JPH04500909A - 家畜からの多能性胚細胞系の誘導 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

従来の遺伝学は、種に発見された突然変異又は先注する遺伝性多形現象に依存し た。研究のために利用できる遺伝的変異体の範囲を広くするだめの唯一の実験的 アプローチは、突然変異誘発、続く適切な対立遺伝子の特異的スクリーニング又 は偶然の回収であった。動物育種は、家畜中に導入される適切な変異からの選択 に依存する。遺伝子分析のための主な手段は、育種分離研究及び直接の表現型の 分析であった。 哺乳類の遺伝学への多大な理論的且つ実際の興味にもかかわらず、実験動物の従 来の遺伝子分析は、それらの比較的小さなサイズ及び長い生活環のために、他の 実験動物システムに相対して不利な地位に立たされて来た。しかしながら、哺乳 類の遺伝子学は、ヒトの遺伝学の研究から利益を得て来ており、ここで、実験的 な育種は存在しないけれども、ひじように大きな人口の詳細な観察が多形現象及 びひじようにまれな実験変異の両者の研究を可能にし、そして遺伝的分離のヒト 系図から利用できるデータの分析のための統計学的方法がひじょうに改良されて 来た。 これに加えて、非減数分裂性遺伝子分析、体細胞遺伝学及びつい最近の直接的な 分子生物学的分析のための方法が存在し、そして実際、ひじょうに効果的に適用 され、そして系図分析と共に組合され、その結果、哺乳類の遺伝子地図及び遺伝 子配列データの知識が急速に前進して来た。 しかしながら、これは観察的な分析である。遺伝子機能の理解及びまた、実験動 物における、その遺伝子知識の実際の適用は、好ましくは自然での偶然の出来事 に完全に頼らない態様で、ゲノムを故意に変性する能力を必要とする。従って、 特異的遺伝子変性の効果が損われていない生物体の情況において研究され得る、 哺乳類の逆向き遺伝学の概念が出現する。 対象の遺伝子は、強化哺乳類遺伝子分析の結果から同定されるのみならず、重要 なことには、それらの分子生物学を通して及び他の種の遺伝子に対する交差相同 性により同定される。ひじょうに多くの場合、マウスにおいて、それらの分子生 物学を通して、他の種の遺伝子との相同性により（たとえばヒト疾患症候群又は ショウジョバエの遺伝学）又はそれらのタンパク質生成物の生化学から（但し、 そのためには、機能欠乏性対立遺伝子が存在せず、そして従って、機能の正確な 遺伝学的試験が存在しない）同定されて来た遺伝子が存在する。これらは、タン パク質構造又は遺伝子制御の突然変異のいづれでもない。これらは、そのような 対立遺伝子を創造することによって単に供給され得る。家畜への実際の適用の分 野においては、制御遺伝子の所望する欠失又はその機能の所望する変性であり得 る通常の生理学的変更は、他のものの過剰発現と同じように重要である。そのよ うな標的遺伝子の欠失又は変性を引き受ける技法は、ヒポキサンチンホスホルボ シルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＲＴ）の遺伝子座でヌル対立遺伝子の創造 により例示されるような可能性に達した〔１〕〔２〕。配列が知られているいづ れかの遺伝子の機能又は特異的変性の欠失のための標的及びスクリーニングを可 能にするであろう方法の開発は、現在、進行中であり、そしてこれは明らかに、 現実的な提案である。それは、次の年かそこらでマウス細胞のための利用できる 日常の技法になるであろうし、そして家畜の胚の幹細胞の開発により、これらの 種にすぐに適用できるようになり、そして十分にトランスジニ・ツク路の選択に なり得る。 哺乳類のトランスゲネシス トランスジニック動物は、集中的な実験介在の結果としてゲノム中に安定して導 入されたそれらのＤＮＡにおける変更を有する。典型的には、これらは追加の外 因性の外来性ＤＮＡ又は新規のＤＮＡ構成体に起因する。標的の特異的遺伝子の 出現により、直接的な実験操作による外因性遺伝子配列のトランスゲネシス特異 的変性の定義から必ずしも排除する必要はない。 哺乳類遺伝学への十分な実験的アプローチは、従来の接合体の注入トランスゲネ シス及び胚の幹細胞の両者の使用を通してひじように急速に実現化になって来た 。後者のアプローチは、完全な動物の再構成の前、集中的なインビトロ遺伝子操 作、選択及びスクリーニングを可能にする。従って、実験的な分子遺伝学及び動 物における遺伝子変化を行なう能力の両者が利用できる。実際上の目的のために は、マウスがそのような研究のための選択の種であるが、しかしマウスで開発さ れた方法をより大きな家畜の種にそれらの実際の適用の意図でもって拡張するこ とができることが重要である。新しい実験哺乳類の遺伝学は、インビトロでの遺 伝子変性の試験及び標的種の遺伝的な変性の企画を可能にする。１つの最っとも 重要な見通しは、医薬試験及び医薬の開発のための疾病の実験的な動物のモデル の構成である。他は、食品、耐病性及び生物医薬的なタンパク質の生成のための より所望される品質を創造するために家畜の特異的変性のためである。 トランスゲネシスのための方法 ＤＮＡのマイクロインジェクションはトランスジニック動物を生成する最っとも 通常に使用される方法であるが、トランス遺伝子を導入する組換えレトロウィル スベクターを用いての胚の感染及びまた多能性胚幹（ＥＳ）細胞の使用も包含す る。 遺伝的変性体の哺乳類への導入のためには、細胞を遺伝子的に形質転換すること が必要であり、この子孫は損なわれていない生物のすべての部分又は所望する部 分に発生することができる。接合体マイクロインジェクション〔４〕は、単一細 胞での又はひじように初期の分裂段階での胚のゲノムの形質転換によりトランス ゲネシスを達成する。哺乳類における生殖細胞系は初期の原始的なストリーク段 階で体細胞前駆細胞系から分離されるので、この段階の前での、たとえば分裂胚 のレトロウィルスベクター感染による、胚細胞の形質転換〔５〕が、体細胞的に 及び生殖系においてトランスジニック性である動物を供給することができる。こ の段階の後での細胞の遺伝子形質転換は、生殖細胞系又は体細胞遺伝子モザイク のいづれかを導ひくであろう。幹細胞が生物がら単離される場合、Ｊ、れらは形 質転換され、そし７てそれらの標的組織を内コロニ“、−化４るために使用され 得、そしてそのような技法の使用は造血幹細胞操作〔７〕により例示される。体 細胞トランスゲネシスへのこのタイプの−ｆブローチは、ヒトの遺伝子療法のた めの唯一の倫理的なルートであり、そして家畜の遺伝子変性のために特に有用で あることを十分に示し、そして幹細胞が、それらの標的組織を再構成するために それらを使用する前、組織培養で保持され得る場合、所望する形質転換体のため の選択が再構成を先んすることができる利点が存在する。たとえばＥｄｗａｒｄ ｓの哺乳類の上皮幹細胞の過渡培養の使用〔８〕を参照のこと。生殖細胞系の分 離の前、胚から単離される細胞は、生殖細胞系のトランスゲネシスのための遺伝 子ビークルを供給することができる。胚の幹細胞はマウス

〔９〕〔１０〕及びハ ムスターからのそのような性質を有するさ思われる細胞〔１１〕から単離されて 来たが、類似するタイプの細胞が他の非ゲソ歯頚の胚から必ず単離され得ること は決して明らかでない。さらに、マウスに゛つぃて記載されるような方法及びハ ムスターのために利用される方法は、他の胚に直接適用できる見込はない。事実 、マウスの胚の幹細胞のために使用される方法に基づく方法により羊の胚の幹細 胞を単離するためにその分野における何人かのを能な研究者の報告された失敗（ 楽観的な標記にもかかわらず）　［１２）は、これを指摘する。他は細胞を単離 したが、しかし細胞系を維持し、又はそれらの多能性を示すのに失敗した〔１５ 〕。過去の失敗は、その細胞が早い増殖性のものであり、そしてマウスの細胞に 似ている予想によるものであった。悪性形質転換は胚盤の生来の無活動を克服す るために必要であることが事実報告された〔６〕。 不成功であった種々の科学学会で口述された多くの試みも存在した。マウスの胚 幹細胞が初めに単離される場合、実質的にあらゆる予測される性質が予測され、 そしてそれらが見出された胚段階が明確に同定された〔１３〕。この背景は、推 定上の有蹄類の胚の幹細胞のために利用できない。 マウスの胚から胚の幹細胞の単離のために確立され、そしてそれについて記載さ れており、そしてハムスターの胚に都合良く適用され得る方法がウシ及びブタの 胚により例示されるように有蹄類の胚に適用できないことが発見された。特に、 胚の幹細胞の単離−他の細胞タイプから幹細胞の同定及び単離において最とも重 要な段階は、細胞の必要な組織培養操作におけるように、まったく異なって基礎 づけられている。 初期の哺乳類の発生：有蹄類からの幹細胞の単離のための理論的な考慮 哺乳類において、受精から着床への胚の発生パターンは極間で広く類似し２卵細 胞の受精は輸卵管で生じ、そして接合体が一連の有糸分裂しながら、子宮に輸送 される。個々の分裂で、細胞の大きさは小さくなり、そしてその結果、胚の体積 は一定に存続する。胚盤胞は、膣が肺内に現われる場合、ある段階で形成される 。この時点で、細胞は２種のタイプ、すなわちそれぞれ胎盤の胎児様部分及び胎 児になる栄養芽層及び内部細胞塊状物に分化する。しかしながら、着床の時まで に、種間に多くの差が観察される。特にマウスにおいては、子宮上皮中への着床 は侵入的且つ急速な工程である〔１４］。 有蹄類、特に牛、羊及びブタにおいては、着床は、栄養外胚葉が急速に増殖し、 そして内部細胞塊状物が静止杯盤を形成する間、相当に遅れた後でのみ生じる。 これらの場合、着床は、胎児細胞き母性子葉との間の弱い関係を包含する〔１４ 〕。 従って、幹細胞が単離され得る時での初期発生は、有蹄類からマウスを包含する 多くの種においてひじように有意に異なる。 ネズミの胚の幹細胞系の単離のための方法は現在十分に確立されている。マウス からの胚の幹細胞の単離の成功は注意したタイミングのための必要性の認識に依 存し、その結果、ＩＣＭ細胞は、ＩＣＭ系に委任され、そして分化された誘導体 の影響を受けない

〔９〕。推定により、幹細胞は有蹄類及び他の種から同様に１ 〜で単離され得ることが論議され得るが、る。種々の手段が、たとえば発生の速 度がひじように遅く、そして初期の胚の外胚葉が円盤状配列で存在し、そして５ 日目のマウスの胚におけるのと同じ固体塊状物でない場合、有蹄類のために必要 とされるであろうことが推測される。これらの考慮は、着床前の胚の胚細胞が、 胚盤の代謝静止の必須期間により、インビトロで容易に培養できず；そして幹細 胞が、単離される場合、マウスの胚の幹細胞に形態的又は増殖特徴において必ず しも類似しない予測を導ひいた。これらの情況において、幹細胞タイプの認識は 困難である。それにもかかわらず、有蹄類からの幹細胞の単離のために、及び確 立されるべき細胞系のために十分な細胞分化を妨げるために十分であるこれらの 条件を定義することができる。必要とされる細胞タイプ及びその単離の手段は、 多くの他の哺乳類の胚、たとえば霊長類の胚はマウス及びいくつかの他のゲラ歯 頚に見られる胚盤葉上層及び円柱状卵よりも有蹄類に見られる構造により類似す る胚盤を通して進化するので、マウスにおける胚の幹細胞の単離の手段よりもよ り一般的であることがわかる。 有蹄類の胚から胚の幹細胞の単離及び培養方法１、組織培養培地 ５〜１０％の胎児及び新生児ウシ血清、イーグル培地に対する非必須アミノ酸及 び０．１ｍモルの２−メルカプトエタノールにより補充されたダルベツコ変性Ｄ 　Ｍ　Ｅ　Ｍ培養培地を使用する。 血清の選択に対する特別な注意が必須であり、そして類似しないほとんどの血清 がマウスの胚の幹細胞誘導のために使用され、５６℃で３０分間の血清の熱不活 性化が必要であることが見出された。 ２、胚の説明 両種の胚は、マウスからの培養物において異なって挙動する。ウシの胚の場合、 その方法は次の通りである：インビボからフラッシュされた新鮮な６日目の胚又 は好ましくは、インビトロで受精され、インビトロで成熟された卵細胞（Ａｎｉ ｍａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｌｔｄ、により供 給される）からインビトロで増殖された、発生の６〜７日目での胚（来町化の十 分に拡張された胚盤胞）のいづれかが、組織培養培地にさらに１又は２日間増殖 せしめられる。それらは自発的に町化するか又はそれらの透明帯から機械的に開 放され、そして前で説明したようにＳＴＯ線維芽細胞支持細胞層を含むペトロ皿 の底に移植される。マウスの胚に関する場合と違って、内部細胞塊状物由来の細 胞は中央の円柱状卵を形成しない。胚の幹細胞の前駆体として単離され得るそれ らの誘導体は、移植体の周囲上に見出される。それらは、トリプシン／ＥＧＴＡ ／ポリビニルアルコール（それぞれ０．２５％：０．１ｍＭ：１０■／−）を用 いて注意したトリプシン化により単離され、そして下記のようにして再プレート される。 ブタの胚に関しては、その工程は次の通りである：卿化（６，５日）〜栄養膜拡 張（１１日）の段階からの胚が、損なわれないで移植され（この場合、栄養膜層 のほとんどが死滅している）；又は好ましくは、胚盤が、線維芽細胞支持細胞層 、典型的には不活性化されたＳＴＯ線維芽細胞上に移植される前、胚盤を単離す るために切開される。主な結果物は、胚の幹細胞の前駆体であることが認識され 、そしてこれらは分離され、そして継代培養される。これらの主な幹細胞物は確 立された細胞系とは異なり、そしてより半透明で平らな密充填上皮Ａ口二一とし て現われる。 ３、支持細胞及び増殖因子 いづれかの種のためには支持細胞としてＳＴＯ線維芽細胞を使用することで十分 である。外因性増殖因子又はならし培地を使用する必要はない。 ４、幹細胞の認識及び単離 マウス及びハムスターの胚の幹細胞とは異なって、有蹄類の胚の幹細胞は多層化 されたコロニーを形成しないが、しかし結果的に単層を形成するために広がる特 別に平らな分極性上皮コロニーに増殖する。その細胞は、マウスの細胞よりも大 きく、大きく明確な核、すなわちいくつかの突起した核及び比較的小さな細胞質 を有する。細胞の大きさは、単離ごとに異なり、そして増殖条件により異なるこ とが見出されているが、しかし一般的な形態及び外観は特徴的である。 他の非上皮細胞タイプが観察され、そして単離されたが、しかしこれらは記載さ れた分化性質を有さない。 ５、培養での細胞の維持 細胞は、３〜４日の間隔で新鮮な支持細胞上でのトリプシン化により４〜５のう ち１つを継代培養し、又はそれらが集密性を達成するちょうど前で継代培養され る。集密性の前、継代培養の失敗は、続ける場合、細胞系の損失を導ひく自発的 な分化の開始をもたらす。未分化コロニーは、培養物の一部分化の後、回収され 得る。その細胞は支持細胞なしに増殖するが、しかし胚様体を形成するそれらの 能力は影響を受けるようになる。 ６、幹細胞の確証 これらの細胞は、自発的に又はモルホゲン、たとえばジメチルスルホキシドはレ チン酸への応答により培養において容易に分化する。主な分化された誘導体は、 線維芽細胞、神経内胚葉及び３種の原基層の代表である筋肉であり、そして細胞 の多能性を確証する。さらに、これらの細胞は、照射されたヌードマウスの腎臓 被膜の下部に移植される場合、腫瘍を形成し、これらの腫瘍は種々の分化細胞タ イプを示す奇形癌である（第７８及び７ｂ図）。 インビトロでの凝集に基づいて、胚様体が形成される。これらは、マウスの胚様 体と、それらがヒト奇形癌細胞により形成される胚様体に見られる分極に類似す る分極を示す事実により明らかに異なる。組織培養皿中へのこれらの胚様体の移 植は、急速且つ集中的な分化をもたらす。 これらのすべての観察は、記載される培養物が実際の胚の幹細胞であることを示 す。 本発明は、幹細胞、及び発生が胚盤、特に有蹄類の胚（たとえばブタの胚及びウ シの胚）によってであるすべての胚からの胚の幹細胞の単離のための上記のよう な一般的な方法を提供することができる。本発明は、特定の遺伝子背景又は特異 的突然変異を担持する胚からそのような細胞の誘導を提供することができる。た とえば、高い純種家畜からのそのような細胞の誘導である。それはまた、分化の ためのそのような細胞の調製方法及び使用、並びにインビトロでの新生研究、及 びインビトロ又はインビボでのいづれか他の分化された細胞の源としてのそのよ うな細胞の使用方法も提供する。さらに、本発明は、同じ種の胚を再集団化する ためにそのような細胞の使用を提供し、従ってそれらはキメラ動物、特に生殖細 胞のいくつか又はすべてが組織培養細胞に由来するキメラ動物；たとえば胚の幹 細胞が遺伝的に変性され又は培養にお源により又は特異的遺伝子変性により、特 異的遺伝子性質を有する細胞を用いて、核摘出された卵細胞又は他の胚細胞中へ の核の移行のための核を提供するために細胞系として一時的に培養され得又は維 持され得る。 本発明は、インビトロで培養された胚の幹細胞からの核を受けた細胞からの胚の 発生を可能にすることができる。それは、核摘出された卵細胞又は他の胚細胞中 への核移行のための核を供給するために、誘導されたキメラ動物又はそのような キメラ動物の子孫又は誘導された核−クローン化動物又はそのような動物の子孫 の特定の部分（たとえば乳腺、肝臓）に新規のタンパク質産生を導くような方法 において、遺伝的に形質転換された幹細胞の使用を可能にすることができる。 本発明の幹細胞は、遺伝子形質転換の技法に使用され得、そして胚の移行により 遺伝的に形質転換された生存動物を生成するためへの胚の創造に使用され得る。 本発明の範囲は、幹細胞自体のみならず、また胚及び遺伝的に形質転換されたそ れらに由来する動物を包含する。本発明はまた、幹細胞、胚及び動物の産生のた めの実質的に非生物学的方法も包含する。 本発明の１つの観点によれば、ウシ幹細胞系及びその産生のだめの方法が提供さ れる。 本発明のこの観点はまた、ウシ幹細胞を含んで成る細胞培養システムも提供する 。 ウシ幹細胞は便利には、適切な組織培養増殖培地においてウシ胚盤胞（インビボ 又はインビトロで受精された）を増殖することによって産生される。１つの好ま しい培地は、非必須アミノ酸（イーグル）（約１体積％）　、１０−’Ｍのβ− メルカプトエタノール１０％の新生ウシ血清及び１０％のウシ胎児血清（両血清 は使用する前、５６℃の温度で３０分間の処理により熱不活性化されている）に より補充された、ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）　７５部及びＨａｍ 　Ｆ１２Ｍ培地２５部の混合物から成る。 吟化の後、その胚盤胞は所望により、分離を引き起こすために処理される。これ は好ましくは、１０−’ＭのＥＧＴＡ　（エチレングリコール四酢酸）及び１０ ＪＰｇ／ｒｎｌのポリビニルアルコールにより補足されたトリプシン　（０，２ ５％Ｄｉｒｃｏ）リブシン、１／２５０）に約１０分間含浸することにより、舶 化後１日でその胚盤胞を処理Ｌ、続いて分離を引き起こすために、小さなピペッ トにより吸い取り、そして吹き出すことによる物理的な処理によりもたらされる 。 従って、好ましい観点において、本発明は、組織培養増殖培地においてウシ胚盤 胞を増殖せしめ、そして胚盤胞の分離を引き起こすためにＥＧＴＡ及びポリビニ ルアルコールにより補足されたトリプシンに約１０分間、吟化後約１日で胚盤胞 を含浸する段階を含んで成る、ウシ幹細胞を得るための方法を提供する。 分離の後、破壊された胚盤胞細胞は再プレート化され、そして不活性化されたＳ ＴＯ細胞と一緒に、増殖培地の追加の供給物において増殖せしめられ、少なくと も２種の異なったタイプの細胞のコロニーの増殖をもたらす。 適切なインキュベーションの後、幹細胞のコロニーは、下記のようにして形態に より選択され得る。その細胞は、不活性化されたＳＴＯ細胞及び増殖培地におい て増殖せしめられ、そして１週に約１回継代培養される。 ４回文５回目の継代の後、細胞は種々のタイプの追加の処理にゆだねられ得る。 たとえば、細胞は、貯蔵が必要とされる場合、凍結され得る。 他方、新鮮な細胞が、従来のマイクロ操作技法を用いて、宿主の胚盤胞に導入さ れ得る。典型的には、１〜１５個の細胞が宿主胚盤胞に導入される。次に、その 胚盤胞は、それがキメラ動物に進化する偽妊娠の育成母の子宮に導入され得る。 宿主の胚盤胞への導入の前、細胞は所望により、既知の技法、たとえばＤＮＡ形 質転換、相同組換えによる標的突然変異又はレトロウィルスベクターによる感染 により操作され得、その結果、得られる動物の変性を可能にし、そして所望する 特徴を有する動物の産生を可能にする。 さらにもう１つの観点において、本発明は、組織培養増殖培地においてウシ胚盤 胞を増殖せしめ；町化の後、その胚盤胞の分離を引き起こし；その分離された細 胞を組織培養増殖培地において増殖せしめ；幹細胞コ［］ニーを形態的な特徴に より選択し：そしてその選択された幹細胞を組織培養増殖培地において増殖せし めることを含んで成る、ウシ幹細胞を得るための方法を提供する。 本発明はまた、本発明の１又は複数のウシ幹細胞を導入された胚盤胞及びそのよ うな胚盤胞のキメラ子孫も提供する。 本発明は、次の例において及び添付図面に関して、例示的にさらに説明されるで あろう。 第１図は、細胞培養において増殖する幹細胞のコロニーの写真であり：そして 第２図は、ウシ幹細胞の単層の写真である。 霞 ウシの胚を次の方法により処理する二 胚をインビボで受精せしめ、この場合、それらは５〜６日目の胚の発生で既知の 技法によりウシからフラッシュすることによって得られる。しかしながら、イン ビトロで受精された胚を使用することが好ましく、そして次の操作が、インビト ロ受精により誘導され、そしてＡｎｉｍａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃ ａｍ−ｂｒｉｄｇｃ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｅｎｇｌａｎ ｄから得られた新しく拡張されたウシ胚盤胞を用いて行なわれた。類似する材料 をまた、他の市販源から得ることができる。胚盤胞を凍結した形で得ることがで きるが、しかし新鮮な胚盤胞を用いることが好ましい。 胚盤胞を、ミドマイシンにより不活性化されたＳＴＯ細胞の支持細胞層上の組織 培養増殖培地における培養皿上で増殖する。使用される培地は、非必須アミノ酸 （イーグル）（約１体積％）　、１０−’Ｍのβ−メルカプトエタノール、５０ 単位／ｍ７！のペニシリンＧ１１０％の新生ウシ血清及び１０％ウシ胎児血清（ 両血清は、使用する前、５６℃で３０分間熱不活性化されている）により補足さ れた、ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）７５部及びＨａｍ’ｓ　Ｆ１２ Ｍ培地２５部の混合物から成る。胚盤胞は、空気中において約５％の二酸化炭素 の雰囲気下で、二酸化炭素ガス湿潤インキュベーターにおいて３７℃でインキュ ベートされる。 インキュベートしている胚盤胞は、町化が観察されるまで、定期的に、たとえば １日２度、顕微鏡を用いて試験される。 このタイミングは、種々の胚により異なるが、しかし典型的には、約２日後であ ろう。 次に、吟化された胚盤胞を、２種の方法のうち１つにより処理する。 １）第１のアプローチにおいて、吟化後約１日で、胚盤胞を、１０−’ＭのＥＧ ＴＡ　（エチレングリコール四酢酸）及び１０．／ｒｄのポリビニルアルコール により補足されたトリプシン　（０，２５％のＤｉｒｃｏ）リブシン、１　／２ ５０）に約１０分間含浸することによって処理する。この混合物は、細胞の生存 性を維持しながら、胚盤胞の細胞を分離するように作用する。 直径約５０〜１００ミクロンの先端を有する小さなピペットを用いて、細胞を、 吸い込んで、そして吹き出し、細胞をクラスター状にし、胚盤胞構造を破壊する ことによって物理的に分離する。 破壊された胚盤胞をすぐに、下記のように追加の処理にゆだねる。 ２）もう１つのアプローチにおいては、病化された胚盤胞を組織培養培地中にそ のままにし、そしてさらに発生せしめる。 約３〜４日後、胚盤胞の内部細胞塊状物が移植体の縁のまわりに位置する丸状の 細胞のクラスターで見出されることが観察される。この段階で、上記１）におい て使用されたトリプシン混合物を培養皿に添加し、そして約１０分間のそのまま にする。移植体の縁での細胞クラスターが他のものより一層容易に弱くなり、そ してこれらの細胞を、直径約２０〜３０ミクロンの先端を有する小さなピペット を用いて取出し、そして追加の処理のために移す。 方法１）又は２）による処理の後、破壊された胚盤胞細胞を、ゼラチン溶液によ り処理された組織培養皿表面に再プレート化する。上記増殖培地の追加の供給物 を、約１０−’Ｍの不活性化されたＳＴＯ細胞と一緒に添加し、そしてその皿を ３７℃でインキュベーターに置く。 細胞を、たとえば毎日、顕微鏡により定期的に試験する。 少なくとも２種のタイプの増殖する細胞のコロニーを観察する。 適切なインキュベーション時間の後、幹細胞であると思われるコロニーを形態学 的に選択し：幹細胞は次の特徴を有する： ａ）それらは、細胞質に大きな核及び相当に突出した核により密充填された丸い 細胞であり； ｂ）それらは、密に付着性のコロニーに増殖し、そしてコロニーが大きくなるに つれて、細胞はコロニーの中央で平になる傾向があり、そしてそのコロニーはａ ）で記載された形の細胞の外側のリムを有し；そして Ｃ）上記１）に記載されるトリプシン混合物を用いてのそのようなコロニーのト リプシン処理に基づいて、大きなコロニーの外側の少し平らになった細胞又は中 央での平ら化を伴わないで小さなコロニーのすべての細胞が、明るい相コントラ スト外観を有し、そして３７℃で短時間のインキュベーションの後に観察される 場合、小葉の偽足を示す小さな球状細胞に容易に分離されることが見出され得る 。 そのようなコロニーは第１図に示される。 幹細胞であると思われる適切なコロニーを選択し、そして不活性化されたＳＴＯ 細胞と一緒に増殖培地の追加の供給物を添加されたもう１つの皿に移す。その皿 を３７℃でのインキュベーターに置き、細胞のコロニーの増殖を可能にする。 細胞を１週間に１度継代培養し、すなわち上記１）に記載されるようにしてトリ プシン処理にゆだね、そして新しい皿上に再プレート化する。これは分化を停止 するものである。 細胞が貯蔵される場合、それらは４又は５回の継代の後、凍結される。 他方、この段階での細胞を他の宿主であるウシ胚盤胞に導入することができ；典 型的には１〜１５個の細胞を、従来のマイクロ操作技法を用いて胚盤胞に導入す る。次に、その胚盤胞は、既知方法により偽妊娠育成母の子宮に導入され、又は 人工的な環境、すなわち宿主の胚盤胞及び導入された細胞の両者からのＤＮＡを 含むキメラ動物中において発生する子宮に維持される。キメラ化は、既知の手段 、たとえば遺伝子マーカーの使用により、又はたぶん、単純には、眼での観察に より検出され得る。 宿主の胚盤胞への導入の前、細胞は、既知の技法、たとえばＤＮＡ形質転換又は レトロウィルスベクターによる感染により培養で操作され得、その結果、得られ る動物の変性を可能にし、そして所望する特徴を有する動物の産生を可能にする 。 本発明のもう１つの観点によれば、ブタ幹細胞系及びその生成方法が提供される 。本発明のこの観点はまた、ブタ幹細胞を含んで成る細胞培養システムも提供す る。 本発明のこの観点は、次の例及び添付図面によりさらに説明されるであろう。 第３図。８日目の胚盤胞からの内部細胞塊状物の付着に起因する主要コロニーの 外観。平らな半透明なコロニーが矢印されている： 内部細胞塊状物の分離された主要結果物に起因するコロニーの形態学。第４ａ図 ：周囲で見える細胞産生の大きな栄養模様細胞のコロニー。この培養物は７日目 の胚盤胞に由来した。第４ｂ図及び４０図；上皮付着性であり、そして大きな核 及び突出した核を有する針様細胞のコロニー。第４ｂ図に示されるコロニーは７ 日目の胚盤胞に由来し、そして第４ｃ図に示されるコロニーは８日目の胚盤胞に 由来した。 第５図；形態学的分化を示す確立されたブタ細胞系。第５ａ図；未分化細胞巣。 第５ｂ図；細胞の集密単層。第５Ｃ図；ニューロン様細胞中への形態学的分化を 示す集密単層。 第６ａ図：非付着性下層上での７日間の培養に続くブタ細胞系により形成された 凝集体。 第６ｂ〜６ｄ図；下層への再付着を可能にされた凝集体からの細胞の結果物。い くつかの分化された細胞タイプが眼に見える：第６ｂ図、上皮、第６Ｃ図、筋肉 及び胚盤胞及び第６ｄ図、神経様細胞。 町化された胚盤胞を、発情後７〜９日で、Ｌａｒｇｅ　Ｂｒ１ｔｉｓｈＷｈ　ｉ 　ｔｅブタからの逆行性子宮のフラッシングにより回収した。 その動物は天然でメイトされ、そして過剰排卵されなかった。 それから手動的に切開された損なわれていない胚盤胞又は内部細胞塊状物のいづ れかを、マウス胚盤胞についてＥｖａｎｓ　＆Ｋａｕｆｍａｎ　（１９８１）　 ［９］により記載される方法に類似する方法で、ＳＴＯ線維芽細胞分裂性不活性 化支持細胞上に移植した。 使用される培地は、１０％新生ウシ血清及び５％〜１０％のウシ胎児血清及び０ ．１　ｍＭの２−メルカプトエタノールにより補足されたダルベツコ変性イーグ ル培地であり、そしてならし培地も外因性増殖因子も添加されなかった。 組織化された分化を刺激するために、細胞をトリプシン化により分離し、そして 次に、ヒト奇形癌細胞培養による胚様体の形成の刺激のためにＭａｇｒａｎｅ　 （１９８２）　［３］により記載されているようにして０．５％アガロースの層 により被覆された培養皿上に接種した。細胞分化を促進するために、メルカプト エタノール及びウシ胎児血清の両者を培地から排除した。 培養の確立 これらの培養の方法により、移植されたブタの胚からの培養物を慣例的に確立す ることがこれまでできた。成功割合は多様であるが、それはしばしば、１回の実 験において８個の移植された胚盤胞に由来する６個の好結果の培養物はどの高さ である。 胚盤胞又は胚盤が培養される場合、それらは１日以内で達成する。主要な生成物 は、大きく平らな、高い半透明の上皮細胞のコロニーから成る（第３図）。これ らは、ネズミＥＫ細胞に対してひじょうに異なった外観及び培養形態学のもので ある。７〜１０日目の胚盤胞から切開され、そして同じ手段で培養された栄養外 胚葉の一部は、コロニー又は生成物を形成することができなかった。 主要生成物を、移植の後７〜１４日目に分離し、そして新鮮な支持細胞層に継代 培養した。ひじょうに明確なコロニー境界を有する単層として増殖したひじよう に漸進的な増殖性コロニーを形成した。細胞は、２〜４個の突出した核を含む大 きく明確な核及び比較的希薄な細胞質を有する上皮様細胞である。これらの細胞 の外観上のいくつかの差異は、主に細胞の大きさに関係される種々の単離体間に 認められた。 第４図は栄養膜様細胞の形態学的特徴を有する細胞を連続的に生成する大きな未 分化細胞の小さなコロニーを示す。そのような培養物を、連続培養で４力月間維 持した。このタイプの培養物は、７Ｂ目の胚から生じることが観察された。 第４ｂ図は、より安定し、そしてより大きなコロニーに成長することができる細 胞タイプを示す。これらの細胞は最とも通常の単離物である。ｉ４ｂ図に示され るタイプのいくつかの細胞系は７日目及び９日目の胚に由来した。１つの細胞系 は、細胞表現型の変化を伴わないで５〜７日ごとに１回の継代培養を伴って１年 以上の間、連続培養で維持された。従って、それは不滅的であると思われる。こ れらの細胞の分化は、細胞が高い密度に達することが可能にされる場合、自発的 に生じる（第５図）。明白に、分化された細胞は、未分化培養物の再生を導びく 継代に基づいて再び目的を達成しない。 第４ｃ図は、ひじようにまれに単離された形である小さな細胞のコロニーを示す 。 これらの細胞タイプのすべては、マウスの胚の幹細胞よりもゆっくり増殖し、そ してその細胞と外観上異なる。それらは、培養において、主に栄養膜様細胞又は 内胚葉様細胞への自発的な分化を示す。他の分化された（主に線維芽細胞様）細 胞タイプもまた形成される。 胚様体への分化 分化可能性の試験（Ｍａｒｔｉｎ　＆　Ｅｖａｎｓ　１９７５）　Ｃ６）として 、１２力月間維持された細胞系からの細胞を、非付着性下層上に接種することに よって凝集体の形成を誘発した。数日後、凝集体の１つの端で、立方体形の上皮 細胞の外側が滑らかな層が現われ、そして他端で、よりざらざらした外観の弱く 付着された細胞が存在した。広範な分化は、胚様体が組織培養皿上に再プレート することによって、下層への付着を可能にされる場合に生じた（第６ｂ図）。細 胞は、いくつかのタイプの眼に見える上皮、内胚葉、筋肉及び神経細胞を伴って 密な培養物を形成するために移動し、そして増殖した。これら分化された細胞は 、すべての３種の胚様生殖細胞層の代表的な誘導体であり、そして幹細胞様培養 物は前原節性胚の主要な外胚葉部を表わすことを示唆する。 論議 単離された細胞系は、ネズミの胚の幹細胞をわずかに思い出されるが、相当に異 なった外観を有する。増殖の外観及び形において、それらはヒトーｉ丸奇形癌に 由来するいくつかの細胞系により類似する。それらの凝集体の発生の形は、懸濁 液で維持される場合、ヒト奇形癌細胞系ｆｌｕｔｔ　ＫＥＢ　（Ｍａｇｒａｎｅ に記載される、１９８２）　［３）の形にひじように類似する。これらの分化す る構造はネズミ胚様体に実際相同であることが推定的に結論づけられ、そしてこ の結論は、組織培養された表面上へのそれらの再移植に続く、より広範なインビ トロ分化について報告される観察により強化される。ＭＪＥの１人は、Ｈｕｔｔ 　ＫＥＢ胚様体の非対称形が、マウス円柱状卵と対比して、胚盤を通してのヒト 胚の発生に影響を及ばずことをこれまで推測して来た。初期発生が明らかな上皮 様胚の外胚葉と共に胚盤を通してであるもう１つの種において、単離された細胞 は、マウスＥＣ及びＥＫ細胞の典型的な重層コロニーにおいてよりも単層として 増殖し、そしてそれらの胚様体の分化が明らかに非対称であることを認識するこ とに興味がある。マウスＥＫ細胞の挙動と明らかに異なるこの挙動は、胚の発生 が胚盤を通してであるヒゲッ歯頚の胚の一般的な特徴であるかも知れない。 多能性胚系はブタに由来することができ、そして培養で維持され得ることが結論 づけられる。 これらは、マウスにおいてこれまで記載された外観、増殖特徴及び挙動とはひじ ように異なる。ブタ細胞系とウシの胚に見られるそれらとの間の明確な類似性は 、このタイプの胚細胞系が、胚盤を通して一般的に発生する哺乳類種（そのよう な種の例は有蹄類である）から得られるであろう細胞系の形である提案を強く支 持する。（ａ）正常な胚細胞に対するそれらの関係及びネズミＥＫ系に比べての それらの区別的な特徴及び（ｂ）天然において一時的であるかも知れない制限さ れた能力の幹細胞集団が存在するかどうか及び（ｃ）ある条件下で多能性を示す ことができるこれらの細胞の起源及び性質を決定するために、本発明の胚細胞の 可能性が現在評価されている。ブタの胚の移植物における未分化針様細胞の増殖 の速度はネズミの胚に由来するものの速度に比べて遅いことが注目に値する。こ れは、これらの種における前着床的な発生においてもう１つの重要な差異、すな わち原腸形成の時点まで、有蹄類において内部細胞塊状物の静止期間に影響を及 ぼすことができる。 これらの新しい細胞系は、ネズミＥＫ細胞に相同であると思われるので、それら は生殖細胞系へのそれらの寄与を導ひく胚のキメラ化を通して正常な受精したブ タ中へのそれらの導入による遺伝子操作のためのベクターとしての可能性を有す る。 ［１］　Ｍ　ＲＫｕｅｈｎ、　Ａ　Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｂ　Ｊ　Ｒｏｂｅｒｔｓ ｏｎ及びＭ　Ｊ　Ｅｖａｎｓ。 Ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｌｅｓｃｈ−Ｎ ｙｈａｎ　５ｙｎｄｒｏｒｎｅ　ｔｈｒｏ−ｕｇｈ　１ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　ｏｆ　ＨＰＲＴ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　１ｎｔｏ　ｍ１ｃｅ　（マウス中への ）ＩＰＲＴ突然変異の導入を通してのＬｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎの症候群について の可能性ある動物モデル）。 ＮＡＴＵＲＥ　３２６２９５　（１９８７）Ｃ２）　Ｍ　Ｌ　Ｈｏｏｐｅｒ、　 Ｋ　Ｈａｒｄｙ、　Ａ　）ｌａｎｄｙｓｉｄｅ、　Ｓ　）Ｉｕｎｔｅｒ及びＭＭ ｏｎｋ。 ＨＰＲＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂ ｒｙｏｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉ ｏｎ　ｂｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ（培養された細胞による生殖細胞系 のコロニー化に由来するＨＰＲＴ−欠失（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）マウス胚） 。 ＮＡＴ［ＩＲＥ　３２６２９２　（１９８７）［３）　Ｍａｇｒａｎｅ　Ｇ、　 Ｇ、　（１９８２）Ａ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｌｌｕｍ ａｎ　ａｎｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（ヒト及びマウ ス奇形癌の比較研究）　ｏ　ＰｈＤ　Ｔｈｅｓｉｓ　Ｕｎｉｖｅｒ−ｓｉｔｙ　 ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ。 Ｃ４］　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　ＲＤ　＆　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ　ＲＬＧｅｒｍｌｉｎ ｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍ１ｃｅ（マウスの生殖細胞系の形 質転換）。 ＡＮＮ、ＲＥＶ、ＧＥＮＥＴＩＣＳ　２０４６５　（１９８６）〔５〕νａｎ　 ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎ　Ｈ，、Ｂｏｔｔｅｒｉ　Ｆ、Ｍ、、　Ｍｉｌｌｅｒ　Ａ 、Ｄ、。 Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ　Ｍ、Ｄ、、Ｆａｎ　Ｈｏ、Ｅｖａｎｓ　Ｒ，Ｍ、＆　ν ｅｒｍａ　１．Ｍ。 Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　１ｎｔｏ　ｔｈ ｅ　ｍｏｕｓｅ　ｇｅｒｍ　１ｉｎｅｖｉａ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔ ｏｒｓ　（レトロウィルスベクターによるマウスの生殖細胞系への遺伝子の効果 的な挿入）。 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８２６１４８−６１５２　（１９８５ ）（６）　ＭｃＷｈｉｒ　Ｊ。 Ｐｈ０口、ｔｈｅｓｉｓ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｊｎ　 ｆａｒｍ　ａｎｉｍａｌｓ（家畜における胚細胞系ど。 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｇａｒｙ　（１９８９）［７］　Ｗｉｌｌ ｉａｍｓ　Ｄ、Ａ、、Ｌｅｍｉｓｈｋａ　Ｉ、Ｒ，、Ｎａｔｈａｎ　ロ、Ｇ、　 ＆　Ｍｕｌ−１ｉｇａｎ　Ｒ，［”。 Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｔｅｒｉａｌ 　１ｎｔｏ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌｈａｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ　ｓｔ ｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ（マウスの多能性造血幹細胞中へ の新規の遺伝子物質の導入）。 ＮＡＴＩＩＲＥ　３１０４７６−４８０　（１９８４）［８］　Ｅｄｖａｒｄｓ 　Ｐ、Ａ、Ｗ、、　Ｗａｒｄ　Ｊ、Ｌ、　＆　Ｂｒａｄｂｕｒｙ　ＪｏＭ。 Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｖ −ｍｙｃ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１ｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ｍａｍｍａ ｒｙ　ｇｌａｎｃｆ　（乳腺の移植物におけるＶ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子による形態 成形の変性）。 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２４０７−４１２　（１９８８）［９）　Ｅｖａｎｓ　Ｍ　 Ｊ　＆　Ｋａｕｆｍａｎ　Ｍ　Ｈε５ｔａｂｌｉｓｂ＋ｎｅｎｔ　ｉｎ　ｃｕｌ ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｊｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍｍｏｕ ｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ（マウス胚からの多能性細胞の培養における確立）。 ＮＡＴＵＲＥ　２９２１５４−１５６　（１９８１）［１０］　Ｍａｒｔｉｎ　 Ｇ、Ｒｏ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ 　ｆｒｏｍ　ｅａｒｌｙ　ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ 　ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｂｙ　ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉ−ｎｏ ｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（奇形癌の幹細胞により条件づけされた培地におい て培養された初期マウス胚からの多能性細胞系の分離）。 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　７８７６３４−７６３８　（１９８１ ）［１１〕Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　Ｔ９．　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｐ、＆　Ｍａｅ ｄａ　Ｎ。 Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｒ＋ｔ　ｏｆ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ −ｄｅｒｉｖｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ（ＥＳ）　ｃｅｌｌｓ　（ハム スターの胚盤胞由来の胚の幹細胞（ＥＳ）の確立）。 Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ　１２７２２４−２２７　（１９８８）［１２］　Ｈａｎｄｙ ｓｉｄｅ　Ａ、、　ｔｌｏｏｐｅｒ　Ｍ、Ｌ、、　Ｋａｕｆｍａｎ　Ｍ、）１． ＆　ＷｉｌｍｕｔＩ。 Ｔｏｗａｒｄｓ　ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ　１ ｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　５ｈｅｅｐ（羊からの幹細胞系の単離）。 Ｒｏｕｘ　ａｒｃｈｉｖｅ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｂｉｏｌｏｇ ｙ　１９６１８５−１９０（１９８７）［１３］　Ｅｖａｎｓ　Ｍ。 ［］ｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎａＩ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ 　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓ−ｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ 　ｄｉｒｅｃｔ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒ ｅ（マウス胚の癌細胞の起源及び組織培養中へのそれらの直接的な単離の可能性 ）。 Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｐｅｒｔ、６２６２５−６３１　（１９８１）［１４）　Ａ ｍｏｒｏｓｏ　Ｅ、Ｃ。 Ｐｌａｃｅｎｔａｔｉｏｎ、　Ｉｎ″Ｍａｒｓｈａｌｌ’ｓ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（生殖のマーシャル生理学）′、３ｒｄ ’ｅｄｎ、、　Ｖｏｌ、２゜ＰＰ　１２７−３１１．　Ｅｄ、Ａ、Ｓ、Ｐａｒｋ ｅｓ、　Ｌｏｎｇｍａｎｓ、　Ｇｒｅｅｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｌｏｎ−ｄｏｎ。 ［１５］　Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ　Ｊ、Ａ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｇ、Ｂ、、Ｍ ａｒｔｉｎ　Ｇ、Ｒ，、ＢｏｎＤｕｒａｎｔ　Ｒ，Ｈ，Ｐａ５ｈｅｎ　Ｒ，Ｌ。 Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　２９２８６　（１９８８＞。 ［：１６］　Ｍａｒｔｉｎ　Ｇ、Ｒ，＆　Ｅｖａｎｓ　Ｍ、Ｊ、　（１９７５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎａｌ　１ｉｎｅｓ　ｏｆ　ｔ ｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ：　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍ ｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（奇形癌のクローン系の分化 ：インビトロでの胚様体の形成）。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ　７２．１４４１−１４４ ５−Ｅ（ら　（ Ｅｌへ　Ｌ Ｆｉｒ、　３ １１口、→し Ｙユｃ、　Ａ Ｙよｒ、５ｂ Ｆ汀、５ｃ Ｆｉｇ　６ａ Ｆｒ６７λ Ｆｒ（、７ｂ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年３月２０日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．非ヒト及び非ゲッ歯類の胚盤胞のインビトロ処理から単離された多能性胚の 幹細胞。
2. ２．有蹄動物種からである請求の範囲第１項記載の幹細胞。
3. ３．ウシ種からである請求の範囲第１項記載の幹細胞。
4. ４．ブタ種からである請求の範囲第１項記載の幹細胞。
5. ５．請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の幹細胞を導入されている胚盤胞。
6. ６．請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の幹細胞の核を核移行により導入さ れている胚盤胞。
7. ７．請求の範囲第５項記載の胚盤胞又は請求の範囲第６項記載の胚細胞の子孫で あるキメラ動物。
8. ８．請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の多能性胚の幹細胞を得るための方 法であって、新生ウシ血清及びウシ胎児血清（両血清は使用の前、熱不活性化さ れている）を含む組織培養増殖培地において胚盤胞を増殖せしめ；自発的な孵化 の後又は透明帯の機械的な除去の後、前記胚盤胞の分離を引き起こし；その分離 された細胞を組織培養増殖培地において増殖せしめ；幹細胞のコロニーと形態学 的特徴により選択し；そして前記選択された幹細胞を組織培養増殖培地において 増殖せしめ；ここで形態学的に選択された細胞が、単層を形成するために広がる 傾向がある独得の平らな分極化上皮コロニーで成長し、そしてその細胞が丸く、 比較的大きく明白な核を有し、突出した核を有し、そして比較的小さな細胞質を 有することを特徴とする方法。
9. ９．細胞の分化を妨げ、そして細胞系を培養で維持するために新鮮な組織培養増 殖培地上での時々のトリプシン処理により前記選択された幹細胞を継代すること をさらに包含する請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．請求の範囲第８項記載の方法に従って生成された１又は複数の幹細胞を胚 盤胞中に導入することを含んで成る方法。
11. １１．請求の範囲第８項記載の方法に従って生成された幹細胞の核を胚細胞中に 核移行により導入することを含んで成る方法。
12. １２．キメラ動物の形で子孫を生成するために、請求の範囲第８〜１１のいづれ か１項記載の方法のいづれかを包含する技法を用いて得られた生存胚を偽妊娠育 成母性動物の子宮への導入を含んで成る方法。