、試験液体試料は典型的には試料カップに入れられ、試 料のアッセイ要素への計量された体積のピペッティング、熟成および試薬（類） と試料分析対象との間の相互作用の結果として得られる信号の読取りを含むすべ てのアッセイ法工程が自動的に行なわれる。該アッセイ要素は、典型的には例え ばピペッティング位置等のある位置から例えば光学読取り位置等の他の位置に回 転体等の移動手段により移動され、試験工程の自動的実施例が可能となる。

このような自動分析装置は、多数のアッセイ要素を迅速に処理することができ、 またこれらのアッセイは極めて高水準の精度を達成する必要がある。しかしなが ら、得られる結果の不精確さは、多数の因子が原因となって生じる。例えば、信 号の読取を行なう際の光学読取装置から信号生成種までの距離の要素毎の変化は 、測定時の信号発生種が存在する層の要素毎の変化と同様に結果に不精確さをも たらす。

薄膜多層アッセイ要素の試薬層は極めて薄く、約０゜０１ｃｎｍまたはそれ以下 の程度である。従って、このような層が極めて高精度で被膜され得るにもかかわ らず、該試薬層の厚さの僅かな変化は要素毎に存在するであろう。

同様に、例えば回転体等のアッセイ要素のための移動手段は、高精度の公差をも って設計され得るが、該移動手段上の各々のアッセイ要素位置に対応する装置位 置には僅かな変化が存在するであろう。

従って、試薬水準の要素毎の変化、および装置位置応答における変化ならびに他 の因子によるものの為に生じる不精確さを補償する方法が望まれている。

本発明の要約 これらのおよび他の目的ならびに利点は、本発明に従って、全血、血漿、血清等 の試料液体中の分析対象の量の測定方法を提供することにより達成される。該ア ッセイ方法は、少なくとも１つの試薬層および光遮断層を含むアッセイ要素を用 いて行なわれる。該光遮断層は、信号発生種の光学的結合／遊離分離を、試料液 体中の分析対象量の関数として与える。該アッセイ要素中の信号発生種は、該要 素に試料液体を分配するに先立って、最初の光学的測定が行なわれる。続いて、 試料液体か該アッセイ要素に適用され、試料分析対象および該要素中の試薬間の 相互作用が起きた後に、該信号発生種の２回目の光学的測定が行なわれる。この 第２回の光学的測定は、該アッセイ要素の同じ層を第１回の光学的測定における 読取と同様に同じ波長にて照射することにより行なわれる。第１の信号に対する 第２の信号の比は、既知量の分析対象のものと比較され、試料液体中の分析対象 の量が決定される。

この方法でのアッセイにより得られた信号の標準化により、要素毎の試薬層の厚 さの変化による試薬水準の変化および分析装置位置応答に対する補償が可能とな る。

このような変化に対する補償は、該アッセイ方法における精度を顕著に改善する 。

図面の簡単な説明 本発明の他の目的およびその更なる特徴に加えて本発明のより良い理解のために 、以下の種々の好適な実施態様の詳細な記述を、添付の図面と組合せて参考とし 、ここにおいて図は、本発明の方法で使用され得るアッセイ要素の部分的な模式 的断面図である。

好適な実施態様の記述 本発明のアッセイ方法において使用されるアッセイ要素は、いずれかの好適な信 号発生種を含んでよい。試薬と反応する標識を含めて検出可能な信号を与える任 意の光輻射放射または吸収標識が、信号発生種として使用され得る。該標識は、 蛍光剤、リン先割または光吸収物質であってよい。

本発明のアッセイ方法は、ここで使用されてもよいアッセイ要素の好適な実施態 様に関連して詳細に記述される。図面を参照すると、アッセイ要素ｌＯは、典型 的には約ｏ、ｔｍｍの厚さを有する薄膜多層要素であり、試薬層１４、光遮断層 １６および試薬層、蛋白質に対するフィルター層、抗摩耗層等として作用し得る 選択的な上部被覆層１８を順に保持する透明支持体１２を含んでなる。

該試薬層１４は極めて薄く、典型的には約０．０２５ｍｍの厚さを有し、興味あ る分析対象に対する結合相手の免疫複合体および標識分析対象物（試料、分析対 象と同じもの、その類似物または該結合相手と結合するであろう構造的類似物質 ）の接合体を含存する。試料分析対象が抗原である場合には抗体である結合相手 は、ポリエステルまたはポリスチレン等の適当な材料であってよい支持体層１２ の表面あるいは担体材料に共存結合されることにより、または該担体材料に物理 的に支持されることによリ、試薬層１４中に固定化される。該担体材料は、ゼラ チン、アガロース等のポリサッカライド、誘導ポリサッカライド、それらの混合 物等の親水性材料であってよい。

光遮断層１６は、例えば酸化鉄、二酸化チタン等が、ポリサッカライド等の結合 材料中に分散された適当な材料を含んでいる。場合により含まれる上部被覆層１ ８は、ポリサッカライド等の材料からなる抗摩耗層を含み、または好ましくは緩 衝剤、遮断剤および変位剤等を含んでもよい。

該アッセイ要素１０は、該試料液体を該要素の上部層表面にわたって均一に分配 するために層または他の手段（示していない）を含んでもよい。例えば、粒子層 、ポリマー層、繊維層、織物層およびこの目的のために適するものとしてこの分 野で開示されている液体移送系を含むいずれかの液体分配技術が使用されてもよ い。該アッセイ要素の表面にわたって試料液体の均一な分配を与えるための多く の分配材料または系がこの分野で知られており、従って、このような材料または 系をここで更に議論する必要は無い。特に好適な液体移送系は、共通に環流され 、同時係属中の１９８８年６月２３日出願の出願番号第２１０．７３２号に記載 されているものである。

該分配手段は、繊維材料等の層であるか、または液体移送系であるが、好ましく は試薬１１１４に比べて相対的に厚い。

実際上、試薬層Ｉ４中に存在する標識は、該アッセイ要素に試料を適用するに先 立って、透明支持体１２を通して適当な電磁輻射を照射することによって光学的 測定が行なわれ、第１の読取信号が得られる。次いで試料液体が該アッセイ要素 の表面にわたって分配され、該液体が、いずれかの液体分配層または存在する液 体移送系に加えて層１４．１６および１８を通して拡散し、平衡が確立される。

試料中に存在する分析対象は、試薬層１４中の標識分析対象と層１４中に固定化 された抗体上の利用可能な部位について競合し、該標識分析対象がそこから解離 されて、試料分析対象および標識分析対象の相対量に適切に同じ比率において試 料分析対象によって置換される。従って、試料中の分析対象の量に依存して、層 １４中の固定化抗体に最初に結合していた標識分析対象のある割合のものがそこ から移動し、該アッセイ要素の残部に分配される。試薬層１４中の固定化抗体に 結合する標識分析対象の量は、常に試料分析対象の量と反比例する。

第２の読取り信号は、試薬層１４を支持層１２を通して第１の光学的測定工程で 用いたものと同じ電磁輻射を用いて再度照射することにより得られ、試料分析対 象の量に反比例する、すなわち試料分析対象量の増加に伴って信号が減少する第 ２の信号を得る。試薬層１４は、層１６および１８をいずれかの液体分配層また は液体移送手段と合わせた厚さに比べると相対的に薄く、また光遮断層１６は、 いずれの読取り電磁輻射がＮ１８または上記のいずれかに入ることを防ぐため、 得られる第２の信号は、固定化抗体に結合している標識分析対象および該アッセ イ要素の残部にわたって分配された遊離の標識分析対象の僅かな割合のものの関 数である。好適な実施態様において、光遮断層と該アッセイ要素の残部を合せた 厚さに対する試薬層１４の厚さの割合は、約ｌ：２０から約１：１００またはそ れ以上である。

第１の信号に対する第２の信号の比率を得、これを既知量の分析対象のものと比 較して試料液体中の分析対象の量を決定する。この比率は得られたもの自体で使 用されるか、または特定のアッセイに依存して所望の範囲におさまる信号を得る ためにある定数が剰じられる。

商業的使用において、該アッセイは分析を自動的に行ない結果を記録する自動分 析装置により行なうことが好ましい。本発明の該アッセイ方法を実施することに より、装置位置応答および要素毎の試薬層の厚さの変化が補償され、顕著に優れ た精度が得られる。

本発明は、例示のみを目的とするものと理解されるべき実施例によって、特定の 好ましい態様に関して更に詳細に記述されるが、本発明は、ここに示される材料 、工程等に限定されるものではない。

例■ アッセイ要素は、透明ポリエチレンテレフタレート支持体上に以下を順次被覆し てなるよう調製された：１、　約５００　ｍｇ／　ｍ’のアガロースとグリオキ シアガロースとの３：ｌ混合物：約７２ｍｇ／ｍ’のビストリスプロパン緩衝剤 ；約１０ｍｇ／ｍ”の七オフィリンに対して生じた抗体；約０．０７ｍｇ／ｍ” の式により表される蛍光標識セオフィリン接合体を含む試薬層； ２、　約６０００ｍｇ／ｍ”の酸化鉄、約２０００ｍｇ／ｍ２のアガロースおよ び約５０．４ｍｇ／ｍ”の２′−モルフォリノエタンスルホン酸（ｐ）１５．　 ７）を含む光遮断層：および、 ３、　約２０００　ｍｇ／ｍ’のアガロースを含む上部層。

緩衝溶液中に異なった量のセオフィリンを含有する試験試料を調製した。該緩衝 溶液は、５０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエチルスルフォネート（ＨＥＰ ＥＳ）緩衝剤、ｐＨ７，２，１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ および１％のボリゲリン（Ｐｏｌｙｇｅｌｉｎｅ）からなる。各試料は、４つ一 組として操作された。

各アッセイ要素を研究用分析装置に挿入し、３７°Ｃにて約２分間調整した。次 いで、該試験要素に透明支持体を通して５５０ｎｍの光を照射し、蛍光放射を５ ８０ｎｍにて測定しム。約ｌＯμｍの試験試料を、更に６分間熟成されたアッセ イ要素に適用し、再度読取りを行なった。

得られたデータが第１表に示されている。各位は、各試験試料を４つ一組で４組 の操作から得られた４つの読取値の平均を示している。標準化信号値は、湿潤読 取値を乾燥読取値で割ることにより得た値に定数、この場合には１．１６６を剰 じて得た。

２．５　１．１９２　７．５　１．２５６　８．６　１．２２９　１．３５．０ 　１．１７４　７．２　１．０＋６　１０．０　１．００８　４．１２０．０　 １．１７６　７．９　０．６８３　１１．０　０．６７８　５．２４０．０　１ ．＋８０　１１．２　０．５６１　２２．０　０．５５１　１０．８本発明の方 法に従った標準化信号は、顕著に改善された精度を与えることが分かる。また、 データは、この改善された精度がアッセイ範囲（２，５−４０，０μｇ／ｄｌ） にわたるセオフィリン濃度水準で得られたことを不例Ｉに例示したものと同様な アッセイ要素を調製し、ここで試薬層は、フェニトインに対し−で生成された抗 体を約２０ｍｇ／ｍ２および例Ｉに示した蛍光残基に結合するフェニトインから なる接合体を０．１．５ｍｇ／ｍ’含有する。

フェニトインをそれぞれＯ１５および４０μｇ／ｄｉ含有する試験試料を、約２ ％のＢＳＡ、約０．０１％のＮ　ａ　Ｎ　ｓおよび約０．０１％のＰＮＳを含み 、ボリゲリンを含まない点板外は例Ｉに記述したものと同じ緩衝溶液中で調製し た。

アッセイ工程は、前述と同様である。各濃度について１８のアッセイを行なった 。得られたデータを第１１表に示しである。標準化信号は、乾燥時の読取に対す る湿潤時の比率に３．８３６を剰じて得た。

０　３．６８２　５．４　６．８０６　４．８　７．０９０　１．７５　３．７ ２４　２．８　５．５４２　２．６　５．７１０　１．４４０　３．５３３　３ ．８　３．４１７　８．９　３．７１１　７．９本発明に従った信号の標準化は 、顕著な精度の改善をもたらすことが分かる。

例Ｉ１１ 例Ｉに示したものと同様なアラせイ要素を調製し、ここにおいて試薬層はフェノ バルビタールに対して生成された抗体を約１５ｍｇ／ｍ”および例■に示した蛍 光残基に結合するフエノバルビタールからなる接合体を約０．１５ｍｇ／ｍ”含 有する。

貯留ヒト血清中にフエノバルビタールを各々０および５μｇ　／ｄｉ含有する試 験試料を調製した。アッセイ工程は、前述したものと同様であった。各濃度につ いて３回のアッセイを行なった。得られた結果を第１１［表に示しである。標準 化信号は、乾燥時の読取に対する湿潤時の比率に３．０を剰じて得た。

０　４、＋１２　５．１３　５．００２　６．０８　３゜６４８　１．２４５　 ３．８８６１０．６６　３．４６２１１．５６　２．６７１　１．０５結果は、 本発明による信号の標準化が、顕著な精度の改善をもたらすことを示している。

例ＩＶ 例Ｉに示したものと同様なアッセイ要素を調製し、ここにおいて試薬層はＴ４に 対して生成された抗体を約０．５ｍｇ／ｍ”　、および例Ｉに示した蛍光残基に 結合するＴ４からなる接合体をＯ，Ｏ１ｍｇ／ｍ”含有する。

血漿中（Ｔ４を除去）にＴ４を各々０．０．２．５および１０．０μｇ／ｄｌ含 有する試験試料を調製した。アッセイ工程は、前述したものと同様であった。各 濃度について１２回のアッセイを行なった。得られた結果を第１ｖ表に示しであ る。標準化信号は、乾燥時の読取に対する湿潤時の比率に３．０を剰じて得た。

第１Ｖ表 ０　２．５７３　３．８５　２．７３５　３．６７　３．１９０　１．４０２． ５　２．５５２　４．８０　２．５２２　５．００　２．９６５　＋、、５２１ ０．０　２．５１２　４．４２　１．９０７　５．９７　２．２７６　２．１４ データは、本発明により信号を標準化することによって、顕著に改善された精度 が得られたことを示している。

本発明を特定の好ましい実施態様に関して記述したが、これに限定されることを 意図するものではなく、むしろ当業者は、これによって本発明の精神の範囲およ び添付された請求の範囲の内で行ない得る変形および修飾を認識するであろう。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００３４５３ Ｓ＾　３Ｂ０８８

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）液体試料を、 ｉ．前記液体を透過する光遮断層；およびｉｉ．信号発生種を含む試薬層 からなる多層アッセイ要素の表面にわたって分配させ；（ｂ）前記試薬層に、前 記信号発生種の吸収領域内の電磁輻射を照射することにより読取信号を得；（ｃ ）　工程（ａ）の前記液体試料の分配の前に工程（ｂ）に使用するものと同じ電 磁輻射を前記試薬層に照射して得た読取信号に対する工程（ｂ）の読取信号の比 率を得；そして （ｂ）　前記比率を既知量の分析対象について得たものと比較して前記試料中の 分析対象の量を決定すること、からなる試料液体中の分析対象の存在の測定方法 。
2. ２．前記アッセイ要素が、更に前記電磁輻射について透明な支持体を含む請求項 １に記載の方法。
3. ３．前記試薬層が前記分析対象に対する固定化結合相手を含み、および前記信号 発生種が前記結合相手に結合可能な残基に結合された標識の接合体を含む請求項 １に記載の方法。
4. ４．前記標識に結合された残基が前記分析対象またはその類似体である請求項３ に記載の方法。
5. ５．前記標識が蛍光性である請求項３に記載の方法。
6. ６．前記アッセイ要素が、更に前記光遮断層の上に配置された上部層を含む請求 項２に記載の方法。
7. ７．前記試薬層の厚さの前記アッセイ要素残部の厚さに対する比率が、約１：２ ０から１：１００またはそれ以上である請求項２に記載の方法。