JPH04500910A - ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一ボ１メーーゼ１　・−Ｃ，に６見上１　ウィルスの本発明は、ＨＰＶを検出し 、そしてＨＰＶの型を検出するための医学的研究及び診断方法を提供する。この 方法は分子生物学及び遺伝子工学の分野において広く使用されるＰＣＲｌすなわ ちＤＮＡ増幅技法を利用する。この方法はまた、これまで知られていないＨＰＶ の株に関する情報を付与するためにも使用され得、そして従って、ウィルス学の 分野にも適用される。

乳頭腫ウィルスは、広範囲の重度のヒト疾患、特に生殖器及び口内粘膜の癌に関 係して来た。生殖器のＨＰＶ感染は主に女性における癌に関連しているけれども 、最近の出来事は、ＨＰＶが男性における前立腺癌の進行に役割を演じているこ とを示唆する。ＢｒｏｋｅｒＡ　ｅ　、　＋　１９８６＋ρ−ａｎｃｅｒ　Ｃｅ ↓」虜、土：１７〜３６は、乳頭腫ウィルスの分子、細胞及び臨床学的観点及び ＨＰ　Ｖと癌との関係金輪じている。ＨＰ　Ｖタイプ６．１１．１６゜１８及び ３３はヒトに、おいて既知の生殖器ＨＰＶタイプであり、そ　Ｌ／　７Ｂｒｏｋ ｅｒ７．Ｋ　（！’　、＋　１９８６＋　ｊ；−ａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　メｊ 　：　５８９−−５９４　４よ、ＨＰＶタイプ６．１１，１６．１８及び３３が ＤＮＡレベルで、特に１１１み取り枠で有意な相同性を共有することを開示する 。

ＨＰＶの同定及び型の検出は、種々のタイプのＨＰ　Ｖが影響を受けた個人に対 して種々の危険性を付与するので、ひじょうに重要である。たとえば、ＨＰν１ ６及びＨＰＶ　１８は、他のＨＰＶタイプよりも頚部異形底及び癌により高い頻 度で確実に確認されて来た。　Ｗｅｂｂ７！　（！”　、　、　１９８７年１２ 月、Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓｅａｓｅ１５６　（６）：　９１２〜９１９は、逆−ブ ロッティング方法を用いる、ＨＰＶ　ＤＮＡタイプを検出するための方法を報告 する。その方法は、４種の異なったＨＰＶタイプからのゲノムＤＮＡが結合され る膜を形成し、そして次に生物学的サンプルからのラベルされたＤＮＡを前記膜 に結合されるＤＮＡにハイブリダイズせしめることを包含する。Ｃａｕｓｓｅｙ 　１１煮、　＋　１９８８年２月、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６ （２）：　２３６〜２４３は類似するＨＰＶ検出法を記載する。

５ｈｉｂａｔａ？、（ｅ　、、　１９８８年１月、Ｌ」）１ニジ見ユ１６７　： 　２２５〜２３０は、ＨＰＶ　１６及びＨＰＶ　１８　ＤＮＡの存在を増幅し、 そして検出するためにＰＣＲの使用を開示する。アメリカ特許第４，６８３．１ ９５号及び第４，６８３，２０２号は、ＰＣＲ及びサンプルにおける核酸配列の 存在又は不在を検出するためにＰＣＨの使用を開示する。ヨーロッパ特許第２２ ９，７０１号及び第２６９．４４５号は、広範囲の種類のウィルス、たとえばＡ ＩＤＳウィルス、ＨＴＬＶＩ及び）ＩＴＬν■に関連するＤＮＡ配列を増幅し、 そして検出するためにＰＣＨの使用を開示する。

Ｍａｉｔｌａｎｄ−狡ζ、、１９８８年５月、５ｅｖｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌＰａｐｉｌｌｏ＊ａｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ａｂｓｔｒａ ｃｔ、　５ページは、タイプｌａ、５．６ａ、６ｂ、８．１１．１６．１８及び ３３におけるＨＰＶ配列のＰＣＲによる特異的増幅のためのプライマーの混合物 の使用を報告する。多くの他の研究者は、５ｅｖｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ＷｏｒｋｓｈｏｐでＨＰＶ配列を 増幅し、そして検出するためにＰＣＨの使用を開示する。

ＨＰＶ配列を増幅し、そして検出するためにＰＣＲの使用にもかかわらず、生物 学的サンプルにおけるＨＰＶを検出し、そしてその型を検出するための単純且つ 急速な方法のための必要性がまだ残る。本発明はその必要性を満たず方法を提供 する。

本発明は、サンプルにおけるＨＰＶを検出し、そしてその型を検出するための方 法を提供する。その方法は、サンプルに存在するＨＰＶ　ＤＮＡの配列を増幅し 、増幅が生じたかどうかを決定し、そして次にその増幅されたＤＮＡにＨＰＶタ イプ特異的プローブをハイブリダイズせしめることを含んで成る。

本発明はまた、前記方法に使用するための新規プライマー及びプローブを供給す る。

本発明は、サンプル中のＨＰＶを検出し、そして存在する場合、そのＨＰＶＯ型 を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は： （ａ）コンセンサスブライマーの拡張生成物が合成され得るような条件下でコン センサスＨＰＶプライマー、重合剤及びデオキシヌクレオシド５′−トリホスフ ェートによりサンプルを処理し、ここで前記コンセンサスブライマーは、一対の プライマーの１つのメンバーから合成される拡張生成物が、その相補的鎖から分 離される場合、前記対の他のメンバーの拡張生成物の合成のための鋳型として作 用することができるように、それらにハイブリダイズするＨＰＶ　ＤＮＡの一本 鎖を分離するために十分に相補的な少なくとも１対のプライマーを含んで成るオ リゴヌクレオチドの混合物であり；（ｂ）もし存在するなら、前記鋳型からプラ イマー拡張生成物を分離し、これに基づいて拡張生成物が一本鎖分子を形成する ために合成され； （ｃ）もしあるなら、段階（ｂ）で生成された一本鎖分子を、プライマー拡張生 成物が鋳型として段階（ｂ）で生成された一本鎖分子のそれぞれを用いて合成さ れるような条件下で段階（ａ）のコンセンサスブライマーにより処理し；（ｄ） 段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１度くり返し；（ｅ）増幅が生じたかどうか を決定し；そして増幅が生じた場合、 （ｆ）前記増幅されたＤＮＡにＨＰＶタイプ特異的ＤＮＡプローブをハイブリダ イズし；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを決定することを含んで成る。

本発明の方法における第１段階は、サンプルに存在するＨＰＶ　ＤＮＡからＤＮ Ａの別の領域を増幅するであろうコンセンサスブライマーの使用を必要とする。

これらのコンセンサスプライマー対はオリゴヌクレオチドであり、そしてコンセ ンサスブライマーはプライマー対の混合物である。この方法に使用される混合物 は、サンプルに存在するＨＰＶＯタイプにかかわらず、°“コンセンサス”配列 間の領域に対応するＲＰＶＤＮＡは増幅されるであろうことを保証する。ＨＰＶ がサンプルに存在する場合、コンセンサスブライマーから生成されるＰＣＲ生成 物は、次に、存在するＨＰＶタイプを決定するためにタイプ特異的プローブとの ハイブリダイゼーションにより分析される。

ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの増幅は、アメリカ特許第４，６８ ３，２０２号及び第４，６８３．１９５号並びに上記クロス−リファレンスに引 用により導入されている関連出願に開示されている。ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、Ｄ ＮＡ０熱変性し、増幅されるべきＤＮＡセグメントを端に有する配列に２種のオ リゴヌクレオチドプライマーをアニールし、そしてそのアニールされたプライマ ーをＤＮＡポリメラーゼにより拡張する反復サイクルを包含する。プライマーは 標的配列の反対の鎖にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによるＤＮＡ合成 がプライマー間の領域を横ぎって進行するように配向され、ＤＮＡセグメントの 量を効果的に２倍にする。さらに、拡張生成物はプライマーに相補的であり、そ してプライマーを結合することができるので、個々の連続的なサイクルは実質的 に、これまでのサイクルで合成されるＤＮＡの量を２倍にする。これは、サイク ル当たり約２ｎ（ここでｎはサイクル回数である）の割合で、特異的な標的フラ グメントの指数的な蓄積をもたらす。

ＰＣＨに使用するためのプライマーの選択は、増幅反応の特異性を決定する０本 発明の方法の増幅段階においては、タイプに関係なく、サンプルに存在する生殖 器ＨＰＶ配列を増幅するであろう“コンセンサスブライマーが使用される。

本発明のコンセンサスプライマーは、分解プライマー、すなわちいくつかのヌク レオチドのいづれか１つが、合成の間、選択された位置でプライマー中に導入さ れ得るように合成されたオリゴヌクレオチドの混合物を包含することができる。

コンセンサスプライマーは、サンプルに存在するいづれかのＨＰＶのＤＮＡ配列 を増幅するためにすべてのタイプのＨＰＶに対して十分に相補的である。コンセ ンサスブライマーはまた、個々の主要ウィルスタイプに対して特異的である配列 を含むＤＮＡの領域を増幅するようにも企画されており、その結果、増幅された ＤＮＡはサンプルに存在するＨＰＶの型を検出するために使用され得る。

いづれのＨＰＶにも適用されるが、本発明は、生殖器ＨＰＶ鎖に関して下記に例 示される。さらに、本発明のプライマー及びプローブは、下記に記載される部分 以外のＨＰＶゲノムの部分に標的が向けられており、但し、標的が向けられてい る特定の部分はコンセンサスプライマーを用いて増幅され得、そしてその増幅さ れたＤＮＡはタイプ特異的プローブを用いて型を検出され得る。

本発明の方法の第１段階は、ＨＰＶ配列がサンプルに存在する場合、コンセンサ スブライマーを用いてＰＣＨによるその配列の増幅を包含する０本発明の例示的 なコンセンサスプライマーは、プライマーが増幅するために使用されるＨＰＶゲ ノムの領域により言及される。ＨＰＶゲノムは環状である。

生殖器ＨＰＶのゲノムは次の通りに配向される：　Ｅ６　、ＥＴ。

Ｅｌ　、Ｅ２．Ｅ４．Ｅ５ａ、Ｅ５ｂ、Ｌ２．Ｌｌ及びＵＲＲ。

“Ｅ”及び“°Ｌ”は、読み取り枠を示すが、しかし多くの読み取り枠はオーバ ーラツプしている。たとえば、Ｅ４はＥ２読み取り枠内に完全に含まれる。ＵＲ Ｒは転写調節領域である。プライマーは、ＨＰ　Ｖ　ｆｉｌ域の１又は複数の領 域に及ぶ配列を増幅するために使用され得る。

たとえば、本発明のＬｌ／Ｅ６ｌ／上ンサスプライマーの組合せは、いづれかの 生殖器ＨＰＶからのＤＮＡの配列を増幅するように企画されている。増幅された 配列は、ＵＲＲを横ぎってＬＬからＥ６中に延長し、そして従ってＬｌ及びＥ６ 領域及びそのＬｌ及びＥ６の間にサンドインチされているＵ　ＲＲ９Ｍ域の部分 を含む。従って、コンセンサスプライマ一対は、Ｌ　Ｉ　Ｍ域における配列に対 して特異的な第１プライマー及びＥ　６　ＴｌＩ域における配列に対して特異的 な第２プライマーから成る。第１表に示されるように、第１のＬｌ−特異的プラ イマーは、ＦＳＩＯ、ＦＳ１７又はＭＹＯＩのいづれかであり、そして第２のＥ ６−特異的プライマーは、ＪＳ１５及びＪＳ１６の少なくともｌ：１混合物であ る（但し、その混合物はまたＪＳ１６よりもＪＳ１５を含むこともできる）。第 １表はまた、個々のプライマー配列及びその対応する配列（及びその配列のヌク レオチド位ｆ）が良く知られたいくつかの生殖器ＨＰＶ　（タイプ６．１１，１ ６．１８及び３３）のゲノムに存在する場合、それらの配列を示す。配列におけ る点線は、ゲノム配列がプライマー配列と同一であることを示す。ヌクレオチド は次の通りに略される： に−号皇一韮　起−鳳 ＲＧ又はＡ　ｐｕＲｉｎｅ ＹＴ又はＣｐＹｒｉｍｉｄｉｎｅ ＭＡ又はＣａＭｉｎ。

ＫＧ又はＴ　Ｋｅｔ。

ＳＧ又はＣ強い相互反応（３Ｈ結合） ＷＡ又はＴ　弱い相互反応（２Ｈ結合）ＨＡ又はＣ又はＴ　ｎｏｔ−Ｇ、　Ｇの 後にＨＢＧ又はＴ又はＣｎｏｔ−Ａ、　Ａの後にＢＶＧ又はＣ又はＡ　ｎｏｔ− Ｔ（ｎｏｔ−ｔｌＬ　Ｕの後にＶＤＧ又はＡ又はＴ　ｎｏｔ−Ｃ，Ｃの後にＤＮ Ｇ又はＡ又はＴ又はＣａＮｙ 第−一り一部 ＬＩ　Ｅ６コンセンサスプーイマー　びＬｌコンセンサス　プライマー ＦＳＩＯ２５７−５’　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＣ Ａ　ＣＡ　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＦＳ１７　２０マ一５’ＧＡＴＣＡＧＴ ＴＴＣＣＹＹＴＸＧＧＡＣＧＭＹＯ１，２０マー５’ＧＡＴＣＡＧＴＷＴＣＣＹ ＹＴＫＧＧＡＣＧ）ＩＰＶＯ６７１５１−−−−−−−Ａ　−−−Ｔ　Ｔ　−Ｇ 　、−−−−−ＨＰＶＩＩ　７１３６　−−−−−−−　Ｔ　−−−ＣＣ−Ｔ　 −−−−−）ＩＰＶ１６７０１５　−−−−−−−　Ｔ　−−−Ｔ　Ｔ　−Ａ　 −−−−−ＨＰＶ１８６９９３　−−−−−　Ａ　−Ａ　−−−ＣＧ　−７−− −−−ＨＰＶ３３６９６８　−−−−−−−　Ｔ　−−−Ｔ　Ｔ　−Ｇ　−−− −−−伏丑」ｌぐ［灸ジ１丈２世−スー陰−１組ブラ」！４−１ＪＳＩ５　１８ ７−５’ＣＣＧＴＴＴＴＣＧＧＴ　ＴＳＡＡＣＣＧＪＳ１６　１９７−５’ＣＣ ＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＣＣＧＡＣＣＧ１１ＰＶ１Ｂ　６Ｂ ＰＣＲの　゛　れるサイズ ＋　ＰＲＩＭＥＲＦＳＩＯＰＳ１７又はＭＹＯＩ−ＰＲＩＭＥＲＪＳ１５及びＪ Ｓ１６　ＪＳ１５及びＪＳ１６ＨＰＶＯ６１１９２ｂｐ　８２２　ｂｐＨＰＶＩ Ｉ　１２３５　ｂｐ　８５６　ｂｐＨＰＶＩ６　ｆ３８７　ｂｐ　９５８　ｂｐ ＨＰＶ１８　１３６７　ｂｐ　９３２　ｂｐＨＰＶ３３　１４３４　ｂｐ　１０ ０５　ｂｐ第１表に示されるように、ＦＳＩＯは、３個がＲＰＶ　１６とミスマ ツチし、そして１個がＨＰＶ　１８及びＦＩＰＶ　３３とミスマツチする２５− マーのものである。ＦＳ１７は種々の）（ＰＶと１又は２個のミスマツチを有す る劣化プライマーである。ＭＹＯＩはＦＳ１７に類憤し、ミスマツチを減じ、そ して広範囲のＨＰＶを実質的に包含するために１以上の劣化塩基を含む。ＪＳ１ ５は、Ｉ（ＰＶ　６　、１１゜１６及び３３のＥ６における陰性鎖のための劣化 １８−マーのものであり、ところがＪＳ１６は）ＩＰＶ　１８と同じ機能を有す る１９−マーのものである。

サンプルがＰＣＲのために適切な条件下で上記に示されるＬｌ／Ｅ６プライマー により処理された後、本発明の方法は、増幅が生じたかどうかの決定を必要とす る。増幅がＬｌ／Ｅ６プライマーにより生ぜしめられる場合、ＨＰＶ配列はサン プルに存在する。ＰＣＲのためのサンプルの能力を確保するために内部増幅制御 の使用は、本発明の範囲内であり、そして誤った陰性結果の可能性を減じる。増 幅が生じたかどうかを決定するためには、種々の方法が存在する。反応混合物の 一部をゲル電気泳動にかけ、そしてその得られたゲルを臭化エチジウムにより染 色し、そして予測されるサイズの生成物が存在するかどうかを観察するために紫 外線に照射する。

ラベルされたブライ”７−又はデオキシリボヌクレオチド５′−トリホスフェー トがＰＣＲ反応混合物に添加され、そして増幅されてＤＮＡ中へのラベルの導入 が、増幅が生じたかどうかを決定するために測定される。増幅が生したかどうか を決定するためのもう１つの方法は、増幅されたＤ　Ｎ　Ａにのみハイブリダイ ズするように企画されたラベルされたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダ イズする能力に９いてＰＣＲ反応混合物の一部を試験することである。そのプロ ーブは、いづれかＨＰ　Ｖかの増幅されたＤＮＡが検出され得るようなコンセン サスプローブであるべきである。たとえば、Ｌ　１　／Ｅ６コンセンサスブライ マーＦＳＩＯ、ＪＳ１５及びＪＳ１６を用いてのＨＰＶ　ＤＮＡ　ｆ７）増幅は 、Ｌｌ／Ｅ６コ：／セフサスブー、　イマ−ＦＳ１７又はＭＹＯＩを用いて検出 され得る。他方、増幅の決定及びＨＰＶタイプの同定は、１又は複数のタイプ特 異的プローブにハイブリダイズするその能力についてＰＣＲ反応混合物の一部を 試験することによって１段階で行なわれる得る。

本発明の重要な観点は、本発明の方法に使用するために提供された新規のプロー ブに関する。これらのプローブが、増幅が生じたかどうかを決定するためのコン センサスプローブであろうと又はこれらのプローブがタイプ特異的プローブであ ろうと、それらのプローブは種々の異なったハイブリダイゼーション型に使用さ れ得る。相補的な標的配列への核酸プローブの溶液ハイブリダイゼーションは、 明らかに本発明の範囲内であるが、本発明の商品化は固定されたプローブの使用 及び従って、疑憤“固相”ハイブリダイゼーションをもたらす傾向がある。この 型においては、プローブは固体支持体に共有結合され、そして次に標的配列がそ のプローブによりハイブリダイズされる。この方法においては、プローブは長い ストレッチのＴ残基により固体支持体に結合され；これらのＴ残基は、ハイブリ ダイズする配列が合成された後、自動合成機上でのプローブの合成の間、プロー ブに付加される。

種々の染料及びクロモゲン並びに対応するラベルが核酸検出システムのために利 用できる。

本発明はひじょうに多くのこれまで知られていない（又は少なくとも特徴化され ていない）ＨＰＶタイプの発見を誘導し、そして誘導し続けているが、しかしな がらコンセンサスプローブが、増幅が生じたかどうかを決定するために使用され る本発明の態様は重要性が衰退し続けるであろう。これは、発見されたＨ　Ｐ　 Ｖの個々の新規タイプに関して、その新規タイプが検出されるであろうことを確 保するためにコンセンナスプローブをより一般的にする相当する必要性が存在す るからである。この問題を克服するためには、本発明は新規タイプのコンセンサ スプローブを供給する。この新規タイプのプローブは、増幅に使用されるプライ マーに対応するＨＰＶゲノム上の２種の配列間に存在するＤＮＡ配列のすべて又 はほとんどを含んで成る、１又は複数のＨＰＶウィルスからのＤＮＡの配列から 実質的に成る。しかしながら、そのコンセンサスブローブは、サンプルにおける ＨＰＶ　ＤＮＡを増幅するために使用されるいづれかのプライマーに相補的な配 列を含むべきでない、この新タイプのコンセンサスプローブは、それが本発明の 他のコンセンサスプローブよりもハイブリダイゼーションのために利用できるよ り多くの配列を有することでより高い多様性を有する。さらに、そのコンセンサ スプローブは、サンプルに存在する）ＩＰＶ　ＤＮＡ配列を増幅するために使用 されるプライマーにより定義されるＤＮＡの領域内に存在する配列にハイブリダ イズするプライマーと共にＰＣＨにより生成され得る。

本発明は、本発明のＬｌ／Ｅ６ｌ／上ンサスプライマーと共に使用するための多 くのタイプ特異的プローブを供給する。

これらのプローブは下記第２表に示される。当業者は、本明細書に例示される本 発明の特定のプライマー及びプローブは一定数のヌクレオチド残基を有するけれ ども、ｌ又は複数のヌクレオチド残基は、本発明の方法におけるそのプライマー 又はプローブの適合性に高い衝撃を典型的には伴わないで、付与されたプライマ ー又はプローブに付加され、又はそれから欠失され得ることを理解するであろう 。

表−Ｉ ＬＩ　Ｅ６コンセンサスブーイマーと丑にするためのＨＰＶ　イブのプローブ 特異性　配　列　サイズ　命名 ＨＰＶ６　５’ＣＣＡＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＣ（１５−７−）　ＦＳｌＢ）Ｉ ＰＶＩＩ　５’ＧＧＣＴＧＴＡＧＡＧＧＧＣＴＴＡＧＡＣ（１９−７−）　ＦＳ １９ＨＰＶ１６　５’ＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＡＣ＾＾ＡＡＴＧＧＧＣＣ（２２− ７−）　ＪＳ１７ＨＰＶ１８　５’ＧＴＡＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧ　（ １Ｂ−７−）　ＦＳ２１ＨＰＶ３３　５’ＣＡＧＧＴＡＧＴにＡＣＴＣＡＣ（１ ５−７−）　ＦＳ２２ＦＳ１９及びＪＳ１７は、それぞれＨＰＶ　１１及びＨＰ Ｖ　１６を特異的に検出することができる。ＦＳＩＢは、ＨＰＶ　Ｉｆ　ＰＣＲ 生成物とのあるハイブリダイゼーションを示す。ＦＳ１Ｂ配列及びＨＰＶ　１１ 配列を含んで成るＵＷＧＣＧＧＡＰプログラム分析は、増幅された領域において ＨＰＶ　１１に対してＦＳｌＢの７３％の相同性を示す、クロス−ハイブリダイ ゼーションは洗浄の強さを高めることによって最少にされ得る。ＦＳ２１はＨＰ Ｖ　１８に対して特異的であった。

上記に開示されるＬｌ／Ｅ６プライマーは、ＨＰＶ　ＤＮＡの比較的大きなセグ メントの増幅を提供する。しかしながら、より短いＰＣＲ生成物をもたらすプラ イマーの使用は、い（つかの利点、たとえば減じられた拡張及び変性時間及び低 められた変性温度を有することができる０本発明のＬｌコンセンサスブライマー は、そのような利点を達成するためにＨＰＶゲノムの比較的小さなセグメントを 増幅するように企画される発明のプライマーの例示である。Ｌ１コンセンサスプ ライマーは、ＬＩ読み取り枠における配列に対応するＰＣＲ生成物を生成し、そ して下記第３表に示される。

■−１−表 Ｌｌコンセンサスブライマー　び　生 Ｌ１コンセンサス　プライマー ＭＹＩＩ　２０　マー　５’　Ｇ　ＣＭ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　賀　ＣＡＴＡＡＹ ＡＡＴＧＧＨＰＶＯ６６７２２−−Ｃ−−−−−Ａ　−−−−−Ｃ−−−−−Ｈ ＰＶＩＩ　６７０７　−−　Ｔ　−−−−−Ａ　−−−−−Ｃ−−−−−ＨＰＶ １６６５８２　−−　Ａ　−−−−−Ｃ−−Ｃ−−Ｔ　−−−−−ＨＰＶ１８６ ５５８　−−　Ａ　−−−−−Ｔ　−−−−−Ｃ−−−−−ＨＰＶ３３６５３９ 　−−　Ａ　−−Ａ　−−Ｔ　−−−−−Ｔ　−−−−−Ｌｌコンセンサス　プ ーイマー ＭＹＯ９２０マー５’　ＣＧ　Ｔ　ＣＣＭ＾ＲＲＧＧＡ％ＩＡＣＴＧＡＴＣＨＰ ＶＯ６７１７０−−−−−Ｃ−ＡＡ−−−Ｔ−−−−−−−）ＩＰＶＩＩ　７１ ５５　−−−−−　Ａ　−Ｇ　Ｇ　−−−Ａ　−−−−−−−ＨＰＶ１６７０３ ３　−−−−−　Ｔ　−Ａ　Ａ　−−−Ａ　−−−−−−−ＨＰＶ１８６７１２ 　−−−−−　Ａ　−Ｇ　Ｇ　−−−Ｔ　−Ｔ　−−−−−ＨＰＶ３３６９Ｂ？ 　−−−−−Ｃ−Ａ　Ａ　−−−Ａ　−−−−−−−ＭＹＩＩ　ｆｆＭＹＯ９ユ １コンセンサスプーイマ−１か′のＰＣＲの　゛　れるサイズ ＨＰＶＯ６４４８ｂｐ ＨＰＶＩＩ　４４８　ｂｐ ＨＰＶ１６　４５１　ｂｐ ＨＰＶ１８　４５４　ｂｐ ＨＰＶ３３　４４８　ｂｐ 生殖器ＨＰＶについての本発明の方法の好ましい態様は、サンプルに存在する場 合、ＬｌコンセンサスプライマーＭＹＯ９及びＭＹＩＩによるＨＰＶ配列の増幅 ；一般的な生殖器ＨＰＶプローブとＰＣＲ反応混合物の一部のハイブリダイゼー ションによる増幅の決定；及び最後に、タイプ特異的プローブによるタイプ決定 を含んで成る。　ＨＰＶ　ＤＮＡ配列の増幅が、本発明のＬ１コンセンサスブラ イマーにより処理されたサンプルに生じたかどうかを決定するためには、ＰＣＲ 反応混合物の一部が第４表に示されるＬ１コンセンサスプローブとハイブリダイ ズすることができる。

員−土一裏 Ｌ１コンセンサスプローブ ＰＳＩＯ５’　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＣＡ　ＣＡ 　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃコンセンサスプローブの１　におけるＨＰＶ　イ ブのＨＰＶ６　６７７１　５’　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　 Ａ　ＣＣＡ　ＣＡ　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＨＰＶＩＩ　６７５６　５’　 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−）ＨＰＶ１６６６３１　 ５’　−−−−Ｔ　−−Ｔ　−−−−−Ｔ　−−−−−−−−−−−１ｌＰＶ１ ８６６０７　５’　−−−−−−−−−−−−−−−−Ｔ　−−−−−−−−Ｈ ＰＶ３３６５８８　５’　−−−−−−−−−−−−−−−−Ｔ　−−−−＋　 −−−単離体３６　５’−−−−Ｔ−−Ｇ−−−−−Ｔ−−Ｃ＾−＾−−Ｃ−− 単離体８８　５’−Ａ−−−−−−−−−−−Ｔ−−Ｔ−−−−−Ｃ−−ＰＣＲ 反応混合物の一部がＬ１コンセンサスプローブ混合物に含まれるプローブにハイ ブリダイズするＤＮＡを含む場合、サンプルはＩＩＰＶ　ＤＮＡを含む、プロー ブがサンプルに含まれるＤＮＡ配列にハイブリダイズしたかどうかを決定するた めには多くの手段が存在する。典型的には、プローブは検出できる方法でラベル され、標的ＤＮＡ　（すなわちＰＣＲ反応緩衝液における増幅されたＤＮＡ）は 固体支持体に結合され、そしてハイブリダイゼーシヨンが生じたかどうかの決定 はラベルがその固体支持体上に存在するかどうかを決定することを包含する。し かしながら、この方法は多様であり、そして標的がラベルされ、そしてプローブ が固体支持体に結合される場合、作動する。プローブ又は標的であれ、核酸をラ ベルするための多くの方法は、当業界において既知であり、そして本発明の目的 のために適切である。本発明の実施を減じることにおいて包含される実験作業に おいては、プローブは、放射性ラベルされたＡＴＰの存在下でポリヌクレオチド キナーゼによりプローブを処理することによって放射性リン３ｔｐにより典型的 にはラベルされた。しかしながら、商業目的のためには、他の非放射性ラヘリン グシステム、すなわちホースラディシュベルオキシダーゼーアビジンービオチン システムが好ましい。

ラベルシステムが使用される場合、Ｌ１コンセンサスプローブがサンプルに存在 するＤＮＡを増幅するためにハイブリダイズした決定が行なわれたすぐ後、その 増幅されたＤＮＡはサンプルに存在するＨＰＶタイプを決定するために型を検出 される。本発明の実施は、多くのこれまで特徴づけされていないＨＰＶタイプの 発見を導びいて来た。たとえば、本発明の方法により試験される３種の臨床サン プルは、ＨＰＶについて公開された配列よりも著しく異なった配列を有する５種 の異なったＨＰＶタイプを含んだ、これらの新規配列は、タイプ特異的態様でこ れらの配列にハイブリダイズするであろうプローブが存在するので、本発明の重 要な観点である。

これらの新規配列は下記に示される。劣化ヌクレオチドは上記に定義された通り であり、そしてその頭載を増幅するために使用されるプライマーにおける劣化ヌ クレオチド及びそのタイプ内の変種に対応する。

ＨＰＶ　３６Ａ、３６Ｂ、８８．ユ山すｑｌ：ｌ’２３８ＢのＬＩＩ嘉九犬１ｔ ｕυ（Ｎ配剋 車塁体−並人 １　ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ　ＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧ　ＣＡ ＣＡＡＴＣＡＡＴ　ＴＧＴＴＴＴＴＡＡＣ５１ＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴ　ＡＣＴＡ ＣＴＣＧＣＡ　ＧＣＡＣＣＡＡＴＣＴ　ＹＴＣＴＧＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＴＣＴＡ ＣＴＡｌｏｌ　ＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴ　ＴＣＣＴＡＡＴＧＡＡ　ＴＡＣＡＣＡＣ ＣＴＡ　ＣＣＡＧＴＴＴＴＡＡ　ＡＧＡＡＴＡＴＧＣＣ１５１ＡＧＡＣＡＴＧＴ ＧＧ　ＲＧＧＡＡＴＴＴＧＡ　ＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴ　ＡＴＡＹＴＴＣＡＡＣＴ ＧＴＧＴＡＡＡＡＴ２０１　ＡＡＣＷＴＴＡＡＣＴ　ＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡ　Ｔ ＧＴＣＡＴＡＣＡＴ　ＴＣＡＴＡＡ丁ＡＴＧ　ＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡ２５１　丁 ＴＴＴＧＧＡＧＧＡ　ＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴ　ＧＧＴＲＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣＴ ＣＣ丁ＡＣＴＧＣＴＡＲＴＴＴＡ３０１　ＧＴＴＧＡＣＡＣＡＴ　ＡＣＣＧＴＴ ＴＴＧＴ　ＴＣＡＡＴＣＴＧＣＴ　ＧＣＴＧＴＡＡＣＴＴ　ＧＴＣＡＡＡＡＧＧ Ａ３５１　ＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧ　ＣＣＡＧＴＴＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴＴＡ 　ＴＧＡＣＡＡＡＣＴＡ　ＡＡＧＴＴＴＴＧＧＡ４０１　ＣＴＧＴＡＡＡＴＣＴ 　ＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧ　ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡ　ＧＴ ＷＴＣＣＹＹＴＫ４５１　ＧＧＡＣＧ 単ｌ■（」近用 Ｉ　ＧＣＭＣＡＧＧｆＪＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ　ＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧ　ＧＧ ＡＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣ５１ＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴ　ＡＣＴＡＣ ＣＣＧＴＡ　ＧＴＡＣＴＡＡＣＡＴ　ＧＡＣＴＴＴＧＴＧＹ　ＧＣＣＡＣＴＧＣ ＡＡｌｏｌ　ＣＡＴＣＴＧＧＴＧＡ　ＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡ　ＧＣＴＧＣＴＡＡ ＴＴ　ＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡ　ＴＴＴＡＡＧＡＣＡＴ１５１　ＧＣＴＧＡＡＧＡ ＡＴ　ＡＴＧＡＴＧＴＧＣＡ　ＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴ　ＣＡＡＴＴＧＴＧＴＲＡ へへＴＡＡＣＡＴＴ２０１　ＡＡＣＴＧＴ丁ＧＡＡ　ＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴ　Ａ ＴＡＴＡＣＡＣＡＡ　ＴＡＴＧＡＡＴＣＣＴ　へへＣＡＴＡＴＴＡＧ２５１　八 ＧＧＡＧＴＧＧＡＡ　ＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴ　ＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡ ＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴ３０１　ＡＧＴＴＡ丁ＡＧＧＴ　ＡＴＧＴＡＣ ＡＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴ　ＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧ　ＣＴＡＡＧＧＴ＾八Ｃ ３５１へＡＣＧＣＣＡＧ＾＾　ＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＧＡ　Ｃ ＴＴＴＴＣＣＴＴＴ　ＴＧＧＧＡＧＧＴＡＡ４０１　ＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡ　Ａ ＡＡＧＴＴＴＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧ　ＧＡＴＣＡＧＴＷＴＣＣＹＹＴＫ ＧＧＡＣＧ皇１ｕ（」坦 Ｉ　ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ　ＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧ　ＧＧ ＴＡＡＴＣＡＧＧ　ＴＡＴＴＴＧＴＴＡＣ５１ＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴ　ＡＣＴＡ ＣＣＡＧＡＡ　ＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴ　ＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴ　ＧＣＡＧＣＴＡ ＡＡＡｌｏｌ　ＧＣＡＣＡＴＴＡＲＣＴＡＡＡＴＡ丁ＧＡＴ　ＧＣＣＣＧＴＧＡ ＡＡ　ＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡ　ＣＣＴＴＣＧＣＣＡＴ１５１　ＧＴＧＧＡＧＧ八 ＾Ｔ　ＡへＧＡＡＣＴＡＣＡ　ＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴ　ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡ　 ＡＡＡＴＡＡＣＣＴＴ２０１　＾ＡＣＴＧＣＡＧＡＲＧ丁ＴＡＴＧＧＣＡＴ　Ａ ＴＴＴＧＣＡＴＡＡ　ＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴ　ＡＣＴＴＴＡＴＴＲＧ２５１　八 ＣＧＡＴＴＧＧＡＡ　ＴＡＴＴＧＧＣＴＴＡ　ＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧ　ＴＴＧＣ ＡＡＣＴＡＧ　ＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴ３０１　ＡＡＡＴＡＴＡＧＧＴ　ＡＴＡＴ ＴＡＡＡＡＧ　ＣＡＣＡＧＣＴＲＴＴ　ＡＣＡＹＧＴＣＡＧＡ　ＧＧＧＡＡＣＡ ＧＣＣ３５１ＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡ　ＡＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＡ Ａ　ＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴ　ＴＧＧＧＡＡＧＴＴＡ４０１　ＡＴＴＴＡＣＡＧＧ Ａ　ＣＡＧＣＴＴＴＴＣ丁　ＧＣＡＧＡＣＣＴＧＧ　ＧＡＴＣＡＧＴＷＴＣＣＹ ＹＴＫＧＧＡＣＧ単１団（オ匿へ １　ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ　ＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧ　ＣＡ ＴＡＡＴＣＡＲＴ　ＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣ５１ＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴ　ＡＣＴＡ ＣＴＡＧＡＡ　ＧＣＡＣＴＡＡＴＴＴ　ＴＴＣＴＧＴＡＴＧＴ　ＧＴＡＧＧＴＡ ＣＡ（１：１０１　ＡＧＧＣＴＡＧＴＡＧ　ＣＴＣＴＡＣＴＡＣ＾　＾ＣＧＴＡ ＴＧＣＣＡ　ＡＣＴＣＴＡＡＴＴＴ　ＴＡＡＧＧ＾＾ＴＡＴ１５１　ＴＴＡＡＧ ＡＣＡＴＧ　ＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴ　ＴＧＡＴＴＴＡＣＡＧ　ＴＴＴＧＴＴＹＴ ＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴ＾八２０１　八＾へＴＡＧＴＴＴＡ　ＡＣＴＡＣＴＧＡＧ Ｇ　ＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡ　ＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴ　ＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡ２５ １　ＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡ　ＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴ　ＴＴＴＧＧＴＣＴＴＡ　Ｃ ＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧＧＴＡＣＴ３０１　ＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡ　ＣＡ ＴＡＴＡＧＡＴＡ　ＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡ　ＣＡＫＧＣＴＡＴＴＡ　ＧＴＴＧＣ ＣＡＡＣＧ３５１　ＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴ　ＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡ　ＣＡＧＡＧ ＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ　ＣＴＡＴＣＣＴＴＴＴ４０１　ＧＧＧＡＴＧ ＴＡＧＡ　ＴＣＴＴＡＡＧＧＡＡ　ＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧ　ＣＡＧＡＡＴＴＡＧ Ａ　ＴＣＡＧｎｌＴＣＣＹ４５１　ＹＴＫＧＧＡＣＧ 単１団（対度比 Ｉ　ＧＣＭＣＡＧＧＧＷＣＡＴＡＡＹＡＡＴＧＧ　ＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧ　ＧＧ ＣＡＡＴＣＡＧＴ　ＴＡＴＴＴＧＴＴＡＣ５１ＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴ　ＡＣＣＡ ＣＡＣＧＴＡ　ＧＴＡＣＣＡＡＴＡＴ　ＧＴＣＴＧＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＧＣＡＡ ＴＴＧｌｏｌ　ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡ　ＴＡＣＴＡＣＡＴＴＴ　ＡＡＡＡＧＴＡ ＧＴＡ　ＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡ　ＧＴＡＴＴＴＡＡＧ八１５１　ＣへＴＧＧＴＧ ＡＧＧ　ＡＡＴＴＴＧＡＴ丁Ｔ　ＡＣＲＡＴＴＴＡＴＡ　ＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴ 　ＧＣＡＡＡＡＴＡＡＣ２０１ＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡ　ＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡ　 ＣＡＴＡＴＡＴＴＣＡ　ＣＡＧＴＡＴＧＡＡＴ　ＣＣＴＧＣＴＡＴＴＴ２５１　 ＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧ　ＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡ　ＴＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＣＡＧＧ　ＴＴＣＴＴＴＡＧＡＧ３０１　ＧＡＴＡＣＣＴＡＴＡ　ＧＧＴＴ ＴＧＴＡＡＣＣＴＣＡＣＡＧＧＣＣＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＲＣＴＧＣ ３５１ＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧ　ＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧ　ＡＴＣＣＡＴＴＴＡＡ　 ＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡ　ＴＴＴＴＧＧＧＡＧＧ４０１　ＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡ　 ＡＧＡＡＡＡＧＴＴＴ　ＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴ　ＴＡＧＡＴＣＡＧＴＷ　ＴＣＣ ＹＹＴＫＧＧＡ４５１　ＣＧ 皇ｍ皮Δ」■ｄ　１５５Ｂ Ｉ　ＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧ　ＴＴＴ＾＾ＴＣ＾＾Ｔ　ＴＧＴ丁ＴＧＴＣＡＣＧＧ ＴＧＧＴＧＧＡＴ　ＡＣＣＡＣＣＣＧＣ＾５１　ＧＣＡＣＣ＾＾ＴＴＴ　ＴＡＣ ＴＡＴＴＡＧＴ　ＧＣＴＧＣＴＡＣＣ＾　＾ＣＡＣＣＧＡ＾ＴＣＡＧＡＡＴＡＴ ＾八＾１０１　へＣＣＴＡＣＣＡＡＴＴ　ＴＴ＾八Ｇへ＾＾ＴＡ　ＣＣＴＡＡＧ ＡＣＡＴ　ＧＴＧＧ／ＩＧＧ＾＾Ｔ　ＡＴＧ八ＴへＴＧＣ＾１５１　ＧＴＴＴＡ ＴＡＴＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴ＾　＾ＧＧＴＣＣＧＴＣＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＡ Ｇ　ＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴ２０１　＾ＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧ＾＾ＴＧＡＣ ＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧ　ＡＴＧＡＧＴＧＧ＾＾　ＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴ２５１　 ＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧ　ＴＴＴＡＧＡＴＧＡＴ　ＡＣＣＴ ／ＩＴＡＧＧＴ　ＡＣＴＴＧＣＡＧＴＣ３０１ＴＣＧＣＧＣＣＡＴＴ　ＡＣＴＴ ＧＣＣＡＡＡ　ＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣ＾＾Ｇ　ＣＣＴ＾＾ＧＧ八 八Ｇ３５１へへ＾ＴＣＣ丁ＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＴ Ｇ　ＴＡＧ＾↑ＴＴ＾＾＾　ＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴ４０１　ＴＣＴＡＣＴＧＡＴ Ｔ　ＴＧ 単ｌ団震−Ｃ１４ １ＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧ　ＣＡＴ＾＾↑ＣＡＧＴ　ＴＧＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴ ＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡ５１　ＧＴＡＣＴ八＾ＴＴへ　ＡＡＣＡＴ ＴＡＴＧＴ　ＧＣＣＴＣＴＡＣＡＣ＾＾＾＾ＴＣ（：ＴＧＴ　ＧＣＣ＾＾ＡＴＡ Ｃ＾１０１　ＴＡＴＧＡＴＣＣＴＡ　ＣＴ＾＾ＧＴＴＴＡＡ　ＧＣＡＣＴＡＴＡ ＧＴ　ＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧ　ＡＧＧＡＡＴＡＴＧＡ１５１　丁ＴＴへＣＡＧＴ ＴＴ　＾ＴＴＴＴＴＣＡＧＴ　ＴＧＴＧＣＡＣＴＡＴ　ＴＡＣＴＴτ＾八ＣＴ　 ＧへＡＧＡＧＧＴＴ八２０１　ＴへＴＣＡＴＡＴＡＴ　ＣＣＡＴＡＧＴＡＴＧ　 ＾＾ＴＡＧＴＡＧＴＡ　ＴＡＴＴＧＧ＾＾＾＾　ＴＴＧＧ＾＾ＴＴＴＴ２５１　 ＧＧＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＧＴＴＴＡ　ＧＴＩ；Ｇ ＡＴＡＣＡＴ　＾丁ＣＧＴ丁ＴＴＧＴ３０１　ＧＣＡＡＴＣＣＧＴＴ　ＧＣＴＧ ＴＴＡＣＣＴ　ＧＴＣＡ＾＾＾ＧＧＡ　ＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴ　ＣＣＡＧＡ＾＾ ＡＧＣ３５１ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡ　ＴＧＡＴ＾八ＡＴＴへ　ＡＡＧＴＴＴＴＧ ＧＡ　ＣＴＧＴＴＧＡＣＣＴ　ＡＡＡＧＧ八＾＾静へ０１　ＴＴＴＴＣＣＴＣＣ Ｇ　ＡＴＴＴＧ当業者は、前記配列情報に関して、新規ＨＰ　Ｖ単離体を増幅し 、そして検出するためのプライマー及びプローブは容易に得られることを理解す るであろう。さらに、これらの配列は、ウィルスを含むサンプルから完全なウィ ルスの単離を可能にする。単離体２３８Ｂは文献に記載されるＲＰＶ　３１タイ プに対応する。頚部癌単離体Ｃ１４はＨＰＶ　４５の変異体である。これらの新 規ＨＰＶ単離体の発見は、ＦＳＩＯ、ＭＹ１８及びＭＹ１９と共に使用するため の追加のＬ１コンセンサスプローブの創造を導びく。これらのし１コンセンサス プローブは、ＦＳＩＯ配列への類似性を示すためにＦＳＩＯプローブ配列として 下記に示される。

Ｌ１コンセンサスプローブ−０１４７はＨＰＶ　４５　ＤＮＡにハイブリダイズ するであろう。

ＦＳＩＯ５’　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＣＡ　ＣＡ 　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＭＹ６６−八−−Ｔ−−−−−−−−Ｔ−−Ｔ− −−−−Ｃ−−ＭＹ５５　−−−−−−−Ｔ−−−−−Ｔ−−Ｃ−−Ｔ−−−− −ＭＹ３９　−−−−Ｔ−−Ｇ−−−−−Ｔ−−Ｃ＾−＾−−Ｃ−−ＭＹ５６　 −−−−Ｔ−−−−−−−−Ｔ−−Ｔ＾−Ａ−−Ｃ−−ＭＹ５７　−−−−−− −−−−−−−−−−−−−Ｔ−−−−−ＷＤ１４７　−−−−Ａ−−Ｇ−−Ｃ −−Ｔ−−Ｃ−−−−−−−−上記に示されるように、ＨＰＶタイプの変化は、 増幅された配列のほとんどすべて（但し、本発明の方法の増幅段階に使用される プライマー対応する部分を除く）を含む長いコンセンサスプローブの使用を必要 とする。このＨＰＶタイプにおける変化はまた、本発明により供給されるタイプ 特異的プローブのための必要性を示す。

本発明は、Ｌ１コンセンサスブライマーから生成される増幅されたＤＮＡの型を 検出するための多くのプローブを供給する。これらのプローブは、下記第５表に 示される。

】−」Ｌ−表 Ｌ１コンセンサスブライマーと丑に　するためのＨＰＶ　イブのプローブ プローブ　特異性　配　列　ゲノム位置ＭＹ１２　ＨＰＶ６　５’ＣＡＴＣＣＧ ＴＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡ　６８１３−６８３３ＭＹ１３　１（ＰＶＩＩ 　５’ＴＣＴＧＴＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡ　６８００−６８２０ＭＹ １４　ＨＰＶ１６　５’ＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡ　６９２６ −６９４５ＷＤ７４　ＨＰＶ１８　５’ＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴＧＡ 　６９０５−６９２２ＭＹ１６　ＨＰＶ３３　５’ＣＡＣＡＣＡＡＧＴＡＡＣＴ ＡＧＴＧＡＣＡＧ　６６２８−６６４８ＭＹ５８　ＨＰＶ１６　５’ＴＴＧＴＡ ＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＣＴ　６８９７ＭＹ５９　）ＨＰＶ３３　５’ＡＡ ＡＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡ　６８７７ＭＹ６０　ＨＰＶ１８　５ ’ＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧ　６６５７ＭＹ６１　ＨＰＶＩＩ　５ ’ＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧ　７０５１ＭＹ６２　ＨＰＶ ６　５’ＣＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡ　７０６８ＭＹ６３　ＨＰ Ｖ６　５’ＴＧＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧ　７０６ＢＭＹ６４　Ｈ ＰＶ３３　５’ＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴ　６８７７ＭＹ６ ５　ＨＰＶＩＩ　５’ＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＧ　７０５ １ＷＤ１２６　ＨＰＶ３１　５’ＣＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＮ 、Ｄ。

ＷＤ１２７　ＨＰＶ３１　５’ＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＮ、Ｄ 。

ＷＤ１２８　ＨＰＶ３１　５’ＴＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＡＴＴ 　Ｎ、Ｄ。

ＭＹ６９　ＨＰＶ４５　５’ＡＴＡＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＮ、 Ａ。

ＭＹ７０　）ＨＰＶ４５　５’ＴＡＧＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧ　Ｎ、 Ａ。

１１０１５０　ＨＰＶＩＩ　５’ＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡ ＧＡ　７０５９ＷＤ１５１　ＨＰＶＩＩ　５’ＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧ ＡＡＡＡＡＧＡＡ　７０５ＢＷＤ１５２　ＨＰＶ１６　５’ＴＴＴＧＴＡＡＣＣ ＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＣＴ　６Ｂ９ＢＷＤ１５３　ＨＰＶＩＩ　５’ＧＴＴＴＧ ＴＡＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＣＴ　７０５３Ｎ、Ｄ、　：決定されなかった Ｎ、八、：入手できなかった 本発明はまた、コンセンサスプライマー及び生殖器ＨＰＶのＥ　Ｂ　ｆｉＩ域に 対して特異的なりＮＡ配列の検出のためのＨＰＶタイプのプローブを提供する。

これらのプローブは、何人かのＨＰＶ−感染された個人において、ＨＰＶゲノム は、Ｅ６−及びＥ７−関連配列のみが存在するように部分的に欠失され、又は再 配列されているので、特に好ましい。本発明のＥ６コンセンサスプライマー対は 、１つのプライマーがＵＲＲ及びＥ　６６Ｎ域の境界近くの配列に相補的であり 、そして他のプライマーがＥ６−Ｅ７境界（Ｅ６及びＥ７の読み取り枠がオーバ ーラツプする）近くのＥ　７　ｊＪｌ域又はＥ６Ｎ域のいづれかにおける配列に 相補的であるプライマー対を含んで成る。これらのＥ６コンセンサスブライマー は下記第６表に示される。

」−」シー表 旦Ｊ≦し化１乙ヱλ１−ヒ虹乙二 ＵＲＲＥ６コンセンサス　プライマー ＷＤ７３　５’ＣＧＧＴＴＳＡ　ＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＷＤ７２　５’　ＣＧ 　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＧ　ＧＷＤ７６　５ ’ＣＧＧＴＴＳＡ　ＡＣＣＧＡＡＡＭＣＧＧＷＤ７７　５’ＣＧＧＴＴＣＡ　Ａ ＣＣＧＡＡＡＭＣＧＧ）ＩＰＶＯ６４３５’　ＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　Ａ　Ｃ ＣＧ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＧ　ＧＨＰν１１４３ ＨＰＶ１６４３　−−−−−Ｇ−−−−−−−−Ｃ−−−ＦＩＰＶ１８４３　− −−−　ＣＧ　Ｇ　Ｇ　−−−−−−−−−”　−ＨＰＶ３３６５ ＵＲＲ／Ｅ６陽性鎖ブラ陽性−プライマー　ＷＤ７２及び−Ｄ７３；−Ｄ７２及 び−Ｄ７６；及び−Ｄ７２及び賀Ｄ７７として使用される。

Ｅ７コンセンサス　′プライマー ＷＤ７０　５’　Ｇ　ＣＲＣＡ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＲＣＡ　ＣＡ　ＣＷ Ｄ７１　５’　Ｇ　ＣＡ　ＣＡ　ＣＣＡ　ＣＧ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　ＣＡ　Ｃ肝ν０ ６　８１３　５’　Ｇ　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　ＣＡ 　ＣＨＰＶＩＩ　８１３ ＨＰＶ１６８４５−ＡＡ−−−一−−−−Ｇ−−−−−ＨＰＶ１８８９４−−Ａ −−ＣＣＡＣ−−−−−−−−ＨＰＶ３３８５６　−−　Ａ　−−−Ｇ　−Ａ　 −−Ｇ　−−−−−ＷＤ６８　５’　ＣＡ　ＣＡ　ＣＡ　Ａ　Ｔ　Ｄ　Ｙ　Ｙ　 Ｙ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＣＣＷＤ６９　５’　ＣＡ　ＣＡ　ＣＡ　Ａ　 Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＨＰＶＯ６８０１５’ 　ＣＡ　ＣＡ　Ｃ丁　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｇ　丁　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＣ ＣＨＰＶＩＩ　８０１　−　−　−　−　−　Ａ　−−Ａ　−−−−−−−−Ｇ 　−−−ＨＰＶ１６８３３　−−−−−　Ａ　−−Ｔ　ＣＣ−−−−−−Ｇ　− −−ＨＰＶ１８８８２　−−−　−−　Ａ　−Ａ　−Ｇ　Ａ　Ｃ−−Ｇ　−−Ｇ 　Ｔ　Ｔ　−ＨＰＶ３３８４４　−　−　−　−　−　Ａ　−−Ａ　−−Ｃ−Ｃ −−−Ｇ　−−−Ｅ７陰性鎖プライマーは混合物：　ＷＤ７０及び畦７１；及び 畦６８及び−Ｄ６９として使用される。

Ｅ６コンセンサス　″プライマー ＷＤ６７　Ｗ　Ｇ　ＣＡ　Ｗ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｗ　Ｗ　Ｇ　ＣＹ　Ｇ　Ｔ 　ＣＴ　ＣＷＤ６６　Ａ　Ｇ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＴ 　Ｇ　Ｔ　ＣＴ　ＣＷＤ１５４　Ｔ　ＣＣＧ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ 　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　ＣＣＣＷＤ１５５　Ｗ　Ｓ　ＣＡ　Ｗ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　 Ｗ　Ｗ　Ｗ　Ｇ　Ｙ　ＣＧ　Ｔ　ＣＹ　ＣＷＤ１６３　Ｗ　Ｇ　ＣＡ　Ｗ　Ａ　 Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｗ　Ｗ　Ｇ　Ｙ　Ｙ　Ｇ　Ｔ　ＣＹ　Ｃ賀Ｄ１６４　賀５ＣＡ ＷＡＴＧＧＷＤＷＧＹＹＧＴＣＹＣＨＰＶ６　２８６　Ｔ　Ｇ　ＣＡ　Ｔ　Ａ　 Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＣＨＰＶＩＩ　２８６　−−− −　Ａ　−Ｇ　−−−Ａ　−−Ｔ　Ｔ　−Ｔ　−−−ＨＰＶ１６２８６Ａ−−− −−−−−−ＴＣ−−−ＡＴ−−−ＨＰＶ１８２９２　Ａ　−−−−Ｇ　Ｃ−− Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　−Ｔ　−Ｔ　−−−）ＨＰＶ３１　−Ｃ−Ｇ−Ｇ−−−ＴＧＴ −Ｔ−−Ｔ−Ｃ−ＨＰＶ３３３９０　−　Ｃ−−Ａ　−−−−−−Ｔ　Ｔ　−− ＣＴ　−−−遺伝子の異なった領域に位置する追加のＥ６コンセンサス陰性鎖プ ライマーは、下記に示されるように対で使用される。

３組のプライマー、ＷＤＩ５７及び同１６０　１ＷＤ１５８及び−０１６１；及 び−Ｄ１５９及びＷＤ１６２が示され、それぞれは同じゲノムＨＰｙ　６１域に 対応するが、しかし長さで異なる。プライマーＷＤ１６０゜ＷＤ１６１．　ＷＤ １６２は）ＩＰＶ　１Ｂ特異性である。

賀０１５７　ＴＴＣＴＡＭＴＧＴ賀ＧＴＴＳＣＡ丁ＡＹＡＣＡＳＨＡＴＡ射０１ ５８　ＣＴＡＭＴＧＴ賀ＧＴＴＳＣＡＴＡＹＡＣＡＳＨ＾丁Ａ＄ＩＤ１６１　＾ ＡＴＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＣ：ＡＣＡＧＡＧＴＣ１ｌｌＤ１５９　ＴＡＭ ＴＧＴＷＧＴＴＳＣＡＴＡＹＡＣＡＳＨＡＴＡＷＤ１６２　ＡＴＧＴＧＴＧＴＣ 丁ＣＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＥ６コンセ７カ入ｙ　−４７−ＪｚＤの　の　 ゛　れるサイズＵＲＲ／Ｅ６プライマー　Ｅ７プライマー　ＲＰＶタイプのため の生成物のサイズ！１ＰＶ６　ＨＰＶＩＩ　ＨＰＶ１６１（ＰＶ］、８　）ＩＰ Ｖ３３ＷＤ７２ａｎｄＷＤ７３　ＷＤ７０ａｎｄＷＤ７１　７７０　７７０　８ ０２　８４４　７９１１７２ａｎｄＷＤ７６　ＷＤ７０ａｎｄＷＤ７１　７７０ 　７７０　８０２　８４４　７９１１７２ａｎｄＷＤ７７　ＷＤ７０ａｎｄ１７ １　７７０　７７０　８０２　８４４　７９１ＷＤ７２ａｎｄＷＤ７３　ＷＤ６ ８ａｎｄ１６９　７５８　７５８　７９０　８３２　７７９１７２ａｎｄＷＤ７ ６　１６８ａｎｄＷＤ６９　７５８　７５８　７９０　８３２　７７９ＷＤ７２ ａｎｄＷＤ７７　ＷＤ６８ａｎｄ１６９　７５８　７５８　７９０　８３２　７ ７９ＷＤ７２ａｎｄＷＤ７３　ＷＤ６６ａｎｄＷＤ６７　２４３　２４３　２４ ２　２４２　２２５ＷＤ７２ａｎｄＷＤ７６　ＷＤ６６ａｎｄＷＤ６７　２４３ 　２４３　２４２　２４２　２２５ＷＤ７２ａｎｄＷＤ７７　ＷＤ６６ａｎｄＷ Ｄ６７　２４３　２４３　２４２　２４２　２２５当業者は、本発明のＥ６コン センサスブライマーがＥ７　ＤＮＡの部分を含んで成る配列を増幅することを理 解するであろう。

Ｅ６コンセンサスプライマーが本発明の方法に使用される場合、増幅が存在した かどうかを決定するためには、Ｅ６コンセンサスプローブが供給される。Ｅ６コ ンセンサスブロープＷＤ１３４及び−Ｄ１３５は小さなＥ６増輻生成物に向けら れ、そして混合物として一緒に使用される。Ｅ６コンセンサスプローブはまた、 Ｅ６コンセンサス陽性鎖プライマーとしても使用され得る。Ｅ６コンセンサスブ ライマーとして使用される場合、Ｅ６コンセンサスプロープは次の組合せで使用 される：賀Ｄ６５及び−Ｄ６４　ｉ　ＷＤ８３及び賀Ｄ６４；及び−Ｄ８４およ び−Ｄ６４、Ｅ６コンセンサスプローブは第７表に示される。

ＷＤ６５ＭＧＡＧＡＣＲＧＣＷＷＴＣＣＡＴ賀ＴＧ賀Ｄ８３　Ｍ　Ｇ　Ａ　Ｇ　 Ａ　ＣＲＧ　Ｓ　Ｗ　Ｗ　Ｔ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｗ　Ｔ　ＧＷＤ８４　Ｍ　Ｇ　Ａ　 Ｇ　Ａ　ＣＲＧ　Ｖ　Ｗ　Ｗ　Ｔ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｗ　Ｔ　ＧＷＤ６４　Ａ　Ｇ　 Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＣＧ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ１（ＰＶ６　２ ６７　ＣＧ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　ＣＴ　Ａ　Ｔ　ＣＣＡ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＧＨ ＰＶＩＩ　２６７　−−−−　Ａ　−Ａ　Ａ　−−Ｔ　−−−Ｃ−Ｔ　−−ＨＰ Ｖ１６２６６　Ａ　−−−Ａ　Ｔ　−−Ｇ　Ａ　−−−−−−−−−ＨＰＶ１８ 　２７３　Ａ　−−−Ａ　−Ａ　−Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　−−Ｇ　Ｃ−−ＨＰＶ３３ ２７１Ａ−−−ＡＧ−−ＡＡ−−−−−−Ｔ−−ＷＤ１３４　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　 Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｗ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｉｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＣＷＤ１３５　Ｇ　Ａ　 Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｗ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｋ　ＣＡ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ＣＥ６コンセンサス ブライマーが本発明の方法に使用される場合、サンプルに存在するＨＰＶのタイ プを決定するためには、Ｅ６タイプ特異的プローブが供給される。これらのプロ ーブは第８表に示される。第６表の陽性鎖プライマー及び−Ｄ７０及びＷＤ７１ 又はＷＤ６Ｂ及びＷＤ６９を含んで成るＵ　ＲＲ／Ｅ　６コンセンサスブライマ ーを用いれば、第８表又は第８Ａ表のＨＰＶタイプのプローブのいづれかが有効 であろう、これらのタイプのプローブはまた、Ｅｌｌ陰性ジプライマーＵＲＲ／ Ｅ６陽性鎖コンセンサスブライマーと共に増幅のために使用される場合、有用で ある。

第一ニー１ Ｅ６　れた　１と丑に　るための ＨＰＶ　イブのプローブ プローブ　特異性　配　列　ゲノム位置ＷＤ７８　ＨＰＶ６　５’ＣＧＡＡＧＴ ＧＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＡＴ　６４３［７９ＨＰＶＩＩ　５’ＣＡＡＧＧＴＧＧ ＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡＣＧ　６４３ＷＤ８０　ＨＰＶ１６　５’ＧＡＡＣＡＣＧ ＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧ　５３４［８１ＨＰＶ１８　５’ＣＡＡＣＣＧＡＧ ＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡ　５３０ＷＤ８２　ＨＰＶ３３　５’ＧＡＧＧＴＣＣＣＧ ＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡ　５３４碧ユ」シ（−表 ハ　なＥ６　と丑に　るための ＨＰＶタイプのプローブ プローブ　特異性　配　列　ゲノム位置ＷＤ１６５　ＨＰＶ３１　５’ＡＡＡＴ ＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＴＣｋｌ）１６６　ＨＰＶ３１　５’ＣＣＴＡＣ ＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＷＤ１６７　ＨＰＶ３９　５’ＣＣＴＴＧＣＡＧ ＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＧＷＤ１６８　ＨＰＶ３９　５’ＣＡＧＡＣＧＡＣＣ ＡＣＴＡＣＡＧＣＡＡＷＤ１６９　ＨＰＶ４２　５’ＧＧＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣ ＡＴＴＡＡＣＡＧＷＤ１０２　ＨＰＶ１８　５’ＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴ ＴＡＣＡＧ　２１３ＷＤ１０３　ＨＰＶＩ６　５’ＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣ ＧＡＣＧ　２０６ＷＤ１０４　ＨＰＶ３３　５’ＧＣＡＧＴＡＡＧＧＴＡＣＴＧ ＣＡＣ８８ＷＤ１３２　）ＨＰＶ１８　５’ＧＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴ ＡＣＡＧ　２１３ＷＤ１３３　ＨＰＶ６　５’ＡＣＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＣＣＴ ＧＴＴＴＣ２４８ＷＤ１３４　ＨＰＶＩＩ　５’ＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴ ＣＡＧＴＧＣ１７５第８Ａ表ノタイプノフローブは、ＷＤ７６　、　ｈｌＤ６６ 及びＨＤ１５４　。

ＷＤ１５７及び−０１６０１ＷＤ１５Ｂ及び畦１６１；賀０１５９及び−０１６ ２。

ＷＤ６６及びＷＤ１５５　；ＷＤ６６及び−０１６３ｉ及び賀Ｄ６６及び−Ｄ１ ６４がら選択された陽性鎖Ｕ　ＲＲ／Ｅ　６コンセンサスプライマーと共に有用 である。これらのプライマーは、長さ約２５０個の塩基対の小さなＥ６増幅生成 物を生成する。

本発明はまた、）ＩＰＶ　Ｅｌ領域における配列に対して相補的であるプライマ ーを供給する。これらのＥ１プライマーは、Ｅ　１９Ｍ域の配列のみを増幅する ために使用され得、又はＥ６゜Ｅ７．Ｅｌからの配列及びこれらの３種の領域の 組合せがらの配列を増幅するためにＥ６／Ｅ７プライマーと共に使用され得る。

これらのＥｌプライマーは下記第９表に示される。

筆−主一部 Ｅｌ　！□プライマー ＴＹＰＯＩ　２０ＭＥＲＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　ＣＫ　Ｇ　Ａ　Ｙ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｍ　 Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＴＹＰＯ２２０ＭＥＲ−−−−−−−−−Ｇ　Ａ　Ｔ　 Ｔ　Ｃ−−−−−−ＴＹＰＯ３２０ＭＥＲ−−−−−−−−−ＣＣＴＴＣ−−− −−−ＴＹＰＯ４２０ＭＥＲＴ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｍ　Ｗ　Ｇ　Ｇ　Ｍ　Ｔ　Ｇ　Ｇ 　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ＴＴＹＰＯ５２０ＭＥＲ−−−−−−−−−− −−−−−Ｇ　Ａ　Ｇ　−−ＴＹＰＯ６２０ＭＥＲ−−−−−−−−−−−−− −−ＡＴＧ−−Ｅｌ　゛ブーイマー ＴＹＮＯＩ　２０ＭＥＲＧ　Ｔ　Ａ　ＣＣＴ　Ｋ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　ＲＴ　ＣＭ　 Ｇ　ＣＣＡ　ＴＴＹＮＯ２２０ＭＥＲ−−−−−−ＧＡＡＴＣ−−−−−−−− −ＴＶＮＯ３２０ＭＥＲ−−−−−−ＧＡＡＧＧ−−−−−−−−−ＴＶＮＯ４ ２０ＭＥＲＡ　ＣＡ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＣＡ　Ｋ　ＣＣＷ　Ｋ　Ｔ　Ａ　 ＣＡＴＹＮＯ５２０ＭＥＲ−−ＣＴＣ−−−−−−−−−−−−−−−ＴＶＮＯ ６２０ＭεＲ−−ＣＡＴ−−−−−−−−−−−−−−−ＴＹＮＯ７２０ＭＥＲ Ｔ　ＣＣＡ　ＣＴ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　Ｗ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｔ　ＡＴＹＮ Ｏ８２０ＭＥＲ−−−−−−−−−−−−Ｙ八−−−一一−Ｅ１プライマーは、 本発明の種々の態様に使用され得る。

たとえば、Ｅ　１　領域内の完全な増幅は、次のプライマ一対を用いて行なわれ 得る：　（１）　ＴＹＰＯｌ、　ＴＹＰＯ２，ＴＹＰＯ３及びＴＶＮＯ７゜ＴＶ ＮＯ８ｉ又は（２）　ＴＹＰＯ４，ＴＹＰＯ５，ＴＹＰＯ６及びＴＹＮＯＩ、　 ＴＹＮＯ８゜↑ＹＰＯ３はＴＹＰＯ２及びＴＹＰＯＩの両者に類領し、そして増 幅から削除され得ることを注目すること。Ｅ１領域はＨＰＶ間に高く保存され、 そしてサンプルの型の分類はＥｌ増幅により可能であるが、型の分類は、Ｅ１プ ライマーが次の通りにＥ６又はＥ７プライマーと共に使用される場合、より一層 容易に達成される。たとえば、次のＥｌ及びＥ６／Ｅ７プライマ一対を用いて、 だれでもＥ　６　／　Ｅ　７　ｅＪＩ域を増幅することができる：　（１）　Ｗ Ｄ７２．阿０７６及びＴＶＮＯＩ、　ＴＶＮＯ２，ｎ’ＮＯ３；　（２）１１Ｄ ６４．　ＷＤ６５及びＴＶＮＯｌ、　ＴＶＮＯ２，ＴＶＮＯ３ｉ　（３）　ＷＤ ７２．　ＷＤ７６及びＴＹＮＯ４，ＴＹＮＯ５，ＴＹＮＯ６；　（４）賀Ｄ６４ ．　ＷＤ６５及びＴＶＮＯ４゜ＴＹＮＯ５，ＴＶＮＯ６；　（５）賀Ｄ７２．　 ＷＤ７６及びＴＶＮＯ７，ＴＹＮＯ８ｉ及び（６）　ＷＤ６４．　ＷＤ６５及び ＴＹＮＯ７，ＴＹＮＯ８゜これらの後者の増幅においては、完全なＥ　Ｔ　Ｈ域 が増幅される。従って、これらの増幅生成物は、下記に示されるＥ７コンセンサ スブローブにより検出され得る： ＴＹＰＯ９５’　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｃ八　八　ＴＴＡＧＷＡＧＡＣＴＹＰ１２　−− −−−−−−−　Ａ　Ｒ’ｆ　−−−当業者は、本明細書に開示される特定のプ ライマー及びプローブは本発明の単なる例示であることを理解する。たとえば、 本発明のプライマー及びプローブは一本鎖ＤＮＡ分子であり、そして標的ＤＮＡ （サンプルにおけるＨＰＶ　ＤＮＡ）は二本鎖ＤＮＡであるので、本発明の有用 なプライマー及びプローブは、本明細書に特異的に開示されるプライマー及びプ ローブに相補的なプライマー及びプローブを合成することによって単に構成され 得るに過ぎない。本発明のプライマー及びプローブはまた、本明細書に特別に例 示されるＲＰＶゲノム以外のＨＰＶゲノムの領域内で配列変種を増幅し、そして 検出するために調製され得る。

本発明のプライマーは一般的に長１８〜２１個のヌクレオチドのものであり、そ してＨＰＶ配列と高い程度の相同性を有するように企画される。たとえば、本発 明の生殖器ＨＰＶコンセンサスブライマーの構成においては、すべての主要な生 殖器ＨＰＶ（ＨＰＶタイプ６．１１，１６．１８及び３３）との高い程度の相同 性が必要とされた。増幅されるべき個々の領域のためには、２つの相同領域が必 要とされ、ここで１つは陰性鎖プライマーのためであり、そしてもう１つは陽性 鎖プライマーのためである。相同領域を同定するためには、ウィルスの配列が比 較される。相同領域が同定された後すぐに、コンセンサスブライマーが企画され る。劣化塩基は、個々のウィルスが相同配列から順に変化する位置を調節するた めの企画に使用され得る。必要なだけ多くの劣化位置が製造され、その結果、す べてのウィルスの配列はコンセンサスブライマーとの３個よりも少ないミスマツ チを有する。その劣化位置は、最少数の劣化塩基が可能性ある最大数のウィルス の配列を調節するように選択される。

特定のウィルスの配列がコンセンサス配列との多数のミスー？ツチを有する場合 、タイプ特異的プライマーがそのウィルスのために製造される。タイプ特異的プ ライマーは、コンセンサスブライマーを製造するために他のウィルスのために企 画された劣化プライマーと混合される。プライマーにおける劣化位置により調節 されないいづれかのミスマツチは、そのプライマーの３′末端から３個以上の塩 基を一般的に配置されるべきである。同様に、いづれかの劣化位置は、プライマ ーの３′末端から３個以上の塩基を配置されるべきである。

劣化プライマーのための評価された最小及び最大Ｔｍｓは、５４〜６４°Ｃの間 であるべきである。Ｔｅｘは非実験的な公式により評価され：個々のＧ又はＣは Ｔｓに４°Ｃ寄与し；個々のＡ又はＴはＴｏｗに２°Ｃ寄与し；そしてＴＩは計 算された値の合計である。最後に、プライマーはパリンドローム又は反復配列を 補うように企画されるべきでない。

コンセンサスプローブ企画はコンセンサスブライマー企画に類似するが、但し、 コンセンサスプローブは一般的にコンセンサスブライマーはど多くのミスマツチ を含まない。結果として、フ゛ローフ゛のためのＴ−は、プライマーのためのＴ ｓ＋よりも高い。しかしながら、ミスマツチ又は劣化位置が３′末端で生じるこ とは、それがコンセンサスブライマーのために存在するほどコンセンサスプロー ブのためには臨界ではない。

タイプ特異的プローブは、与えられたプローブがそのプローブにより認識される ＨＰＶタイプとは異なるＨＰＶタイプからの配列と７５％以下の相同性を一般的 に有するであろうように企画される。そのタイプ特異的プローブは長さ１８〜２ ０個のヌクレオチドのものであり、そして５８〜６４°Ｃの範囲での推定Ｔ訃を 有する。

当業者はまた、本発明の方法は種々の手段により行なわれ得ることを本発明の開 示から認識するであろう。本発明の方法は、いづれかヒト乳頭腫ウィルスに適用 でき、そして特に生殖器ＨＰＶを検出し、そしてその型を検出するために好まし い。その方法は特定のＨＰＶタイプ内で単離体がら単離体の変種を検出するため に使用され得、そしてまた、患者に存在するＨＰＶにおける有意な変化をスクリ ーンするためにも使用され得る。本発明の１つの態様において、ＨＰＶゲノムの いづれかの部分が欠失されている場合、他の領域もまた欠失され得ることを確保 する、ＨＰＶ　ＤＮＡの１以上の領域に対するコンセンサスブライマーが使用さ れるであろう。類似する態様において、増幅されたＤＮＡの型の分類は、その増 幅されたＤＮＡの種々の領域を認識する種々のタイプ特異的プローブを用いて行 なわれ得る。

当業者は、本発明がサンプル存在するＨＰＶ　ｍＲＮＡを検出するためにもまた 使用され得ることを認識するであろう。あるＨＰＶｍＲＮ＾種、特にＥ６及びＥ ７　ｍＲＮへの発現は、ＨＰＶ感染が癌に進行するであろう傾向の表示であるこ とができる。本発明の方法によりＲＰＶ　ｅ＋ＲＮＡを検出するためには、ｍＲ ＮＡは、ｃＤＮＡ分子を合成するために適切な反応混合物において逆転写酵素に より処理され得る。逆転写反応に使用されるプライマーは本発明のコンセンサス ブライマーであることができ、又はｍＲＮＡの３′末端近くでハイブリダイズす る異なったオリゴヌクレオチドであることができる。次に、このｃＤＮＡのコピ ーが二本鎖ＤＮＡ分子中に生成され、そしてこれが本発明の方法に従って検出さ れ、そして型の分類を行なわれ得る。

本発明のコンセンサスブライマーはまた、これまで特徴化されていないＨＰＶタ イプを検出するためにも使用され得る。

たとえば、上記第４表に示されたＨＰＶ単離体３６及び８８はこれまで決して特 徴づけられたことはなかった。従って、本発明のコンセンサスブライマーは、こ れまで未知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列を増幅するために使用され得る。次に、 その増幅されたＤＮＡは配列決定され、そしてその配列データは本発明の方法に 使用するためのタイプ特異的プローブを生成するために使用され得る。

下記に与えられる例は本発明を単に例示するに過ぎず、ぞして請求の範囲を限定 するものではない。

鼾 ポリメラーゼ坂及夷刃Ｊ」」１「砿（Δ９Ｌ」頚部及び外陰部のスワブ及び陰茎 の切屑は典型的には１０”〜１０’個の細胞を含む。細胞をリン酸緩衝溶液２ｄ に懸濁し、遠心分離によりベレット化し、そして上清液をすてた。細胞懸濁液が 試験の前、ある期間貯蔵される場合、抗生物質がその懸濁液に一般的に添加され た（市販の抗生物質、たとえば２　ＸＦｕｎｇｉ　Ｂａｃｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ がこの目的のために適切である）。

細胞数を評価し、そして血液がサンプルに存在する場合、細胞をＴＥ緩衝液（１ ０ｍＭのトリス−ＨＣｆ、ｐＨ７，５及び１ｍＭのＨＤＴＡ）　１〆に懸濁し、 赤血球細胞を溶解し、そして次に再ベレット化した。約１０！〜１０’個の細胞 をＰＣＲ反応当たりに使用した。細胞をまず初めに、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８ ，５：　１　ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＬａｕｒｅｔｈ−１２；及び２００４／ｄ のブロティナーゼＫを含む緩衝液１００ｉ１！に懸濁した。この混合物を５５° Ｃで約１時間インキュベートし、そして次にブロティナーゼＫを、９５℃で１０ 分間、前記混合物をインキュベートすることによって熱不活性化した０次に、そ のサンフルを、標準のＰＣＲ法に従って、本発明のコンセンサスブライマーによ り処理し、存在するいづれかのＨＰＶ配列を増幅した。１０８〜１０’個の細胞 を含むアリコートを、ＰＣＲ反応混合物１００ｊ１１当たりに使用した。

ＰＣＲのための細胞懸濁液を調製するためのもう１つの方法は、脱イオン水１０ ０Ｊ１１に細胞を懸濁し、そしてその得られた懸濁液を１００°Ｃで１０〜１５ 分間インキュベートすることを包含する。

貰Ｉ パラフィンから　の 本発明の方法はしばしば、パラフィンにおける組織切片がＨＰＶを含むかどうか を決定するために使用されるであろう。

本発明に使用するために、典型的には５〜１０戸の幅の組織切片を調製するため には、次の方法が使用された。

組織切片をキシレン又はアルカン、たとえばオクタンＩｄ３０分間行なわれた。

次に組織切片を１００％エタノールにより２度すすぎ、抽出剤を除去し、そして 回転蒸発器により乾燥せしめた。次に切片を、界面活性剤及びプロテイナーゼＫ を含むＴａｑ緩衝液に懸濁し、そして例１に記載しているようにして処理した。

但し、５５°Ｃでのインキュベーションが２〜４時間行なわれた。

プロテイナーゼにの熱不活性化の後、懸濁液を遠心分離し、残骸をペレット化し 、そして上清液約１〜２０ｄを個々のＰｃＲ反応のために使用した。

■ユ ＰＣＲ法 すべてのＰＣＲ法を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｂｉｇｅｒ／　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ装置を用いて行なった。典型的な反応 混合物は、５０ピコモルのコンセンサス陽性鎖プライマー；５０ピコモルのコン センサス陰性鎖プライマー；２．５単位のＴａｑポリメラーゼ；１０１１１のｌ ０ＸＰＣＲ緩衝液（０，５ＭのＫＣｊｌ！　ｉ　１００蒙Ｈのトリス、ｐＨ＝　 ８．５　；　２０〜４０ｍＭのＭｇＣ／！ｔ　；０．２ｍＭの個々のｄＮＴＰ　 、約１０ｍの臨床的又はパラフィンサンプル；及び脱イオン水１００１１１まで ）を含んだ。

臨床的サンプルと共に使用するためのＰＣＲ反応時間は次の通りであった。機械 を、サンプルを機械に配置する前、７２℃に加熱した。次にその機械を、次の温 度変化を実施するようにプログラムした３９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び ７２℃で６０秒の３０サイクル；７２℃で５分間；そして１５°Ｃで維持される 。

パラフィン切片のためには、機械は次の通りに温度変化を実施するようにプログ ラムされた：９５°Ｃで５０秒、５５℃で５０秒及び７２°Ｃで２分間の４０サ イクル；７２°Ｃで５分間；及び１５°Ｃで維持される。

ＰＣＲ生成物が５ｏｏｂｐよりも長いことが予測される場合、機械は次の通りに 温度変化を行なうようにプログラムされたニア２°Ｃで１分；９５°Ｃへの５０ 秒間のランプ；９５°Ｃで２０秒、５５゛Ｃへの９０秒間のランプ、５５°Ｃで ３０秒、７２°Ｃへの５０秒間のランプ及び７２°Ｃで３分の４０サイクル；７ ２°Ｃで５分；及び１５°Ｃで維持された。

増幅が生じたかどうかをコンセンサスプローブの使用により決定するためには、 約１０ｊｌｌの反応混合物が、１４０ｉ１１の脱イオン水及び５０１１１の４× 変性溶液（１，６ＭのＮａＯＨ及び１００ｍＭのＥＤＴＡ）に添加された。この 変性された溶液的１００ｐｌを、ＢｉｏＲａｄドツト−プロット装置を用いて正 に荷電されたナイロンＧｅｎｅｔｒａｎｓ膜上にスポットを付けた。得られたド ツトを２００Ｉの２０ＸＳＳＣにより１度すすいだ。次に、その膜をブロック− から除き、空気乾燥せしめ、そして紫外線に照射しく光に直面するＤＮＡを有す る）、膜にＤＮＡを共有結合せしめた。

前記膜を、水槽中において６８°Ｃで少なくとも４５分間、プレーハイブリダイ ズせしめた。そのプレーハイブリダイゼーション溶液は、６ＸＳＳＣ１５ＸＤｅ ｎｈａｒｄ溶液及び０．５％のＳＯ３を含んだ。他方では、膜をプレーハイブリ ダイゼーション溶液により単にすすぐことができる。プレーハイブリダイゼーシ ョン溶液をデカントした。約ｌＯ−のプレーハイブリダイゼーション溶液を、１ ０■／戚の変性されたサケ精子ＤＮＡ　１００Ｊ１！及びコンセンサスプローブ ｌｌｄ当たり約１×１０ｈ個のＣｈｅｒｅｎｋｏｖ計数（０，２ピコモル）に添 加した。この溶液を膜の裏に添加し、そしてコンセンサスプローブを５５°Ｃで 少なくとも１時間ハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションの後、その ハイブリダイゼーション混合物をデカントし、そして膜を３０〜５５℃の洗浄溶 液によりすばやくすすぎ、過剰のプローブを除いた。前記洗浄溶液は２ＸＳＳＣ 及び０．１％のＳＤＳから成った。次に膜を、５５゛Ｃに加熱された新しい洗浄 溶液により洗浄した。この洗浄段階のためには、膜は加熱された洗浄溶液を含む トレーに置かれ、そしてそのトレは５５°Ｃの水槽にＩＯ分間装いた。この洗浄 工程を１度（り返し、そして膜を５５〜６０″Ｃに加熱された２ＸＳＳＣ及び０ ．１％ＳＤＳの溶液によりすすいだ、他の洗浄方法は同じ工程を包含するが、し かし異なった温度での洗浄溶液、すなわち５５°Ｃでの洗浄溶液が初めの２回の 洗浄で使用され、そして最終のすすぎでは、室温洗浄溶液が使用された。次に膜 は空気乾燥せしめられ、そしてＸ−線△、の７〜４８時間の照射をされた。

増幅されたＤＮＡのＨＰＶタイプを決定するためには、ＰＣＲ反応混合物を、上 記のようにしてタイプ特異的プローブにハイブリダイズした。その方法において 唯一の有意な差異は、フィルターの最終洗浄が特定のタイプ特異的プローブのＴ ｌ１ｌにひじょうに近い温度で行なわれることであった。異なったタイプ特異的 プローブにハイブリダイズされたフィルターは一緒に洗浄されなかった。

分子生物学、医学的な診断技法、生化学、ウィルス学、遺伝学及び関連する学問 の分野の当業者に明らかである上記本発明の７１１様の１つの変法は、請求の範 囲内にある。

国際調査報告 １＋ｍ＋ｅ＊＋ｌ１１−＾””””　’＝　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３７４７Ｓ Ａ　３１６７４

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．存在する場合、サンプル中のヒト乳頭種ウィルス（ＨＰＶ）を検出し、そし てそのＨＰＶの型を分類するための方法であって： （ａ）ＨＰＶが存在する場合、コンセンサスプライマーの拡張生成物が合成され 得るような条件下でコンセンサスＨＰＶプライマー、重合剤及びデオキシヌクレ オシド５′−トリホスフェートによりサンプルを処理し、ここで前記コンセンサ スプライマーは、一対のプライマーの１つのメンバーから合成される拡張生成物 が、その相補的鎖から分離される場合、前記対の他のメンバーの拡張生成物の合 成のための鋳型として作用することができるように、それらにハイプリダイズす るＨＰＶＤＮＡの一本鎖を分離するために十分に相補的な少なくとも１対のプラ イマーを含んで成るオリゴヌクレオチドの混合物であり； （ｂ）もし存在するなら、前記鋳型からプライマー拡張生成物を分離し、これに 基づいて拡張生成物が一本鎖分子を形成するために合成され； （ｃ）もしあるなら、段階（ｂ）で生成された一本鎖分子を、プライマー拡張生 成物が鋳型として段階（ｂ）で生成された一本鎖分子のそれぞれを用いて合成さ れるような条件下で段階（ａ）のコンセンサスプライマーにより処理し；（ｄ） 段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１度くり返し；（ｅ）増幅が生じたかどうか を決定し；そして増幅が生じた場合、 （ｆ）前記増幅されたＤＮＡにタイプ特異的ＤＮＡプロープをハイプリダイズし ；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを決定することを含んで成る方 法。
2. ２．前記ＨＰＶが生殖器ＨＰＶである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記段階（ｅ）が、ハイブリダイゼーション条件下で段階（ｄ）において調 製された反応混合物をコンセンサスプローブにより処理し、そしてハイブリダイ ゼーションが生じたかどうかを決定することを含んで成る請求の範囲第２項記載 の方法。
4. ４．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶの転写調節領域の配列を増 幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶのＬ１読み取り枠配列を増 幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
6. ６．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶのＥ６読み取り枠配列を増 幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
7. ７．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶのＥ１読み取り枠配列を増 幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
8. ８．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶのＥ７読み取り枠配列を増 幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
9. ９．前記コンセンサスプライマーが前記生殖器ＨＰＶのＥ１，Ｅ６及びＥ７読み 取り枠配列を増幅することができる請求の範囲第２項記載の方法。
10. １０．前記タイプ特異的プローブが前記生殖器ＨＰＶの転写調節領域の配列にハ イプリダイズすることができる請求の範囲第２項記載の方法。
11. １１．前記タイプ特異的プローブが前記生殖器ＨＰＶのＬ１読み取り枠配列にハ イプリダイズすることができる請求の範囲第２項記載の方法。
12. １２．前記タイプ特異的プローブが前記生殖器ＨＰＶのＥ６及びＥ７配列から成 る群から選択されたＥ６読み取り枠配列にハイプリダイズすることができる請求 の範囲第２項記載の方法。
13. １３．前記コンセンサスプローブが前記生殖器ＨＰＶの転写調節領域の配列にハ イプリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の方法。
14. １４．前記コンセンサスプローブが前記生殖器ＨＰＶのＬ１読み取り枠配列にハ イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の方法。
15. １５．前記コンセンサスプローブが前記生殖器ＨＰＶのＥ６読み取り枠配列にハ イプリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の方法。
16. １６．前記コンセンサスプローブが前記生殖器ＨＰＶのＥ１読み取り枠配列にハ イブリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の方法。
17. １７．前記コンセンサスプローブが前記生殖器ＨＰＶのＥ７読み取り枠配列にハ イプリダイズすることができる請求の範囲第３項記載の方法。
18. １８．前記生殖器ＨＰＶの完全なＵＲＲ領域の配列が増幅される請求の範囲第４ 項記載の方法。
19. １９．前記プライマーがＦＳ１０，ＪＳ１５，ＪＳ１６，ＦＳ１７及びＭＹ０１ から成る群から選択される請求の範囲第４項記載の方法。
20. ２０．前記プライマーがＭＹ１１及びＭＹ０９である請求の範囲第５項記載の方 法。
21. ２１．前記プライマーがＷＤ６４，ＷＤ６５，ＷＤ６６，ＷＤ６７，ＷＤ６８， ＷＤ６９，ＷＤ７０，ＷＤ７１，ＷＤ７２，ＷＤ７３，Ｗ０７６，ＷＤ７７，Ｗ Ｄ８３，ＷＤ８４，ＷＤ１５４，ＷＤ１５５，ＷＤ１５７，ＷＤ１５８，ＷＤ１ ５９，ＷＤ１６０，ＷＤ１６１，ＷＯ１６２，ＷＤ１６３、及びＷＤ１６４から 成る群から選択される請求の範囲第６項記載の方法。
22. ２２．前記プライマーがＴＹＮ０１，ＴＹＮ０２，ＴＹＮ０３，ＴＹＮ０４，Ｔ ＹＮ０５，ＴＹＮ０６，ＴＹＮ０７，ＴＹＮ０８，ＴＹＰ０１，ＴＹＰ０２，Ｔ ＹＰ０３，ＴＹＰ０４，ＴＹＰ０５、及びＴＹＰ０６から成る群から選択される 請求の範囲第７項記載の方法。
23. ２３．前記生殖器ＨＰＶの完全なＥ７領域の配列が増幅される請求の範囲第９項 記載の方法。
24. ２４．前記プローブがＭＹ１２，ＭＹ１３，ＭＹ１４，ＭＹ１６，ＭＹ５８，Ｍ Ｙ５９，ＭＹ６０，ＭＹ６１，ＭＹ６２，ＭＹ６３，ＭＹ６４，ＭＹ６５，ＭＹ ６９，ＭＹ７０，ＭＤ７４，ＭＤ１２６，ＭＤ１２７，ＭＤ１２８，ＭＤ１５０ ，ＭＤ１５１，ＭＤ１５２、及びＷＤ１５３から成る群から選択される請求の範 囲第１１項記載の方法。
25. ２５．前記プローブがＷＤ７８，ＷＤ７９，ＷＤ８０，ＷＤ８１，ＷＤ８２，Ｗ Ｄ１０２，ＷＤ１０３，ＷＤ１０４，ＷＤ１３２，ＷＤ１３３，ＷＤ１３４，Ｗ Ｄ１６５，ＵＤ１６６，ＷＤ１６７，ＷＤ１６８、及びＷＤ１６９から成る群か ら選択される請求の範囲第１２項記載の方法。
26. ２６．前記プライマーが少なくとも１つのＥ１プライマー及び少なくとも１つの Ｅ６プライマーを含んで成る請求の範囲第１３項記載の方法。
27. ２７．前記コンセンサスプローブがＦＳ１０，ＭＹ１８，ＭＹ１９，ＭＹ３９， ＭＹ５５，ＭＹ５６，ＭＹ５７，ＭＹ６６，ＭＹＸＸ、及びＷＤ１４７から成る 群から選択されたプローブを含んで成る請求の範囲第１４項記載の方法。
28. ２８．前記コンセンサスプローブがＷＤ６４，ＷＤ６５，ＷＤ８３及びＷＤ８４ から成る群から選択されたプローブを含んで成る請求の範囲第１５項記載の方法 。
29. ２９．前記コンセンサスプローブがＴＹＰ０９及びＴＹＰ１２から成る群から選 択されたプローブを含んで成る請求の範囲第１７項記載の方法。
30. ３０．ＦＳ１０，ＪＳ１５，ＪＳ１６，ＦＳ１７，ＭＹ０１，ＭＹ１１，ＭＹ０ ９，ＷＤ６４，ＷＤ６５，ＷＤ６６，ＷＤ６７，ＷＤ６８，ＷＤ６９，ＷＤ７０ ，ＷＤ７１，ＷＤ７２，ＷＤ７３，ＷＤ７６，ＷＤ７７，ＷＤ８３，ＷＤ８４， ＷＤ１５４，ＷＤ１５５，ＷＤ１５７，ＷＤ１５８，ＨＤ１５９，ＷＤ１６０， ＷＤ１６１，ＷＤ１６２，ＷＤ１６３，ＷＤ１６４，ＴＹＮ０１，ＴＹＮ０２， ＴＹＮ０３，ＴＹＮ０４，ＴＹＮ０５，ＴＹＮ０６，ＴＹＮ０７，ＴＹＮ０８， ＴＹＰ０１，ＴＹＰ０２，ＴＹＰ０３，ＴＹＰ０４，ＴＹＰ０５，ＴＹＰ０６， ＭＹ１２，ＭＹ１３ＭＹ１４，ＭＹ１６，ＭＹ５８，ＭＹ５９，ＭＹ６０，ＭＹ ６１，ＭＹ６２，ＭＹ６３，ＭＹ６４，ＭＹ６５，ＭＹ６９，ＭＹ７０，ＷＤ７ ４，ＷＤ１２６，ＷＤ１２７，ＷＤ１２８，ＷＤ１５０，ＷＤ１５１，ＷＤ１５ ２，ＷＤ１５３，ＷＤ７８，ＷＤ７９，ＷＤ８０，ＷＤ８１，ＷＤ８２，ＷＤ１ ０２，ＷＤ１０３，ＷＤ１０４，ＷＤ１３２，ＷＤ１３３，ＷＤ１３４，ＷＤ１ ６５，ＷＤ１６５，ＷＤ１６７，ＷＤ１６８，ＷＤ１６９，ＭＹ１８，ＭＹ１９ ，ＭＹ３９，ＭＹ５５，ＭＹ５６，ＭＹ５７，ＭＹ６６，ＭＹＸＸ，ＷＤ１４７ ，ＷＤ６４，ＷＤ６５，ＷＤ８３，ＷＤ８４，ＴＹＰ０９、及びＴＹＰ１２から 成る群から選択された、サンプル上でのＨＰＶＤＮＡを検出するために有用なオ リゴヌクレオチド。