JPH04500907A - 細胞選別技術及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞選別技術及びその利用 本発明は細胞生物学の分野に属し、そしてバイブリド細胞を同定しそして単離す るための細胞選別技術を記述する。さらに詳しくは、バイブリド細胞、好ましく は抗体分泌細胞を蛍光励起セルソーターを用いて選別する方法を示す。

バイブリド細胞の形成を可能にする技術は、種々の生物学的現象の理解を促進し 、深い実際的な用途、特に顕著には抗体を分泌する細胞系の形成の用途を有して いる。基本的に、バイブリド細胞の形成は、１又は複数の標的細胞を適当な細胞 融合剤を用いて融合し、そして次にその混合物よりバイブリド細胞を選別するこ とを意味する。細胞融合の方法およびバイブリド細胞の選別方法は当業界におい て知られている。

最もよく用いられる二つの細胞融合剤または細胞融合物質は、ポリエチレングリ コール（ＰＥＧ）または不活性ウィルス、特にセンダイウィルスである。Ｒｉｎ ｇｅｒｔｚ、Ｎ、ａｎｄ　Ｓａｌｖａｇｅ、Ｒ。

Ｃｅ１ｌ　Ｈｙｂｒｉｄｓ　Ｃｈａｐｔｅｒｓ　４（ｐ、２９）　ａｎｄ　５（ ｐ、４６）、　Ａｃ４ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９７６）、　Ｐ　Ｅ　Ｇは容 易に入手できるため、そしてセンダウィルスは時間を要する生産、タイトレージ ョン（力価検定）および不活性化工程を要するため、ＰＥＧは非常に好都合な細 胞融合剤である。ＰＥＧは様々な分子量の製品があり、そして特定の製品が細胞 融合剤に好ましい。Ｇｅｆｔｅｒ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、。

に二通りの方法の一方を用いて選別される。第一の方法は、定義された培地中で バイブリドの増殖を促進するがしかし非融合細胞の増殖を促進しない薬剤耐性遺 伝子マーカーをもつ細胞からバイブリドを形成することから成る。第二の方法は 、バイブリドを形成する細胞のそれぞれに、二つの異なる蛍光マーカーを導入し 、そしてその後これら両方の蛍光マーカーで標識されたバイブリド細胞を蛍光セ ルソーター装置を用いて選別することからなる。

蛍光励起細胞選別技術は、従来の生化学的手段によるバイブリド細胞の単離方法 に比べ、いくつかの利点を有する。第一に、そして最も明らかなことは、薬剤添 加培地より選別できる、薬剤耐性遺伝子マーカーを有する細胞系を作製する必要 がないことである。これは、しばしば大変時間がかかり、骨の折れる仕事である 。第二に、融合の操作が行われた後において、バイブリドおよび非融合細胞を薬 剤選択培地中で増殖させることにより、非融合細胞に対して選択するという生化 学的選択操作を必要としない。第三に、特定の融合技術の効果を蛍光励起セルソ ーター技術を用いることにより、直ちに判定することができる。対照的に、細胞 を薬剤マーカーを用いて選別する場合には、培養物が増殖し、そして非融合細胞 が除去されるまでかなりの時間待つ必要がある。

蛍光励起細胞選別技術を用いたバイブリド細胞選別方法は、以上の利点にもかか わらず、広範囲の種類の細胞に一般に適用されないのは、調和のとれた色素の組 み合わせの同定に伴う困難さのためである。これは特にマウスのバイブリドが選 択される場合にそうである。なぜなら、細胞に取り込まれ、そしてさらに選別工 程を行うのに十分な時間にわたり、その中に保持される蛍光色素が少ないためで ある。これは特にマウス抗体分泌細胞、それがハイプリドーマ、トリオーマ、ク アドローマであっても真実である。理由の一つとして、蛍光励起細胞選別に必要 な色素を細胞から除去することができる、細胞膜輸送機構をマウス細胞が有して いることが知られているからである。

もう一つの蛍光励起細胞選別技術の欠点は、今のところ、死細胞と生細胞を識別 する蛍光色素の組み合わせが同定されていなかったことにある。それゆえ、現在 の方法では死細胞と生細胞より成るバイブリドを選別する。

したがって、本発明の目的は、バイブリド細胞の選別を可能にする蛍光色素の組 成物およびその利用方法を提供することにある。

本発明の異なる目的は、バイブリド細胞、好ましくはゲラ歯動物のバイブリド、 さらに好ましくは抗体分泌ゲン歯動物細胞の選別を可能にする蛍光色素の組成物 およびその利用方法を説明することにある。

本発明の更なる目的は、生細胞によって細胞内に取り込まれ、それによって、バ イブリドの選択を可能にするような一対の蛍光物質を同定すること及びその使用 方法であり、ここで色素の対の一方の構成員をそれぞれが含有する細胞の融合か らバイブリドが形成される。

本発明の追加の目的は、生存ゲン歯動物細胞を優先的に選別するための蛍光色素 対の同定及びその使用方法であり、ここで、該色素対の一方の構成員は細胞から 迅速に輸送される性質を有しており、ここに記載する方法は、この輸送過程を防 止し、それによってゲラ歯動物バイブリドを選別するために色素を使用すること が可能となる。

図１はＯ，Ｓｔｓ／ｒａｉｌのローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）または１Ｏｆ ｆ　／”−のヒドロエチジン（ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ）を標識させた５２ ０Ｃ９細胞の増殖曲線を示す。さらに、いずれの色素によっても標識されていな いコントロール増殖曲線が示される。

図２は０．５　ｔｒｇ　／　ｍｆｌローダミンまたは】０硝／ｄヒドロエチジン で標識された３Ｇ８細胞の増殖曲線を示す。さらに、いずれの色素によっても標 識されていないコントロール増殖曲線が示される。

図３はローダミンで標識された５２０Ｃ９細胞のＦＡＣ５像を示す。

図４はヒドロエチジンで標識された３Ｇ８細胞のＦＡＣ３像を示す。

図５は融合しいない５２０Ｃ９及び３Ｇ８細胞の混合物のＦＡＣ５像を示す。

図６は融合した５２０Ｃ９及び３Ｇ８細胞の混合物のＦＡＣ５像を示す。

図７は５２０Ｃ９及び３Ｇ８細胞、並びにこれらの細胞系より得られたバイブリ ドハイブリドーマ３Ｅ１１のクロモマイシンＡ３ＤＮＡ染色図を示す。

図８は５２０Ｃ９及び３Ｇ８細胞、並びにこれらの細胞系より得られたバイブリ ドハイブリドーマ４Ｈ３のクロモマイシンＡ３ＤＮＡ染色図を示す。

図９は、標識された５ＫＢｒ細胞に対する、５Ａ５および４Ｈ３培養上清の細胞 障害効果を示す。

図１０はトリチウムで標識された５ＫＢｒ細胞に対する、５Ａ５及び４）１３並 びに対応するサブクローンの細胞障害効果を示す。

図１１はバイブリドハイブリドーマ２Ｂ１より分泌した抗体を含む腹水液のＯＤ ｚ＊ｏにおけるセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）２００の溶出の状態を示す 。

図１２は２Ｂ１の抗体画分のＯＤ！ｌ１０におけるＤＥＡＥセファローズ（Ｓｈ ｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィーの溶出の状態を示す。

図１３は両分５２〜６２　、７８〜８５　、１０２〜１１０のＳＤＳ　ＰＡＧＥ ゲル電気泳動図を示す。

図１４はクロミウム（ｃｈｒｏｍｉｕｍ）標識された５ＫＢｒ３細胞に対するＤ ＥＡＥ精製２Ｂ１の細胞障害活性を示す。

本明細書に示される発明は、蛍光励起細胞選別技術を用いた、バイブリド細胞の 選別方法を示す。一般に、これは、使用される濃度において毒性がなく、且つ細 胞内に取り込まれそして細胞選択工程を実施するのに十分な時間にわたってその 中に保持される一対の蛍光色素を選択することを含む。さらに、これらの蛍光色 素は近い励起波長を示すが、しかし区別できる発色波長を示すという更なる性質 を有するであろう。

細胞は適当な融合剤により融合され、そして好ましくは蛍光励起セルソーターを 使用して選別される。

゛　色、による　胞の　： 多様な種類のバイブリド細胞をこの発明の方法により製造することができる。し かしながら、この発明は一２二価モノクローナル抗体を分泌する細胞系を得るの に特に有効である。

二価抗体は二つの異なる抗原結合部位を示す。トリオーマそしてクアドローマは 二価モノクローナル抗体を分泌する細胞系の二価である。トリオーマは一般に、 ハイブリドーマとリンパ球の融合により形成され、他方クアドローマは−ｇに二 つのハイブリドーマの体細胞融合により形成される。ハイブリドーマ及びリンパ 球はそれぞれ、単一特異性抗体、すなわち同一抗原に対して二つの結合部位を示 す抗体を生産する。

１−かじながら、トリオーマ及びクアドローマは、両方親細胞のタイプの、即ち ハイブリドーマまたはリンパ球の両者のライト及びヘビー鎖を生産し、そしてこ れらが結合して二価特異抗体となるのである。

本発明におけるバイブリド細胞の同定及び単離の方法の最初の工程は、融合すべ き細胞を適当な生理溶液中でインキュベートすることを含み、そしてそれぞれは 選択した蛍光色素を収容した別々のチューブ内で行われる。細胞を、後にバイブ リド中で検出されるのに十分な量の蛍光色素を取り込むまでインキュベートする 。

広範囲の種類の生理溶液を、蛍光色素存在下で細胞をインキュベートするために 用いることができる。例えば、細胞は短い時間にわたりリン酸緩衝生理食塩水の ような栄養素の欠如した生理溶液中でインキュベートでき、あるいは特定の蛍光 色素はその色素が検出可能な量として取り込まれるために比較的長いインキュベ ーション時間を必要とし、そして細胞系は栄養素の添加された溶液、好ましくは 細胞培地中でより適切にインキュベートすることにより細胞の劣化を防止する。

溶液のｐＨは約７．４付近であることが期待されるが、しかしながら蛍光色素の 取り込みに対して有意な影響を与えず、また細胞の生存に対する悪影響を与えな いｐＨの変更は予想される。

蛍光色素の細胞生存への影響は、当業者によく知られている技術を利用すること によって測定することができる。最も有用な技術はＭｏｓｍａｎｎ、Ｔ、、　Ｊ 、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　６５　：　５５（１９８３）に記 述された方法であり、それは細胞の生存を細胞数の関数として測定する。それゆ え、蛍光色素の細胞生存能力及び細胞数両者への影響が同時に測定され得る。こ の測定方法は、無色のテトラゾリウム塩がミトコンドリア脱水酵素によって検出 可能な有色生成物に変化することに基づく。好都合なテトラゾリウム塩はＭＴＴ または（３（４，５−ｄｉｍｅ−ｔｈｙｌｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ　−２−ｙｌ ）　−２、５−ｄｉｐｈｅｒｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）で ある。

本発明に用いられる蛍光色素は、いくつかの重要な特性を有する。第一に、前述 した通り、それらはバイブリドを形成するのに、及び生存バイブリドを蛍光セル ソーターで検出するのに必要とされる濃度において、細胞に対して毒性があって はならない。第二に、該色素は適当な蛍光検出器を用いて容易に測定できる波長 で発光するものでなくてはならない。

第三に、ひとたび色素が細胞内に取り込まれた後、洗浄及び測定中に細胞から除 去されるその色素の速さは、細胞内の色素の量が少な過ぎて検出不可となるレベ ルまで下げてしまうほど大きいものであってはならない。これら特性を有する実 質的な色素対は、この発明において適切に機能するであろう。

しかしながら、最も好ましいのはローダミン１２３とヒドロエチジン色素の組で ある。はとんどの種類の細胞に、これら色素は容易に取り込まれ保持される。し かしながら、ゲラ歯動物、特にマウス細胞はローダミン１２３について高い除去 速度を示す。しかし、ローダミン１２３と共インキュベートされる細胞がさらに カルシウム遮断剤、即ちカルシウムの原形質膜を通しての輸送を阻害する分子と 一緒にインキュベートされる場合、ローダミン１２３は、チャンネル遮断剤が無 い場合に比べより長く細胞内に保持されることが決定された。特定の理論により 拘束されたくないが、ローダミン１２３は、カルシウムイオン輸送とリンクする 機構により細胞から輸送されること、及び適当なカルシウムチャンネル遮断剤を 用いてカルシウムイオン輸送を妨害することにより、ローダミン１２３の除去も 止られ、そしてこのために色素が細胞内に保持されることが考えられる。それゆ え、ローダミン１２３が一対の色素の構成員の一つであり、そして融合すべき細 胞がゲラ歯細胞の場合には、十分な濃度のローダミン１２３を細胞内に保持させ るには、色素により細胞が標識される間、そしてその後の洗浄、細胞融合、及び 蛍光励起細胞選別工程の間に、溶液にカルシウムチャンネル遮断剤が入っていな ければならない。

様々なカルシウムチャンネル遮断剤が当業界において知られているが、本発明に おける好ましいカルシウムチャンネル遮断剤はベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ ）である。これはシグマケミカル■より購入できる。ベラパミルの有効濃度は当 業界において知られた技術により経験的に決定することができる。

前述の通り、標識溶液中の蛍光色素濃度は、細胞にとって無毒でなくてはならな いが、しかしながら、細胞が融合してバイブリドを形成した後、蛍光励起セルソ ーターを用いてバイブリドが検出されるための量の色素が細胞内に取り込まれる だけ、十分に高くなくてはならない。はとんどの色素は躇／ｄの濃度の範囲で用 いられ、好ましくは０．１〜２０Ｉｒｇ／ｄの範囲である。ヒドロエチジン及び ローダミン１２３はそれぞれがおよそ０．１〜１０屑／−及び１〜１５　ｔｒｇ 　／　ｔｒ＆の濃度で好ましく用いられる。これら色素の最も好ましい濃度はロ ーダミン１２３及びヒドロエチジンがそれぞれ０．２５〜０．５ｔａｒ／Ｍｌ及 び５〜１０■／ｄである。

その他、適当な蛍光色素による細胞標識に関しての詳細は、インキュベーション 温度に加えて細胞を色素とインキュベートする最適時間である。前述の通り、標 識時間は、蛍光色素の濃度に加えて、用いる細胞の種類に依存して相当変化する 。

しかしながら、好ましいインキュベーション時間は１０〜５０分であり、更に好 ましくは１５〜３０分、最も好ましくは２０分である。細胞は種々の温度でイン キュベートでき、それによりインキュベーション時間に影響を及ぼす。この様々 な条件での最適時間は実験的に決めることができる。しかしながら、ローダミン １２３は細胞を２０分間インキュベートするのに好ましい温度は３７℃であり、 そしてヒドロエチジンは室温にて２０分間が好ましい。次に記述する細胞融合を 行うための準備として、細胞系を適当な蛍光色素で標識後、それらを色素残留物 を除去のために洗浄し、そして生理溶液、好ましくは細胞培養液中でインキュベ ートする。

豊皿散豆 適当な蛍光色素を含んだ細胞系は、適当な生理溶液中で一緒にされ、そして標準 的な細胞融合の材料及び方法を用いて融合された。注目すべき重要なこととして 、細胞融合混合物を例としてカルシウムチャンネル遮断剤、好ましくはベラパミ ルを含ませたという処置を施したにもかかわらず、ゲラ歯細胞からはかなりの速 さによりローダミン１２３の除去が認められた。細胞融合は様々な融合剤を用い て行われるが、しかしながら好ましい融合剤はポリエチレングリコールである。

更に好ましくは分子量が１５００〜４０００の範囲のポリエチレングリコールで ある。二つの細胞系は異なる濃度で一緒にすることができるが、しかしながら各 細胞系の数が１０６〜１０７個であることが好ましく有用される。

さらに詳しくは、細胞融合工程は、約１０６〜１０７個の各細胞系を、その融合 する細胞系の種類によって、ベラパミル存在下または非存在下の適当な細胞培養 液で混合させることより成る。細胞混合物は遠心により集められ、ポリエチレン グリコール１５００を用いて細胞融合する。用いた技術はＫｏｈｌｅｒａｎｄ　 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ＋　１９７５＋　２５６　：　４９５に記載 されている。

簡単な、細胞ハイブリダイゼーションの達成される工程としては、０．５　ｄの ５０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００溶液を室温にて３０秒かけて 滴下しながら加え、次に３０秒間３７゛Ｃにてインキュベートする。細胞の懸濁 液に２０ｍの１０％子牛血清・細胞培養液を加えゆっくり撹拌する。次に、細胞 を、４８８または５１４ｍｍで発光するアルゴンレーザー装備の蛍光励起セルソ ーター装置を用いて細胞選別される前に、１０％子牛血清・細胞培養液の中に静 かに再懸濁し、３７°Ｃにて２〜４時間インキュベートする。これらの波長はヒ ドロエチジンとローダミン１２３の色素の組み合わせを用いるときに特に有用で ある。

４８８又は５１４ｍのいずれかで励起された細胞内ヒドロエチジンはエチジウム （ｅｔｈｉｄｉｕｍ）に変化し赤い蛍光色を発する。対照的にローダミン１２３ はいずれかの波長で励起させると黄色の蛍光色を発する。それゆえ、バイブリド 細胞は黄色及び赤色の両方を発するものと予想される。

ｋ朕五■ 細胞融合混合物に存在するバイブリドは蛍光励起セルソーター装置を用いて単離 できる。様々なこのような装置がある中で、Ｂｅｃｋｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 　（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）社製、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＥＰ ＩＣ５Ｖ又はＦＡＣ５ＩＩＩセルソーターらが我々にとって満足しうる性能を示 した。レーザーの強度は約１５０ｍＷ　、そして前述の通り励起波長４８８また は５１４ｍｍで用いるのが好ましい。スタンダードミラー及びフィルターは、選 択された蛍光色素対より発された蛍光を調和させること及び集めるために用いら れた。同様に、標準的な技術を用いて、バイブリド細胞を選択するためのセルソ ーター窓の調整を行い、そしてその方法はり、Ｋａｒａｗａｊｅｗ、　Ｂ、Ｍｉ ｃｈｅｅｌ、　Ｏ，Ｍｉｃｈｅｅｌ、　Ｏ，Ｂｅｈｒｓｉｎｇａｎｄ　Ｍ、Ｇａ ｅｓｔｅｌ、Ｊ、ｆ＋ｎｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８７＋　９６　：　 ２６５−２７０に詳述されている。

坑」ＬＬ泌−ハイブリードーマの肌 前述の通り、この技術は抗体分泌ハイブリドーマ細胞、好ましくはハイブリドー マ、トリオーマ、及びクアドローマとして有名なバイブリドハイブリドーマの単 離に特に有効である。しかしながら、蛍光セルソーターにより単離されたバイブ リド細胞のすべてが抗体を分泌するわけではないので、それら抗体分泌細胞を同 定しなくてはならない。最も一般的なハイブリドーマの検出に適用される方法は 、他にも知られた技術があるにもかかわらず、固相アッセイによるバイブリド細 胞分泌抗体を媒介とした測定である。似たような技術は、膜及び不溶性抗原の検 出にも用いることができる。どちらの場合でも、抗原を支持体に結合させ、支持 体を適当なプロキング剤で処理し、そして抗原を直接標識されたハイブリドーマ 抗体を結合させるかまたは間接的にハイブリドーマ抗体に結合する標識物質を用 いるかのいずれがで測定する。後者の標識物質は、抗体・プロティンＡ又はその 他の結合物質でありてもよい。この測定方法は当業界において知られており、Ｌ ａｎｇｏｎｅ、　Ｊ、ａｎｄ　Ｖａｎν１ｎａｋｉｓ、Ｈ，、４ｏｆ　Ｅｌカ遅 四■、−９７□【）！−戸−亙（１９８３）、に記載されている。

トリオーマまたはクアドローマより分泌した抗体は、以上の方法で同定できるが 、二価抗体としての特徴及び特性を確認するには、さらなる評価を行わなければ ならない。前述の連り、１リオーマまたはクアドローマより分泌された抗体は、 二価の特異性、即ち、−抗体分泌細胞つの異なる抗原に対する吸着結合認識部位 を有する。抗原への結合は同時にもまた連続的にも起こりうる。トリオーマまた はクアドローマがこの技術により単離されたかどうかは、これら細胞系から分泌 された抗体を、その同一抗体が二つの異なる抗原と結合することに由来する機能 試験によって特定することによって確認できる。

二価特異性抗体は例えば、二価抗体−抗原スクリーニングアッセイにより、本当 に二つの異なる抗原を認識できるか、それゆえ二つの異なる抗原結合部位により 構成されているかを証明することができる。この評価方法は当業界において知ら れ、そのうちのいくつかがＩＪ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏｓ、４，６３４，６６ ４　；４．７１４，６８１　；及び４，４７４，８９３に詳述されている。Ｕ、 Ｓ、ＰａｔｅｎｔＮｏ、４，６３４，６６４はトリオーマについて詳述、またＵ 、Ｓ、ＰａｔｅｎｔＮｏｓ、４，７１４，６８１及び４，４７４，８９３はクア ドローマの製造及び同定の方法を提供していることは注目すべきである。

細胞毒性試験もトリオーマ及びクアドローマより分泌された抗体の同定に用いる ことができる。細胞毒性はモノサイトス、マクロファージ、ナチュラルキラー細 胞等の細胞障害性細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｃｅ１ｌ）の表層レセプターによ るものと考えられている。これらのレセプターは、標的細胞の細胞膜構成物に対 して特異性があり、そして作用を及ぼし、これにより細胞障害性細胞と標的細胞 の複合体を形成して細胞溶解を引き起こすものと考えられている。もし細胞障害 性細胞を標的細胞に近づけたら、細胞障害は促進されるであろう。二価抗体は、 この工程を促進することができる、そしてそれは一方の結合部位を標的細胞に、 そして他方の結合部位を細胞障害性細胞の溶解促進レセプターに結合することで 二種の細胞を連結させることによって細胞障害性細胞に殺傷の信号を送らせるこ とによる。これらの評価を行う材料及び方法は当業者によく知られている。代表 な評価方法ば、Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　ｓｈｉｉｇｉ。

による’５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ＋’　ｐ、１３０゜ｅｄｓ、　Ｃ，Ｈｅｎｒｙ　ａｎｄ　）１． Ｍｉｓｈｅｌｌ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　５ａｎＦｒａ ｎｃｉｓｃｏ（１９８４）　、出版であり、そしてその後Ｈｅｒｌｙｎ　Ｄ、、 　Ｈｅｒ−Ｉｙｎ　Ｍ、、　Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ、Ｚ、、　ａｎｄ　Ｋｏｐｒ ｏｉｖｓｋｉ　Ｈ，、”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏ ｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｘ　ｌ５ｏｔｏｐｅｓ　ｉｎ　Ｃｙｔｏ ｔｏｘｉｃＲｅａｃｔｊｏｎｓ　ｗｉｔｈ　）ｌｕｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｕｒｉｎ ｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ’、Ｃｅ１ｌｕ−ハＬ如μ机りユ１９８５． ％憂１０５〜１１４に詳述されている。前者は５ＩＣｒ遊諦測定について詳述、 そして後者は溶解細胞より遊離したトリチウ化チミジンの測定を含んだ３Ｈの遊 離測定を紹介している。

トリオーマ又はクアドローマの前述した機能試験で同定した後、二価特異性抗体 の特性は、単離した抗体の調製品の構造を調べることにより、確認できる。二価 抗体は両融合細胞のライト及びヘビー鎖より構成される。

抗体は培養培地または体液より精製され、それは通常のイムノグロブリンの精製 方法、例えば必要なら硫安沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、限 外濾過等による。

イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィーは単独または組み合わせのいず れかで用いられる。ライト及びヘビー鎖の分析はゲル電気泳動技術を用いること により実施でき、加えて他の技術も当業界において知られている。

本発明について概略したが、次に本出願の実施例を紹介する。しかしながら、当 業界において知られていることであるが、実施例は本発明のすべての方法につい てこれを限定するものではない。

尖施拠上 ゛　、の　： ３Ｇ８及び５２０Ｃ９細胞系のバイブリドバイブリドーマ又はクアドローマの形 成に先立ち、ローダミン１２３、及びヒドロエチジンの細胞毒性を測定した。３ Ｇ８はモノサイトス、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ等を含む様々な 細胞タイプに存在するヒトＦｃレセプター■を認識するモノクローナル抗体を分 泌するネズミハイブリドーマである。これはＵｎｋｅ−Ｉｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、 、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　＋４９８８＋　６　 ：　２５１゜に詳述されている。５２０Ｃ９は乳癌細胞中に存在する抗原を認識 するネズミモノクローナル抗体を分泌する。これはＵ、Ｓ、特許４，７５３，８ ９４に詳述されている。前述した論文を引用により、本明細書に組み入れる。

細胞増殖及び生存能力は前述したＭＯ３ｌｉａｎｎ＋　Ｔ、　＋によるＭＴＴア ッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイが細胞数を反映するかを確証するため、 そのアッセイが適当な細胞数の範囲で直線性を示すことを保障する実験を行った 。前述のそれぞれの細胞系について試験を行い、５２０Ｃ９及び３Ｇ８それぞれ の結果を図１及び２に示した。両方の細胞系において１０’ｃｅ月Ｓ／ｗｅｌｌ を上限としてアッセイは直線性を示した。

次に、それらの細胞系をローダミン１２３またはヒドロエチジンのいずれかの存 在下で標識し、その後、細胞数を測定しながら３日間培養した。細胞は０．５ｎ ／ｄローダミン１２３と１０団ベラパミル存在下、または、５または１０ｘ／ｍ ヒドロエチジンで標識された。　１０．０００〜２０，０００の間のｃｅｌｌｓ ／ｗｅｌｌを〜ヒドロエチジンの場合室温で、ローダミン１２３の場合３７℃の 室温にて２０分間にわたり標識し、２回洗浄し、そして色素無添加培地で培養し た０図１は、ベラパミル存在下でのローダミン１２３も、またヒドロエチジン（ １０■／ｄ）　も、５２０Ｃ９細胞の増殖を阻害しなかったことを示す、増殖速 度及び細胞数は標識物無添加培地中での細胞増殖のそれと比べ、事実上同程度の ものであった。

図２は３Ｇ８細胞系における結果を示す、ベラパミルを含むローダミン１２３及 び５ｎ／ｍでのヒドロエチジンも阻害を示さなかった。しかしながら、ヒドロエ チジンが１０ｔｒｇ／Ｍｌのとき、３Ｇ８の増殖を約２４時間経過後阻害し始め た。

２施伍工 ゛　、による　： 蛍光色素による細胞標識の工程は、約２Ｘ１０’個の３Ｇ８または５２０Ｃ９細 胞を１０ｘ／ｄのヒドロエチジンまたは０．５ａ／ｄのローダミン１２３のいず れかを含ませてインキュベートすることより成る。ローダミン１２３中でインキ ュベートした細胞には、１０−ベラパミルも加えた。ヒドロエチジンによる標識 は室温にて、遮光して２０分間にわたり行った。ローダミン１２３による標識も 遮光し、３７°Ｃにて１５分間にわたり行った。

インキュベート終了後、細胞系らを１０団ベラパミル存在下、無血清１ｓｃｏｖ ｅ培地で２回洗浄し、そして実施例■に詳述されているように融合を行った。

実施ＩＬ ハイブリドーマのノ　単一 バイブリドハイブリドーマは３Ｇ８細胞と５２０Ｃ９細胞を融合することにより 、形成された。この工程の最初の段階は実施例■詳述の細胞の標識より成り、そ してその後それらをポリエチレングリコールで融合する。融合工程は、２Ｘ１０ ’個の各細胞系を５０ｍ１ｓｃｏｖｅ培地中で混合させ、そして４００ｒｐｍに て５分間遠心して細胞を沈降下させることより成る。この工程は室温で行われ、 その後の段階では約３７℃の溶液を用いて行った。

３ＧＢ及び５２０Ｃ９細胞の細胞沈渣に１８０Ｊ１１の無血清１ｓｃｏｖｅ培地 を添加し、そして１００ｉ１１のこの混合物を５０ｄ遠沈管に移し入れた。この 懸濁液をバイブリドの形成に用い、残ったものはコントロールに用いた。融合は 、３７°Ｃに温めた５０％ポリエチレングリコール溶液０Ａａｆを１分間かけて 細胞沈渣に加えることにより行われた。この混合物をさらに数分間静かに撹拌し 、全ての細胞が可能な限りこの融合剤にさらされるように返した。７ＩＩ！１の 無血清１ｓｃｏｖｅ培地を２〜３分ぐらいかけて撹拌しながら加え、次にその混 合物を８０ｄの１０％子牛血清・ｌ５ｃｏｖｅ培地の入ったＴ−１５０フラスコ の中に移し入れた。その混合物を９５％の大気、５％ＣＯ，雰囲気で、３７°Ｃ ，２〜４時間インキュベートした。最後にフラスコをインキュベーターから取り 出し、１０分間直立させ、細胞をフラスコの底に沈ませた。６０１ｄのその上清 を吸引除去し、そして以下の実施例■に記す、ＦＡＣ５装置を用いてバイブリド を得るためにこの残りの混合物を選別した。

叉施炎ヱ 染色された細胞懸濁液はＣｏｕｌｔｅｒ　ＥＰＩＣＳＶセルソーターを用いて分 析及び選別された。ローダミン１２３及びヒドロエチジンはアルゴンレーザーに より、強度１５０ｍＷ、　４８８ｎｍで励起された。４８８ｎｍダイクロイック ミラーは右角散乱光の集光に用い、そして５５０ｎｍグイクロイックミラーは５ ２５ｎｍバンドパスフィルター及び６３０ｎｍロングパスフィルターと組み合わ せてローダミン１２３及びヒドロエチジンそれぞれの蛍光を集めるのに用いた。

前方角散乱光（ＦＡＬＳ）、ログ右角散乱光（ＬＲＡＬＳ　）、ロググリーンフ ルオレセンス（ｌｏｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）及びログレッ ドフルオレセンス（ｌｏｇ　ｒｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を同時に測定 した。死細胞及び細胞塊はそれらのＬＲＡＬＳ特性とＦＡＬＳの調和により、最 初にゲートをくぐった。二番目のゲートは二重染色細胞のために設置した。両ゲ ートは二重染色細胞の比率を測定するために用いられた（二番目のゲートは一番 目のゲートの上に設置した、ｉ、ｅ、ＦＡＬｓｖｓＬＲＡＬｓ）。

二重染色細胞をＣｏｕｌｔｅｒオートクローン機構を用い、滅菌状態で丸底９６ 六マイクロタイタープレートまたは平底１２穴プレートのいずれかに選別した。

単数の細胞は９６穴プレート中に選別し、多数の細胞は１２穴プレート中に選別 した。選別ゲートは同窓（ＦＡＬＳｖｓＬＲＡＬＳ　、　ＬＧＦＬｖｓＬＲＦＬ ）により構成された。

ローダミン１２３及びヒドロエチジンの両者は生細胞のみを染色するため、死細 胞はソーター窓で識別される。同様に、異なる蛍光染色細胞よりなる細胞の塊も 、それが有する散乱光の特性により排除される。

以上の選別パラメーターを用いることによってバイブリドが選別されたかを確め るために、次の対照実験を行った。ローダミン及びヒドロエチジンにより標識さ れた５２０Ｃ９及び３ＧＢ細胞のそれぞれを分析し、そのＦＡＣ５像を記録した 。

図３はローダミン１２３で標識された５２０Ｃ９細胞の、そして図４はヒドロエ チジンで標識された３ＧＢ細胞のドツトプロットＦＡＣＳ像を示す。どちらの細 胞タイプにおいても、バイブリド細胞選別用セルソーター窓に入っていく数はわ ずかであった。

前述したこの細胞選別パラメーターを用いるにあたって、バイブリド細胞のみが 選別されたかを確認するため、二番目の対照実験を行った。非融合の５２０Ｃ９ 及び３Ｇ８細胞の混合物、尚これは実施例■でのコントロール細胞であるが、こ の細胞を分析し、そしてバイブリド細胞ソーター窓に入る細胞の数を記録した。

図５に示すように、この混合物中の細胞でソーター窓に入っていったものはわず かに約１．５４％であった。

対照的に、融合した５２０Ｃ９及び３Ｇ８細胞の混合物を選別した場合、設置さ れたバイブリドソーター窓に入っていく細胞の数は大きく増加した。図６は、実 施例■詳述の融合混合物に存在する細胞のうち、設置されたバイブリド細胞窓に 入っていったものは４．３２％であったことを示す。これは、約２％の細胞が融 合されたことを示す。

２語■Ｍ 実施例■の方法により選択された細胞が、本当に３ＧＢと５２０Ｃ９が融合して できたバイブリド細胞であるかを確かめるため、親細胞系及びそれらより得られ たバイブリドのＤＮＡ含量を測定した。標準的な、ＤＮＡ染色クロモマイシンＡ ３を用いた細胞選別技術が用いられた。その技術は７ａ１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８１．７８（１２）　：　７７２７に詳 述され、この論文を引用し組み入れた。細胞を７０％メタノールで固定化し、評 価前に一２０°Ｃで保存した。二つの独立した融合工程ＴＳＩ及びＴＳ３を行っ た。ＴＳＩは６つのクローンを生産し、ＴＳ３は８つのクローンを生産した。３ Ｅ１１及び４Ｈ３はそれぞれＴＳＩ及びＴＳ３からのクローンである。図７及び ８はそれぞれ、これらクアドローマが親細胞系の約２倍のＤＮＡを有することを 示す。

これらを合わせると、以上のデーターは本発明の工程がバイブリド細胞を明確に したことを確証した。

裏侮拠■ ＆イブリドハイブリドーマの西 先の実施例詳述の工程を用いることにより、ハイブリドーマ５Ａ５及び４Ｈ３を 二つの独立した３Ｇ８及び５２０Ｃ９の融合物から生産し、そして５Ａ５はＴＳ Ｉから、そして４Ｈ３はＴＳ３から得られた。これらハイブリドーマは二価抗体 を分泌することが、二価抗体生物学活性の測定により示され、そしてそれは最初 にクロミウム遊離細胞毒性試験を用いることにより、そしてその後のチミジン遊 離測定を用いての確認よりなる。これらの実験は５Ａ５又は４Ｈ３の抗体含有培 養物を用いて行われた。

その後、５Ａ５及び４Ｈ３はサブクローンされ、そのいくつかのサブクローンの 培地を、チミジン遊離測定方法により分析した。５Ａ５からのサブクローンは２ Ｂ１及び２Ｄ３；並びに４Ｈ３からは３Ｄ７及び３Ｆ、７であった。さらに、サ ブクローンの一つ２Ｂ１からの抗体を精製し、そして二価特異性活性を示すかを 分析した。またコントロールも、即ちＴＳＩ融合物より得られた二価抗体を分泌 しないハイブリドーマ３Ｂ５よりなる培養物も分析した。付は加えて、２Ｂに二 価抗体のサブユニット構成物が、３Ｇ８及び５２０Ｃ９抗体の双方より得られる ライト及びヘビー鎖を示すかどうかを確認するため分析した。

クロミウムで標識された５ＫＢｒ３細胞毒性試験：この評価方法はだいたいにお いて、Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉの”ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”に詳述されている。細 胞障害性細胞は以下のように調製した。１０ｄのヘパリン処理血清を５０−のチ ューブに分配し、そして３０ｄのカルシウム及びマグネシウムを含む）ｔａｎｓ 平衡食塩水（ＨＢＢＳ　Ｃａ−Ｍｇ）を加えた。

チューブは数回、溶液を混合するために反転させ、そして１０−のフィコールー ヒパク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）を直接チューブの底にゆっくり滴下し た。チューブは室温にて２５分間、１２５Ｏｒｐｍ後チューブを注意深く、溶液 が混ざらないようにして取り出した。次にパスツールピペットを用い、それを外 観が黄白濁していることにより区別できる単一層の真上まで降ろし、上清を除去 した。単一細胞層は、１ＯＩｎ１のピペットで、赤血球の沈渣を乱さないように 注意深く集めた。この工程で３０ｄの血液を処理した。このようにして分離した 単一層細胞を５０１ｎｆｌのＨＢＳＳ　Ｃａ−Ｍｇに懸濁し、そして２０分間、 １２５Ｏｒｐｍ　、そしてブレーキはオフの状態で遠心分離した。細胞沈渣の真 上の上清を吸引除去し、そして細胞沈渣を再懸濁させた。体積を培養液で５０ｄ に増量させ、細胞数を測定するため少量を取り出し、そして細胞をまた１０分間 、１２５０ｒｐｍ　、ブレーキがオフの状態で再沈澱させた。上清を吸引除去し 、その沈渣は適当な量の培養液により、総量０．’２　ｍ／ｗｅｌｌで作用因子 ／標的（ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ｌａｒｇｅｔ）の比率、またはＥ／Ｔの比率が２０ ／１となるように調整した。これは２Ｘ１０６作用細胞／ｄに相当した。

作用細胞を前述の方法で単離、準備した後、またはそれと同時に、標的細胞即ち 、５ＫＢｒ３を準備した。この細胞のクロミウムによる標識は、細胞障害作用細 胞の準備において、高生存細胞数が確保されたときに行うべきである。以下のク ロミウム標識工程はおよそ前記Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉによるが 、次の点を変更した。５ＫＢｒ　−３を集めるために標準的な実験用Ｔ　２５０ ｃｆｆｌフラスコ中で増殖し、そして実験の前日に新鮮な培地で栄養供給した。

細胞単一層を１０ｍ１のＨＢＳＳ　−Ｃａ　−Ｍｇで２回洗浄し、そして細胞の フラスコからの取り出しは、単一層を１０−のベルセン（ＥＤＴＡ）　（ｖｅｒ ｓｅｎｅ（ＥＤＴＡ））で洗い、３７°Ｃ１５％ＣＯＺ下で３〜５分間分間イン キュトートそして細胞を固い面でたたくことにより追い出すことによった。次に 、細胞の再懸濁のために１０−の培地を加え、そしてその混合物を５０ｍ１のシ リコン処理ポリプロピレンチューブに移し入れた。体積が５０ｄとなるよう培地 で調整し、そして少量を細胞数測定のため取り出した。その細胞を１０分間、１ 　＋　０００ｒｐｒｒｌの遠心により沈澱させ、■−の培地中で再懸濁し、１２ ２μＣｉのクロミウム−５１を増殖フラスコごとの５ＫＢｒ３細胞に加えた。こ の細胞懸濁液を４５分間３７°Ｃで時々撹拌しながらインキュベートし、その後 １４ｍ１のＨＢＳＳ　−Ｃａ　−Ｍｇを加え、細胞を沈澱させ、そして上清を除 去した。この細胞を、残ったクロミウムを除去するために５０ｍ１のＨＢＳＳ　 −Ｃａ　−Ｍｇで一回、そして培地で一回洗浄し、そして培地で２Ｘ１０’細胞 １０．１−の密度となるように再懸濁させた。標準的な実験用９６穴培養プレー ト中に０．１戚の標識された細胞を入れ、さらに０．１　ｄの培地のみまたは適 当な評価試料、即ち、クアドローマ上清液、ヘテロ複合体（ヘテロコンジュゲー ト）又は親細胞系より分泌した抗体を加えた。

この混合物を３７°Ｃ２９５％大気、５％ＣＯ□雰囲気下で４５分間インキュベ ートして、抗体を作用細胞に結合させ、次に結合していない抗体を除去するため 、この細胞を洗浄した。次に、上清を除去し、０．２　ｄの作用細胞／ウェルを 加え、そしてこの作用／標的・細胞の混合物を大気９５％／ｃｏ２ｓ％雰囲気下 で３７°Ｃ，３時間インキュベートした。この細胞混合物を沈澱させ、そして０ ．１　ｄの上清を取出し、そしてガンマ−カウンターで細胞溶解の比率及び細胞 障害の程度を測定した。

図９は、４Ｈ３及び５Ａ５のクローンより分泌した抗体によるパーセント殺傷力 が、それらの親細胞、５２０Ｃ９及び３Ｇ８すなわち４Ｈ３及び５Ａ５を作り出 すための融合に用いられた細胞より分泌された抗体のそれよりもかなり大きかっ たことを示す。

４Ｈ３そして５Ａ５による殺傷力は、実際２倍近くあった。ペテロ複合体、５２ ０Ｃ９／３Ｇ８は４８３及び５Ａ５に見られたものと同じぐらいの細胞障害作用 を示した。図９はまた、３Ｂ５からのコントロール培地の細胞障害活性が、コン トロール培地で見られたものと同じ程度であったことを示す。それゆえ、クアド ローマ４Ｈ３及び５八５、並びにそれらより得られたサブクローンは、二価特異 性活性を有する抗体を生産することが明らかである。

トリチウムで標識された５ＫＢｒ３による細胞毒性試験：５Ａ５並びに４８３の クローン、そしてこれらに対応するそれぞれのサブクローン２８１及び２Ｄ３並 びに３０７及び３Ｅ７より生産された抗体の二価特異性細胞障害活性を以下の方 法により測定した。結果を考察する上で、抗体らはＦｃレセプター細胞、さらに は５２０Ｃ９抗原を示す乳癌細胞に結合することを示すことが予想されるという ことを認識しておくことが重要である。

ヒトバッフイーコート細胞（Ｈｕｍａｎ　ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ　ｃｅｌｌ）を インターロイキン−２で再処理し、そしてトリチウムで標識された５ＫＢｒ３乳 癌細胞と伴に、これを抗体存在下または様々なコントロール条件下で培地の中で インキュベートした。５ＫＢｒ３細胞の標識は、トリチウムで標識されたチミジ ン（２，５μＣｉ／ｍｌ）の添加された培地中でこの細胞らを２４時間増殖する ことによる。培養終了後、細胞らはトリプシンにより除去し、遊離トリチウムを 除去するために洗浄した。この実験は無血清培地中で行われ、数人のボランティ アのバッフイーコート細胞で繰り返した。この抗体は５ＫＢｒ３細胞に加えてバ ッフイーコート細胞の抗原に対しても認識しうる結合部位を有するので、この抗 体はその対応する単一特異性の抗体に比べ、殺傷力を増強させる。それゆえ、一 つのコントロールは、バイブリドにより生産された抗体に対する、５２０Ｃ９ま たは３Ｇ８の単独又は組み合わせによる殺傷力の程度の測定より成る。二つ目の コントロールは、５２０Ｃ９及び３ＧＢにより構成されたヘテロ抗体複合体の殺 傷力のレベルを比べることにある。後者は、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ＋　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、可Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

１９８４、１６０　：　１６８６〜１７０１詳述の化学架橋剤を用いることによ り形成した。最後に、コントロール培地も試験した。

図１０は、５Ａ５または４８３またはそれらのサブクローンのいずれのバイブリ ドが生産した抗体も、その５ＫＢｒ３細胞に対する殺傷力において、５２０Ｃ９ または３ＧＢ抗体のそれよりも効果的であったことを示す。これらを合わせると 、これらの結果より５Ａ５及び４）１．３並びにそれらのサブクローンが生産し た抗体は二価特異性抗体であることを立証した。

抗体の特性記述：５Ａ５サブクローンからの抗体、２Ｂ１を精製、特定し、そし て以下の方法でその細胞障害活性を測定した。１４．５ｄの脱脂腹水液を、セフ ァクリル−２００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−２００）特級カラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　Ｃｏ、）でクロマトグラフにかけた。カラムは直径２６ｍｍ長さ８５０肛 であり、１１００ＩＩＩトリス塩酸緩衝液ｐＨ８，６で平衡化させた。溶出液は ０Ｄ２１１゜で測定し、そしてフラクションは４ｄづつ集めた。図１１はその溶 出状態を示す。２０％のゲルを用いたＳＤＳゲル電気泳動により、カラム通過フ ラクションのうち２９〜３６の中に抗体が含まれていたことがわかった。これら のフラクションをプールし、水で４倍希釈し、そして２５ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ ８，６であらかじめ緩衝したＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カ ラム　（２６ｍｍＸ　１３０ｍｍ）でクロマトグラフにかけた。カラムは一回５ ０ｍの２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，０で軽く洗い、そして抗体を５００ｍ のリン酸ナトリウムｐＨ７，０の２５から２００ｍＭのグラジェントにより溶出 させた。溶出液はＯＤ２．。で測定し、そしてフラクションは、Ｍづつ集めた。

その溶出状態は図１２に示される。フラクションらは２０％ゲルによるＳ０５　 ＰＡＧＥゲル電気泳動法により抗体を分析され、そして５２〜６２をプールし、 同様に７８〜８５及び１０２〜１１０もプールし、そしてそれらはそれぞれ５２ ０Ｃ９抗体、二価特異性抗体、及び３Ｇ８抗体を含むことを示した。ゲルの図は 図１３に示した。三つのフラクションは無菌濾過され、前述したクロミウムで標 識された５ＫＢｒ３細胞に対する細胞障害活性に試験された。その結果を図１４ に示した。この図により、２Ｂ１２価特異性のプールは、抗体濃度が１１００ｎ ／ｍからｌｎｇ／　ｍ１１の範囲で、５２０Ｃ９及び３Ｇ８プールと比較して、 めざましい殺傷力の増大を示すことが、明らかとなった。

だいたいにおいて詳述したが、出願人がその発明について希望することは、これ ら教示したものに代用できる材料及び方法は多数あるが、それらは本発明の範囲 に属すると当業者が考えることである。本発明はもっばら添付された請求範囲に 限定される。

ロコントロール　＋Ｒ１２３◇ヒドロエチジンＦＩＧ、１ 時間（日） ロコントロール　＋Ｒ１２３ ◇ＨＥ　１０ＵＧ／ＭＬ　ΔＨＥ５ＵＧ／ＭＬＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ チャンネル番号×１０１ ＦＩＧ、７ ０　５　１０　１５、２０　２５　３０％細胞毒性 ＦＩＧ、　１０ ％特異的 試薬　濃度　溶解性 提供者＃１５２ 提供者＃１５４ 提供者＃１５８ ＦＩＧ、　１３−１ カラム両分 ＦＩＧ、　１３−２ カラム画分 ＦＩＧ、　１３−３ ＦＩＧ、　１３−４ ＦＩＧ、　１４ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０４０２３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハイブリド細胞を選別する方法であって、（ａ）第１の細胞タイプを、第１ の蛍光色素を含有する生理溶液中で、蛍光励起セルソーター装置により検出可能 な量で前記第１の細胞タイプが、前記第１の蛍光色素で標識されることを可能に するような時間及び有効濃度で接触せしめ、ここで前記第１の細胞からの前記第 １の蛍光色素の除去速度は無視できるものであり； （ｂ）第２の細胞タイプを、第２の蛍光色素を含有する生理溶液中で、蛍光励起 セルン−ター装置により検出可能な量の前記第２の蛍光色素、及び前記細胞内に 検出可能なレベルで前記第２の蛍光色素を保持するのに有効な量のカルシウムチ ャンネル遮断剤を前記第２の細胞タイプが取り込むことができるだけの時間及び 有効濃度で接触せしめ；（ｃ）前記生理溶液から前記第１の及び前記第２の細胞 タイプを単離し； （ｄ）ハイブリド及び非融合細胞の混合物を作り出すために、前記の単離した第 １の及び第２の細胞タイプを融合剤存在下の生理溶液中で一緒にすることであり ；そして（ｅ）前記混合物を蛍光励起セルソーター装置に通すことにより、該溶 液混合物から、前記第１の及び第２の細胞タイプを含んで成るハイブリド細胞を 単離する、段階を含んで成る方法。 ２．前記第１の細胞タイプがゲッ歯動物細胞である、請求項１に記載の方法。 ３．前記第２の細胞タイプがゲッ歯動物細胞である、請求項２に記載の方法。 ４．前記蛍光色素らがローダミン１２３及びヒドロエチジンにより構成される組 み合わせより選んだ、請求項３に記載の方法。 ５．前記第１の蛍光色素がヒドロエチジン、そして前記第２の蛍光色素がローダ ミン１２３である、請求項３に記載の方法。 ６．前記第１及び第２の細胞タイプがマウス細胞であり、そして前記第１の蛍光 色素がヒドロエチジンそして前記第２の蛍光色素がローダミン１２３である、請 求項５に記載の方法。 ７．前記第２の細胞タイプそして前記第２の蛍光色素を前記マウス細胞からロー ダミン１２３が除去されることを防止するのに、十分効果的な量のカルシウムチ ャンネル遮断剤の含んだ生理溶液中に入っている、請求項６に記載の方法。 ８．前記カルシウムチャンネル遮断剤がベラパミルである、請求項７に記載の方 法。 ９．前記ベラパミルが約１０μｇ／ｍｌの濃度である、請求項８に記載の方法。 １０．前記ヒドロエチジンが前記生理溶液中で約１〜２０μｇ／ｍｌの濃度であ る、請求項９に記載の方法。 １１．前記ローダミン１２３が前記溶液中で約０．５〜１．０μｇ／ｍｌの濃度 である、請求項１０に記載の方法。 １２．前記第１及び前記第２の細胞タイプとヒドロエチジン及びローダミン１２ ３との接触が約１５〜４５分間である、請求項１１記載の方法。 １３．前記第１及び第２の細胞タイプとヒドロエチジン及びローダミン１２３と の接触が約２１〜３７℃で約１５〜３０分間である、請求項１１記載の方法。 １４．前記マウス細胞がハイブリドーマである、請求項７に記載の方法。 １５．前記工程（ｃ），（ｄ）及び（ｅ）の溶液が前記第２の蛍光色素を前記第 ２の細胞タイプの中に測定可能なレベルまで保持できるほど十分に効果的な量の カルシウムチャンネル遮断剤を含む、請求項１に記載の方法。 １６．請求項１に記載の方法により製造したハイブリド細胞。 １７．請求項７に記載の方法により製造したハイブリド細胞。 １８．請求項１３に記載の方法により製造したハイブリド細胞。 １９．ハイブリドーマ、トリオーマ及びクアドローマより構成されたグループよ り選択された、請求項１３に記載の方法により製造したハイブリド細胞。 ２０．請求項７に記載の方法により製造した抗体。 ２２．請求項１３に記載の方法により製造した抗体。 ２３．請求項１６に記載の方法により製造した抗体。 ２４．請求項１９に記載の方法により製造した抗体。 ２５．ハイブリドーマ２Ｂ１。 ２６．ハイブリドーマ２Ｂ１より分泌した抗体。