JPH04500904A - 免疫応答のエフェクター細胞のヒトプロテオグリカンペプチドコアをコードしているポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、請求項ｌのプロテオグリカンペプチドコアタンパクをコードしている発現 し得る配列からなるＤＮＡ分子を準備し、（ｉｉ）該分子で宿主を形質転換し、 （ｉｉｉ　）該ＤＮＡ分子のプロテオグリカンペプチドコアタンパクの配列を該 宿主中で発現させ、そして （ｉｖ　）該発現によって生産されたヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパ クを分離することからなる、ヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパクの製造 法。

１８、該宿主が哺乳動物細胞である請求項１７に記載のヒトプロテオグリカンの 製造法。

１９、式：　５ＶＱＧＹＰＴＱＲＡＲＹＱＷＶＲ１７）ペブチ）’。

２０、式：５ＮＫＩＰＲＬＲＴＤＬＦＰＫＴＲのペプチド。

２１、式：　ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧのペプチド。

２２、ヒト分泌プロテオグリカンまたはそのフラグメントと結合し得る抗体。

２３、ヒト分泌プロテオグリカンペプチドコアタンパクと結合し得る請求項２２ の抗体。

２４、該抗体が、請求項１９．２０または２１のいずれかのペプチドに対して惹 起されたものである請求項２２の抗体。

２５、該抗体がポリクローナル抗体である請求項２２の抗体。

２６、該抗体がモノクローナル抗体である請求項２２の抗体。

明　細　書 発明の名称 免疫応答のエフェクター細胞のヒトプロテオグリカンペプチドコアをコードして いるポリヌクレオチド 本発明は、１９８８年７月１３日出願の米国特許出願第０７７２２４．０３５号 の一部継続出願である。本発明に基づく研究は、政府の基金に支えられており、 政府は本発明について特定の権利を有する。

発明の分野 本発明は、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの精製、およびそのペプチドコアの組 換えＤＮＡ技術による生産に関する。さらζこ、本発明は、ヒト分泌顆粒プロテ オグリカンに対する抗体の生産に関する。

本発明の　景の簡単な、説明 分泌顆粒プロテオグリカンは、ペプチドコアに共有結合して０る少なくとも１つ の硫酸化グリコサミノグリカン鎖を有する、そのすべてが高酸性巨大分子である 哺乳動物プロテオグリカン類における幾つかの族の１つである［タントラパヒ（ Ｔａｎｔｒａｖａｈｉ、　Ｒ，Ｖ、　）らのＰｒｏｃ。

Ｍａｔ　１、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　＋１３：９２０７ （１９８６）］。ヒトのプロテオグリカンは、モノクローナル抗体のパネルに対 する反応性の差異、タンパク質分解処理後のペプチドマツピングの差異、翻訳後 における大きさの違い、およびある場合にはアミノ酸配列の違い、に基づいてそ の種々の族が提示されている。そのプロテオグリカン族はさらに、細胞内におけ る最終的な位置（例えば、細胞内、細胞外および／または細胞周囲（ｐｅｒｉｃ ｅｌｌｕｌａｒ）マトリックス）、およびペプチドコアに結合している炭水化物 残基の性質によっても分類される。例えば、細胞外マトリックスに位置している プロテオグリカンは、原形質膜に挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅ）する比較的疎 水性の高いプロテオグリカンの亜族とは明らかに異なる族に帰属されるようであ る［Ｔａｎｔｒａｖａｈｉ、　Ｒ。

Ｖら（前掲）コ。

ヒトにはプロテオグリカンのペプチドコアとして存在する少なくとも１２個の興 なるタンパク質があるが、現在、そのうちの数種しか完全な一次構造および／ま たは染色体の位置が知られておらず、いずれのプロテオグリカンについても完全 なペプチドコアをコードしている遺伝子は単離されていない。

線維芽細胞（フィブロブラスト）の回りの細胞外マトリックスに存在するデルマ タン硫酸プロテオグリカンペプチドコアをフードしているｃＤＮＡが、ヒト胚線 維芽細胞セルラインからクローンされている［クルジウス（Ｋｒｕｓｉｕｓ、　 Ｔ、　）およびロースラーチ（Ｒｕｏｓｌｈｔｉ、Ｅ、）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　１１３ニア６＋＋３（１ ９８６）］。そのヌクレオチド配列により、３つのグリコサミノグリカン開始部 位およびＮ一連結オリゴサツカライドのための３つの部位を有する４０．ＯＯＯ Ｍｒのペプチドコアが予測されている。

さらに、細胞表面の糖タンパク質がプロテオグリカンとして存在する場合もある 。例えば、トランスフェリン−レセプターおよびクラス■抗原の不変鎖は、それ ぞれヒト皮膚線維芽細胞およびヒトリンパ組織の原形質膜上のプロテオグリカン であると報告されている〔ギヤコレット（Ｇｉａｃｏｌｅｔｔｏ、　Ｋ、　Ｓ、 　）らのＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１４２２（１９８６）］。

それらトランスフェリンレセプターおよび不変タンパク質をコードしているｃＤ ＮＡの推定アミノ酸配列により、セリン−グリシンのグリコサミノグリカン開始 部位が判明した。コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを含有する、ヒト黒 色腫の細胞表面上の他のプロテオグリカンがｇ己載されている「ブモル（Ｂｕａ ＋ｏｌ、　Ｔ、　Ｆ、　）およびライスフェルト（Ｒ４ｃｅｆｅｌｄ、　Ｒ，Ａ 、　）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、　７９：１２４５|１ ２４９（１９＋３２）コ。その２４０．ＯＯＯＭｒ以上のペプチドコアをフード している遺伝子は染色体１５に存在すると推定されている［レッティク（Ｒｅｔ ｔｉｇ、　Ｉｌ、　Ｊ、　）らの５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１２８１（１９８６ ）］。

ラットのヒフの肥満細胞の研究によって、細胞の顆粒内に貯蔵されるプロテオグ リカンの存在が初めて立証された。しかし、免疫および炎症の応答に関与してい る、粘膜肥満細胞、好塩基性白血球、好酸性白血球、好酸性白血球、マクロファ ージ、血小板、およびナチュラルキラー細胞などの多くの細胞も、それらの顆粒 内にプロテオグリカンを含有していることが次第に明らかになってきた。原形質 膜または細胞外マトリ、クスではなく、細胞内にプロテオグリカン族が存在して いることは、これらの分子が上記の細胞における腫瘍のサーベイランス、および 細菌、ウィルス−１真菌および寄生虫病原体に対する宿主防御機能にとって重要 であり得ることを示唆するものである。スティーベンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ、　Ｒ ，Ｌ、　）のＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｏｇＩｙｃａｎｓ（１９８７） のｒ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ　ｉｎ　Ｃｅ １ｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅＩｍＩＩｌｕｎｅ　ＳｙｓｔｅｍＪには、肥満細胞、好塩 基性白血球およびナチュラルキラー細胞のプロテオグリカンが分泌顆粒内に存在 している証拠、これらのプロテオグリカン独特の構造的特徴、および免疫応答に おけるそれらのあり得る機能が概説されている。

ボートン（Ｂｏｕｄｏｎ）ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、 　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２：１３２２（１９８５）］は、ラットのフンドロ イチン硫酸プロテオグリカンペプチドコアのｃＤＮＡを同定し、配列決定した。

Ｌ２ラット卵黄嚢腫瘍（Ｌ２　ｒａｔｙｏｌｋ　ｓａｃ　ｔｕｍｏｒ）のポ１バ Ａ）”ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーの中からｃＤＮＡクローンｐ ＰＧ−１を選択するために、Ｌ２プロテオグリカンのＮＨ，−末端タンパク質配 列の２つの領域から誘導したオリゴヌクレオチドを使用した。２つの異なるＮＨ ，−末端のアミノ酸配列部分由来のオリゴヌクレオチドを使用することは、所望 のｃＤＮＡクローンを同定するために必須であった。一方または他方の１７−ｍ ａｒオリゴヌクレオチドとはハイブリダイスするが、１１１ｅｒとはハイブリダ イスしない幾つかのクローンを入手した。これらのクローンの中の１つを部分的 に配列決定した。得られた配列は上記の適当な１７−ＩＩｌｅｒプローブとの完 全な相同性を有しておらず、プロテオグリカンのＮＨ，−末端のペプチド配列を フードしていなかった。

上記ｐβＧ−１プロテオグリカンのペプチドコアｃＤＮＡクローンから推定した アミノ酸配列により、このラットの腸瘍細胞から産生される成熟プロテオグリカ ンのペプチドコアにおける完全な一次構造が判明した。プロテオグリカンペプチ ドコアのＮＨ，−末端アミノ酸配列との推定アミノ酸配列相同性に基づいて同定 された、プロテオグリカンペプチドコアのフード化配列は、計算上の分子量１０ ゜１９０ダルトンを有する１０４アミノ酸コアタンパク質をコードしている。

ラットのＬ２細胞プロテオグリカンペプチドコアのアミノ酸配列は３つの構造領 域を含有しており、それは１４アミノ酸のＮＨ，−末端領域から始まり、次に４ ９アミノ酸のセリン−グリシン反復領域および４１アミノ酸のＣ０ＯＨ〜末端領 域が続いている。ＮＨ，−およびＣ００Ｈ−末端領域の機能は知られていないが 、プロテオグリカンと細胞表面および細胞外の両分子との相互作用を決定する役 割を担うと考えられる。

この分子の中央にあるセリン−グリシン反復領域の機能も、コンドロイチン硫酸 側鎖の結合のための認識およびレセプター部位として役立つものと考えられる。

コンドロイチン硫酸およびヘパリン鎖の全プロテオグリカンとの結合は、セリン との０−グリコジル結合によってなされる。さらに、グリシンはプロテオグリカ ン中に豊富にあるので、グリシン残基もグリコサミノグリカン結合に関与してい ることが知られており、かくしてセリンおよびグリシンを交互に含有する合成ペ プチドは、グリコサミノグリカン鎖開始のためのアクセプターとして役立たつこ とができる。Ｌ２プロテオグリカンにおけるセリンＯ−グリコジル化の程度は約 ６０％と算定されており、このことはこのコアタンパク質の少なくとも１４個の セリン残基がフンドロイチン硫酸鎖を担っていることを示唆するものである。Ｂ ｏｕｒｄｏｎらは、セリン−グリシン領域の構造がラットのヘパリンプロテオグ リカンのグリコサミノグリカン結合領域について推定されたものと極めて類似し ていることに気付き、セリン−グリシン反復領域は少なくともプロテオグリカン のサブセットの一般的特徴であり得ることを示唆した。ラット肥満細胞のヘパリ ンプロテオグリカンにおけるプロナーゼ耐性のグリコサミノグリカン結合領域は セリンとグリシンアミノ酸のみを含有しているので、１５−２０個のセリン残基 とリシン残基とが交互になっており、ヘパリン鎖には、３つのセリンの組み当た りそれぞれ少なくとも２つは結合していると提示された。ラット肥満細胞ヘパリ ンプロテオグリカンおよびラット卵黄１ｍｌ瘍のプロテオグリカンという少なく とも２つのプロテオグリカンは同一または同一に近いグリコサミノグリカン結合 領域を有しているように思われる。セリンおよびグリシンのコドン・ユセイジ（ ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）はｐＰＧ−１のｃＤＮＡでは極めて限定されており、 ８１％のセリン残基は可能な６つのコドンのうちの２つによってコードされ、そ してグリシンの７０％は４つの可能なコドンのうちの１つによってコードされて いる。

多くの他のプロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸側鎖に加えて、〇−および Ｎ一連結オリゴサツカライドを有している。これらのオリゴサ・／カライド鎖は 、スレオニン（セリン）０−グリコジルまたはアスパラギンＮ−グリコジルアク セプター認識配列を介してプロテオグリカンペプチドコアと連結している。ラッ トのＬ２細胞プロテオグリカンペプチドファのアミノ酸配列を調査しても、配列 ：Ｘ−アスパラギン−Ｙ−セリンを有しているアスパラギンオリゴサツカライド アクセプタ一部位は見付けられない［Ｂ　ｏｕｒｄｏｎ、　Ｍ、　Ａ、ら（前掲 ）、ホーニス（Ｈｕｇｈｅｒ；、　Ｒ，Ｃ１）のＰｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２６　：１８９−２６８（１９７３）］。

ステベンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２６０ 　：　１４１９４−１４２００（１９８５）には、本発明者および他の数人の研 究者による、インターロイキン３−依存性マウス肥満細胞由来の細胞内フンドロ イチンＥプロテオグリカンのタンパク質の構造分析が報告されている。この分析 により、グリシン、セリン、およびグルタミン酸／グルタミン残基の合計は、こ のコアタンパク質の全アミノ酸の７０％を占めることが判明した。

著者は、マウスの肥満細胞のコンドロイチン硫酸Ｅとラットの漿膜肥満細胞ヘパ リンプロテオグリカンとは、共に分泌顆粒内にパッケージングされており、プロ テアーゼ−耐性であり、高い硫酸化グリコサミノグリカン類であり、セリンおよ びグリシンが豊富なペプチドコアを有する点で、類似していると明記している。

さらに、マウスのフンドロイチン硫酸Ｅプロテオグリカンは、Ｂ　ｏｕｒｄｏｎ らによって（前掲）ラットの卵黄量から単離されたフンドロイチン硫酸ブロテオ グ＋７カンとサイズおよびＳｅｒ、　Ｇ】ｙ、　Ｇｌｘ含量の点で若干類似して いるペプチドコアを有しているとも明記している。

Ｔ　ａｎｔｒａｖａｈｉらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、８３：９２０７−９２１０（１９８U ）には、肥満細胞由来のマウスの骨髄腫（Ｂ　Ｍ　Ｍ　Ｃ）　（細胞内フンドロ イチン硫酸Ｅプロテオグリカンを含有する細胞）およびラット漿膜肥満細胞（細 胞内ヘパリンプロテオグリカンを含有する細胞）から同じ遺伝子が発現されるこ とを証明するために、Ｂ　ｏｕｒｄｏｎら（前掲）に記載されているＩＩ）ＰＧ −１プローブおよびそのサブクローンを使用したことが報告されている。

発明の要約 本発明は、ヒト前骨髄性白血病セルラインＨＬ−６０に存在する分泌顆粒プロテ オグリカンペプチドファタンパク質をコードしているｃＤＮＡおよびゲノムフラ グメントの同定、特性化、および配列決定に関する。

本発明は、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質をコードして いる遺伝子配列を提供する。さらに、本発明はこのような遺伝子配列を含有する 発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換された宿主、および遺伝子操作 された、すなわち組換え型分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質の 製造方法を提供するものである。

また、本発明は、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質のアン チセンスＲＮＡをコードしている遺伝子配列、このような遺伝子配列を含有する 発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換された宿主、遺伝子操作された 、すなわち組換え型アンチセンスＲＮＡの製造方法、およびヒトプロテオグリカ ンペプチドコアタンパク質遺伝子の発現を阻害するための、これらベクターを使 用する方法を提供するものである。

本発明はさらに、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンを特異的に認識する抗体を提供 する。この抗体は、このタンパク質をコードしているｃＤＮＡの共通配列に基づ く配列を有する共通ポリペプチドに対して生成させた。

本発明の分泌顆粒プロテオグリカンｃＤＮＡ、組換えタンパク質、アンチセンス ＲＮＡおよび抗体は、健康および疾患時の免疫エフェクター細胞の活性化および その関連をモニターするための診断プローブとして有用である。

例えば、このプロテオグリカンは、腫瘍細胞を死滅する際にヒトナチニラル牛う −細胞から放出されるので、本発明抗体は、癌の診断とモニターに使用すること ができる。他の態様では、このプロテオグリカンは免疫活性期に肥満細胞からも 放出されるので、炎症およびアレルギー疾患のモニターにも本発明抗体を使用す ることができる。さらに、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク 質は、組織損傷および修復に伴う炎症応答時およびある種の免疫応答時に発現さ れるので、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質に対する抗体 は、ヒトにおけるこのような反応の検出、およびその経過の追跡を行うための検 定に使用することができる。

種々の造血細胞は、このプロテオグリカンペプチドコアに結合している異なるタ イプの炭水化物を有している。しかし、種々のヒト造血細胞におけるこの族のプ ロテオグリカンのペプチドコアは同じであるので、本発明の抗体は、造血エフェ クター細胞のすべての分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアを認識するもので ある。

分泌顆粒プロテオグリカンは、プロテアーゼと相互作用する。肥満細胞のプロテ アーゼをこのプロテオグリカンと結合させた場合、大きな基質に対するその分解 活性は大幅に減少される。したがって、本発明プロテオグリカンはさらに、タン パク質分解インヒビターとしてインビトロおよびインビボにおいて有用であり得 る。

図面の説明 １１’Ａ：ｅＤＮＡ−Ｈ４およびその関連ｃＤＮＡの制限地図およびヌクレオチ ド配列決定法の方針を示している。ｃＤＮＡ−Ｈ４はＨＬ〜６０細胞を起源とす る。ｒＸＪおよびｒＡＪは、それぞれＸ■ｎＩおよびＡｃｃｌに感受性である、 各ｃＤＮＡ内における部位を意味している。矢印は、配列決定したｃＤＮＡの各 サブクローン化フラグメントの方向および長さを示している。

！２［ｉｌ：ＨＬ−６０細胞−誘導化ｃＤＮＡの共通ヌクレオチド配列、および 翻訳プロテオグリカンペプチドコアの推定アミノ酸配列である。矢印は、シグナ ルペプチドの推定の開裂部位を示している。停止コドンは＊＊＊で示している。

右列および左列の数字は、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの配列を表して いる。Ｘ１ｎＩおよびＡｅｅｌ制限部位を示している。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　−Ｈ４ と比較して、ｃＤＮＡ−Ｈｌ２の５°末端は４ｂｐ長く、ｃＤＮＡ−Ｈｌ　９の ５°末端は１４ｂｐ短い。ｃＤＮＡ−Ｈ８はそのｃＤＮＡの３°末端に過剰のチ ミジン（括弧内で示している）を有している点がｅＤＮＡ−Ｈ４と異なっている 。

単離したヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア遺伝子の制限地図である。

！±閃：ヒト分泌顆粒プロテオグリカンのペプチドコアをコードしている遺伝子 のヌクレオチド配列である。５°フランキング領域、エクソン／イントロン結合 部、および３つのエクソンのヌクレオチド配列を示している。エクソン１におけ る翻訳されたプロテオグリカンペプチドコアの疎水性シグナルペプチドおよびエ クソン３におけるセリン−グリシン豊富なグリコサミノグリカン結合領域を四角 で囲っている。

ドしているマウス遺伝子のヌクレオチド配列である。５°フランキ翻訳されたプ ロテオグリカンペプチドコアの疎水性シグナルペプチドをエクソン１内に四角で 囲っている。タンパク質へのグリコサミノグリカン付加を指令すると提示されて いる二酸性アミノ酸配列、およびセリン−グリシングリコサミノグリカン結合領 域をエクソン３内に四角で囲っている。エクソン３内のポリアデニル化部位に下 線を引いている。

第６図：ウサギ抗−ペプチド０２血清のＥＬＩ　ＳＡである。ペプチド０１（０ ・・・・・・・・・○）および０２（・・・・・・・・・・）を結合してマイク ロタイターウェルを分離し、種々の希釈度のウサギ抗−ペプチド０２血清をそれ らの特定のペプチドに対する反応性について調査した。セイヨウワサビ・ベルオ キシダーゼーフンジコグート化ヤギ抗−ウサギ抗体を添加し、次いで２，２°ア ジ７−ジー［３−エチル−ベンズチアゾリンクスルホネートを添加した後、４９ ０ｎｍにおいて分光側光学的に検出した。

（Ｂ）ＨＬ−６０細胞の細胞溶解物における免疫沈降の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で ある。（Ａ）［ｓｓＳ］硫酸−標識化ＨＬ−６０細胞の細胞溶解物を、抗−ペプ チド０２１ｇＧとの免疫沈降の前に（レーン１）、およびペプチド０２の存在下 （レーン２）および不存在下（レーン３）に抗−ペプチド０２１ｇＧと免疫沈降 した後に分析した。（Ｂ）ＨＬ−６０細胞の細胞溶解物を、［３６８］メチオニ ンと２分（レーン１）または１０分（レーン２）インキ一ベートした後に、抗− ペプチド０２１ｇＧとの免疫沈降によって分析した。１０分の［ＩＳＳ］メチオ ニン−標識化ＨＬ−６０細胞を洗浄し、次いで細胞溶解物を抗−ペプチド０２Ｉ ｇＧと免疫沈降する前にメチオニン含有の豊富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｍｅｄｉ ｕｍ）培地中でさらに３分間インキュベートした（レーン３）。５分標識化ＨＬ −６０細胞の細胞溶解物を、ペプチド０１（レーン４）またはペプチド０２（レ ーン５）の存在下に抗−ペプチド０２１ｇＧと免疫沈降した。免疫−前のＩｇＧ と非特異的に免疫沈降したｐｓＳ’］メチオニンー標識化タンパク質をレーン６ に示す。起点（ｏｒｉ）およびＭｒママ−−を各パネルの左側および右側に示す 。矢印は、抗−ペプチド０２　１ｇＧと免疫沈降する前駆体ペプチドコアおよび 成熟プロテオグリカンを示している。

好ましい態様の簡単な説明 １、定義 以下の記載に於いて、組換ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術で使用される多数の語句を広 範に使用する。この様な語句を与えられた範囲を包含する明細書および請求の範 囲が明白かつ一致して理解されるように、以下の定義を提供する。

１伝”Ｆ　ＲＮＡポリメラーゼのための鋳型を含有しているＤＮＡ配列。遺伝子 から転写されたＲＮＡはタンパク質をコードし得るかまたはし得ない。タンパク 質をコードするＲＮＡは、いわゆるメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、 真正核細胞ではＲＮＡポリメラーゼ■によって転写される。しかしながら、個々 の■ＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＲＮＡ配列が転写されるが、正常に翻 訳されないＲＮＡポリメラーゼ■鋳型を含有している遺伝子を構成することも知 られている。この様な遺伝子構築物を本明細書では“アンチセンスＲＮＡ遺伝子 ”と呼び、この様なＲＮＡ転写物を“アンチセンスＲＮＡと呼ぶ″。アンチセン スＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ配列中に翻訳終止コドンが存在するために、正 常に翻訳され得ない。

“相補的ＤＮＡ”または“ｃＤＮＡ”遺伝子は、ｍＲＮＡの逆転写によって合成 され、介在配列（イントロン）が除去された組換え遺伝子を包スミドまたはファ ージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、ビヒクルの実質的な生物学的機 能を失うことなく確定可能な方法でこの様なりＮＡ配列を切断し得、その複製お よびクローニングを行なうためにＤＮＡをスプライスし得る１または少数のエン ドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられる。このクローニング・ビヒクル は更に、このクローニング・ビヒクルで形質転換された細胞の識別における使用 に好適なマーカーを含有することができる。マーカーは、例えばテトラサイクＪ ノン耐性またはアンビシソン耐性である。リローニング・ビヒクル”の代わりに しばしば、２ベクター”なる語句が使用される。

発現ビヒクル　クローニング・ビヒクルに類似したビヒクルまたはベクターであ るが、宿主にトランスフオームされた後、これにクローニングされた遺伝子を発 現し得る。クローニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列の様なある種の コントロール配列のフントロール下に位置される（即ち、操作可能に結合される ）。発現コントロール配列は、ベクターが原核生物性宿主中で操作可能に結合さ れた遺伝子を発現するようにデザインされているか、真核生物性宿主中で操作可 能に結合された遺伝子を発現するようにデザインされているかよって異なり、更 に、エンハンサ−エレメント、終止配列の様な転写エレメント、組織−特異性エ レメント、および／または翻訳開始または終止部位を含有することができる。

プロテオグリカン　本明細書および請求の範囲で使用されるこの語句は、プロテ オグリカンのコアタンパクに共有結合しているグリコサミノグリカン鎖を含有し ているかしていない“ヒト分泌プロテオグリカン”を意味する。この語句はまた 、生物学的（機能上または構造上）活性を保持しているプロテオグリカンの部分 フラグメントの様な、ペプチドコアタンパクが天然の数より少ないアミノ酸を含 有しているヒト分泌プロテオグリカンのペプチドフラグメントを包含するものと する。機能上活性の例は、天然の弁組換えタンパクが行うのと同様にして特異的 生物学的応答を誘発する活性である。構造上活性の例は、天然の弁組換えタンパ クをも認識する抗体を結合する活性である。

この語句はまた、天然のヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクま たはその類似体と共に１またはそれ以上の側面に位置しているアミノ酸の配列を 含有しているペプチドであって、ヒト分泌プロテオグリカンの生物学的（機能上 または構造上）活性を示すペプチドを包含して使用される。

本発明は、全長ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクの発現、お よびこのタンパクの機能的誘導体の両者に関するもバクの“機能的誘導体“は、 弁組換えヒト分泌顆粒プロテオグリカンの生物学的活性に実質上類似した生物学 的活性（機能上または構造上のいずれか）を有するタンパクである。ヒト分泌顆 粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクの機能的誘導体は、特異的機能の達成 のため修飾が必要であれば、共有結合的に結合された炭水化物の様な翻訳後修飾 を含有してもよいし、しなくてもよい。“機能的誘導体”なる語句は、分子の“ フラグメント、“変異体”、“類似体”、または“化学的誘導体”を包含するも のとする。

フラグメント　ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの様な分子の“フラグメント”は 、ペプチドコアまたはペプチドコアの変異体の様な分子の変異体を意味するもの とする。

良黒傅　ヒト分量顆粒プロテオグリカンの様な分子の“変異体”は、分子全体ま たはそのフラグメントのいずれかに構造上または生物学的活性において実質上類 似した分子を意味するものとする。従って、２分子が同様の活性を有する場合、 一方の分子の組成または２級、３級また４級構造が他方で見いだされるそれと同 一でないか、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、この語句が本明細書 で使用される時これらは変異体とみなされる。

！置体 ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの様な分子の“類似体”は、分子全体またはその フラグメントのいずれかに機能において実質上類似している分子を意味するもの とする。本明細書で使用する時、これが分子の名目上ではない１部分である化学 的部分を含有する時、分子はその他の分子の“化学的誘導体”と言われる。この 様な部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善することができる。

この部分は、また、分子の毒性を低下し、分子の望ましくない副作用を排除また は除去することができる。この様な効果を媒介し得る部分は、レミントン・ファ ーマシニーティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒａ＋ａ ｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０）ｌこ記載されて（する。分 子にこの様な部分を結合させる方法は当業者に既知である。

■、ヒト　泌　粒プロテオグリカンの遺伝子工学本発明は、ヒト分泌顆粒プロテ オグリカンペプチドコアタンノでりのアミノ酸配列、プロテオグリカンペプチド コアタンノイクｍＲＮＡまたはアンチセンスｍＲＮＡをコードしている遺伝子配 列、遺伝子配列を含有している発現ビヒクル、それで形質転換された宿主、およ びその様な形質転換された宿主の発現によって産生された組換ヒト分泌顆粒プロ テオグリカンペプチドコアタンパクおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。本発 明は更に、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクに対する抗体を 包含する。

本発明によると、ヒト分泌顆粒ブ１チオグリカンペプチドコアの配列を遺伝子操 作するための方法は、ペプチドコアをコードし得る遺伝子配列のクローニングお よびその様な遺伝子配列の発現によって促進される。本明細書で使用される時、 “遺伝子配列”なる語句は、核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を意味するものとす る。ヒト分泌顆粒プロテオグリカンのペプチドコアをコードし得る遺伝子配列は 、種々の供給源に由来する。これらの供給源は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ１合成 りＮＡおよびその組み合わせを包含する。ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの好まし い供給源は、ヒト前骨髄球性白血病セルライン、ＨＬ−８０である。

本発明の分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクのゲノムＤＮＡは、天 然のイントロンを含有してもよいし、しなくてもよい。また、この様なゲノムＤ ＮＡは、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク遺伝子配列の５′ プロモーター領域および　。

／または３′転写終止領域を付随して得ることができる。更に、この様なゲノム Ｄ　Ｎ　Ａは、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクｍＲＮＡの ５′非翻訳領域をコードしている遺伝子配列および／または３′非翻訳領域をフ ードしている遺伝子配列を付随して得ることができる。宿主細胞が、ｍＲＮＡお よびタンパクの発現に関する転写および／または翻訳調節シグナルを認識し得る 限り、転写およびＷ４訳の調節のために天然の遺伝子の５゛および／または３′ 非転写領域、および／またはｍＲＮＡの５゛および／または３′非翻訳領域を保 持および使用することができる。ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタ ンパクのゲノムＤＮＡは、当業者に既知の方法（例えば、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｓ、Ｌ、　Ｂｅ ｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ６．　ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１ ９８７）参照）によって、ヒト染色体１０を含有しているいずれかの細胞から抽 出および精製することができる。

また、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクのｍＲＮＡは、当業 者に既知の方法（例えば、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｓ、Ｌ、　Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅ ｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８７）参照）によって、ヒト 分泌顆粒グロテオグリカンを産生または発現するいずれかの細胞から単離し、ｃ ＤＮＡを製造するために使用することができる。使用される目ＲＮＡＸ１ｌ製品 は、天然には大雪のタンパクを産生じている細胞から分離するか、またはイン・ ビトロではショ糖密度勾配遠心法の様な、ｍＲＮＡ調製品を特異的配列について 豊富にするために通常使用される方法、またはその両者によって、ヒト分泌顆粒 プロテオグリカンペプチドコアタンパクをコードしているｍＲＮＡが豊富とされ ることが好ましい。

ベクターにクローニングするために、この様な好適なりＮＡ調製品（ヒトゲノム ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）をそれぞれランダムに切断するか、または酵素的に切断 し、適切なベクターにライゲートして組換遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ ）ライブラリーを製造する。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクまたはその機能的誘導体を コードしているＤＮＡ配列を、ライゲートのための末端のプラント末端化および 付着端化、適切な末端を得るための制限酵素消化、適時付着端を充填すること、 望ましくない結合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、適当なりガ ーゼによるライゲーションを包含する常法に従ってＤＮＡベクターに挿入するこ とができる。この様な操作のための方法は、Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ、等、前 掲によって記載され、当業者に既知である。

ヒト分ｌ・顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパククローンを含有している ライブラリーをスクリーニングし、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア タンパククローンを、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクＤＮ Ａを特異的に選択する方法、例えばａ）このタンパクのＤ　Ｎ　Ａに特異的な配 列を含有している適当な核酸プローブとハイブリダイズさせるか、またはｂ）そ のクローンにハイブリダイズする天然のｍＲＮＡをイン・ビトロで翻訳させ、翻 訳産物を更に特性化する、ハイブリダイゼーションー選択翻訳分析、またはＣ） クローンされた遺伝子配列がｍＲＮＡを発現し得る場合、クローンを含有してい る宿主によって産生された翻訳されたヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコ アタンパク産物の免疫沈降によって識別することができる。

このタンパクに対するクローンを識別するために使用し得るヒト分泌顆粒プロテ オグリカンペプチドコアタンパクに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、タ ンパクのペプチドコアのアミノ酸配列を知ることによってデザインすることがで きる。ペプチドにおけるアミノ酸残基の配列は、本明細書では、その通常使用さ れる３文字表示法またはその１文字表示法によって表示される。これらの３文字 およ１文字表示のリストは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ 、＾、、　ｆｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　 （１９７０）の様な教則的書物に見いだすことができる。アミノ酸配列が水平に 記載されている場合、アミン末端は左端に存在するものとされ、カルボキシ末端 は右端に存在するものとされる。ペプチドにおけるアミノ酸残基は、ハイフンに よつて分離することができる。この様なハイフンは単に、配列の表示を理解し易 くすることを意図する。

遺伝子のコードは同義性を有するものであるため、個々のアミノ酸をコードする ために１以上のコドンを使用することができる（Ｖａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、、　Ｉ ｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　３ｒ ｄ　Ｅｄ、、　Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒ ｋ、　ＣＡ　（１９７７）、　ｐｐ、３５６−３５７）。ペプチドフラグメント を分析し、同義性の程度が最も低いオリゴヌクレオチドによってコードされるア ミノ酸配列を決める。これは、１コドンのみによってフードされるアミノ酸を含 有する配列を確認することによって行われるのが好ましい。

アミノ酸配列は時々、１個のオリゴヌクレオチド配列のみによってコードされ得 るが、アミノ酸配列はしばしば、同様のオリゴヌクレオチドの組のいずれかによ ってコードされ得る。重要なことには、この組のメンバーは全て、同じペプチド フラグメントをコードするオリゴヌクレオチド配列を含有し、従ってペプチドフ ラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含有し得るが、 この組の１個だけがこの遺伝子のエクソンをコードしている配列と同一のヌクレ オチド配列を含有する。この１個はこの組に存在し、この組のその他のメンバー の存在下でもＤＮＡにハイブリダイズし得るので、ペプチドをコードする遺伝子 をクローンするために、分別していない一組のオリゴヌクレオチドを、１個のオ リゴヌクレオチドを使用するのと同様にして使用することが可能である。

遺伝子コードを使用する時（Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、＋　Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　３ｒｄ　Ｅｄ、、　Ｔ、 Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９７ ７））、アミノ酸配列から、その各々がヒト分泌顆粒プロテオグリカンをフード し得るであろう１またはそれ以上の異なったオリゴヌクレオチドを識別すること ができる。個々のオリゴヌクレオチドは事実上、実際のヒト分節顆粒プロテオグ リカンコード配列を構成するであろうらしいことは、正常でない塩基対の結合お よび個々のコドンが真核細胞で実際に使用される（個々のアミノ酸をコードする ）頻度を考慮することによって評価し得る。この様な“コドン使用ルール”はＬ ａｔｈｅ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　１８３：１− １２　（１９８５）によって開示されている。Ｌａｔｈｅの“コドン使用ルール ”を使用する時、ヒト分泌顆粒プロテオグリカン配列をコードし得る理論上の“ 最も起こり得る”ヌクレオチド配列を含有する１個のオリゴヌクレオチド配列、 または１組のオリゴヌクレオチド配列が識別される。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク遺伝子のフラグメントをフ ードし得る（またはこの様なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組 に相補的な）好適なオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組を、当 業者に既知の方法（例えば、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＩＩＡ、　Ｓ、Ａ、Ｎａｒａｎｇ、　ｅｄ。

、　１９８７．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ Ａ）によって合成し、当業者に既知の方法によって、クローンされたヒト分泌顆 粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク遺伝子を識別し分離するためにプロー ブとして使用し得る。核酸のハイブリダイゼーションおよびクローンの識別の方 法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、（ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　ＣＩｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ｔ＋ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　ＮＹ　（１９ｇ２乃およびＨａｍｅｓ、Ｂ、Ｄ、、　 ｅｔ　ａｌ、　（Ｉｎ：　１ｌｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５））によって開示されており、本明細書の １部を構成する。次いで、この様なハイブリダイゼーションし得ることが見いだ された上記遺伝子ライブラリーのこれらのメンバーを分析し、これらが含有して いるヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクコード配列の程度およ び性質を調べる。

所望のヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクＤＮＡコード配列の 検出を容易にするために、上記ＤＮＡプローブを検出可能な基でラベルする。こ の様な検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有するいずれかの 物質とすることができる。

この様な物質は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で十分開発されており、通 常、この様な方法で有用な多くのいずれかのラベルを本発明に適用することがで きる。”Ｐ、’ＨＳＩ’Ｃ％　”Ｓ％　”’１等の様な放射活性なラベルがとり わけ有用である。適切なシグナルを提供し、十分な半減期を有するいずれかの放 射活性なラベルを使用することができる。オリゴヌクレオチドを、例えばＲｉｇ ｂｙ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１１３：２３７　（１９７７）に記 載された既知の方法で、“ニックトランスレーション”によって、および例えば Ｄｅｅｎ、に、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３５： ４５６　（１９８３）に記載されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼ置換合成法によって 、放射活性にラベルすることができる。

また、ビオチン、酵素または蛍光基の様な非放射活性マーカーでラベルする場合 、ポリヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼーションプローブとしても有用であ る。例えば、Ｌｅａｒｙ、Ｊ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０：４０４５　（１９８３）；　Ｒｅｎｚ、Ｍ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１２：３４３５　（１９ ８４）：およびＲｅｎｚ、Ｍ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：８１７　（１９８３）を 参照されたい。

即ち、要約すると、ヒト分泌顆坊ブロテオグリカンベブチド配列を実際に識別す ると、この様なペプチドをフードし得る理論上“最も可能な”ＤＮＡ配列、また は１組のこの様な配列の識別が可能となる。この理論上の配列に相補的なオリゴ ヌクレオチドを構築することによって（または“最も可能な”オリゴヌクレオチ ドの組に相補的なオリゴヌクレオチドの組を構築することによって）、ヒト分泌 顆粒プロテオグリカン遺伝子を含有しているクローンの識別および分離のための プローブとして機能し得るＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子の組）を得る。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカン遺伝子をクローニングする別法では、発現ベクタ ーを使用し、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンを発現し得る細胞から調製したＤＮ Ａまたはより好ましくはｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングすることによっ てライブラリーを製造する。次いで、このライブラリーを、例えばタンパクに対 する抗体でライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト分泌顆粒プロ テオグリカンペプチドコアタンパクを発現するメンバーにつイテスクリーニング する。

別の態様では、分泌顆粒プロテオグリカンペプチドファタンパクをコードしてい るヒトｃＤ　Ｎ　Ａまたはゲノム配列を識別するために、の関連プロテオグリカ ン、ｐＰＧ−１に対して前記ラット上２細胞由来のｃＤＮＡを使用する。別種で 発現された配列間でのミスマツチを考慮することが必要である場合、例えば、消 化されたヒトゲノムＤＮＡのサザノブ口、トを、低ストリンジェント下、ニック トランスレーションされたｐＰＧ−１またはｐＰ　Ｇ−Ｍ（ｐＰ　Ｇ　−１の４ ８９ｂｐ　５ｓｐｒ−３’末端フラグメントに特異的な遺伝子）、Ｔａｎｔｒａ ｖａｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾８ ３：９２０７　（１９８６）でプローブすることができる。

従って、上記の方法は、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクま たはこのタンパクのフラグメントをコードし得る遺伝子配列を識別することがで きる。この様な遺伝子配列を更に特性化し、組換タンパクを製造するためには、 これらの配列がコードするタンパクを発現させることが望ましい。この様な発現 は、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの特性を有するタンパクを発現するこれらの クローンを識別する。この様な特性にはとりわけ、ヒト分泌顆粒プロテオグリカ ン抗体への特異的結合能、ヒト分泌顆粒に結合し得る抗体の産生誘導能、受容細 胞へのヒト分記・顆粒プロテオグリカン関連機能付与能がある。

■、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンおよびその機能的誘導体の発現ヒト分１１顆 粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質を発現させるためには、適当な宿主 によって認識されうる転写および翻訳シグナルが必要である。上記の方法で得ら れた好ましくは２本鎖形の、クローンしたヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチ ドコアタンパク質をコードしている配列を、発現ベクター中の転写発現をコント ロールする配列に機能的に結合させ、原核性または真核性のどちらかの宿主細胞 中に導入して、組換えヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質ま たはその機能的誘導体を製造することができる。ヒト分泌顆粒プロテオグリカン ペプチドコアタンパク質をコードしている配列のどちらの鎖が転写発現をコント ロールする配列に機能的に結合しているかによって、ヒト分泌顆粒プロテオグリ カンペプチドコアタンパク質のアンチセンスＲＮＡまたはその機能的誘導体を発 現させることができる。

異なる宿主でのプロテオグリカンペプチドコアタンパク質の発現によって、プロ テオグリカンの性質を変えることもある翻訳後修飾が異なった結果になることが ある。本発明は、好ましくは真核細胞、特に哺乳動物、昆虫および酵母細胞中で のヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質またはその機能的誘導 体の発現を包含している。特に好ましい真核宿主はインビボまたは組織培養中の 哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は組換えプロテオグリカンペプチドコアタン パク質に翻訳後修飾を与えるが、これには天然のプロテオグリカンで見い出され る部位と同一かまたは類似の部位におけるグリコジル化および／または折り畳み が含まれる。最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞には、ラット−１線維芽細胞、 マウス骨髄由来の肥満細胞、牛ルステン肉腫ウィルスで永久化したマウス肥満細 胞、またはマウス線維芽細胞と同時培養された正常なマウス肥満細びＲｅｙｎｏ ｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、”キルステン肉腫ウィルスを生成する線維芽細胞と肺臓 細胞の同時培養による分化の複数段階におけるネズミの結合組織型肥満細胞の永 久化”、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３　：　１２７８３−１２７９ １（１９８８）コ（後記実施例５を参照）。

ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写調節情報を含む発現コントロール配列を含 有しているときにポリペプチドを「発現することができる」と言われ、このよう な配列はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に「機能的に結合」し ている。

機能的な結合とは、配列の発現を調節配列の影響下または支配下に置くように、 ある配列を調節配列（または配列群）に結合させる結合である。２つのＤＮＡ配 列（例えば、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質をコードし ている配列とこの暗号配列の５”末端に結合したプロモーター領域の配列）は、 プロモーター機能の誘導によってヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタ ンパク質をコードしている配列のｌｌｌＲＮＡが転写される結果になるとき、お よび２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異を導入す る結果にならず、（２）ヒト分泌顆粒プロテオグリカンのｍＲＮＡ、アンチセン スＲＮＡ、またはタンパク質を発現させる発現調節配列の能力を妨げず、あるい は（３）プロモーター領域配列によって転写されるヒト分泌顆粒プロテオグリカ ンの鋳型の能力を妨げないときに機能的に結合していると言われる。即ち、プロ モーター領域は、プロモーターがＤＮＡ配列を転写させることができるときに該 ＤＮＡ配列に機能的に結合している。

遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種あるいは細胞型に訳の開始にそれ ぞれ関与している５°非転写および５°非翻訳（非暗号）配列、例えばＴＡＴＡ ボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などを含んでいる。特に、このような５ °非転写コントロ一ル配列には、機能的に結合した遺伝子の転写コントロールの ためのプロモーターを含有する領域が含まれるであろう。

真核宿主中でのヒト分泌顆粒プロテオグリカンタンノくり質の発現は、そのよう な宿主中で機能する調節領域、好ましくは真核性の調び翻訳調節シグナルを、真 核細胞に感染するウィルス、例えばアデノウイルス、ウソ乳頭腫ウィルス、サル ウィルス、ヘルペスウィルスなどのゲノム配列から導くこともできる。これらの 調節シグナルは、宿主細胞において高レベルの発現が可能な特定の遺伝子と結合 しているのが好ましい。

転写が翻訳と関連していない真核生物においては、そのようなコントロール領域 は、クローンした配列がメチオニンを含有しているか否かによって、イニシエー ターのメチオニン（ＡＵＧ）コドンを与えるものであってもよいし、また与えな いものであってもよい。通常、このような領域には、宿主細胞においてＲＮＡの 合成を開始させるに十分なプロモーター領域が含まれるであろう。翻訳が可能な ｍＲＮＡ産物をコードしている異種の補乳動物遺伝子由来のプロモーターが好ま しく、特に、宿主細胞中でプロモーターとして機能するという条件のもとで、ア クチン、コラーゲン、ミオンンなどのプロモーターのような強力なプロモーター を用いることができる。好ましい真核性プロモーターには、マウスメタロチオネ インＩ遺伝子のプロモーターｒＨａ＋＋＋ｅｒ、　Ｄ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、 　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　Ｌ　：　２７３−２８８（１X ８２）］；ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター［ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　 、　Ｃｅ１ｌ　３１：　３５５−３６５（１９８２）ｌ］　；　Ｓ　Ｖ　４０初 期プロモーター［Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、　＋Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ ｏｎｄｏｎ）　２９０．３ｏ４−３１ｏ（ｘ９ｇ１）コ；酵母では酵母ｇａ１４ 遺伝子プロモーター［Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、　Ａ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　］、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７X ：　６９７１−６９７５（１９８２）　；　５ｉｌｖｅｒ、　Ｐ、　Ａ、　、　 ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　rｃｉ、　ＵＳＡ ８１　：　５９５１−５９５５（１９８４）］が含まれ、グルコース分解の遺伝 子プロモーターを用いることもできる。

広く知られているように、真核性−ＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードし ているコドンのところで開始される。このため、ヒト分泌顆粒プロテオグリカン ペプチドコアタンパク質またはその機能的誘導体をコードしているＤＮＡ配列と 真核性プロモーターの間の結合が、メチオニンをコードしつる介在コドンを全く 含まないことを確実にするのが好ましい。このようなコドンが存在すると、融合 タンパク質の生成（ＡＵＧフドンがヒト分泌顆粒プロテオグリカンをコードして いるＤＮＡ配列と同じリーディングフレーム内にあるとき）、またはフレームシ フト変異（ＡＵＧコドンがヒト分泌顆粒プロテオグリカンをコードしている配列 と同じリーディングフレーム内にないとき）が得られることになる。

所望なら、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンベブチドコアタンパク質の融合産物を 作成することもできる。例えば、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンベブチドファタ ンパク質をコードしている配列をソゲナル配列と結合させると、特定の宿主から のタンパク質の分泌、または特定の宿主中でのタンパク質の画分化力呵能になろ う。このようなシグナル配列を特定のプロテアーゼ部位を含むがまたは含まずに 設計して、シグナルペプチド配列の後の除去を容易にしてもよい。

別法では、このタンパク質の天然のシグナル配列を用いることもできる。

機能的に結合した遺伝子の発現を調節することができるように、抑制または活性 化が可能な転写開始調節シグナルを選択することができる。温度を変えることに よって発現を抑制または開始させることができる温度感受性である調節シグナル が重要であり、そして、例えば中間代謝物などの化学的調節にがける。また、ヒ ト分泌顆粒ブロテオグリカンペプチドファタンパク質のｍＲＮＡおよびアンチセ ンスＲＮＡの両方が転写可能な形態であるが異なるプロモーターまたは他の転写 調節要素を含んで与えられている構築物が重要であり、ヒト分泌顆粒プロテオグ リカンペプチドファタンパク質のｍＲＮＡ発現の誘導をアンチセンスＲＮＡ発現 の抑制によって行い、モして／またはヒト分泌顆粒プロテオグリカンベブチドフ ァタンパク質のｍＲＮＡ発現の抑制をアンチセンスＲＮＡ発現の誘導によって行 う。

翻訳シグナルは、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質のアン チセンスＲＮＡ配列を発現させることが所望であるときには必要ではない。

所望なら、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンベブチドコアタンパク質をコードして いる配列の３°の非転写および／または非翻訳領域を、上記のクローニング法に よって得ることができる。この３°非転写領域をその転写終止調節配列要素のた めに保持させることもできるし、３゛非紅訳領域をその翻訳終止調節配列要素の ために保持させることもできるし、また真核細胞中でポリアデニル化させる要素 のために保持させることもできる。天然の発現フントロール配列シグナルが宿主 細胞で満足に機能しないときには、この宿主細胞中で機能する配列を置換するこ とができる。

本発明のベクターは、他の機能的に結合した調節要素、例えばエンハンサ−配列 、または機能的に結合した遺伝子に組織もしくは細胞型特異的な発現を付与する ＤＮＡ要素をさらに含有させることもできる。

本発明のＤＮＡ構築物で哺乳動物細胞を形質転換するために多数のベクター系を 用いることができるが、これは、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタ ンパク質ＤＮＡ構築物を宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入するのが所望であるか 、または染色体外の形態で存在させるのが所望であるかによる。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカンＤＮＡをコードしている配列および機能的に結合 したプロモーターが、直線分子またはより好ましくは自律的に複製することがで きない閉じた共有環状分子のいずれかである非複製のＤＮＡ（またはＲＮＡ）分 子として受容真核細胞中に導入されたときには、ヒト分泌顆粒プロテオグリカン タンパク質の発現は導入された配列の一時的な発現によって起こるであろう。

好ましい態様では、遺伝的に安定な形質転換体をベクター系または形質転換系を 用いて作成し、それによってヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパ ク質ＤＮＡを宿主染色体中に組込む。

このような組込みは細胞内で初めから起こることもあるし、また最も好ましい態 様では、宿主染色体中に自身を機能的に挿入するベクターを用いる、例えばレト ロウィルスベクター、トランスポゾンまたは他のＤＮＡ要素（染色体中へのＤＮ Ａ配列の組込みを促進する）を用いる形質転換によって助けることもできる。所 望の遺伝子配列を哺乳動物宿主細胞染色体中に組込むことができるベクターを用 いる。

導入したＤＮＡをその染色体中に安定に組込んだ細胞は、染色体中に発現ベクタ ーを含有する宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーをも導入 することによって選択する。このマーカーは、例えば生物致死側耐性を与えるも のであってよい（抗生物質、銅のような重金属などへの耐性）。選択マーカー遺 伝子は、発現させようとするＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させることもできるし 、また同時トランスフ２クシコンによって同じ細胞中に導入することもできる。

別の態様では、導入した配列を、受容宿主中で自律的に複製することができるプ ラスミドまたはウィルスベクター中に導入する。以下に概略するように、多種多 様の任意のベクターをこの目的のために用いることができる。

特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には次のも のが含まれる：即ち、ベクターを含有する受容細胞を認識し、そしてベクターを 含有しない受容細胞から選択することが容易であること：特定の宿主に望ましい ベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復」させ うることが所望であるか否か、である。

好ましい真核性プラスミドには、ウシ乳頭腫ウィルス、ワタンニァウイルス、Ｓ Ｖ４０から導かれるもの、および酵母では２ミクロンの環を含有するプラスミド など、あるいはこれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当分野では 周知であり［Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　。

ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ、　１９　：　２６５− ２７４（１９８２）　；　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、”sｈｅ 靭旦ヨ〕Ｌμ立１ｏｇｙ　ｏｆ圧虹麺亜旦ハ三江ご圓１１Ｊ匡匡匹バ旦」剥Ｉｎ ｈｅｒｉｔａｎｃｅ″、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＢａｒｂＯｒｌ　ＮＹ＋　ｐ、４４５ −４７０（１９８１）　；　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　２８　： 　２０３−２０４（１９８２）@；　Ｂ ｏｌｌｏｎ、　Ｄ、　Ｐ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｈｅ ｍａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．１０　：　３９−４８（１９８O）　；　Ｍａｎ 入手することができる。例えば、クローンした遺伝子を発現させるためにＭＳＶ −ＬＴＲプロモーターを用い、そしてヘル／ｆ−ウィルスで同時トランスフェク ションしてプラスミドコピー数を増幅し、このプラスミドを宿主細胞の染色体中 に組込むことができる哺乳動構築物（群）を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発 現用に調製されたら、このＤＮＡ構築物（群）を種々の適当な手段（トランスフ ークンヨンを含む）のいずれかによって適当な宿主細胞中に導入する。

ベクターを導入した後、受容細胞を選択培地で増殖させ、これをベクター含有細 胞の増殖について選択する。クローンした遺伝子配列（群）の発現によってヒト 分泌顆粒プロテオグリカンベブチドコアタンパク質またはこのタンパク質のフラ グメントが産生される結果になる。この発現は、形質転換された細胞中で継続的 に、または制御下で、例えば形質転換細胞の分化の誘導（例えば、神経芽腫細胞 などへのプロモチオキ／ウラシルの投与による）に続く発現によって行うことが できる。

発現されたタンパク質を通常の条件、例えば抽出、沈澱、クロマトグラフィー、 アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などで単離および精製する。

上記の方法によって得られたヒト分泌顆粒プロテオグリカンＤＮＡをフードして いる配列は、定義によりヒト分記・顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク 質をコードしている配列、および次いでヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチド コアタンパク質アンチセンスＲＮＡ遺伝子配列を得るために用いることができる 配列を与えるであろう（このアンチセンスＲＮＡ配列が、ペプチドコアの１ＲＮ Ａを転写する鎖の反対側の鏡上に見い出される配列であるため）。また、このア ンチセンスＤＮＡ鎖を発現ベクター中のプロモーターに機能的に結合させて、こ のベクターによる形質転換によって、形質転換細胞中でヒト分泌顆粒プロテオグ リカンアンチセンスＲＮＡを発現させうる宿主を得ることもできる。アンチセン スＲＮＡおよびその発現を用いて、特異性の高い方法で分泌顆粒プロテオグリカ ンペプチドコア遺伝子の転写または翻訳を阻害または抑制するように、内生のヒ ト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用させる ことができる。遺伝子の発現をブロックするためにアンチセンスＲＮＡプローブ を使用することは、Ｌ　１ｅｈｔｅｎｓする抗体の作成および同定 以下の記述においては、免疫学分野の当業者には周知である種々の方法を参考に する。免疫学の全般的な原理を記載する標準的な参考文献には、Ｃａｔｔｙ、　 Ｄ、　［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ 、　Ｖｏｌ、　１゜ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９８ −８）コ　；　Ｋ　１ｅｉｎ、Ｊ　、［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　：　Ｔｈｅ　５ ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ−Ｎｏｎｃｅｌｌ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏ ｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）］　 ：　Ｋ　ｅｎｎｅｔｔ、　Ｒら［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａ１人ｎａｌｙｓｅｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

１、１３．　Ｂｕｒｄｏｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　、　ｅｄｓ、　）、　Ｅｌ ｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）コ；およびＥ　１ｓｅｎ、　 Ｈ、Ｎ　、　［＠ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３ｒｄ　Ｅｄ、　（Ｄａｖｉｓ、 　Ｂ、　Ｄ、　、　ｅｔ　ａｌ、　）、@Ｈａｒｐ ｅｒ　＆　Ｒｏｖｉ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８０）］の文献が含ま れる。

抗体は、それが分子と特異的に反応してそれによって分子を抗体と結合させるこ とがで、きるときに、分子を［結合することができる」と言われる。「エピトー プ」なる用語は、抗体によって認識され、結合されうるハブテンの部分を意味す る。抗原は１またはそれ以上のエピトープを有することができる。「抗原」とは 、この抗原のエピトープに結合しうる抗体を産生ずるように動物を誘導すること ができるものである。上記の特異的な反応とは、抗原が選択性の高い方法でその 対応する抗体と反応するが、他の抗原によって誘導される他の多数の抗体とは反 応しないことを示すものである。

本明細書で用いる「抗体（Ａｂ）ｊまたは「モノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｊな る用語は、抗原と結合することができる無傷の分子ならびにそのフラグメント［ 例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど］を包含するものとする 。ＦａｂおよびＦ　（ａｂ’　）＝フラグメントは、無傷抗体のＦｃフラグメン トを欠いており、より迅速に循環から浄化され、無傷抗体の非特異的な組織結合 が少ないことがある［Ｗａｈｌｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、２４　： 　３１６−３２５（１９８３）コ。

本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって調製される。例えば、ヒト分泌 顆粒プロテオグリカンペプチドコアタン７＜り質またはそのフラグメントを発現 している細胞を動物に投与し、ヒト分泌ｍ　粒プロテオグリカンと結合すること ができるポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導することができる。好 ましい方法では、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質のフラ グメントを化学的に合成し、ＨＰＬＣによって精製して不純物を実質的に含まな いようにする。次いで、このような調製物を動物に導入して特異活性の高いポリ クローナル抗血清を生産させる。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ法を用いて製造することが法には、ヒト分 泌顆粒プロテオグリカン抗原を用いて動物を免疫することが含まれる。このよう な動物の肺臓細胞を取り出し、適当な骨髄腫セルラインと融合させる。任意の適 当な骨髄腫セルラインを本発明に従って用いることができる。しかし、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能な永久骨髄腫セルライン（Ｓ、Ｐ、Ｏ） を用いるのが好ましい。融合の後、Ｗ　ａ　ｎｄ　ｓ　。

Ｊ、Ｒ，ら［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８０　二２２５−２３２（１ ９８１）］の記載のようにして、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選 択的に維持し、次いで限界希釈法でクローンする。次いで、このような選択によ って得られたハイブリドーマ細胞を検定して、ヒト分泌顆粒プロテオグリカン抗 原と結合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。

上記方法を応用することによって、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンタンパク質の エピトープを認識する抗体を産生ずることができる別のセルラインを得ることが できる。

ヒトプロテオグリカンペプチドコアの高保存性および低保存性の両領域に対する 抗体は、正常および病的状態のヒト分泌顆粒プロテオグリカンの生合成および異 化作用の制御の研究に有用である。さらに、これらの抗体を臨床的に用いて、ヒ ト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパク質の発現が異常である病的状 態の進行をモニターすることができる。

以下に挙げる実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定 するものではない。

実施例１ 旦１．ヨＬ仄可すＮ込ゴヒ仁１うＪ二１２’ｉＲ：ｉｆｔ　＆　Ｕ玉！二辷二三 ２３５−前骨髄白血病細胞系ＨＬ−６０は、コンドロイチン硫酸ブロテオグＩＪ カンを合成し、それらのプロテオグリカンを分泌性顆粒１こ蓄える形質転換ヒト 細胞である。ある種のインビボ条件下、この細胞を、好中球、単核球、マクロフ ァージ、好酸球及び好塩基球ζ二類似する細胞に分化するよう誘導することがで きる。ＨＬ−６０細胞（ラインＣＣＬ２４０：アメリカン・イ・ソシニー・タイ プ・コレクション、ロックヴイル、メリーランド）をグアニジンインチオジオナ ート（ＢＲＬ、ゲイザースバーグ、メリーランド）の存在で溶解し、全ＲＮＡを チーブウィン等、バイオケミストリイ　１８　：　５２９４（１９７９）のＣ５ ＣＱ密度勾配遠心法の技術により精製した。オリゴ（ｄＴ）−セルロース（コラ ボラテイブ・リサーチ、ウィルサム、マサチューセッツ）クロマトグラフィー（ アヴイヴ、エッチ、及ヒレーター、ヒー、ブロク・ナトル・２アカド・スキ・ニ ーニスエイ　６９：１４０８（１９７２））により得たポリ（Ａ）”ＲＮＡをｃ ＤＮＡ（オカカジマ、エッチ、及ヒヘルク、ピー、モル・セル・パイオル２：１ ６１−１７０（１９８２）に移した。得られるｃＤＮＡは、Ｔ４　ＤＮＡポリメ ラーゼ（バイオラプス、ベヴアリイ、マサチューセッツ）、内部ＥｃｏＲ１部位 メチル化、及びＥｃｏＲＩポリ−リンカ−に連結するｃＤＮＡを伴う平滑断端で あった。セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）クロマトグラフィーによる７ ５００ｂｐのｃＤＮＡをＡ択Ｌ　ｃＤ　Ｎ　Ａを脱リン酸化λｇｔｌＱＤＮＡに 連結させた。エセリシア・フ１バＣ６００Ｈｆ１株）を、複雑度＞ｌＸｌ０’を 有するライブラリィ中に得られている、生じる組換えファージで感染した。ＨＬ −，６０細胞誘導ｃＤＮＡライブラリイを３７°ＣＴ［ａ−”Ｐ］ｄＣＴＰ（３ ０００Ｃｉ／＋ｎモル；ニュー・イングランド・ヌクレアー、ボストン、マサチ ューセノッ）ニックトランスレートしたｐＰＧ−１で、ハイブリッド形成緩衝液 （５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０，１５Ｍ　Ｎ５ｃＱ７１５ｍＭクエン酸 ナトリウム）、２×デンハーズ（Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）緩衝液、、　０　 、１　％　Ｆ’　テ’／　／ｌ／　Ｗ酸（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１００μ ｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ担体及び１０ｍＭリン酸ナトリウム）中、プローブした。

フィルターを３７°Ｃで、１．０Ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、 及び１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０の低厳格の条件下に洗浄した。ライ ブラリー中、はぼ５００．　ＯＯＯ組換体をプレートに塗布しクローン指名（ｄ ｅｓｉｇｎａｔｅｄ）ｃＤ　Ｎ　Ａ　−８４を分離した（図１）。ＨＬ−６０細 胞誘導ｃＤＮＡライブラリイ（−５０ｏ、ｏｏｏ組換体）をプローブとしてｃＤ ＮＡ−Ｈ４を用い再びスクリーンした。高厳格の条件（５５℃＋　０．２ｘＳＳ Ｃ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ及び］、ＯｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７，０）下、ＣＤＮＡ−Ｈ４とハイブリ、７ドした３０クローンをライブラリィ の二次スクリーニングから分離した。

個々のＨＬ−６０細胞誘導ｃＤＮＡ及びごれらのサブクローン断片をＭ１３＋＋ ＋ｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９（アマ−ジャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ ）に挿入し、サンガー等、プロシーディング・すＡ−Ｈ４の両鏡を配列した。シ ーフェンシング方法は図１に示す。

ＨＬ−６０ｉ導分泌性顆粒プロテオグリカンペプチドコアｃＤＮ、Ａの共通ヌク レオチド配列を図２に示す。

Ａ　２４９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−）ＥＣＯＲＩ断片は、ｃＤＮＡ−Ｈｌ　９のＥｃ ｏＲ■消化物から分離された。この断片（表１）のヌクレオチド配列は、ポリア デニル化部位（下線）及びポリ（Ａ）″テール（下線）が期待される配列を含む 。この断片は、このプロテオグリカンペプチドコアの遺伝子をフードするゲノム 断片にハイブリッド形成し、従って多分転写の最後の２４９ｂｐを表現する。

ＨＬ−６０分泌性顆粒プロテオグリカンのペプチドコアをコードするｃＤＮＡの ３゛末端の共通ヌクレオチド配列（アヴラハム等、プロシーディング・ナショナ ル・アカテミイ・サブ・サイエンス・ユーエスコニイ、８６　：　３７６３−３ ７６７（１９８９乃。

ＧＡＡＴＴＣＴＴＭ−ＡＧＧＡＴｒＡＴＧＣ−ＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧ　−ＴＴＡ ＴＣＴＡＴＣＴ−ＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴ−ＧＡＡＡＡＴＡＣbＴ　− ＧＣＡＴｒＴＩＴＴＧ　−ＧＴＡＴＣＡＴＧＴＴ−ＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴ　−Ｃ ＡＴＴＡＴＧＡＭ　−ＴＴＡＡＴＴＡＧＡＴ−ＴＣＣＣＡＴfＧＣＣ− ＡＴＡＡＭＴＧＧＣ−ＴＴＴＡＡＡＧＭＴ−ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ−ＴＴＴＴＡ ＡＡＧＴＡ−ＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧ　−ＣＡＡＡＴＴＧＧＣ`　− ＧＧＴＡＡＴＡＴＴＴ−ＣＡＴＡＣＣＴＡＡＡ−ＴＴＡＡＧＡＣＴＣＴ−ＧＡＣ ＴｒＧＧＡＴＴ　−ＧＴＧＭＴＴＡＴＡ−ＡＴＧＡＴＡＴＧbＣ− ＣＣＴＴＴｒＣＴＴＡ−ＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡ−ＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡ−Ｔ実施 例２ ト遺伝子の染色体局在用に、５つの異なるヒト／マウス（線１３Ｃ２，２４Ｂｓ 、１７１１．４６２ＴＧ及び１７５）並びに１２の異なるヒト／ハムスター（線 ３５Ａ２．３５Ａ４．３５Ｂ５．３５Ｃ１，３５Ｄ３．３５Ｄ５．３５Ｅ４．３ ５Ｆ１．３５Ｆ３．８９Ｅ５及び９５Ａ４）体細胞ハイブリッドをＢａｍＨＩで 分解した。得られる断片をアガロースゲル電気泳動により解明し、ＤＮＡプロッ トを、プローブとしてｃＤＮＡ−８４を用いる高厳格の条件下分析した。ＣＤ　 Ｎ　Ａ−８４プローブの各ヒト染色体へのバーセント不一致は表Ｈに記載される ように決定した。○、ＯＯの一致しないフラクションは、ＨＬ−６０の細胞中、 分泌性顆粒プロテオグリカンペプチドコア遺伝子が染色体１０に位置しているこ とを示す。

表■ ヒト／ｌｉ歯類体細胞ハイブリッドからのＤＮＡによるｃＤＮＡ−Ｈ４の分離様 式 異ナルヒト／ハムスター及びヒト／マウス体細胞ｌ＼イブ１ルノド細胞系並びに 対照からのＤＮＡをｃＤＮＡ−Ｈ４へのそのノ〜イブリ、２ド形成について分析 した。カラム名称は、＋／＋、ｃＤＮＡ／ｅＤＮＡ−Ｈ４へのハイブリ・ノド形 成と染色体のいずれもあり、−／−１ｃＤＮＡ−Ｈ４へのハイブリッド形成と染 色体ともになし、十／−、ハイブリッド形成はあるが染色体はなし、そして−／ ＋、ノーイブ１ル。

ド形成はないが染色体はある。各染色体の一致しないフラクションの計算用に、 ＋／−及び−／十欄の和を＋／十、−／−１十／−及び−／−欄の和で割る。１ ９ｑ＋部門は、２つの異なるＸ／１９転位キャリヤーからの白血球による溶解か ら誘導されたノ＼イブリ、ドクローンのｄｅｒ１９転位染色体を示す。Ｘ及びＸ ｑ一部門は、未処理のＸ及びｄｅｒＸ転位染色体を示す。ブランス等、／　（イ オケム・ジエ不　）　ト　−１７川　０３　１−１０５９（１９７９）。

実施例３ 分泌顆粒プロテオグリカン類および関連タンパクをコードしているヒトゲノムの ヌクレオチド配列の同定ラット上２セル誘導ｃ　ＤＮＡ、ｐ　ＰＧ　−１（Ｂｏ ｕｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１３２２（１ ９８５）に開示）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡのＢａｍ旧消化物からの分泌顆粒 プロテオグリカンペプチドファタンパクをコードするゲノム断片を同定した。

ＤＮＡプロットがｐｐｃ−１またはｐＰＧ−Ｍにより高厳密性の条件下でプロー ブされたときまたはｐＰＧ−Ｍにより低厳密性の条件下でプローブされたときに はいかなるハイブリダイゼーションも生じなかったが、ｐＰＧ−１により低厳密 性の条件下でプローブされたときには少なくとも１０個のＤＮＡ断片が観察され た。検出された多数のＤＮＡ断片は、Ｌ２セルプロテオグリカンペプチドのセリ ン−グリシン反復領域をコードする反復配列に類似する反復配列を持ったマルチ −遺伝子ファミリーがヒトに存在することを示唆する。

実施例４ ヒト分泌顆粒プロテオグリカンベブチドファ遺伝子の単離と特性化 ＨＬ−６０セル誘導プロテオグリカンｃ　ＤＮＡ、ｃ　ＤＮＡ　−Ｈ４のサブク ローン断片を［α−”Ｐ］ｄ　ＣＴ　Ｐ　（３Ｇ（１０Ｃ４／ｍｍｏｌ；ＤｕＰ ｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）で放射標識し、ニックトラ ンスレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈｓｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ１０９−１１４（１９８５） ）またはランダムブライミング（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、 、　１ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ　１６５：２２４−２２９（１９８３））によ り特異的活性＞１０”　ｃｐｍ／ｌ１９とし、次いでＥＭＢＬ３ヒトゲノムライ ブラリーにおいて（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、＋ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６５：１０９５−１１１２　（１９８７））、プラーク／ Ｘイブリダイゼーションにより〜１０６の組換体をスクリーニングした。

ニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍり を４２℃において５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ　ＮａＣ６，７５ｍＭクエン 酸ナトリウム、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔバッファー、０．１％ＳＤＳ、　１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、１００μ９／ｌサーモン精子ＤＮＡキヤリヤーおよび１０ＩＩＩＭ リン酸ナトリウム中でプローブした。ニトロセルロースフィルターを５５°Ｃに おいて３０　ｍＭＮａｃ４．３ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、　１ ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）で洗浄した。

全長６５０塩基対（ｂｐ）ＨＬ−６０セル誘導ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ−Ｈ４を用い て、若干の独立クローンを得た。しかし遺伝子の５″フランキング領域の良好な 代表物を得るために、ｃ　ＤＮＡ−Ｈ４の１３６ｂｐ５°→Ｋｐｎ　Ｉフラグメ ントを用いてヒトゲノムライブラリーの再度スクリーニングを行い、更に２個の クローンを単離した。クローンの制限地図はそのＤＮＡのサンプルをそれぞれＡ ｃｃｌ、　ＢａｍＨＩ、　ＥｃｏＲＩ、　ＨｉｎｄＩ！Ｉ、　Ｋｐｎｌまたは５ ａｌＩ　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ ）と共に培養することによって決定した。消化物は１％アガロースゲル中で電気 泳動し、分離したＤＮＡ断片はナイトラン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　 ５ｃｈｕｅｌｌ。

Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、　９８：５０３−５１７　（１９７５））に移した。得られたＤ　Ｎ　Ａプ ロットをｃＤＮＡ−８４の特異性５’　（５’　→Ｋｐｎ　Ｉおよび５°→Ｘｍ ｎＴ）および３′（λｍｎｌ→３’およびＡｃｅＩ→３′）断片でプローブした 。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカン遺伝子のヌクレオチド配列分析 ヒトゲノム断片を二重酵素分極シジットガン連結反応を用いてブルースクリプト （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）プラスミドベクターに サブクローンし、組換効率を改善し、サブクローンの配向を維持する（Ｋｕｒｔ ｚ、　Ｄ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１３：１４５−１５２　（１９８ ０））。組換形質転換体をコロニーハイブリダイゼーションによって同定し、フ ァージクローンに対して上に使用したのと同様の方法によって制限地図化を行っ た。２本鎖ＤＮＡ配列の決定（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７４：５４６３−５４６７　（ １９７７））　：　Ｚｈａｎｇ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒ ｅＳ、　１５：１２２０−１２２７ｔｅｄ、　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｅａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）および［α−５５Ｓ］ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ 　（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　：　Ａｍｅｒｃｈａｍ）を用いて、プラスミドサ ブクローンについて直接行った。ユニバーサルオリゴヌクレオチドブライ？−（ ＳＫ、　ＫＳ、　Ｔ３．　Ｔ７およびＭ１３　ｒｅｖ　：　Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）を用いて、各サブクローン断片における最初と最後の３００ヌクレオチド配 列を決定した。ゲノム断片のセンス鎖（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）とアンチセ ンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）のヌクレオチド配列に基づいて、 各１８ヌクレオチドの長さを有する二つのオリゴヌクレオチドをＨａｒｖａｒｄ 　Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

ＭＡにあるＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０オリゴヌクレオチド シンセサイザー上で合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして 使用して、二重鎖のＤＮＡの各方向における次の２００〜２５０ヌクレオチドの 連続ヌクレオチド配列を決定した。ｃＤＮＡの異なった領域に相補的な付加的オ リゴヌクレオチドをプライマーとして使用して両方向におけるエクソンからの配 列の延長を行った。ヌクレオチド配列データを、カルテノクモレキニラーバイオ ロジーソフトウエアパ、ケージを使用して、ＩＢＭ−ＰＣに入れ、編集した。デ ータベースサーチおよびマウス分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア遺伝子お よび他の遺伝子との相同性の比較は、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ所在のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅにあるコンピュータを使用して行った。

ヒトゲノムライブラリーを全長６５０ｂｐのｃＤＮＡ−Ｈ４プローブを用いてス クリーニングした場合、６つの独立クローンが分離された（λＨＧ−ＰＧＩない しλ）ＩＧ−ＰＣ６と番号を付けた）。これラックローンの制限地図化は、６つ のクローン全＃）＜５’　１２　ｋｂＥｃｏＲＩ　−＋　ＥｃｏＲＩ断片に欠け 、ｃＤＮＡ−Ｈ４の１３６ｂｐ　５’→Ｋｐｎ■断片にハイブリダイズしなかっ た。ゲノムライブラリーをＣＤＮＡ　Ｈ４の５′断片で再スクリーニングしたと ころ、それぞれλＨＧ−ＰＧ７およびλＨＧ−ＰＧ８と名付けられた二つの付加 的クローンを単離した。制限地図化による分析により、クローンλＨＧ−ＰＧ６ 、λＨＧ−ＰＧ７およびλＨＧ−ＰＧ８は、重複するゲノム配列を含むことが判 明したが、これは−緒にしたとき、ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア をコードする全長遺伝子を含んでいる。

これらのサブクローンの詳細な制限地図化によって、この遺伝子は少なくとも１ ５ｋｂであって、３エクソンを有することが明らかとなった。第１と第２のエク ソンの間には約８ｋｂのイントロンがあり、第２と茅３のエクソンの開には約６ ｋｂイントロンが存在する。両イントロンはヌクレオチド配列“ＧＴＡＡＧ″で 始まり、配列″ＣＡＧ”で終わっている。この遺伝子のヌクレオチド配列の解析 により、エクソン１はｍＲＮＡ転写の５゛非翻訳領域と翻訳分子の全長２７アミ ノ酸疎水性シグナルペプチドをコードする。エクソン２は、ペプチドコアの４９ アミノ酸部分くアミノ酸残基２８〜７６）をフードし、この部分は疎水性シグナ ルペプチドが小胞体中で除去された後分子のＮ末端になるものと考えられる。エ クソン３　（６３４ｂｐ）は最大のエクソンであって、翻訳分子の残りの８２ア ミノ酸とｍＲＮＡ転写の全長３′非翻訳領域をフードする。上記８２アミノ酸は 、１７アミノ酸配列（残基７７〜９３）をフードし、これはセリン−グリシン富 化グリコサミノグリカン付加領域、１８アミノ酸セリン−グリシン富化領域（残 基９４〜１１１）および翻訳分子のＣ末端（残基１１２〜１５８）と続く。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア遺伝子の転写開始サイトの決定 Ｓ１ヌクレア一ゼマツピング分析により、ＨＬ−６０セルの分泌顆粒プロテオグ リカンのペプチドコアをコードするヒト遺伝子の転写開始サイトの同定を行った 。ゲノムクローンλＨＧ−ＰＣ７の４ｋｂＳａｌＴ→旧ｎｄＩＩｌ断片はブルー スクリプトにサブクローンされた（ｐＢ５ｓＨ３と命名）。オリゴヌクレオチド （５°→ＡＣＴＧＣＡＴＴＴＧＡＧＴＡＧＣＴＴ→３゛）は、ｃＤＮＡ−Ｈ４の アンチセンス鎖の残基３９〜５９に対応するものが合成された。このオリゴヌク レオチドのＩｏｎ　ｇをアルカリ変成ｐＢ５ｓＨ３の４μ２にハイブリダイズし 、ＤＮＡの相補的鎖を［α−”Ｐ］　ｄＡＴＰで標識した以外は上記に類似した 条件下で合成した。４００ｂｐアンチセンスＤＮＡプローブを、合成品の８Ｍウ レア／８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分離した。一本鎖放射標 識ＤＮＡ断片をオートラヂオグラフィーで同定し、電気溶出し、エタノール沈澱 させた。放射標識ＤＮＡ断片の標品５０．０００ｅｐｍを、ＨＬ−６０セル誘導 全ＲＮＡ　（Ｃｈｉｒｇｉｎ、　Ｊ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ１８：５２９４−５２９９（１９７９））〜１５μ９またはＨＬ−６０セ ル誘導ポリ（Ａ）’ＲＮＡ　（Ａｖｉｖ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９：１４０８−１４１２（１９７２） ）　１　Ｈ９に、８０％ホルムアミド、４００ｍＭ　ＮａＣｌ２、ＩｍＭＥＤＴ Ａおよび４０ｍＭ　Ｐｉｐｅｓ　（ｐＨ６，４）中で４８℃において１６時間／ ＼イブリダイズさせる。３”Ｐ−ＤＮＡ／ＲＮＡバイブリドをＳｌヌクレアーゼ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　１００単位と６０分間培養した。反応終了後、標品を フェノールで抽出し、−８０°Ｃでエタノール沈澱させた。ＩｍＭＥＤＴＡと１ ０ｍＭ　丁ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐｌ’１８．ｏ）　３ｕＱとホルムアミドロー ディングバッファー４ｕＱを沈澱した標品に加えた。

標品を沸騰させ、８Ｍウレア／８％ポリアクリルアミドシーケンシングゲル上に 、３ｆｆｐ標識ｐ　Ｂ　Ｒ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂＳ） のＭ　ｓ　ｐ　Ｉ消化物と同一オリゴヌクレオチドでプライムしたｐＢＳＨ３の シーケンンングラダーと共に負荷させた。二つのネガティブコントロールに対し 、Ｓ１ヌクレア一ゼ反応がｔＲＮＡ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｌａｂｓ）またはＭＢＢＣ（Ｒａｚｉｎ、　Ｅ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｔ　２５７：７２２９−７２３６（１９ｇ２））全ＲＮ　Ａ　Ｌ５ｕ９と 共に並行して行われた。

ＨＬ−６０セル誘導全ＲＮ　Ａポリ（Ａ）”ＲＮＡは、プローブの〜８２ヌクレ オチドをＳｌヌクレアーゼによる分解から保護した。

従って、この遺伝子に対するＨＬ−６０セルの推定転写開始サイトは転写開始サ イトの５３ｂｐアツプストリームにあるものと結論された。１Ｐ標識５“アンチ センス４００ｂｐＤ　Ｎ　Ａ断片は、Ｓ１ヌクレアーゼとの接触に先立ってｔＲ ＮＡやマウスマストセルＲＮＡと培養した場合には、保護されない。ＨＬ−６０ セルにおけるこの推定転写開始サイトは、８ＭＭＣ誘導マストセルや好塩基性す ウケミアセル（Ｂｏｕｒｄｏｎ、　Ｍ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、７：３３−４０　（１９８７））で発現するが、ラット上２卵黄 嚢悪性細胞（Ｂｏｕｒｄｏｎ、　Ｍ、＾、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、　７：３３−４０　（１９８７））では発現しない類似の遺伝子の 推定転写開始サイトに対応している。

第３図はヒト遺伝子の制限地図である。第４図はフランキングとイントロン配列 を含むヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクをコードする遺伝子 のヌクレオチド配列である。

マウス遺伝子のクローニング マウス分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクをコードする遺伝子を含 む１５ｋｂマウスゲノム断片を、上記した方法を用いてマウス分泌顆粒プロテオ グリカンのペプチドコアをコードするＢＭＭＣｃＤＮＡ　（ｃＤＮＡ−Ｍ６）の ［α、ｓａｐ］ｄＣＴＰ標識４５０ｂｐ　Ａｃｅ　Ｉ→３′遺伝子特異性断片の 使用により、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス肝ＤＮＡの５ａｕ３ＡＩ消化物（Ａ ｖｒａｈａｍ、　Ｓ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：３ ７６３−３７６７　（１９８９））から誘導されたマウスゲノムライブラリーを スクリーニングすることにより、クローニングされた。この遺伝子のヌクレオチ ド配列と推定アミノ酸配列を第５図に示す。

ヒト遺伝子またはマウス遺伝子のいずれも、その転写開始サイトの〜３０ｂｐア ップストリームに古典的なＴＡＴＡボックス（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ、　Ｒ，ｅ ｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５０：３４９−３８３（１ ９８１））またはＧＣ−富化エレメント（Ｓｅｈｇａｌ、＾、ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　８：３１６０−３１８７　（１９８８））を有 していなイ。従ッテ、造血セル中で発現される分泌顆粒プロテオグリカンペプチ ドコア遺伝子は、異常なプロモータを有しているものと思われる。他のヒトプロ テオグリカンペプチドコア遺伝子についての５°フランキング領域については、 これまで記載がないので、他のプロテオグリカンペプチドコアをコードする遺伝 子との比較は出来なかった。しかしながら、他の遺伝子に対する若干の既知ｃｉ ｓ作用制限エレメントに一致するヒトおよびマウス分泌顆粒プロテオグリカンペ プチドコア遺伝子のこれら５゛フランキング領域内に若干のヌクレオチド配列が 存在する。重要なことは、ヒト（残基−１ないし−１１９）遺伝子とマウス（残 基−１ないし−１２５）遺伝子の転写開始サイトの１１９ｂｐヌクレオチド配列 アップストリームに存在するヌクレオチドの９６％が同一であると言う発見であ る。

この一致の程度は、これら二つの種の遺伝子のエクソン内の他の１１９ｂｐ領域 を比較した場合に得られる程度を太き（上回るものであり、重要なｃｉｓ作用制 限エレメントがこの保存されたヌクレオチド領域に存在することを示唆するもの である。

実施例５ ラット−１繊維芽細胞のマウス分泌プロテオグリカンペプチドコア遺伝子による トランスフェクションフィッシャーラット−１繊維芽細胞を、１０％ウシ胎児血 清、２ｍ１ｊ　Ｌ−グルタミン、ペニシリン１００Ｕ／ｘ（ｉおよびストレプト マイシン１００μｇ／ｘＱを補充したダルベコの修飾基本培地（ＤＭＥ　Ｍ　） 中、５％ＣＯ，ａ気雰囲気中３７°Ｃにおいて生育させた。

ＤＮＡＮトコンスフェクションを、本質的にこれまで記載されたと同様に行った （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌｎ、Ｇ ｅｎ１：３２７−３４１（１９８２））。簡単に述べれば、３−４Ｘ１０’ラッ ト−１繊維芽細胞を、マウスゲノムクローンλＭＧ−ＰＧ　１　と選択性、’− カーｐｓｖ２ネオでフトランスフェクションする前に、１２〜２４時間にわたり ＤＭＥＭを含む１０ｃｒＡプラスチ・ツク培養皿に置いた。

気泡の存在下、λＭＧ−ＰＧＩＤＮＡ５ｕ９とｐｓｖ２ネｔ　Ｏ，５ｕ９を含む リン酸カルシウムの２５０ｍＭ溶液０．　ＳｚＱを２８０＋ｎＭ　ＮａＣＱ、　 １０ｍＭＫＣｆ２．１２＋ｎＭデキストローズ、１．５ｍＭリン酸ナトリウムお よび５ｈ＋Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，１）の０．５ｘｌ！に滴下するこ とによって、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿物を生成せしめる。３０分間培養後 、生成した沈殿物を、繊維芽細胞の培養皿に加え、１０〜１８時間後、ＤＮＡ沈 殿物を除去した。トランスフェクションされたセルを生育媒地で２回洗浄し、こ れを回収してから２４時間後にトリプシンで処理し、１：６の比で分割させた。

得られた繊維芽細胞を新しいｌｏａｍプラスチック皿に置き、ゲンタマイシン（ Ｇｉｂｃｏ）　５００μ９／ｘＱを含むＤＭＥＭ中で２〜３週間培養した。培地 は細胞のゲンタマイシン抵抗コロニーを個別にクローニングシリンダーで拾いあ げ、１００μｇ／ｌ１ｌＩ２ゲンタマイシンを含む培地中でセルラインとして生 育させた。

マウスプロテオグリカン遺伝子でトランスフェクションされたラット−１繊維芽 細胞のＲＮＡおよびＤＮＡプロット分析全ＲＮＡを、グアニジニウムチオシアネ ート法（Ｃｈｉｒｇｉｎ、　Ｊ。

Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９４−５２９９（ １９７９）　；　Ｇ１１ｓｉｎ、　Ｖ、ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１３：　２６３３−２６３７（１９７４））により、マウスＢＭＭＣ，ラッ トー１繊維芽細胞およびトランスフェクションされたラット−１繊維芽細胞から 調製した。ＲＮＡ（５μ９／レーン）を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル で電気泳動し、ゼタバインド（Ｔｈｏ＋ｎａｓ、　Ｐ、Ｓ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：５２０１−５２０５（１９８０）） に移された。得られたＲＮＡプロットを、ｃＤＮＡ−Ｍ６の放射標識ＡＣｃＩ→ ３′断片を含むハイブゾダイゼーションバソファー中、２４時間にわたり４２℃ で培養した。プロ。

トを高厳密性条件下に洗浄し、オートラジオグラフィを行った。

プロットからプロテオグリカンペプチドコアプローブを高温洗浄で除去し、プロ ットをアクチンｃＤＮＡでリブローブして各レーンで負荷されたｍＲＮＡを定量 した。

ＤＮＡをマウス肝臓、ラット肝臓、ラッ）−１繊維芽細胞およびトランスフェク ションされたラット−１繊維芽細胞から単離しくＢ１１ｎ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、、 ｈｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、３：２３０３−２３０１１１（１９７６） ）、標品をそれぞれＸｍｎ　Ｉ　ＳＢａｍＨＩ　ＳＢｇｌ　ＩＩ、Ｓｓｐ　Ｉ　 ５Ｓａｕ３Ａ　Ｉ、ＨｉｎｄＩ［ＩまたはＥｃｏｒ　Ｉで３７℃において４時間 にわたり消化させた（１０μｇ／消化）。断片をアガロースゲル電気泳動によっ て分解性条件下にマウスｃＤＮＡ−Ｍ６のＡｃｅ　Ｉ→３′断片をプローブとし てハイブリダイゼーション分析した。

トランスフェクションされたラット−１繊維芽細胞中におけるマウス分泌顆粒プ ロテオグリカンのペプチドコアをコードしているマウス遺伝子の発現 λＭＧ−ＰＣＩが、そのプロモータ領域を含み、全マウス分泌顆粒プロテオグリ カンペプチドコア遺伝子を含んでいること、およびこのマウスゲノムクローンが 他の哺乳動物セル内で発現されることを証明するため、ラット−１繊維芽細胞を λＭＧ−、ＰＧｌおよびプラスミドｐｓｖ２ネオによってコードされた優性ネオ 抵抗選択性マーカーによってコトランスフェクションされた。ネオ抵抗トランス フェクションされたラット−１繊維芽細胞の１７個の独立クローンを単離し、そ れぞれ伸長させた。

全ＲＮＡをＢＭＭＣ，ネオトランスフェクションされたラット−１繊維芽細胞お よびコトランスフェクションされたラット−１繊維芽細胞セルラインから単離し た。

遺伝子−特異性分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアプローブは、非トランス フェクション繊維芽細胞のＲＮＡプロット中で、転写物にハイブリダイズさせる ことが出来なかった。しかしながら、マウスＢＭＭＣ中およびコトランスフェク ションされたラット−１繊維芽細胞セルラインの二つの中で１．０ｋｂＲＮＡに ハイブリダイズさせることが出来た。トランスフェクションされた繊維芽細胞か らのＲＮＡを使用して、ブライマーエクステンション分析を行い、転写開始サイ トを決定した。トランスフェクションされたセルからのＲＮＡをＲＮＡ鋳型とし て使用したとき、−８０ヌクレオチドはｃＤＮＡ−Ｍ６の残基７８〜９８に対応 するオリゴヌクレオチドブライマーの上に伸長され、−１００ヌクレオチドの長 さを持ったＤＮＡ生成物が得られた。

ｃＤＮＡ−Ｍ６の残基３９〜５９に対応する別のプライマーをア。

セイ中で用いたとき、−６０ヌクレオチドのＤＮＡ生成物が得られた。

ゲノムＤＮＡをトランスフェクションされたラット−１繊維芽細胞の上記二つの クローンから作成し、ＢｇｌＩｒ、Ｘｍｎ１．５ａｌＩまたはＢａｍＨＩで消化 した。消化物のＤＮＡプロットをｃ　ＤＮＡ−Ｍ６のＡｃｃ　Ｉ→３′遺伝子特 異性断片でプローブし、これらのトランスフェクションされたラット−１繊維芽 細胞セルラインがマウスプロテオグリカンゲノム配列中に含まれていることを証 明した。マウスプロテオグリカンプローブは、マウス化ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化 物中に存在する２、　７ｋｂ断片およびうｙ）肝臓ＤＮＡとう・バー１繊維芽細 胞ＤＮＡの両者のＢｇｌＩ消化物中に存在する７、　５ｋｂ断片にハイブリダイ ズした。トランスフェクションされた繊維芽細胞は、２．７ｋｂおよび７．５ｋ ｂＤ　Ｎ　Ａ断片を含んでいる点で、非トランスフェクシぢンラソト〜ｌ繊維芽 細胞とは興なっている。遺伝子特異性プローブが等量のマウス肝臓ＤＮＡと繊維 芽細胞ＤＮＡのＢｇｌＩ［消化物中に存在する２、　７ｋｂ断片にハイブリダイ ズする相対的強度に基づいて、繊維芽細胞セルラインは、それぞれ１０〜２０個 および２〜３個のマウス分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコア遺伝子がそのゲ ノムの中へ取り入れられてよい。

トランスフェクションは、チャイニーズハムスター卵巣細胞の中で、デフリンと 称される繊維芽細胞誘導デルマタンサルフェートブロテオグソカンのペプチドコ アをコードしているｃＤＮＡにより行われる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、　Ｙ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３６：２４４−２４６　（１９８ｇ））。また 、ＣＯ５−７セルの中で、Ｉａと関連するＴ細胞銹導不変鎖プロテオグリカンの ペプチドコアをコードしているｃＤＮＡにより行われる（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：１３５９−１３６３（１９８８））。しか しながら、全プロテオグリカンペプチドコア遺伝子を含むゲノムクローンを用い たトランスフェクションはこれまで報告されていない。

実施例６ 自然ＨＬ−６０分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクを認識するアミ ノ酸コンセンサス配列のペプチドに対する抗体の製造 １６アミノ酸ペプチド０２　［Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇコを化学的に合成し、ヘモシアニンに結合させ、ニュウジーランドホ ワイトラビットに注射した。このペプチドは、翻訳分子の残基６４〜７９に対応 し、セリン−グリシン富化グツコサミノグリカン付加領域に先行するコアの領域 である。

ヒト分泌顆粒プロテオグリカンのペプチドコアタンパクを特異的に認識する抗体 の誘導は次のようにしてテストされた。ペプチド（３ｊＩ９）を０．２５％グル カールアルデヒドの存在子牛−ホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ）　 ５ｘｇと結合させ、ポリクローナル抗体をユニつジーランドホワイトラビット中 標準免疫法により結合ペプチドまで上昇させた。全血清中の抗体タイターは酵素 結合免疫吸着剤分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。

各ミクロタイターウェルは、ホスフェートバッファー食塩水中合成ペプチド１μ ９を用いて４℃で一夜培養した。ウェル中の残存タンパク結合サイトを１％（Ｖ ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）で１時間培養することによってフロッ クした後、ウェルを１％（ｗ／ｖ）　Ｔｖｅｅｎ２０含有ホスフェートバッファ ー食塩水で洗浄した。ホスフェートバッファー食塩水で連続的に希釈したウサギ 血清を加え、更にセイヨウワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（ Ｂｉｏ−ｒａｄ、　ＲｉｃｂＩＩｌｏｎｄ、　ＣＡ）を加えた。その後ウェルを ２，２′−アジノージ［３−エチルーベンズチアジンンスルホネートコ染料（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、１ｎｄｉａｎａＰｏｌｉｓ、ＩＮ）を 加えて比色法で分析した。ｃＤＮＡ−８４の推定アミノ酸の残基２４〜３９に対 応するペプチド０１（Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−ＧＩｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−丁ｙｒ−Ｇ１ｎ−Ｔｒｐ−１ａｌ−Ａｒ ｇ）を合成し、ＥＬＩＳＡで使用して、ウサギ血清の特異性を確認した。アンチ −ペプチドＩｇＧを硫酸アンモニウム沈殿法およびイオン交換クロマトグラフィ によって部分的に精製した。

アンチ−ペプチドＩｇＧ　（−３０μｇ）をタンパクＡ−セファロースビーズ（ Ｓｉｇｍａ）のＲＩＰＡバッファー中の１５％（Ｗ／Ｖ）懸濁液１００μａと共 に室温で１時間培養した。得られたタンパクＡ−セファロース−１ｇＧ？ｊ［合 体を、タンパクＡ−セファロースと共に２４時間、次いでタンパクＡ−セファロ ース／前免疫１ｇＧと共に２４時間培養することにより予めきれいにした［”Ｓ コメチオニン標識またはｐｕｓ］硫酸塩標識ＨＬ−５０セルを５Ｘ１０”セル当 量含有するＲＩＰＡセル分解物１ｘＱに加えた。

タンパクＡ−セファロース／アンチペプチド−１ｇＧと共に４℃で１８〜２４時 間培養した後、ビーズを１０ｍＭ非標識メチオニンまたは非標識硫酸ナトリウム 含有０．１％ウシ血清アルブミン、０゜５％Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｍＭホス フェートバッファー食塩水（ｐＨ７，２）で遠心分離することによって３回にわ たり洗浄した。ビーズをＬａｅ＋ｕ＋１　ｉバッファー６０μｌに懸濁させ、９ ５℃で５分間培養することによって、結合放射標識抗原を溶出させた。溶出物を １５％５ＤＳ−ＰＡＣ，Ｅゲル中で電気泳動させ、フマッシーブリリアントブル ーで染色し、乾燥し、コダックＸＡＲ−５フィルムを用いてオートラジオグラフ 化させた。

ＥＬＩＳＡＪこ５おいて、抗血清は約５００倍希釈において、半極大結合を与え た（第６図）。アンチペプチド０２血清は、同じｃＤＮＡの推定アミノ酸残基２ ４〜３９に対応するペプチド０１を認識することが出来なかったく第６図）。前 免疫血清もまた、結合ペプチド０２と反応することが出来なかった。抗血清１μ ｇをペプチド０２の１μ９と共に２５°Ｃにおいて６０分間にわたり前培養した とき、ＥＬＩＳＡにおいて免疫反応性が認められなかった。

アンチペプチド０２血清のＩｇＧ富化フラクションを用いて、タンパクＡ−セフ ァロース結合抗体が初期翻訳分泌顆粒ペプチドコアと完熟プロテオグリカンを認 識するか否かを決定した。目立った２０．ＯＯＯＭｒタンパクを［ＳＳＳコメチ オニン標識ＨＬ−６０セルの２分間分解物から特異的に免疫沈殿させ、僅かにゲ ルに入っ特異的に免疫沈殿させた。１０分間のパルスと５分間の追跡の後、２０ ．０００Ｍｒ［”Ｓ］メチオニン標識タンパクは明白性が減少したが、巨大分子 は多少とも増加した。［ＩＳｓ］メチオニン標識巨大分子は、セルをｐ［ｓｌ硫 酸塩で一夜放射標識した後、沈殿させた［”ｓ］硫酸塩標識プロテオグリカンに 正確に対応する大きさであった。沈毅はタンパクへ−セファロースー免疫１ｇＧ を合成ペプチド０１の１μ９で前培養することによって阻止されるから、ウサギ アンチ−ペプチド０２抗体はプレカーサーと完熟ＨＬ−６０セルブロテオグリカ ンペプチドコアを認識するもと結論された。

第７図に示すように、免疫沈殿ペプチドコアタンパクの太きさは約１３．０００ ダルトンであり、その２７アミノ酸シグナルペプチドを失ったペプチドコアにつ いて５ｔｅｖｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３ニア ２７ｇ（１９８８）により推定された大きさと一致する。

実施例７ プロテオグリカンタンパクの分離 グラフィー、ゲル電気泳動、アフイニテイクロマトグラフイー、または上記の抗 体を用いる免疫抽出技法などのこの分野における通常の蛋白分離技術を用いて分 離することができる。例えば、このプロテオグリカンは下記の操作により抽出す ることができる（ステイブンス、Ｒ，Ｌ、ら、ジャーナル・バイオロジカル・ケ ミストリー、２６０：１４１９４−１４２００　（１９８５））。

ＢＭＭＣペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む１％ツビツターゲント３−１２の ５０μｌ中に３０秒間再度けんだくさせて溶解し、ついで、ＣｓＣ］　（密度１ ．４ｇ／ｍｌ）を含む４ＭグアニジンＨＣ１（ＧｎＨＣｌ）２．３５ｍ１を添加 する。ついで、これらのデタージェント−ＧｎＨＣｌプロテオグリカン抽出物を 集め、典型的な実験では、約２Ｘ　１０”ＢＭＭＣから抽出物４８ｍ１が得られ 、このうち、３Ｘ１０’は放射性ラベルされている。集めた抽出物は１７°ＣＣ １９５０００ｘにて４８時間遠心分離し、勾配溶出物は大多数の実験ではそれぞ れ、Ｄ、（下部）およびり、（上部）と称するフラクションに２等分した。Ｃｓ Ｃ］勾配フフラクションまたは次のイオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィ ーからのフラクション中のフンドロイチン硫酸Ｅプロテオグリカン部はハイドロ フルオル（Ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒ）　１２．　５ｍ　Ｉ中に各フラクションの試 料をけんだくさせ、トラコールアナリティックマークＩＩＩ液体シンチレーシヲ ン計数器で放射性ラベル−プロテオグリカン中の３５８および３Ｈ放射能を定置 することにより測定した。タンパクは、標準物質として牛血清アルブミンを用い るローリ−らの方法によるか、または２８Ｑｎｍにて光学密度により測定する。

核酸は２６０ｎｍの波長にて測定した。各ＣｓＣ１勾配の下部フラクションは５ ００００　Ｍｒ遮断の透析管系に入れ、１ＭＮａｃＩに対して、４℃にて２４時 間透析し、ついでさらに２４時間、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，３含有の１Ｍ尿素 に対して透析する。透析物は固体尿素を添加して、尿素中４Ｍに調整し、あらか じめ、４Ｍ尿素、０．０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８中で平衡化したＤＥ ＡＥ−５２の０．８Ｘ２９Ｃｍのカラムにかけた。イオン交換カラムは４Ｍ尿素 、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８の３５ｍ１で洗浄し、フンドロイチン 硫酸Ｅプロテオグリカンを、流速４ｍｌ／時間で尿素緩衝液中ＮａＣ＋　（０− ０，１Ｍ）の直線勾配置８０ｍ１にて溶出させた。フラクション２ｍｌを集め、 高プロテオグリカンのフラクションを、り５ＳまたはｓＨ放射能のいずれかをフ ラクションの一部につき観察しながら細胞がプレラベルされたかどうか検索して 集め、４℃にて０゜ＩＭＮＨ，ＨＣＯ，に対して４８時間透析し、凍結乾燥させ た。この物質を０．４Ｍ　ＧｎＨＣＩｌｏ、１Ｍ硫酸ナトリウム１０．１ｍトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，０の１００μｍに再度溶解し、同じ緩衝液中でセファロー ズＣＬ−４Ｂの０．６Ｘ１００ｃｍＯカラムにかけ、カラムから１．５ｍｌ／時 間の流速にて溶出させた。フラクションＱ、５ｍｌを集め、放射能および２８０ ｎｍにおける吸収を測定した。プロテオグリカン含有フラクションを集め、Ｏ， ＩＭＮＨ。

ＨＣＯ３に対して透析し、凍結乾燥させた。

実施例８ ４０、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ベシエスダ、メリーランド） を強化培地［牛胎児血清１０　（Ｖ／Ｖ）％、ｊｍＭＬ−グルタミン、Ｑ、１ｍ Ｍ非必須アミノ酸、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ μｇ／ｍｌで補足した培地ＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ、グランドアイラン ド、ニューヨーク）］で、３７°Ｃにて、Ｃ０，５％の加湿雰囲気中で培養した 。

［”Ｓ］メチオニンラベルのために、ＨＬ−６０セルを、無メチオニン、透析牛 胎児血清強化培地中で１０７セル／ｍｌの濃度にて１０分間ブレインキュベート した。ついで　［１８Ｓ］メチオニン（１２９Ｃｉ／ミリモル；アメルシャム、 アーリントンノ１イツ、イリノイ）約５００μＣｉ／ｍｌを添加した。ＨＬ−６ ０セルはさらに、３７℃にて、２−１ｏ分間インキュベートし、冷却しつつ、１ ２゜Ｘｇにて遠心分離し、４°Ｃにて強化培地中で洗浄した。パルス−チェイス 実験において、ＨＬ−５Ｑセルを１ｏ分間、［”Ｓ］メチオニンラベルし、上記 と同様に洗浄し、さらに５分間、３７℃にて通常の強化培地で再度けんだくさせ た。［”Ｓ　］］メチオニンラベルＨＬ−６０セの５ｘｌＱ’部をＲＩＰＡ緩衝 液［０，１５ＭＮａＣ］、１％テ゛オキシコラート、１％ノニデントＰ−４０， １％ＳＤＳ、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド、２ｍＭぶつ化フェニルエチルス ルホニル、１０ｍＭ　ＮａＦおよびＯ，ＩＭ）リス−ＭＣＩ、ｐＨ’７゜２］　 １ｍｌ中溶解し、溶解質の免疫沈降物を下記に記載の５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。

［”Ｓｌスルファ−トラベルのために、ＨＬ−６０セルを［３５Ｓコスルフアー ト（−４０００Ｃｉ／ミリモル；デュポン−ニューイングランドヌクレア、ボス トン、マサチニーセッッ）５０μＣｉ／ｍ１含有強化培地中で、Ｉ　Ｘ　１０’ セル／ｍｌの密度で１時間、または２Ｘ１０”セル／ｍｌの密度で１８時間イン キュベートした。放耐性ラベルしたセルを４℃、１２０Ｘｇにて１０分間遠心分 離し、コンドロイチン硫酸Ａ（マイルスサイエンティフィク、ネイバービル、イ リノイ）１００μｇおよびヘパリン１００μｇ（シグマ、セントルイス、ミズー リ）グリコサミノグリカンキャリアーを含む１％ツビッターゲント３−１２（カ ルピオケム、サンジエゴ、カリホルニャ”）１５０μｌを各セルのベレットに添 加し、ついで、４ＭＧｎＨＣｌの１．３５ｍ１、Ｏ，１Ｍ硫酸ナトリウムおよび Ｏ，１Ｍトリス−ＭＣＩを添加した。各溶解質および上清の試料をセファデック スＧ−２５／ＰＤ−１０カラム（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャ ーシイ）のクロマトグラフィーにかけ、高分子物質への［”Ｓｌスルフアートの 取り込みを定量した。

［”Ｓｌスルファ−トラベルＨＬ−６０セルプロテオグリカンの単離のために、 固体ＣｓＣＩをセル溶解質の残部に添加し、１００ｇ／ｍｌの最終密度にした。

−１０００００Ｘｇにて４８時間遠心分離した後、各ＣｓＣｌ勾配の下部３３％ を０．５Ｍ酢酸ナトリウムに対して２４時間透析し、さらにＯ，１Ｍ炭酸水素ア ンモニウムに対して２４時間透析した。透析物は凍結乾燥し、水０．４ｍｌに再 度溶解した。一部端製した［！１１８］スルファートラベループロテオグリカン の試料を、プロネーゼ（カルビオケム）１０ｕｇの存在または不存在下に３０分 間インキュベートし、ついで、消化物を、４Ｍ　ＧｎＨＣ＋、０．１Ｍ硫酸ナト リウム、Ｑ、ＩＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，２で平衡化しておいたセファローズ ＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア）の０．８Ｘ８５ｃｍのカラムにかけた。対照とし て、［’ａ％Ｓ］スルファートラベルしたコンドロザルコーマプロテオグリカン の試料につき、同時にブロネーゼに対する感受性を分析した。

プロナーゼ感受性フンドロザルコーマプロテオグリカンは細胞外基質蛋白であり 、分泌顆粒プロテオグリカンとは区別される。

プロナーゼ処理後、Ｈし一６０セル［ｓＳＳ　］］スルファートラベルプロテオ グリカの流体力学的規模の実質的な変化は観察されなかっタカ、一方、ラット［ ”Ｓｌスルファ−トラベルコンドロザルコーマプロテオグリカンは分解を受け易 かった。これらの結果はプロテオグリカンがプロナーゼ消化に耐えることを示し ている。

本発明を詳細に、かつ具体的な実施例に関連させて記載したが、発明の要旨およ び範囲を逸脱することなく、発明中に種々の変更および修正が可能であることは 当業者にとって自明である。

ＦＩＧ、イ ＦＩＧ、２ 〜ト ＃Ｃ）ＩＬ　（４９０ｎｍ） ＦＩＧ、１Ａ　ＦＪＧ、”ｌＢ 国際調査報告 ＋＋１１＃ｒＲＩｌｔ６１１１１＾ａ＠ｈｌ易”””ｏｒＴ／ｎｉＱ／ｎ１ＯＲ ＋ＰＣＴ１０Ｓ８９１０３０５１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋なヒト分泌顆粒プロテオグリカンペプチドコアタンパクまたは その誘導体またはフラグメント。
2. ２．該ペプチドコアタンパクがＨＬ−６０細胞の染色体１０に存在する遺伝子に よりコードされている請求項１の実質的に純粋なヒト分泌顆粒プロテオグリカン ペプチドコアタンパク。
3. ３．ヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパクが生物学的系で合成される請求 項１の実質的に純粋なヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパク。
4. ４．該生物学的系が哺乳動物培養細胞である請求項３の実質的に純粋なヒトプロ テオグリカンペプチドコアタンパク。
5. ５．該ペプチドコアタンパクが、組換ＤＮＡから転写された該ペプチドコアタン パクのｍＲＮＡから翻訳されるものである請求項４の実質的に純粋なヒトプロテ オグリカンペプチドコアタンパク。
6. ６．該タンパクが （ｉ）基本的に交互のセリンおよびグリシンからなる１８アミノ酸グリコサミ ノグリカン付着領域を含んでおり （ｉｉ）免疫系の効果細胞中の分泌顆粒中に天然の型で存在し、そして （ｉｉｉ）タンパク分解に抵抗するものである請求項１または２の実質的に純粋 なヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパク。
7. ７．該タンパクをコードしている遺伝子配列が組換ＤＮＡからなる請求項６の実 質的に純粋なヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパク。
8. ８．実質的に純粋なヒト分泌プロテオグリカンペプチドコアタンパクＤＮＡまた はそのフラグメント。
9. ９．該ＤＮＡの配列が 【配列があります】 である請求項８の実質的に純粋なヒト分泌プロテオグリカンペプチドコアタンパ クＤＮＡまたはそのフラグメント。
10. １０．請求項１のヒト分泌顆粒プロテオグリカンのペプチドコアタンパクをコー ドしている核酸配列からなる組換ＤＮＡ分子。
11. １１．該分子が更にクローニングベクターを含んでいる請求項１０の組換ＤＮＡ 分子。
12. １２．該ベクターが該ＤＮＡ分子を発現し得る請求項１１の組換ＤＮＡ分子。
13. １３．該ベクターが該ＤＮＡ分子に対するアンチセンスＲＮＡを発現し得る請求 項１１の組換ＤＮＡ分子またはそのフラグメント。
14. １４．請求項１０の組操ＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
15. １５．該細胞が哺乳動物細胞である請求項１４の宿主細胞。
16. １６．該哺乳動物細胞がマウスマストセルである請求項１５の宿主細胞。
17. １７．（ｉ）請求項１のプロテオグリカンペプチドコアタンパクをコードしてい る発現し得る配列からなるＤＮＡ分子を準備し、（ｉｉ）該分子で宿主を形質転 換し、 （ｉｉｉ）該ＤＮＡ分子のプロテオグリカンペプチドコアタンパクの配列を該宿 主中で発現させ、そして （ｉｖ）該発現によって生産されたヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパク を分離することからなる、ヒトプロテオグリカンペプチドコアタンパクの製造法 。
18. １８．該宿主が哺乳動物細胞である請求項１７に記載のヒトプロテオグリカンの 製造法。
19. １９．式：【配列があります】のペプチド。
20. ２０．式：【配列があります】のペプチド。
21. ２１．式：【配列があります】のペプチド。
22. ２２．ヒト分泌プロテオグリカンまたはそのフラグメントと結合レ得る抗体。
23. ２３．ヒト分泌プロテオグリカンペプチドコアタンパクと結合し得る請求項２２ の抗体。
24. ２４．該抗体が、請求項１９、２０または２１のいずれかのペプチドに対して惹 起されたものである請求項２２の抗体。
25. ２５．該抗体がポリクローナル抗体である請求項２２の抗体。
26. ２６．該抗体がモノクローナル抗体である請求項２２の抗体。