JPH04500966A - 脈管狭窄の治療におけるγ―インターフェロンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、／ｌｖのｒム　に＋し　−　ン　−　ロン支止■ 本発明は、例えば血管形成および／または脈管手術における再狭窄治療を含む内 膜過形成によって生した脈管狭窄の治療についての製剤の製造にＴ−インターフ ェロンを使用することに指向することにある。特に、本発明は血管形成および／ または脈管手術における動脈狭窄の治療に指向することである。

見所Ωｉ景 心臓血管についての研究の進歩によって、特に高コレステロール血症、スモーキ ング（ｓｍｏｋｅｉｎｇ）および高血圧症のようなアテーロム性動脈硬化症につ いての危険要素を減少することによって、患者における心臓発作の発生率を低下 させている。心臓発作の発生は冠状動脈における血栓を溶解する組織−タイププ ラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の投与によって止めることができること は知られている。最近、組換えＤＮＡ技術によるｔ−ＰＡのクローニングおよび 生成によって、ｔ−ＰＡを制限されない量で生成させている。

冠状アテローム性動脈硬化症を引き起こす患者における心臓発作を防止するため には、外科的方法だけが用いられている。

二三の重要な新しい技術は外科治療において発展している。特に、バルーン　カ テーテルを用いる血管形成手段および最近のレーザーは、冠バイパス外科治療が 確実でなく、かつひどくない症状の患者、また一般条件が主な外科治療に望まし くない患者の治療に適している。

しかしながら、通常の外科または血管形成手段である主な血管のすべての手技は 、動脈の再狭窄を導びく内膜過形成をよく起すことから障害となる、例えば、サ ルグレンの病院（ｓａｈｌ−ｇｒｅｎ’　ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）　、スウェー デン、イエーテボリーにおける、経皮トランスルミナル冠血管形成症にかかって いる患者のすべての内の約３０％が虚血性症状を起す内膜病変（ｉｎｔｉｍａｌ 　１ｅｓｉｏｎｓ）を引き起している。

また、この問題は通常の脈管外科治療後にも観察されている。

下肢に血液を供給する動脈の再形成手術では、すべての場合の５０％が内膜病変 により虚血性症状を再発している（ラザフオードＲ（Ｉ集）　ｒＶａｓｃｕｌａ ｒ　ＳｕｒｇｅｒｙＪＣｈ、　５８を第２版、サランダース（１９８４）参照） 。同様に、頚動脈血管内膜切除を受けた患者のすべての内ち約２０％が内膜過形 成を引き起している。同様の結果は二三の他の治療センターから報告されている 。また、内膜過形成は冠バイパス手術に関連して、しばしば観察されている。そ れ故、今日において、手術後および［血管形成後（ｐｏｓｔａｎｇｉｏｐｌａｓ ｔｉｃ）　ｊ内膜過形成は、臨床心臓病学、心臓手術および脈管手術において主 問題とされている。

例えば、狭心症の多く患者は血管形成手術を繰返し受けており、結局、冠バイパ ス手術が行われている。内膜過形成の発生を回避できる場合には、患者を苦痛お よび悩みから開放してやることができ、また実質的に治療費を軽減することがで きる。

内膜細胞増殖による機構は脈管生物学者によって非常に注意深く研究されている 。動脈に対する機械的障害は内側平滑筋細胞を内膜に移行することは知られてい る。一旦、内膜において、細胞が増殖を始め、何ケ月か持続する内膜病変を形成 する（シュワルツＳＭ　、カンプベルＧＲおよびカンプベルＪＨ氏’Ｃ１ｒｃＲ ｅｓ　Ｊ　５８　：　４２７　（１９８６）参照）。表面の再内皮化は病変の退 行について重要であると思われ、内皮上構造に対する損傷の割合は病変の進行に ついて大切である。

脈管平滑筋細胞の増殖は、おそらく、インスリンのような血液に循環するか、ま たは小板−誘導成長ファクターのような細胞から開放するかによる成長ファクタ ーで制御することができる。後述するファクターは巨核球によるばかりでなく、 単球および内皮細胞によって合成される（ロス８氏ｒＮｅｗ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍ ｅｄ」３１４　：　４８８　（１９８６）およびロス８氏、レインスＥ−ボーウ エンーホップ叶氏ｒｃｅｌｌ」４６　：　１５５〜１６９　（１９８６）参照） 、この事は炎症性細胞が管壁の成長調整に関係することを示している。

平滑筋細胞についての成長抑制ファクターについてはあまり知られていない。ヘ パリンの薬理学的に投与は平滑筋増殖を抑制しくクローニスＡＷおよびカルノブ スキーＭＪ氏ｒ　Ｎａ　ｔｕｒｅ　Ｊ２６５　：　６２５　（１９７７）参照） 、この事は内因性ヘパリン一様物質が生理学的生成制御に影響を与えることを示 している。しかしながら、血管形成および外科的処置を受けたすべての患者がヘ パリン治療を受けているが、有意な内膜狭窄を引き起している。

細胞タイプ−特異的モノクロナール抗体を用いる最近の免疫細胞化学研究では、 単球−誘導マクロファージがアテローム性動脈硬化斑に多量に存在することを報 告している（ベデラーＣＡ、ナイランドＨおよびマドラ−８氏：早期ヒトアテロ ーム性動脈硬化病変における泡沫細胞の１ｎＳｉｔｕ特性ｒＡｃｔａ　Ｐａｔｈ ｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　５ｃａｎｄ　（Ｃ）　Ｊ　９２　： 　１３３〜１３７　（１９８４）、およびアクエルＮＭ、パルＲＹ　、ワルドマ ンＨおよびミツチンソンＭＪ氏：ヒト　アテローム性動脈硬化斑における泡沫細 胞の単球源、ｒＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　Ｊ　５３　：　２６５〜２７ １　（１９８４）、およびジョナソンし、ホルムＪ、スカリーＯ，ボンジエルス ＧおよびハンソンＧＫ氏：　ヒト　アテローム性動脈硬化斑におけるＴ−細胞、 マクロファージおよび平滑筋細胞の局部蓄積、「Ａｔｈｅ−ｒｏｓｃｌｅｒｏ− ｓｉｓ　」６　：　１３１〜１４０　（１９８６）、およびガウンＡＭ、ツカダ ＴおよびロスＲ氏：ヒト　アテローム性動脈硬化■、ヒトアテローム性動脈硬化 病変の細胞組成の免疫細胞化学分析ｒＡｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｊ　１２５　； 　１９１〜２０７　（１９８６）参照）。しかしながら、これらの研究は、病的 環境における動脈壁に見出すことのできる唯一の血球−骨細胞についてではない 。Ｔ−リンパ球はヒト　アテローム性動脈硬化斑の線維性キャップにおける細胞 集団の５分１を構成しており（ジョナソン氏ほか’Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓ ｉｓ　Ｊ　６　：　１３１〜１４０　（１９８６）参照）、およびまた脈管損傷 の実験的モデルにおいて観察することができる（ジョナソンし、ホルムＪおよび ハンソンＧＫ氏：平滑筋細胞の損傷に対する動脈応答中のＩａ抗原発現、ｒＬａ ｂ　ＩｎｖｅｓＪ　５８：３１０〜３１５　（１９８８）。

免疫細胞化学データは、Ｔ−リンパ球が平滑筋細胞の成長特性および他の機能を 調整できることを示している。Ｔ−リンパ球に冨んだアテローム性動脈硬化斑に おいて、多くの平滑筋細胞はクラス■主組織適合性複合抗原（Ｉａ抗原）を発現 する。

他方において、平滑筋細胞は非アテローム性動脈硬化、正常動脈におけるＩａ抗 原に欠乏している（ジョナンソンし、ホルムＪ、スカリーＯ，ガビアニ一〇およ びハンソンＧＫ氏：ヒト　アテローム性動脈硬化における脈管平滑筋細胞のクラ スＩＩ移植抗原の形質発現、ｒ　Ｊ　Ｃ１１ｎ　ＩｎｖｅｓＪ　７６　：　１２ ５〜１３１　（１９８５）、およびハンソンＧＫ　、ジョナソンし、ホルムＪお よびクラエソンーウェルシし氏：アテローム性動脈硬化斑におけるクラス■ＭＨ Ｃ抗原形質発現；平滑筋細胞のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ　および不変γ鎖の 発現、ｒｃｌｉｎ　ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ」６４　：　２６１〜２６８　（１ ９８６）参照）。Ｉａ抗原はラットの損傷に対する動脈応答中、平滑筋細胞に発 生するが、しかもＩａ抗原と脈管狭窄との関係を示すまたは暗示する研究はこれ までは存在していない。

これらの抗原はＴリンパ球に対する外来抗原の表示において基本的役割を演する 。マクロファージ、内皮細胞およびユニの他の細胞タイプによるこれら抗原の形 質発現は活性化Ｔリンパ球により分泌されるγ−インターフェロンによって誘導 される（ポベルＪＳ、ギムブロンＭＡ、コトランＲ３，レイスＣ３゜ブラコオフ ＳＪ、フイエルスＷおよびアウルトＫＡ氏；活性化Ｔ細胞によりおよびヒトＴ− インターフェロンにより誘導できる脈管内皮によるＩａ形質発現、ｒＪ　Ｅｘｐ 　Ｍｅｄ　Ｊ　１５７　：　１１３９〜１３５３　（１９８３）　、およびウナ ヌエＥＲおよびアレンＰＭ氏：非リンパ球におけるＩａ形質発現の研究結果につ いてのコメント、ｒＬａｂ　ＩｎｖｅｓＪ　５５　：　１２３〜１２５　（１９ ８６）参照）。

白血球、繊維芽細胞および他の細胞タイプにより生ずるα−およびβ−タイプ　 インターフェロンはある種の細胞タイプの増殖を抑制することが知られている。

Ｔ−インターフェロンは活性化Ｔリンパ球により釈放され、またコンディション ド　メディウムまたは製剤を乳腺細胞および繊維芽細胞のような種々のタイプの 培養細胞に加える場合には、増殖を抑制することが知られている（ルピンＢＹお よびグフタＳＬ氏：抗ウィルス剤および抗増殖剤としてのヒト　タイプＩおよび タイプ■インターフェロンの識別効力、ｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ ｉ　ＵＳＡ　Ｊ　７７：５９２８〜５９３２　（１９８０）　、およびブラロッ クＪＥ、ゲオルジアデスＪＡ。

ラングフォールドＮＦおよびヨハンソンＨＭ氏：繊維芽細胞または白血球インタ ーフェロンより強い抗細胞活性を有する精製ヒト免疫インターフェロン、ｒｃｅ ｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｊ　４９　：　３９０〜４０１（１９８０）、およびワ ラヒルＳＭおよびガルテリイＣＬ氏：ヒトＴ細胞および連続Ｔ細胞系源のリンホ カインによる繊維芽細胞成長の調整、ｒＪ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　」１３０　：　１ ２２６〜１２３０　（１９８３）参照）。しかしながら、この効果はγ−インタ ーフェロンそれ自体の抑制効果より、むしろリンフォトキシン（腫瘍壊死因子） による製剤の汚染によるかどうかが問題とされている。

要約すると、脈管狭窄および関連する障害を平滑筋細胞の成長を抑制する製剤の 使用によって治療できるので有益である。

主肌二皿車度翌所 本発明において、Ｔ−インターフェロンが内膜病変およびアテローム性動脈硬化 における平滑筋細胞についての重要な成長抑制剤であることを見出したことは驚 くべきことであり、この事が本発明の基礎をなすものである。

本発明の１つの観点においては、例えば内膜過形成により生ずる脈管狭窄の治療 における製剤の調製にＴ−インターフェロンを使用することである。

本発明のこの観点の１例においては、脈管狭窄の治療を動脈狭窄または閉塞の治 療による再狭窄に適用する。

本発明のこの観点の好適例においては、脈管狭窄の治療を血管形成および／また は脈管手術による動脈狭窄治療に適用する。

本発明の他の観点においては、例えば内膜過形成により生ずる脈管狭窄の治療に Ｔ−インターフェロンを使用する方法にあり、この場合γ−インターフェロンを 患者に、かかるインターフェロンを治療効果を生ずるのに十分な分量で含有する 製剤で投与する。

本発明のこの観点の１例においては、脈管狭窄の治療を動脈狭窄または閉塞の治 療による再狭窄の治療に適用する。

本発明のこの観点の好適例においては、脈管狭窄の治療を血管形成および／また は脈管手術による動脈狭窄治療に適用する。

使用するＴ−インターフェロン源は臨界的でなく、合成、天然または組換えＤＮ Ａ技術により作られた組換えＴ−インターフェロンを用いることができる。

本発明の製剤は患者に非経口投与、すなわち、皮下、静脈または筋肉注射によっ て投与するのが好ましい。

希釈薬および賦形剤を、一般に製薬、例えば生理食塩水に用いることができる。

図　（７）　、Ｚ”肌 第１図は培養平滑筋細胞増殖におけるγ−インターフェロンの種々の濃度の効果 を示すグラフである。

第２図は平滑筋細胞培養における成長の誘導についてのγ−インターフェロンの 種々の濃度の効果を示すグラフである。

第３図は平滑筋細胞周期の０１相の持続を示すグラフである。

第４図は平滑筋細胞周期の初期相での平滑筋細胞複製におけるγ−インターフェ ロンの効果を示すグラフである。

第５図は異なるＴ−インターフェロン濃度において平滑筋細胞におけるＩ−Ａ形 質発現でのＴ−インターフェロンの効果を示すグラフである。

第６図は平滑筋細胞におけるＩ−Ａ形質発現でのＴ−インターフェロンの時間に 対する効果を示すグラフである。

第７図は平滑筋細胞増殖の抑制に用いられたＴ−インターフェロン製剤における エンドトキシン汚染の欠乏を示すグラフである。

第８図はＩ−Ａ発現平滑筋細胞およびＩ−Ａネガティブ平滑筋細胞のそれぞれの 複製の程度を示すダイヤグラムである。

主肌■詳に立且旦 培養動脈平滑筋細胞における組換えＴ−インターフェロン効果を研究し、このリ ンホカインが細胞増殖を抑制することを確めた。この効果はＩａ抗原の誘導に対 応する。それ故、Ｉａ形質発現および細胞複製をバルーンド（ｂａ　ｌ　１ｏｏ ｎｅｄ）ラット頚動脈における損傷に対する動脈応答について研究した。Ｉａ形 質発現と増殖の欠乏との相関関係を得た。

研究を行い、アテローム性動脈硬化斑を形成する細胞集団を同定した。それ故、 細胞タイプ−特異抗原に対するモノクロナール抗体を血管内膜切除被検物のセク ションに適用した。脂質に富んだコア部位における多くの細胞は抗体によりマク ロファージ抗原を染色するのを確め、繊維状キャップの細胞の多くが、しばしば 抗平滑筋抗体によって染色された（ジョナソンＬ、ホルムＪ、スカリー０．ボン ドジエルスＧおよびハンソンＧＫ氏ｒＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」６　 ：　１３１　（１９８６）参照）。更に、驚くべきことは、特に繊維状キャップ に実質的量のＴリンパ球を観察したことである。これらの多くを活性化の符号、 すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、ＶＬＡ−１およびインターロイキン−２受容体の形質 発現を示した（ジョナソンし、ホルムＪ、スカリーＯ，ガビアニＧおよびハンソ ンＧＫ氏ｒＪ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｊ　７６　：　１２５　（１９８５） 、およびハンソンＧＫ、ジョナソンし、ホルムＪおよびタラエソンーウエルシＬ 氏ｒｃ１ｉｎ　ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｊ　６４　：　２６１　（１９８６） 参照）。

これらのＴ細胞に富んだ区域における多くの平滑筋細胞はＨＬＡ−ＤＲ（Ｉａ抗 原）を発現し、これに対してこの抗原は正常動脈壁の平滑筋細胞においていまだ かって見出されていない。ＨＬＡ−ＤＲ形質発現はＴ−インターフェロンの釈放 を介して活性化Ｔ細胞によって誘導される（ポベルＪＳ氏ほかｒＮａｔｕｒｅ」 ３０５　ニア２６　（１９８３）、およびウナヌエＥＲおよびアレンＰＭ氏ｒＬ ａｂＩｎｖｅｓＪ　５５　：　１２３　（１９８３）参照）。それ故、アテロー ム性動脈硬化における研究結果は、γ−インターフェロンがアテローム性動脈硬 化斑における遺伝子発現のバラクリニア調整に含まれることを示している。アテ ローム性動脈硬化斑におけるγ−インターフェロンの存在についての直接免疫組 織化学的証明は最近、得られている。

実ｍ段 実験動物モデルを動脈平滑筋増殖および遺伝子発現を調整するＴ白血球の役割に ついての分析に用いた。この目的のために、バウムガートナー氏により開発され 、かつクローウスおよびレイディ氏により改良されたバルーン　カテーテル　モ デルを適用した。内膜病変をラット頚動脈にフォガーティ　バルーンカテーテル により誘導し、白血球およびＩａ抗原の発現の異なるタイプの浸潤を損傷後、異 なる時点で免疫組織化学により分析した。

少量であるが、しかし有意量のＴ細胞増殖を２週間にわたって確め、内膜におけ る平滑筋細胞がＩａ抗原の発現し始めるのを確めた。試験管内で、Ｉａ形質発現 は組換えγ−インターフェロンによって誘導することができた。これらの研究結 果は、Ｔ−インターフェロンが釈放し、内膜病変において平滑筋遺伝子発現に影 響を及ぼすことを示している。

試験管内で、Ｔ−インターフェロン平滑筋細胞増殖の効果的な抑制剤であり、こ れが損傷後、内膜病変において平滑筋増殖の内因性抑制剤として作用するものと 思われる。

この仮説についての間接的支持と病変における平滑筋細胞複製の分析によって得 られた。Ｉａポジティブ平滑筋細胞が損傷後１４日日月おいて２４時間パルス中 に３Ｈチミジンを吸収しないことを確めた。

他の組の実験において、すべての複製平滑筋細胞をバルーニング（ｂａｌｌｏｏ ｎｉｎｇ）時に導入された浸透圧ポンプを介して３Ｈチミジンで標識付けした。

３ＨオートラジオグラフイーおよびＩａについての免疫組織化学染色の組合せに よって、犠牲時において、すなわちバルーニング後１４日月においてＩａを発現 した細胞カ月ａ−ネガティブ平滑筋細胞より有意に少ないサイクルの複製を受け ることを確めた。この事は、Ｔ−インターフェロンが内膜過形成における平滑筋 細胞複製の内因性抑制剤であることを確認している。これらの結果は、損傷に対 する動脈応答における非経口的投与によるＴ−インターフェロンの効果を試験す る研究継続によって確めた。

材料豊よび方法 豊皿培１ ラット大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣＳ）を２００μ雄のスプラギューダウレイ（ｓ ｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットからコラゲナーゼ消化により分離し、ウシ 胎児血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｄペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプ トマイシンおよび５０　μｇ／１ｒｄｌアスコルビン酸で補充したＲＰＭＩ−１ ６４０培地で成長させた。１７３〜１７５部の細胞を実験に用い、これらの細胞 を成長分析のために９６−ウェル　微量滴定プレート（Ｎｕｎｃ、　Ｒｏｓｋｉ ｌｄｅ、デンマーク）に、または　ＤＮＡ合成の分析のためにｌ　Ｏｃｍ　２ペ トリ一皿に入れた。

裟ｌ公折 ＳＭＣＳを指数関数的に成長させるか、または０．５％ＦＣ５における血清飢ｆ ｉ（ｓｅｒｕｍ　５ｔａｒｕａｔｉｏｎ）の４８時間後１０％ＦＣ３の添加によ る細胞サイクルのギヤツブｔ（Ｃ＋）相を導入するように誘導した。

培養物を、培地を１０％ＦＣ５と共に加えた組換えマウスγ−インターフェロン （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　、カリフォルニア州、南すンフランシスコ）にさらし た。

種々の時間において、培養物を０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ３，１中に４％ホルム アルデヒドで固定し、アミドブラックＢと温置して細胞蛋白質を染色させた。非 結合染料を蒸留水でゆすぎ落とし、染料吸収量をＥＩＡ微量滴定光度計において ６２０ｎｎ＋で調べた。

細胞当りに結合した染料を培養物当りの染料吸収量（Ａｂ□。単位）を培養物当 りの細胞数で割って計算し、更に平衡培養物におけるトリプシン処理した細胞の 血球係数器で測定した。これらの培養物における細胞当りの染料吸収量が極めて 小さい変動性（く２％）であったことから、細胞数は与えられた培養物のＡ６□ 。吸収量をＡ６□。／細胞係数で割って評価することができた。この場合、Ｔ− インターフェロン処理培養物と未処理培養物との間のＡ６□。／細胞における有 意な差はなかった。細胞数を測定するための微視的力ランチングと染料結合分析 との間に相関関係は優れていた（　ｒ　＝０．９８）。

二Σへ金戒 ＤＮＡ合成をレインスおよびロス氏により記載されるように調べた。簡単に、Ｓ ＭＣを上述するようにしてキャップＯ相（Ｇｏ）に同期し、次いでＴ−インター フェロンの存在で、または不存在で血清の添加後、同時にまたは異なる時間にお いて１０％ＦＣＳを添加して細胞周期を導入するように誘導した。３Ｈ−チミジ ン（１０ｉｔ　Ｃｉ／１０　ｃｍ”ウェル（ｗｅｌ　ｌ）をｐｃｓと共に加え、 細胞を２４時間でトリプシン処理により採取した。これらを０．２２−μｍ微細 孔フィルター（Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）上に集め、トリクロロ酢 酸−不溶性放射能をインスターゲルＩＲ（Ｉｎｄｔａ−ｇｅｌ　１）に可溶化後 、シンチレーション　カウンターで分析した。

ａ　ノ　の　入イム　・・セイ ９６−ウェル微量滴定プレート（ヌンシ（Ｎｕｎｃ）　）におけるＳＭＣを以下 に記載するようにＴ−インターフェロンにさらした。細胞をＰＢＳ　（リン酸緩 衝食塩水、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭリン酸緩衝液、ｐ）ｌ　７．２　） で３回ゆすぎ、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２中１％ホルムア ルデヒドで４°Ｃ１５分間にわたって固定した。これをＰＢＳで３回ゆすぎ、０ ．１ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ　（ＢＳＡ　、　ＲＩＡ等級、シグマ　ケ ミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ、セントルイス）中１００ｍ Ｍグリシンと３７°Ｃ３０分間にわたって反応させた。細胞をＰＢＳ中でゆすい だ後、細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中０．５％標準ウマ血清と３７°Ｃで６ ０分間にわたって予備温間し、０．０５％トウイーン２０を含有するＰＢＳで３ 回ゆすぎ、次いでモルクロナール抗体０×６およびＯｘ１７　（Ｓｅｒａｌａｂ 、　Ｃｒａ−ｗｌｅ　Ｄｏｗｎ＋英国、サセックス）で温置し、チェケルボード 滴定（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって定めた最適な希 釈で、３７℃６０分間にわたってＩ−ＡおよびＩ−Ｅ抗原のそれぞれを検出した 。過剰の抗体をＰＢＳ／　）ウィーンで３回ゆすいで洗い落し、細胞をＰＢＳ／ ＢＳ八に１：１０００の割合に希釈したアルカリ性ホスファターゼ−標識、アフ ィニティー精製ヤギ　アンチ−マウス免疫グロブリンＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　 Ｌａｂ、ペンシルヴエニア州アボンダレ）と３０分間にわたって温置した。ＰＢ Ｓ／）ウィーン洗浄後、被検物を１０％ジェタノールアミン、０．５ａ＋Ｍ　Ｍ ｇＣ１ｚに１　ｍｇ／Ｉｄ　ｐ−ニトロフェニル　ホスフェート基質を含有する 基質溶液、ｐ）１９．８中３７℃で６０分間にわたって温置した。反応を２ＨＮ ａＯＨの添加により停止し、４０５における吸光度を微量滴定光度計で調べた。

勤上夫筋↓ １５年５ケ月生育したスプラギューーダウレイ　ラットを上述するように頚動脈 損傷させた。簡単に、麻酔したラットを左外側頚動脈を介してフォガーティ２Ｐ バルーン　カテーテルでカテーテル処理した。バルーンを共通頚動脈の最も近い 部分において膨張し、カテーテル頚動脈分岐点の方向に後退させた。この処理を ３回繰返し、次いでカテーテルを除去し、外側頚動脈および表在損傷を閉じた。

この処理によって、損傷区域のすべての内皮細胞を除去し、かつ内側平滑筋細胞 が幾分、失うのを確めた。３Ｈ−チミジン（６，７Ｃｉ／ｎモル；　Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ＋マサチューセッツ州ボストン）を、５匹のラット に手術日から腹腔内浸透ミニポンプを介して連続的に注射した（クローニス静お よびシュワルツＳＭ：　損傷ラット頚動脈における静止平滑筋移動の重要性ｒＣ ｉｒｅ　Ｒｅｓ」５６　：　１３９〜１４５　（１９８５）参照）。

他の１０匹のラットに、４日間において２４時間中３回にわたって″Ｈ−チミジ ンを注射したくジョナンソンし、ホルムＪ、ハンソンＧＫ：損傷に対する動脈応 答中Ｉａ抗体を発現する平滑筋細胞’Ｌａｂ　ＩｎｖｅｓＪ　５８　：　３１０ 〜３１５　（１９８８）参照）。

手術後１４日にして、ラットを麻酔し、頚動脈にリン酸緩衝液、ｐＨ７，２中１ ％ホルムアルデヒドを潅流して固定した。損傷させた左側および損傷させない右 側の頚動脈を含むセグメントを液体窒素中でスナップ凍結しく５ｎｓｐ−ｆｒｏ ｚｅｎ）　、８μｍセクションを低温槽ミクロトームにおいてカットした。Ｉａ 抗原Ｉ−Ａを、マウス　アンチ−ラット　モノクロナール抗体ＯＸ６で、次いで ビオチニル処理した（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ウマ　アンチ−マウス免疫グ ロブリンＧおよびビオチン−アルカリ性ホスファターゼ複合物（Ｖｉｃｔｏｒ、 カリフォルニア州　バーリンガム）で温間して明視化した。次いで、セクション をホルムアルデヒドに固定し、ＮＴＢ　２ニユークリア　トラック　エマルジョ ン（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州ロチェスター）に浸した。これらのセクション を２週間後展開し、ヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡で検査した。各動物に ついて、２００個の細胞を内膜肥厚（ｉｎｔｉｍａｌ　ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ） の相当する区域において数え、およびＩａ−ポジティブおよび３Ｈ−チミジン− ポジティブ細胞を定めた。

手段をスチュデンツＬテスト（５ｔｕｄｅｎｔｓ’　ｔ　ｔｅｓｔ）と比較した ；多比較の場合、シュフッ　コレクション（Ｓｃｈｅｆｆｅ　ｓ’　ｃｏｒｒｃ ｔｉｏｎ）をアルミテージ（Ａｒｍｉｔａｇｅ）氏により記載されているように 用いた（アルミテージＰ氏；医学研究における統系的方法、英国オックスフォー ド、ブラックウェル出版（１９７１）参照）。差異はＰ＜０．０５において有意 のように考えられた。回帰線を最小−スクエア法（ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ 　ｍｅｔｈｏｄ）により適合させた。

見−且 指数関数的に成長するラット平滑筋細胞の増殖は培養基に組換えγ−インターフ ェロンを存在することによって抑制できた。

第１図は、平滑筋細胞増殖はＴ−インターフェロンによって抑制することを示し ている。９６−ウェル微量滴定プレートにおける指数関数的に成長する動脈平滑 筋細胞を培養基において異なる投与量の組換えマウスＴ−インターフェロン（ｒ −ＩＦＮ）ニサらした。Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥは０．　１．１０．１５および １００のそれぞれの単位（ｕ）／　ｒｌｌＲのＴ−インターフェロンの濃度に相 当させた。有意な抑制を処理後４日目において１０単位／ｄで、およびインター フェロン添加後２日月で５０または１００単位／戚で得た。平坦域に達した場合 には、５０単位／ｄまで、Ｔ−インターフェロン投与と増殖抑制との間に投与一 応答関係が存在した。

成長抑制は、先ず細胞が血清飢餓により成長抑制され、次いでＦＣＳ添加により 細胞周期が導入される場合に、極めて著しかった。この事を第２図に示しており 、同期した平滑筋培地における成長誘導がγ−インターフェロンによって抑制さ れていることを示している。Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤおよびＥを第１図のＡ−Ｅと同じＴ −インターフェロン濃度に相当させた。この場合、培地における１０単位／１ｄ ｒ−インターフェロンが５０％成長抑制を得、有意な抑制が９日間さらした後１ 単位／Ｉｄのように少量で得た。有意な抑制は１０単位／ｄで４日後に得られ、 最大抑制は５０単位／ｄで達成した。

また、平滑筋細胞複製におけるＴ−インターフェロンの効果は、細胞周期中およ び細胞周期に導入後、同期細胞によって吸収される３Ｈ−チミジンの分析によっ て評価した。先ず、細胞周期のＧ、相の持続を調べた。１０ｃｍ”ペトリ皿中の 細胞を血清飢餓によって阻止し、次いで１０％ウシ胎児血清の添加により０時間 で細胞周期を導入されるように誘導した。３Ｈ−チミジンをウシ胎児血清と一緒 に加え、細胞を異なる時点で採取し、トリクロロ酢酸不溶性放射能を三重培養物 （ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｃｕｌｔｕｒｅｓ）のシンチレーション　カウンターに より調べた。血清添加から３Ｈ−チミジン吸収の開始にわたる時間を調べた（す なわち、第３図の曲線の彎曲点）。Ｇ１相は約２０時間であった。

第４図は、Ｔ−インターフェロンを血清と一緒に添加した場合、３Ｈ−チミジン の吸収が７０％まで減少することを示している。γ−インターフェロンは細胞周 期の初期Ｇ１において作用することによって平滑筋細胞複製を抑制する。１０ｃ ｎ＋”ペトリ皿中の細胞を成長阻止し、次いでＦＣＳの添加により細胞周期に入 るように誘導した。次いで細胞を３Ｈ−チミジンに連続的にさらした。γ−イン ターフェロンをＦＣＳと共に、または３，６゜９．１２または１５時間後に加え た。すべての細胞を２４時間で採取し、トリクロロ酢酸不溶性放射能を四重培養 物のシンチレーション　カウンターにより調べた。Ｘ軸はＦＣＳの添加からＴ− インターフェロンの添加にわたる時間を示しており、「０時間」はＦＣＳおよび Ｔ−インターフェロンを同時に受け入れた培養物を示し、「１５時間」はウシ胎 児血清の添加後１５時間においてＴ−インターフェロンを受け入れた培養物を示 している。ｙ−軸において、１００％はＴ−インターフェロンにさらさない培養 物における３Ｈ−放射能を示しており、Ｔ−インターフェロン処理培養物におけ る放射能をこの値の百分率で与える（平均植土ＳＤ　）。しかしながら、γ−イ ンターフェロンの添加を血清添加後９時間以上遅らせた場合には、抑制は得られ なかった（第４図参照）。それ故、データは、Ｔ−インターフェロンがＧｏから Ｇ、の変異、または脈管平滑筋細胞における細胞周期のＧ。

相中の初期を阻止することによって作用することを示している。

Ｔ−インターフェロンは内皮細胞および繊維芽細胞を含む標的細胞の変種による Ｉａ抗原の形質発現を誘導する。アテロ−。

ム性動脈硬化動脈における平滑筋細胞はこれらの抗原を発現するのに観察されて おり　（ジョナソンＬ、ホルムＪ、スカリ０゜ガビアニＧおよびハンソンＧＫ氏 ：ヒト　アテローム性動脈硬化における脈管平滑筋細胞でのクラスＩＩ移植抗原 の形質発現ｒＪ　Ｃ１１ｎ　ＩｎｖｅｓＪ　７６　：　１２５〜１３１　（１９ ８５））　、アテローム性動脈硬化斑における活性化Ｔリンパ球の存在は、Ｔリ ンパ球から釈放されたＴ−インターフェロンがこの抗原の形質発現を誘導するこ とを示している（ジョナソンＬ、ホルムＪ、スカリＯ。

ガビアニＧおよびハンソンＧＫ氏：ヒト　アテローム性動脈硬化における脈管平 滑筋細胞でのクラスＩＩ移植抗原の形質発現ｒＪ　Ｃ１１ｎ　ＩｎｖｅｓＪ　７ ６　：　１２５〜１３１　（１９８５）、およびハンソンＧＫ、ジョナソンし、 ホルムＪおよびクラソンーウエルシし氏；アテローム性動脈硬化斑におけるクラ スＩＩ　Ｍ）ＩＣ抗原形質発現；平滑筋細胞がＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱおよ び不変のＴ−鎖を発現する、ｒｃｌｉｎ　ＥＸＩ）　Ｉ＋＋ｕｎｕｎｏｌ　Ｊ　 ６４　；　２６１〜２６８　（１９８６）参照）。この可能性については培養平 滑筋細胞をＴ−インターフェロンにさらすことによって試験した。

第５図は、Ｔ−インターフェロン（ｒ−ｔｐＮ）が投与量−依存手段での平滑筋 細胞における細胞表面１−Ａ形質発現を誘導することを示している。９６−ウェ ル微量滴定プレートにおける細胞を組換えマウスＴ−インターフェロンにより種 々の濃度で３日間にわたって処理し、次いで酵素結合イムノアッセイ技術により Ｉ−Ａ形質発現について検定した。細胞当りのＴ−Ａ形質発現を、各培養物にお ける全Ｉ−Ａ値（４０５ｎｍにおける吸光度）を染料結合により測定された培養 物当りの細胞数で割って計算した。培養物の平均（ｎ＝１６）を示し、変動係数 （ｖａｒｉａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ）　は常に２％以下とした。

第６図は、平滑筋Ｉ−Ａ形質発現を誘導するＴ−インターフェロンの時間経過状 態を示している。９６−ウェル微量滴定プレートにおける細胞（ｎ＝１６）をＴ −インターフェロン（ｒ−ＩＦＮ微量：　１００単位／ｄ）で処理し、Ｔ−イン ターフェロン（Ａ）添加後、種々の時点での酵素結合イムノアッセイによって分 析した。細胞当りのＩ−Ａ形質発現を、ウェル当りのＩ−Ａ形質発現（Ａ、。、 単位）をウェル当りの細胞数で割って定めた。

対照値（Ｂ）は非模擬細胞（ｕｎｓｉｍｎｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ）から誘導し た。

標準偏差は平均の２％以下であった。誘導はＴ−インターフェロンにさらした４ ０時間後に検出でき、平坦域は６０時間の刺激後に達成した。Ｉ−Ａ形質発現の 誘導のタイム　フレームはＴ　−インターフェロンにより誘導された成長抑制に 明らかに近似した。

第７図、成長およびＩ−Ａ形質発現におけるγ−インターフェロンの効果がエン ドトキシン汚染によらないことを示している。この事はポリミキシンＢをγ−イ ンターフェロンと共に添加することによりエンドトキシン抑制が結果に影響を及 ぼさないためである。成長−同期細胞は種々の濃度における組換えＴ−インター フェロンによって、およびポリミキシンＢの添加（５０μｇ／ｍｌ）　（Ｂ）ま たは添加しない（八）で影響される。９６−ウェル微量滴定理における１６個の 平行培養物の平均を示しており、変動係数を常に２％以下にした。Ｐ、はポリミ キシンＢと称する。マウスγ−インターフェロンにより得られた成長および■ａ 形質発現における効果（Ｇｅｎｅｔｅｃｈにより得られた）は組換えラットγ− インターフェロンにより得られた効果（Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　により得られた）と同一であった。これに対して、ヒト γ−インターフェロンはラット細胞におけるＩａ形質発現を誘導しなかった。

同時にＴ−インターフェロンの試験管内での観察は細胞増殖の抑制を誘導し、Ｉ −Ａ抗原の形質発現は成長抑制およびＩ−Ａ形質発現が生体内での現象と関係す るという仮定の試験を助長する。それ故、ラット頚動脈における平滑筋増殖はバ ルーンカテーテル損傷によって誘導し、損傷時からのすべての複製細胞を浸透ポ ンプを介して連続的に受ける３Ｈ−チミジンで標識付けした。細胞複製およびＩ −Ａ形質発現を、内膜肥厚を達成し、しかも増殖がまた続いた場合に、損傷後１ ４日で分析した。

結果を表■に示す。

表−土 １４日３Ｈ−チミジン標識期間中に増殖内膜病変における細胞複製およびＩａ形 質発現 ３Ｈ−チミジン＋　３Ｈ−チミジン− １−Ａ”　１．３　（１，４）　９．６　（６，２）１−Ａ−８０，６（４，１ ）　８．５　（８，９）内膜平滑筋細胞のうち、８１．９％は細胞複製の少なく とも１サイクルを通じて生じたことを示す３Ｈ−チミジンであった。免疫組織化 学により検出できるＩ−Ａは細胞の１０．９％で発現した。

また、大部分の全内膜平滑筋細胞は３Ｈ−チミジンにより標識付けされ、Ｉ−Ａ ポジティブ細胞の８分の１だけが３Ｈ−チミジン　ポジティブであった。３Ｈ− チミジン−ネガティブ平滑筋細胞のうち、半分以上がＩ−Ａポジティブであった 。

また、ＤＮＡ複製とＩ−Ａ形質発現との相関関係は動物を殺す直前、２４時間３ Ｈ−チミジンを注射することによって、手術から１４日中に分析した。この場合 、２５．５％の細胞が３Ｈ−チミジン　ポジティブであったが、しかしこれらの 細胞はなにもＩ−Ａを発現しなかった。これらの結果を表■に示す。

−表一」− ２４時間３Ｈ−チミジン標識期間中、増殖内膜病変における細胞複製およびＩａ 形質発現３Ｈ−チミジン９　３Ｈ−チミジン− １−Ａ”　Ｏ（０）　５．８（２，２）１−Ａ−２５，５（４，２）　６８．７ 　（６，４）表中、カッコ内は全細胞数の値（％）、平均±ＳＤを示している。

ＤＮＡ複製とＩ−Ａ形質発現との間の逆相関関係は、Ｉ−Ａ形質発現を誘導する 機構が増殖を抑制することを示している。

この考察は、１４日浸透ポンプで標識付けしたラットから得たオートラジオグラ フィー分析によって支持した。第８図は、Ｉ−Ａ形質発現平滑筋細胞が、損傷に ついての応答中、ネオインチマ（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）におけるＩ−Ａネガティ ブ形質発現平滑筋細胞より僅かに複製されることを示している。動脈損傷はラッ トの頚動脈バルーニングによって加えられ、複製細胞は１４日にわたる浸透ポン プを介して連続的に注入する″Ｈ−チミジンによって標識付けした。Ｉ−Ａ形質 発現は同じセクションの免疫組織化学およびオートラジオグラフィーによる３Ｈ −チミジン吸収によって調べた。Ｉ−ＡポジティブおよびＩ−Ａネガティブ細胞 における銀粒子の数は４種の病変において数えた（病変当りの５０個のＩ−Ａポ ジティブおよび５０個のＩ−Ａネガティブ細胞）。

動物間には有意な差がなかったので、すべての５種の病変からのデータは統計的 分析にプールした。Ｉ−Ａポジティブ細胞とＩ−Ａネガティブ細胞間における銀 粒子の差はｐ＜ｏ、ｏｉで異なり、平均±ＳＤを図面に示している。細胞の３Ｈ −チミジン標識増殖集団において、核当りの銀粒子の平均数は、Ｉ−Ａポジティ ブ細胞と比較した場合に、Ｉ−Ａネガティブ細胞におけるより約２倍高かった。

多くの３Ｈ−チミジンは各付加増殖により細胞に蓄積すると予想されており、細 胞当りの粒子数は明らかに細胞当りの放射能に関係する。それ故、Ｉ−Ａポジテ ィブ平滑筋細胞とＩ−Ａネガティブ平滑筋細胞との間の差は、■−Ａポジティブ 細胞がＩ−Ａを発現しない平滑筋細胞よりＤＮＡ合成の少数サイクルで生ずるこ とである（このタイプの合成について討議するため；クローニスＡＷおよびシュ ワルツ３Ｍ氏：損傷頚動脈における平滑筋移行の重要性ｒｃｉｒｃ　Ｒｅｓ　Ｊ 　５６　：１３９〜１４５　（１９８５）。

監笠皇荻■ ８匹の雄スプラギューーダウレイ　ラットを含む生体内実験パイロットを行った 。内膜病変を上述するようにフオガーテイ２Ｐバルーン　カテーテルによって普 通頚動脈に加えた。４匹のラットには、組換えラットＴ−インターフェロンを７ 日間にわたり１日に２００，０００　Ｕ、ｓ、ｃで与え、他の４匹のう・ントに は同量の賦形薬（塩化ナトリウム溶液）を注射した。

すべてのラットをバルーニング後１４日日に犠牲にし、１％ノでラホルムアルデ ヒドを含むリン酸緩衝液を注いで固定した。処理（左）および未処理（右）頚動 脈をＯＣＴ培地に埋置し、ｎ−ヘキサン／液体窒素中でスナップ凍結した。１０ μｍクリオスタット　セクションを１００μｍごとにカット・シ、ネオインチマ で占める区域をポイント−サンプリング法を用いる形態計測により調べた。結果 を表■に示す。

表■ γ−インクフェロン処理ラットおよび対照ラットにおけるネオ−内膜（Ｎｅｏ− ｉｎｔｉｍａ）処理　ｎ　ａ　ｓ、ｄ、ｐ ｒ　−Ｉ　ＦＮ　４　２．３０　１．００　＜０．０１対照　４　４．８０　０ ．５０ 表中、ｎはラットの数を示し、およびａは平方マイクロメートルを示している。

スタデンツ　ｔ　テストによる統計的分析Ｔ−インターフェロンによる処理は内 膜肥厚の進展を有意に抑制することを示しており、この抑制がＴインターフェロ ン処理中止後、１週間持続することは注目すべきことである。この事は、内側細 胞が損傷後、臨界的な時点において複製および移行するという仮説を支持する。

この時点における増殖の抑制は病変の大きさを持続的に減少するように思われる 。

上述する実験は、明らかに、平滑筋細胞複製におけるＴ−インターフェロンの抑 制作用を示している。

このように、Ｔ−インターフェロンは、例えば内膜過形成により生ずる脈管狭窄 の治療に、および好適例において脈管手術および／または血管形成による動脈狭 窄の治療に用いることができる。γ−インターフェロンは治療効果を生ずるのに 十分な量でかかるγ−インターフェロンを含有する薬剤を患者に投与する必要が ある。特定の場合において要求される実際の投与量および治療時間は医師によっ て定めることができる。投与量は標的細胞、例えば表皮ケラチン細胞にクラスＩ Ｉ−ＭＨＣ抗原の形質発現を誘導するのに十分な量にする必要がある。

Ｔ−インターフェロンとは、欧州公開特許出願明細書第７７６７０号に記載され ているように生（ｎａｔｉｖｅ）　Ｔ−インターフェロンのセクションを有する ポリペプチド、およびここに記載する方法により狭窄を抑制することのできるす べてのアミノ酸配列またはその他の変異体、または他の動物からの細胞を用いる 類似体を意味する。かかる変異体としては、アミノ酸残基を除去、挿入または置 換する特定部位の突然変異誘発の体位遺伝子または生成物を例示できる（例えば 、欧州公開特許明細書第１４６３５４号参照）。獣医学治療の場合、γ−インタ ーフェロンは治療すべき動物の種類に一致させて、または作用するように用いる 。ヒト治療においては、欧州特許出願明細書（ＥＰ）　７７６７０号に示されて いる配列のｄｅｓＣｙｓＴｙｒＣｙｓ変異体の必要があり、必要に応じて最後の ４つの残基を翻訳プロセシングにおいて除去するＣ−末端変異体を用いることが できる。手配列を利用するＴ−インターフェロンは既知方法を用いる自然源から 精製により得ることができる。同じ分子またはその変異体は既知方法により組換 え源（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｏｕｒｃｅｓ）から得ることができる。

代表的な調剤はｐｎｓ、ｏで注射／　ｍ　１においてＴ−インターフェロン（２ ０ｘｌＯｆｂ）　１．０または０．２ｍｇ／ｍｌ、コハク酸０．２７ｍｇ／ａ＋ １゜コハク酸二ナトリウム六水和物Ｑ、７３ａｇ１０＋１、マンニトール４０ｏ ＋ｇ／ｍｌ、ポリソルベート２００．１ｍｇ／＋ｎｌまたは（ｑｓ　ｔｓ）水１ ｇを含有する。この水性調剤は臨床により定められるように、ヒトにおいて最大 致死量以下の治療投与量で投与する。また、Ｔ−インターフェロンは再構成凍結 乾燥調剤から投与することができる。

γ−インターフェロンは、内膜損傷部位に治療投与量で任意の普通の投与経路で 、例えば静脈内または肺内経路で投与することができる。投与は治療レベルを維 持するのに十分に連続注入または丸薬投与することができる。Ｔ−インターフェ ロンは、必要に応じて狭窄を生ずる過程において少なくとも使用し、しかる後に 脈管構造を適当に治療するのに十分な時間にわたって継続使用することができる 。

ＴＩＭＥ（ＤＡＹＳ） ＴＩＭＥ（ＤＡＹＳ） Ｆｉｇ、３ ＴＩＭＥ（ｈｒｓ） Ｆ＋９．４ ＴＩＭＥ（ｎｒｓ） Ｆｉｇ、５ ７−ＩＦＮ（Ｕ／ｍＬ） ＴＩＭＥ（ｈｒｓ） Ｆｉｇ、７ ’に一＋ＦＮ（ｕ７ｍＬ） 補正音の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）中ド

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．脈管狭窄の治療用薬剤の調製におけるγ−インターフェロンの使用。
2. ２．脈管狭窄が動脈狭窄または閉塞の治療により再狭窄である請求の範囲１記載 のγ−インターフェロンの使用。
3. ３．再狭窄が血管形成および／または脈管手術による動脈狭窄である請求の範囲 ２記載のγ−インターフェロンの使用。
4. ４．γ−インターフェロンを、治療効果を生ずるのに十分な量の前記インターフ ェロンを含有する調剤で、患者に投与することを特徴とする脈管狭窄治療におけ るγ−インターフェロンの使用方法。
5. ５．脈管狭窄治療が動脈狭窄または閉塞の治療による再狭窄の治療である請求の 範囲４記載のγ−インターフェロンの使用方法。
6. ６．再狭窄治療が脈管手術および／または血管形成による動脈狭窄治療である請 求の範囲５記載のγ−インターフェロンの使用方法。