JPH04501111A - 線虫駆除剤の調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 線虫駆除剤の調製 産業上の利用分野 本発明は、植物に寄生する線虫に対して特に有効である新たな線虫駆除剤薬剤と 、線虫罹患から生じる損害を防止するためのプロセスとに係わる。

発明の背景 植物寄生線虫は、全世界において数多くの農芸作物に対する重大な経済的損害の 原因となっている。この種の線虫は顕微鋺的な蛎虫であり、一般的に、植物の強 制寄生虫である。これらの線虫は宿主植物の根を餌にすることが殆どである。し かし、茎、葉、花を含む地上部分にも寄生することが知られている種類もある。

はぼ全ての主要な植物種が様々な種類の線虫の侵入を受ける可能性がある（注目 に値する例外はセンジュギクとアスパラガスである）。例えば、植物線虫、根瘤 線虫の最重要な種類の１　ツ（ＭｅｌｏｉｄｏＢｎｔ種）は、３０００種を越え る種の作物植物に寄生するとされている。これらの植物は、耕種学的作物、野菜 、果実、花木、低木を含む。報告によれば、線虫は米国内だけで６０億米ドルを 越える額に相当する作物損害を引き起し、全全世界ではｔｏｏｏ億米ドルを越え る額に相当する作物損害を引き起している。

植物寄生線虫罹患に起因する症状は、植物宿主（各変種ごとに）、線虫種（各種 族ごとに）、植物の年齢、地理的位置、気候条件等に応じて、広範囲に変化する 。一般的に、田畑で植物全体に斑点状の外観があると、線虫侵入を示すものと見 なされる。更に具体的には、線虫罹患は、幾つかの種の根瘤病線虫（ｋｌｅｌｏ ＋ｄｏＢｎｅ種）及び嚢腫線虫（［Ｉｅｌ＊ｒｏｄｅｒ＊種）によって引き起こ される根の虫瘤（樹皮部分内の細胞の急速な増殖に起因する組織内の異常な腫張 ）と、病変線虫（Ｐｒｇｔ７１ｅ＋ｃｈａｓ種）によって引き起こされる損傷（ 局部的な変色区域）と、「切り林状」の根を生じさせる細胞分裂の阻害（Ｔｒｉ ｅｈｏｄｏｒａｓ種）と、地上部分の皺又は捩じれを含む成長異常（Ａｐｈｅｌ ｅ＋＋ｃｈｏｉｄｅｓ種）と、更には、場合によっては細胞の壊死（死滅）とを 結果的に引き起こす。植物寄生線虫は、根瘤病線虫又は病変線虫の場合のように 内部寄生性であっても、ダガー線虫（ｄＩＢｅ＋　ｎｅｍ＊ｊｏｄｅ）（Ｘｉｐ ｂｉａｅｍ１種）とランス線虫（Ｉｓｏｃｔ　ｎｅｉ＊１ｏｄｅｌ　（Ｈｏｐｌ ｏｌｔｉｍａｓ種）との場合のような外部寄生性であってもよい。線虫は植物ウ ィルスの病原媒介昆虫である可能性があり、これらの線虫は、植物に対する他の 病原性真菌及びバクテ゛リアの侵入のための感染経路を作り出すことによって、 複合的な病的異変を引き起こすことも知られている。

土壌燻蒸作用を有しまたは有さない化学線虫駆除剤が長い間使用されてきており 、これらの化学線虫駆除剤は線虫を駆除するための数少ない実行可能な処置の１ つである。現在では、この処置は、作物の植付けの前に合成化学薬品を土壌に対 し反復的に施すことを含む。これらの化学薬品は、線虫以外の生物に対し極度な 毒性を有し、環境に対しても重大な脅威を与える。

米国環境保護庁によって安全な水と空気とが近時重要視されるにつれて、及び、 地下水又は幾つかの非標的生物の中にこうした活性成分とその代謝生成物とが多 く検出されるにつれて、これらの化学薬品の製造及び／又は使用に関して重大な 関心が寄せられるようになった。最も効果的且つ経済的であり、最も広範に使用 される線虫駆除剤の１つは、ＤＢＣＮｌ、２−ジブロモ−３−クロロプロパン） であるが、このＤＢＣＰは、雄の生殖不能状態と発癌性の可能性とをもたらすも のと判断され、地下水の中に含まれると報告された。別の広範に使用される化学 薬品であるＥＤＢ　（エチレンジプロミド）も、地下水の中に発見された。ごく 一般的に使用される別の殺虫剤−線虫駆除剤であるアルジカルブ（１１ｄｉｃｔ ｒｂ）　（２−メチル−２−（メチルチオ）プロピオンアルデヒド０−（メチル カルバモイル）オキシム）が、激しい毒性を有することが発見され、米国の幾つ かの地域では地下水の中に発見された。ごく一般的に使用される２つの線虫駆除 剤であるカルボフラン（２，３−ジヒドロ−２，２−ジメチル−７−ベンゾフラ ニルメチルカルバマート）と１．３−Ｄ　Ｃ１，３−ジクロロプロパン）とは、 鳥類に対する毒性と発癌作用の可能性とを有するが故に、環境保護庁による特別 な再調査を受けている。

現在までのところ、商業的に受入れ可能な生物学薬品の中で、線虫駆除に関して 有効なものは全く知られていない。

解真菌である。本明細書で言及される生物活性代謝生成物を生成することが可能 なこの菌株の標本が、分譲制限をつけずして、Ａａｅｒｉｃｘｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（１２３０１Ｐｘｒｋｌｔｖｎ　Ｄｒｉｗ ｅ。

Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、　Ｍｄ）の永久菌株コレクシ褒ンの中に加えられ、寄託番 号ＡＴＣＣ４６４７４を与えられている。

真菌−１ｖｅｒ１ｌｃｌ！目の培養ないし真菌Ｍ、ｖｅｒ＋ａｃｗｒ目自体とに よって生成されるような本発明の菌糸体抽出物及び濾液は、特にＭｅｌｏｉｄｏ ｇｙｎｔ　ｉａｃｏｇ口ｉ１１口封１１線虫駆除作用を示す。本発明の抽出物及 び濾液は、Ｈｅ１ｅｒｏｄｅｔ８１１ｙｃｉｎｆｆｉｓ、Ｈｏｐｌｏｌ＊ｉ園＋ ＋ｔ　種、　Ｐｒ畠１７１ｅｎｃｈａ＋種、　ｌＩｅ’ｌｉｃｏｊ７１ｓｎｃｈ ｗｓ　種、Ａｐｂｅｌｅ＋＋ｃｈｕｓ　ｔｙｓ■ｅ、　ＰｘｎＢｒｅｌｌｏ＋種 、及びこれらに類似するもののような他の線虫に対して様々な度合いの線虫駆除 作用を有する。

液内、好気的、好熱的条件において生理活性代謝生成物を生成するためのプロセ スは、真菌分離菌株ＡＴＣＣＮｏ、　４６４７４のようなＭｙｒｏｔｂｓｅｉｕ ｍ　ｗｒ＋ｒｕｃ＊ｒｉｚを栄養培地中で培養することを含み、この培養におい ては、菌株の種菌が栄養培地を含む発酵槽の中に入れられて発酵が生じ、この発 酵は栄養培地の炭素源が概ね消費され尽くすまで続く。発酵の手段はフラスコ振 とう法によるが、当業者には公知である他の様々な方法が使用可能であり、特定 の発酵手段が本明細書に開示される本発明の基礎を形成することはない。

線虫駆除の方法の１つは、真菌分離菌株ＡＴＣＣＮｏ、　４６４７４のような真 菌Ｍｙｒｏｌｂｅｃｉａｍ　ｖｔｒｒｎｃ＊ｒｉ＊代謝生成物、又は、前記真菌 自体を、前記線虫が侵入した土壌に対して有効量だけ投与することを含む。

発明の詳細な説明 真菌分離菌株ＡＴＣＣＮｏ、　４６４７４のような真菌Ｍ７ｒｏｊｈｓｃｕｉマ ＠ｒｒａｃ＊ｒｉｔは、様々な発酵培地の中で、１又は２以上の生理活性代謝生 成物を生成する。この真菌又はその代謝生成物との両方は、線虫駆除作用を有し 、従って、線虫による植物の損傷を防止し、線虫の成長を抑制する。本明細書で 使用される場合の語句「植物の損傷を防止する」と線虫に関する語句「成長の“ 抑制」とは、線虫もしくは線虫卵の増殖、再生産、成長、岬−化、又はその存在 を駆除、防止、減少、又は排除することを意味する。

本明細書で使用される場合の術語「代謝生成物」又は「抽出物」は、本明細書で 言及される真菌分離菌株Ａ丁ＣＣＮｏ、　４６４７４のような、真菌關、マｅｒ ｒａｃｘ＋ｉｔを培養することによって、即ち、前記真菌の培養後に得られる、 最終的な、単離された、調整済の細胞培地を意味する。従って、この代謝生成物 は、発酵ブロスに、沈澱物を与えるために、アセトン、メタノール、石油エーテ ル、酢酸エチル、及びこれらの類似物を非限定的に含む有機溶媒を加えた場合に は、固体であることが可能であり、一方、発酵後のブロスを直接使用する場合又 は前記固体が水性媒質中に再分散される場合には、液体であることが可能である 。抽出操作に適した有機溶媒は、アセトン又はメタノールである。前記調整済の 細胞培地は、根瘤線虫又は他の植物寄生線虫の駆除に有効な１つ以上の生理活性 成分を含む。

線虫駆除のために真菌又はその代謝生成物を使用する方法は、真菌又はその代謝 生成物を含む線虫駆除組成物を、植物寄生線虫、特にＭｅｌｏｉｄｏｇｙ＋＋ｅ 種による侵入を受け易い、あらゆる農場作物、果実作物、野菜作物、草花作物、 鑑賞植物作物、又は苗木作物に対して使用することによる。その使用方法は、土 壌に対する直接的使用と、周囲土壌内での線虫駆除剤の制御放出と、植物の土壌 内への植付は前における植物の根に対する直接的使用と、葉に対する使用と、こ れらに類似した方法とを含む。

本明細書で使用される場合の術語「土壌」は、植物の成長を支持することが可能 な全ての媒質を含むことを意図され、腐植室と砂と肥料と堆肥とこれらの類似物 とを含む。

液内、好気的、好熱的条件において生理活性代謝生成物を生成するためのプロセ スは、真菌分離菌株ＡＴＣＣＮｏ、　４６４７４のような真菌Ｍ７ｒｏ＋ｈｔｃ ＋ｕｍマｅ＋１ｃｌｒ目の真菌分離菌株を栄養培地中で培養することを含み、こ の培養においては、前記分離菌株の種菌が栄養培地を含む発酵槽の中に入れられ て発酵が生じ、この発酵は前記栄養培地の炭素源が概ね消費され尽くすまで続く 。

発酵時間は、約４〜７日が好ましく、約５日が最も好ましい。

発酵培地の温度は約２０〜約４０℃である。この温度は約２５〜約３０℃である ことが好ましく、約２５℃であることが最も好ましい。

発酵培地のｐｎは約４〜約ｌＯであり、好ましくは約５〜約８であり、最も好ま しくは中性９［１である。菌糸体と発酵液とが、公知の濾過方法によって発酵培 地から分離される。菌糸体が更に抽出された後、当業界で公知の手順によって濾 過され、この濾液に前記発酵液が再び入れられる。残存溶媒を蒸発し、抽出物を 凍結乾燥して所望の時期に使用する。

本文書で使用される場合の術語「発酵槽」は、実験室と大規模発酵プロセスとの 両方における本発明の代謝生成物の生成のために使用する、振りまぜ式と、固体 状態式、連続発酵法及びバッチ供給発酵法とを非限定的に含む様々なタイプの発 酵法の′ために使用される装置を意味する。

本発明のプロセスは初期培養のために様々な培地を使用することが可能であり、 Ｉｂｓ　Ｍｌ！＋１１１　ｏｆｌｅｄ＋＋５ｌｔｉｓｌ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏＢ■ ｄ　ＢｉｏｊｅｃｈｎｏｌｏＨ，Ｄｅｍ＊ｉａ　１＋＋ｄ　Ｓｏｌｏｍｏａ、Ａ ｓｅｒｉｃｓｎ　５ｏｃｉｅｊｙｆａｒ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢ７．　ＩＦＪ＃ ｂｉａｆｆｊｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、１９ｇ８で定義されているような、ジャガイモ −デキストロース寒天、Ｈ脣浸剤寒天（［Ｉｘ７　ｉＩｌｆｇｓｉｏａ　ＢＩ＋ ）　、トウモロコシ粉寒天、腐葉土寒天、ＰＣＮＢ寒天、ＲｏＭｅ　ｌ１ｓＢｓ ｌ　、土壌浸剤（Ｓｏｉｌ　ｉｎｆｗｓｉｏｃ）　、又はイースト麦芽寒天から 成ることが可能である。

本発明の代謝生成物は、管理された条件の下での好気発酵の間に、前記真菌によ って生成される。誠、マｓｒｒｍｃｔｔｉｔの代謝生成物の最も好ましい生成方 法は、液内発酵によるものである。

本発明の実施態様の１つによれば、発酵は、振りまぜフラスコ又は静置バット発 酵槽の中で行われる。振りまぜフラスコ内では、培地と空気との混合をもたらす フラスコ攪拌をしながら、通気が行われる。静置発酵槽の場合には、ディスクタ ービン、羽根付きタービン、開放タービン、又は船舶プロペラのような羽根車手 段によって攪拌が行われる。通気は、空気又は酸素を発酵混合物の中に導入する ことによって行われる。

発酵培地は、微生物が資化可能な炭素と窒素と無機塩と成長因子との適切な供給 源から成る。炭素源の適切な例は、デキストロース、グルコース、ラクトース及 びマルトースのような糖と、デンプン、デキストリン、トウモロコシ粉及びグリ セロールである。

窒素源は、有機の、無機の、混合された冑機−無機の窒素源であることが可能で ある。培地中で使用可能な窒素源の例は、大豆粉と、トウモロコシ抽出液（ｃｏ ｒｎ　ｔ＋ｅｅｐ　１ｉｑｌｏｒ）と、落花生粉と、綿実粉（ｃｏｌｔ＠ｍｓ＠ ＠ｄ　ｍｔＩｌ）　と、トウモロコシ胚芽粉と、様々なアンモニウム塩とである 。

一定の量の無機物と成長因子とを発酵培養基の中に含宵させることも、有益であ る。蒸留残可溶分、トウモロコシ抽出液、魚粉、イースト生成物及びペプトン化 ミルクとのような粗培地成分は、無機物を含むばかりでなく、成長因子をも含む 。しかし、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄（■）、炭酸カルシウム、 塩化コバルト、硫酸マグネシウム及び硫酸亜鉛のような無機塩を、前記発酵培地 に加えてもよい。

特定のタイプのベレット形成にとって有利に働＜ｐＨ調整をより容易にするため に、炭酸カルシウムのような固体原料がこのプロセスに加えられることが好まし い。

振りまぜ培養発酵法を用いて本発明の代謝生成物を生成するプロセスは、種菌生 成の初期段階のためにも使用することが可能である。生成物培養は、胞子から又 は特別に成長させた種菌から開始される。最初は一般に成長が急速で、２４時間 後には識別可能である。その後、成長が鈍化するが、５〜７日後には１リツトル 当たり約２００〜約３ｆ１ｇの固体を含む濃度になり、定常状態となる。この時 には、成長物は一般に濃密であり、大きなベレットもしくは小さなペレット、又 は、特徴のある外観と臭いを有するある種のスラッジ状の成長物から成る。生成 物形成は接種の１〜３日後に始まり、３〜４日以上に亙って続く。生成物収率は 、含まれる細胞の量と、前記細胞の比活性と、前記細胞の生成物形成持続能に応 じて決まる。

接種は、前記細胞の集団の回収を最大にするよう経験的に選択された液体培地の 中に入れられる。この場合にはジャガイモ−デキストロース寒天である初期成長 培地上にできる胞子は、その培養菌の発芽と初期成長とを可能にする（種菌フラ スコと呼ばれる）フラスコの中に含まれる成長培地に移される。その後、活発に 成長している発芽胞子が、特定の発酵培地を含むエルレンマイヤ〜フラスコ（振 りまぜフラスコ）又は静置バット培養槽に移される。成長の発酵段階のためには 、典型的には１〜２％の接種が作られる。

接種培地は当業者の公知のものであり、その補足的な情報は、上記の　ｔｈｅ　 Ｍｘｎａｓｌ　ｏｒ　Ｉａｄａｒｆｒｉｔｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＋Ｂ　！ｎｄ ＢｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇＬ　３１〜４０頁に記載されている。

広範囲の振りまぜ式培養装置が、本発明の実施に使用可能である。主なタイプの 振りまぜ式培養装置は、回転式又は往復式の振りまぜ機械装置のどちらかに基づ いている。本明細書におけるプロセスは回転振りまぜ機を使用し、この回転振り まぜ機内では、フラスコが約５０ｍｍの軌道を約２００〜約２５Ｏｒｐｍの回転 数で回転する（しかし、この回転数は１００〜５００＋ｐｍの範囲で変化可能で ある）。培地は、一般的にはエルレンマイヤーフラスコである前記フラスコの内 側を円滑に動く。発酵プロセスの規模拡大の手法も当業者には公知であり、本発 明の基礎を形成しない。

液内培養中に振りまぜる目的は、成長中の細胞に酸素と栄養素とを供給すること である。本明細書の場合には、振りまぜ培養の間に、発酵フラスコ内の培地に細 胞又は胞子が接種される。

接種材料として使用される菌株は、凍結乾燥状態又は低温（例えば−７０℃）に おいて親培養菌として保存される。接種材料に関して使用されるべき最適胞子濃 度は、常套的実験により容易に決定される。

発酵ブロスからの代謝生成物の単離とこれらの成分の回収は、公知の技術を用い て行われる。その活性成分は水溶性であり、この特性は発酵ブロスからの代謝生 成物の回収に有利に使用され得る。

以下の実施例は、代謝生成物を得るための方法を例示する。

説明されるこうしたプロセスは、広範囲に変化することが可能であり、それを多 少変更又は拡張しても何れも本発明の範囲内に含まれるものと見なされる。

実施例１ 微生物Ｍ７ｒｏｌｂｅｃｉｕｍ　ｗｓ＋ｒＩｌｃｚｒｉ＊、ＡＴＣＣＮｏ、４６ ４７４が、蒸留水で望ましい体積とし２０分間１２１．５℃でオートクレーブ消 毒された、Ｄｉｌｃｏ　Ｃ＊１ｓｌｏｌ　Ｎｏ、０ＯＮ−０１４培地を含むジャ ガイモ−デキストロース寒天培地上で培養された。２５℃で３〜４週間培養の後 、その胞子が０．０１％のＴｖｅｅｎ−８０を１ｍｇ含む５　ｍｌのバイアルに 移された。

この胞子懸濁液（０，１ｍ１）を培地から取り出し、５００ａ＋１エルレンマイ ヤーフラスコ内の１００１の無菌種菌用培地（１０００ｅｌの水の中のトウモロ コシ抽出液（１０ｍｌ）とグルコース（１５，６ｍｇ））の中に接種し、３日間 ２８℃の温度において振りまぜて種菌を得た。

得られた種菌の１〜２％が、振りまぜフラスコ内の発酵培地（５００ｍｌエルレ ンマイヤーフラスコ内に２００ｉ１）　（ｐＨ７，０に調整した水１０Ｏｈｌ中 にグルコース（２Ｉ）、可溶性デンプン（１５，０，）　、イースト抽出物（２ ，０ｇ）、水和硫酸マグネシウム（σ、３ｔ）、炭酸カルシウム（１，Ｌｘ）及 びネオペプトン（Ｓ、Ｏｔ）を含む水溶液を加熱滅菌したもの〕の中に移され、 ５日間２５℃で攪拌（２００ｔ、ｐ、ｔ）　した。

５日後の発酵液は暗黄色を呈し、そのｐＨは約８．１〜８．２だった。

得られた溶液が、ＲＡＰＩＤ−ＦＬＯ■６−１層２インチ二重ゲージ面ディスク （ミルク）フィルタ２層を通す濾過によって、分離された。

菌糸体を室温において２時間アセトンの中に浸け、菌糸体内容物を抽出するため に絞りながら濾過された。残留物を捨て、濾液が発酵液と共に蓄えられた。この 混合物中のアセトンを蒸発し、抽出物を凍結乾燥した。このようにして調製され た乾燥粉末を「抽出物」又は「代謝生成物」と呼び、試験材料として使用した。

線虫駆除作用は前記菌糸体抽出物にあるばかりでなく、前の特徴は、Ｃｏｍｐｅ 口ｄｉｕｍ　ｏｒ　５ｏｉｌ　！ｎＢｉ、　ＤｅａｒＣｈ他、　Ｖｏｌａｍｅ　 Ｉ　。

（１９８０１，４８５〜４８７頁に説明され、これを本明細書に参考事項として 組み入れる。

代謝生成物はｐＨ安定であり、最初は約４〜約１０のｐｉｔの一般的な培地の中 で生成され、約８の最終ｐＨとなる。その成分は、約り５℃〜約３５℃の様々な 温度範囲で活性である。この代謝生成物は、発酵培地中で僅か３日間で非常に迅 速に発育することも観察されている。このことは、大量生産の場合に前記代謝生 成物の十分好適な製造を可能にするだろう。

前記代謝生成物の幾つかの特性と作用を測定するために、接触アッセイが用いら れた（参照：　Ｂ１１＊ｏ他、Ｐｒｏｄｎｒｌｉｏｎ　ｏｆＮｅｍｒｌｏｄｅ− Ａｌｔ＋＊ｃｔｉｎｇ　ｒｏｄ　Ｎｃｍ＊１ｏｃｉｄ１１　Ｓａｂ＋ｊ＊ａｃｅ ｓ　ｂ７１’＋５ｄｘｃｉｏｕｓ　Ｆｕｎｇｉ、　ＦｏｌｉｌＭｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、１９．５１２−５１９　（１９７４）　）。

この接触アッセイには、２４の窪みを備えた組織培養用プレート（２４−ｗｅｌ ｌ　ｔｉｐｔｏｅ　ｅｎｄＯｒｅ　ｐｌｓｌｅ）の中に入れられた、液状に戻し た前記乾燥試験材料１ｍｌを使用した。（真菌を含まない）発酵培養基が類似の 方法で処理され、無菌の水が対照標準として使用された。根瘤線虫ＭＣ１０１Ｍ Ｃ１０１ｄＯ狂０！ｆｌｉ１１の第２期の幼虫が新たに採集され、試験生体とし て使用された。水５０μｍ中に含まれた約１００匹の線虫を、前記窪みの各々の 中に加えた。

前記試験プレートが２４時間２５℃で培養された。この試験時間の後で、線虫の 運動反射が観察された。各処置ごとに４つの反復が行なわれ、これらの反復の統 計的平均が示された。（表２の場合のように）特に明示がない限りは、ここで使 用される温度の全ては摂氏で示される。

最初の接触アッセイは、適した抽出溶媒を確定するために、様々な溶媒中で抽出 された後の代謝生成物に対して行われた。

（前記方法で調製した）この真菌から得られた等重量の活性線虫駆除調製物が、 試験対象の同体積の様々な抽出溶媒と十分に混合された。懸濁液をＷｈ＊Ｉａ＊ ｎ　Ｎｏ、１濾過紙を通して濾過し、その後一連のＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタ ー（０，１１０ＳＯ，４５，０，２０μｓ）を通して濾過した。これらの無菌濾 液の根瘤線虫の第２期幼虫を使用した線虫駆除作用が、成長培地中の前記代謝生 成物の４倍量を使用する接触評価分析によって測定された。表１の抽出物の有効 性から分かるように、前記代謝生成物は水溶性であることが示された。

表１及び表２における作用等級は次の通りである。

−　無作用 ＋５０％の線虫死亡 ＋＋７５％の線虫死亡 ＋　＋　＋　７６−９９％の線虫死亡 ＋　＋　＋　＋　１００％の線虫死亡 表１ 様々な溶媒中での抽出の後のＭ、ｒｅｒｒａｃｘｒｉｓの代謝生成物の線虫駆除 作用 溶媒　作用 アセトン　１００％　− メタノール　１００％　＋ ８０％　＋＋＋ 酢酸エチル　１００％　＋ ８０％　＋ クロロホルム　８０％　＋＋ 脱イオン水　＋＋＋／＋＋＋＋ 凍結乾燥全培養物　＋＋＋＋ ＋＋＋謝生成物の作用は、表２に示されるように、温度変化によっては実質的に 影響されない。その抽出物は様々な温度で１時間に亙って培養された。各々の処 置毎に４つの反復が、接触アッセイを用いて行われた。

表２ 線虫駆除作用に対する温度の影響 抽出物濃度は最初のブロスの４倍にした。例えば、２００ｍ１の最初の発酵液か ら調製された抽出物が、４倍の濃度を得るように５０ｍ１の水で液状に戻した。

表示値は、２５℃における２４時間の培養の後に得られたものである。

温度℃　作用 Ｏ＋＋＋ ２５（室温）＋＋＋ １２１（オートクレーブ）＋＋＋ 対照水　− Ｖ、マｅｒｒｕｃｇｒｉｇ抽出物の線虫駆除作用が、表３では種子袋アッセイに より、及び表４と表５ではポット試験アッセイにより確認された。

当業界では公知である種子袋アッセイは、Ｐｒｅ１１ｅｔ他、ＡＳｏｉｌ−［＋ ｅｅ　Ｓ７ｓ＋ｅｍ　！ｏｒ　Ａｇ＋Ｂｉｎｇ　１ｌｓｉｔｆｉｅｉｄｓｌ　Ａ ｃｔｉｖｉ１７　ｏｆＣｈｅｍｉｃｔｌｓ、Ｊｏｕ＋ａｔｌ　ｏｆ　Ｎｃｍｘｆ ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　１３．　Ｎａｍｂｅｒ　４゜１９８１年１０月、５ ３５〜５３７頁に一般的に説明されている。

本発明で使用された場合、前記種子袋アッセイは、１）２つのキュウリ種子（栽 培変種植物Ｓｔ＋ｘｉｇｈｌ　Ｅｉｇｈｔ）を殺菌された種子袋の中に入れて行 なう。これらの袋は、成育チャンバ内において高い湿度条件と中庸な強度の光と の下に保たれた。約５〜６日後、その根の長さが４１５インチである時に、これ らの袋が実際のアッセイに使用される準備が整ったものと見なされた。

２）アッセイ前に、乾燥代謝生成物を望ましい濃度の液になるよう無菌水を使用 して戻し、３）液状に戻された２ｍｌの抽出物（４〜８倍の濃度）が、各々の若 木の根の周囲にピペットされた。２４時間後、新たに集められた感染性の根瘤線 虫（Ｍ、ｉｏｃｏｇｎｉｔｔ）の第２期幼虫を約２０００匹含む線虫懸濁液２１ が、各々の袋に加えられた。４〜６つの袋が各々の処置毎に用いられ、残りの袋 が発酵培地か又は対照用の水の何れかによって処置された。これらの袋が成育チ ャンバ内に維持され、ｌＯ〜１４Ｂ後に線虫感染（根の虫瘤）の症状に関して観 察された。表３の場合には、これらの線虫は前記抽出物の投与の２４時間後に加 えられ、その表示示度は前記処置の１４日後に得られた。損害に関して使用され る等級は、表３に示されている通りである。

表３ 線虫駆除剤作用−キュウリ種子袋処置 処置　反復 対照　（線虫添加）　＋＋＋　＋＋＋＋　＋＋＋＋非接種対照　−−− これらの結果は、下記虫瘤指標（Ｇｒｌｌ　Ｉｎｄｅｘ）により示される。

虫瘤指標 −虫瘤なし、１００％駆除 ＋　僅かな虫瘤、７５％を越える駆除 ＋十　中庸な虫瘤、７５％を下回る駆除＋＋＋　著しい虫瘤 ＋＋＋＋　全体的な虫瘤 当業界で公知のポット試験法は、Ｄｉ　５ｅｎｔ・他、　！ｌｅｓ＊ｔｏｄ＠ｒ ＊ｓｐｏ＊ｓｅ　ｔｏ　Ｃ５ｒｌ＋ａｆｓｒｓ＋、　Ｊｏｍｒ＋＋ｔｌ　ｏｒ　 ＩＩｅｍｓｊｏｌｏＨ，Ｖ＋＋ＩｓｍｅＳ、　Ｎ＊ｓｌ＋ｚｒ　１．１９７３年 １月、２２〜Ｎ頁に一般的に説明されている。

温室ポット試験を用いて、５′植木鉢の砂の中に移植された４退会のトマト若木 が使用された。液状に戻された前記試験材料（５倍、１０倍、２００倍濃）がト マト若木の根区域の周囲にピペットされた。２４時間後に、感染性の根瘤線虫幼 虫（卵から幹化された第２期幼虫、１本当たり約５００１１匹）が各々の植木鉢 に加えられた。

３〜４週間後に、トマト若木が採取され、それらの根の線虫感染（主層）の症状 を観察した。この場合の市販の線虫駆除剤はアルジカルブ（ｓｌｄｉｃｓｒｂ） である。

表４は、濾液の３つの反復の統計的平均であり、表５は菌糸体抽出物からの４つ の反復の統計的平均である。

主層指標の等級は表３に説明されている通りである。以下で使用される術語ｒ　 ＭＥＪは、！１の成育培地から得られた培地同等物又は材料を意味する。

表４ 線虫感染に対する濾液の作用 処　置　若茎重量　根重量　主層指標 −−−−■―■−−自■■−■■■■リーーーーーーーー■■■■−線虫無し　 ８８．３ｔ　１６．５ｔ　−線虫有り　１１７．２　１９．　Ｉｔ　＋　＋　＋ 　＋培地　８０．８　１１９　＋　＋　＋　＋１１１０ＭＥ　濾液６４．２　１ ０．９　＋！３１Ｅ濾液　７６．１　１２．２　＋表５ 線虫感染に対する菌糸体抽出物の作用 処　置　若茎重量　根重量　主層指標 線生態し　４６．３ｒ　９．ｉｔ　− 線虫有り　３ｇ、　５　９．２　＋　十＋　＋１００ＭＥ抽出物　！６．７　５ ．６　＋／−５０ＭＥ　抽出１１ｍ　４１．９　１０．３　＋表６と表７は、殺 菌されていない自然土壌の中と、砂の中とにおける代謝生成物組成物の作用（表 ６）と、様々なタイプの自然土壌の中と、オートクレーブ消毒された土壌の中と 、殺菌された砂の中とにおける代謝生成物組成物の作用（表７）とを示す。

６インチのプラスチック植木鉢の中で成育された４退会のトマト若木（栽培変種 植物、Ｒａｌｇｅ口）の根区域の周囲に、各表に示される投与量の抽出物が与え られた。トマト若木は温室内に維持された。前記抽出物を与えてから２４時間後 に、トマト若木に、新たに岬化された感染性の根瘤線虫（Ｍ、ｉｎｅｏｇＩｌｉ ｊｓ）幼虫５０００匹を接種した。これらのトマト若木が、前記接種の３０日後 に採取された。これらの結果は、４つの反復の統計的平均である。

いない土壌　５００闘Ｅ　５７．４　１８、！＋／−２５０ＮＥ　Ｔｏ、　８　 １９．９　＋／−ＮＥＭＡ　８１．２　２６．５　＋÷＋＋未処置　７９．８　 ２２．２ 砂　１００ＭＥ　３１．１　９．７ ＮＥＭＡ　６５．６　２８．３　＋＋＋未処置　６５．２　２５．９ ＮＥＭＡ＝線虫が接種された未処置の土壌表　７ 野外の土壌　５００　ＭＥ　５３．１　１０．１　÷２５０ＭＥ　６１．１１　 １６．３　＋０　７０．３　３４．０　＋＋＋＋ 未処置　７ｇ、７　２６．７ オートクレ　５００ＭＥ　２５．６　５．９−プ殺菌　２５０ＭＥ　２７１　５ ．８された土壌　０　５１１．０　３０．３　＋÷＋＋未処置　６２．８　１９ ．８ 殺菌された　５００ＭＥ　２６．４　４．７　＋土壌　２５０ＭＥ　４１．５　 １．８　＋０　５８．８　２９．３　＋＋＋＋ 未処置　６７．３　２０．７ 前記代謝生成物は、線虫Ｍ、＋ｎｃｏｇ＋＋ｊｔの卵に対して様々な影響を与え る。高濃度の即ち８倍濃度の前記代謝生成物は殺卵作用を示すが、低濃度の即ち １倍濃度の前記代謝生成物は線虫のに関する、つまり幼虫に対するのではなく卵 に対する上記のような試験の接触アッセイについてのデータが、表８に示されて いる。対照標準水の場合を除いて、畔化幼虫の全てが死亡していることが発見さ れた。

表８ 卵の酢化の促進／抑制に関する代謝生成物の影響２４　１０Ｇ　＋３８　６６　 １３ ４８　１００　＋３８　７５　３２ ７２　１Ｎ　２３０　２０　２Ｇ 実際には、ｌＯ日日経暗時対照標準水中で畔化した卵の割合（％）は、個々の反 復において１５〜３０％の範囲内にすぎなったが、対比のためには前記割合を　 １００％と見なした。上記表の数値は６つの反復の平均である。

本発明の真菌とその代謝生成物は、数多くの様々な草木と果実に対する様々な農 芸的応用に関して、線虫の駆除のために使用されることが可能である。この種の 草木と果実は、非限定的に、トマト、アーチチョーク、ナス、バナナ、オオムギ 、ビート食用根、カカオ、ニンジン、キャラサバ、セロリ、ヒョコマメ、カンキ ツ類、ココナツト、コーヒー、トウモロコシ、綿、ササゲ、ナス、ｆｉｅｌｄ　 ｂｔｓｎ、飼い葉、ブドウ、バンジロウ、メロン、アワ、オートムギ、オクラ、 鑑賞植物、パパイヤ、落花生、コシヨウ、キマメ、パイナツプル、ジャガイモ、 コメ、ライムギ、モロコシ、タイプ、テンサイ、サトウキビ、アマトウガラシ、 サツマイモ、茶、タバコ、様々なレタス、コムギ、ヤムイモを含む。カーネーシ ョン、バラの木、ガーベラ、キク、鉢植えの草花、ビードロカズラ、イチジク、 ポトス、チトセラン、サボテンのような栽培孔が、本発明によって保護されるこ とが可能であり、栽培草木の例は、全ての鑑賞用及び開花低木を含むだろう。

本発明の生理活性代謝生成物は、処置されるべき区域に対して、植付は時にもし くは植付けの数日前に直接的に注入することによって、又は、徐放的に前記代謝 生成物を使用することによって、植木鉢又は容器の土壌の中に混入されることが 可能である。前記代謝生成物の投与は、鉤爪耕うん機（ｃｌａｗｃｍ目ｉｗｘｌ ｏｒ）又は軽量鋤（ｌｉｇｈｔ　ｐｌｏｗ）によって約１０〜２０ｃｍの土壌深 さまで土壌を掘り返しながら、地表に顆粒の形で散布することによって行われる ことが可能である。前記活性代謝生成物の有効投与量は、駆除すべき線虫の予想 個体数、線虫のタイプ、土壌、作物、湿度等に基づいて決まるが、１ニーカー当 たり約１０π〜１００ポンドの範囲内となろう。

本発明の代謝生成物から農芸組成物を調製するために、固体又は液体の何れかの 不活性な農芸的に使用可能な増量剤が使用可能である。固体の形の調製物は、非 限定的に、微細に分散可能な粉末、分散可能な顆粒及びこれらの類似物を含む。

溶液、乳濁剤、懸濁剤、濃縮物、乳化可能な濃縮物、スラリー及びこれらの類似 物のような液体の形の調製物が、意図される適用と望ましい調合媒体に応じて使 用可能である。

本発明の代謝生成物は、活性組成物として調合されてもよ（、この調合組成物は 、微粉砕された乾燥又は液体希釈剤、増量剤、充填剤、様々な粘土を含む崩壊剤 、賦形剤、けいそう土、タルク及びこれらの類似物と、又は水、様々な有機液体 及びこれらの混合物とを含む。前記代謝生成物が水溶性であるが故に、滴下潅注 法も使用可能である。

本発明の代謝生成物は、除草剤、抗菌物質、殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節剤 、又は栄養素のような他の主要な生物学的薬剤又は有益な微生物又は活性成分と 組み合わされて使用されることが可能と思われる。

当然のことながら、本発明は本明細書に説明される特定の実施例と使用態様とに 限定されるものでなく、本発明の範囲から逸脱することなく、詳細な点での幾つ かの変形を想定することが可能である。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．　線虫駆除剤作用を有する真菌Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｏｍｖｅｒｒｕｃａｒｉ ａの代謝生成物。
2. ２．前記真菌が分離菌株ＡＴＣＣＮｏ．４６４７４である請求項１に記載の代謝 生成物。
3. ３．真菌Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｏｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａの代謝生成物を含む、線 虫による植物損害を防止するための線虫駆除剤組成物。
4. ４．前記真菌が分離菌株ＡＴＣＣＮｏ，４６４７４である請求項３に記載の線虫 駆除剤組成物。
5. ５．有効量の真菌Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｏｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａ代謝生成物を、 線虫駆除処置を必要とする植物の根、土壊、又は種子に投与することを含む、線 虫による植物損害を防止するための方法。
6. ６．前記真菌が分離菌株ＡＴＣＣＮｏ．４６４７４である請求項５に記載の方法 。
7. ７．真菌Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｏｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａを含む、線虫による植物 損害を防止するための線虫駆除剤組成物。
8. ８．前記真菌が分離菌株ＡＴＣＣＮｏ．４５４７４である請求項７に記記載の線 虫駆除剤組成物。
9. ９．真菌Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｏｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａを、線虫駆除処置を必要 とする植物の根、土壊、又は種子に投与することを含む、線虫による植物損害を 防止するための方法。
10. １０．前記真菌が分離菌株ＡＴＣＣＮｏ．４６４７４である請求項９に記載の方 法。