JPH04501112A - 安定化・凍結乾燥された哺乳類細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、　上記細胞が生理学的状態で正常または異常であるヒト組繊細胞から誘導さ れ得ることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。

７、　免疫検定に使用する生物学的対照細胞として機能するため染色することが できることを特徴とする請求の範囲ｌ記載の凍結乾燥細胞。

８、　流動細胞計測器において積極的に染色した生物学的対照として次いで使用 するのに適する最初の膜構造および細胞表面抗原性を保持したことを特徴とする 冷凍温度で５ケ月以上貯蔵した後蒸留水中で再構成することができる凍結乾燥し たヒトおよび培養した細胞。

９、　上記細胞が凍結乾燥前に適用されるトレハロース等張流体の保存被膜を有 することを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。

１０、ＤＮＡ分析に適する生物学的対照であることを特徴とする請求の範囲８ま たは９記載の凍結乾燥細胞。

１１、ＴおよびＢ細胞集団の細胞周期分析に対する標準として使用することがで きることを特徴とする請求の範囲８または９記載の凍結乾燥細胞。

１２、再構成される場合に細胞膜構造の保全および細胞表面抗原性を保持する凍 結乾燥した哺乳類細胞を製造するに当り、Ａ３選定した容量の燐酸緩衝アルブミ ン中に懸濁する所定のサンプル数の細胞を集め、 Ｂ、細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得、Ｃ６細胞ペレットをトレハロ ースの等限流体溶液中で所定時間周囲室温で培養して細胞懸濁液を得、Ｄ、細胞 懸濁液を容器に導入し、規定した低温に冷却し、約−７０°Ｃて約１時間凍結し 、 Ｅ、容器を取出し凍結乾燥器に規定した凍結乾燥サイクルで入れついで、 Ｆ、凍結乾燥した細胞を内蔵する容器を２〜８°Ｃの冷却温度で次に蒸留水中で 再構成するため貯蔵することを特徴とする凍結乾燥した哺乳類細胞。

１３、８工程で誘導された細胞懸濁液を先ずＢ工程で処理して細胞ペレットを生 成し細胞ペレットをＣ工程の操作で再び処理し然る後生成した細胞懸濁液をＤ工 程で処理することを特徴とする請求の範囲１２記載の方法。

１４、培養を１０９６トレハロース等張溶液中で行うことを特徴とする請求の範 囲１２または１３記載の方法。

１５、細胞ペレットを燐酸緩衝アルブミン中４℃で１時間懸濁させることを特徴 とする請求の範囲１２または１３記載の方法。

１６、細胞ペレットを１０％トレハロース等張溶液中周囲室温で約３０分間培養 することを特徴とする請求の範囲１４記載の方法。

１７、凍結乾燥サイクルが約１５時間であることを特徴とする請求の範囲１２ま たは１３記載の方法。

１８、検定試薬および装置について標準化するため対照媒体を使用する哺乳類の 生理学的細胞の検定において、生物学的対照として機能するため水中で再構成す ることができる凍結乾燥した哺乳類細胞を用い、対応する新鮮な正常哺乳類細胞 に類似する細胞膜構造の保全および細胞表面抗原性を保持することを特徴とする 哺乳類細胞の検定。

１９、上記哺乳類細胞を末梢血液細胞、培養した細胞、ハイブリドーマ細胞系ま たは組繊細胞から選定することを特徴とする請求の範囲１８記載の検定。

２０、検定か、末梢血液細胞の分離した細胞集団を検出するためであることを特 徴とする請求の範囲１８記載の検定。

２１．２〜８℃で数ケ月間冷却温度で貯蔵した後蒸留水中で再構成することがで きる凍結乾燥した哺乳類細胞であって、新鮮な細胞と比較してほぼ同等の生理学 的パラメータを保持することを特徴とする凍結乾燥細胞。

２２、＠乳類細胞分析用分析対照として機能的に適することを特徴とする請求の 範囲２１記載凍結乾燥した細胞。

明　細　書 安定化、凍結乾燥された哺乳類細胞およびその製造方法技術分野 本発明は、一般に生物材料を凍結乾燥する技術、特に哺乳類細胞を凍結乾燥して 、安定性および保存寿命特性を有し、しかも新鮮な細胞に比べてまだ実現されて いな（、かつ実質的に同等の生理学的パラメータを有する、免疫検定法および他 の血液学的測定のための保存ヒト細胞、ハイプリドーマ細胞、組繊細胞および対 照細胞を調製する方法に関する。

背景技術 生理学的活性分子を含有するリポソームを保存するためのおよび細菌培養のため の凍結乾燥の方法は知られている。また、凍結乾燥処理を用いる錠剤の調製は知 られている。米国特許第４、６７８．８１２号明細書には、賦形剤および安定剤 としてトレハロースを用いる診断応用に有用な錠剤の調製方法が記載されている 。米国特許第４．７１２．３１０号明細書には診断検定のための試薬担体として 有用な錠剤の調製方法が記載されている。

薬剤、核酸、蛋白質、リポータ−分子、酵素などのような材料をリポソームに封 入する方法は従来の特許明細書に教示されている。これらの特許としては、例え ば米国特許第４．５１５．７３６および４．４１１．８９４号明細書がある。米 国特許第３．２６１，７６１．４゜２０６、２００および４．２４６．３４９号 明細書には細菌についての凍結乾燥処理について教示している。この同じ研究分 野において、題目が「凍結乾燥培養の安定性の改良」で１９８８年３月１６日に 発行された欧州公開特許出願第０．２５９．７３９号明細書がある。

同じ従来技術として、安定化作用のため凍結乾燥に糖質（ｓｕｇａｒｓ）を用い る技術がある。また、糖質トレハロースはこの作用に有用であることが示されて いる。ＰＣＴ　Ｎｏ、　ＷＯ８６１０３９３８号で公開された（１９８６年７月 １７日）国際特許出願明細書には、凍結乾燥中リポソームの内側におよび外見上 溶液状態で保存薬としてトレハロースを使用することが開示されている。リポソ ームに外見上および本質的にトレハロースを用いることは好ましいことが示され ている。

従来技術には、哺乳類細胞、特にヒト細胞を保存することについて研究されてい ない。血液細胞のようなヒト細胞は細菌またはリポソームの膜構造と比へてその 膜構造において特徴を有している。細菌の場合、細胞壁が非常に厚い非脂質壁で あり、この壁は細胞流体含有物を、熱、浸透圧変化のような恕い影響から保護し 、糖質のような保存薬の不存在において凍結乾燥する作用をする。それ故、細菌 の多くの菌株は、その硬い細胞壁のために唯一の保存保護または被覆の不存在に おいて凍結乾燥のストレスに耐える。

リポソームの場合には、流体空間が単一ラメラまたは多重ラメラ脂質小胞によっ て閉塞されている。小胞の壁は極性頭部（ｐｏｌａｒ　ｂｅａｄｓ）および非極 性尾部（ｎｏｎ−ｐｏｌａｒ　ｔａｉｌｓ）を有するｌまたは２種以上の脂質成 分の生体分子層によって形成されている。水溶液において、１つの層の極性頭部 は外方に配向し周囲媒体に伸び、脂質の非極性尾部は互いに結合し、小胞の壁に 極性表面および極性コアを形成する。単一ラメラ　リポソームは１つの生体分子 層を有するのに対して、一般に多重ラメラリポソームは多数の実質的に同心的な 生体分子層を有している。

それ故、リポソームは、ステロイドを含むまたは含まないリン脂質の混合物を水 溶液に分散する場合に形成した球状構造である。これはインビボ部位に認識放出 する試薬を封入するのに役立つと思われる。

リポソーム細胞壁は、例えばヒト細胞のそれと比べて人工的な二重脂質膜である 。ヒト細胞膜の組成ははるかに複雑である。

二重脂質膜構造のほかに、ヒト細胞膜はその脂質二重層中に入っている多くの付 加タンパク質および糖タンパク質分子を有している。これらのタンパク質分子が 人工リポソームに存在しない細胞表面抗原または決定部位を与えることから、こ れらのタンパク質分子は特に興味深い。ヒト細胞表面標識の研究はヒト血液細胞 に関する免疫検定法、および他の血液学的測定において最重要点である。リポソ ームにおける同じ区別はハイブリドーマ細胞系およびモノクローナル抗体におい て用いることができる。心に留めておくべきもう１つの区別は哺乳類細胞の複合 流体含有物と例えばリポソームの流体含有物との間の差異である。ヒト血液細胞 の場合には、細胞は、非等張溶液を含む任意の媒体に存在するリポソームの場合 にはない、等張流動媒体においてたけに存在する。

本発明において具体的に実施する凍結乾燥法は、対照細胞として構成した場合に 、細胞の形態を逆に変えることなく、および例えば検定に適用するプローブまた は標識に結合した後に細胞膜を浸透することなく哺乳類細胞を凍結乾燥すること に特徴かある。更に、上記凍結乾燥法は細胞膜のタンパク質構造および細胞壁内 のその配向を安定化する作用をし、このために膜表面タンパク質標識を破壊しな い。哺乳類細胞の細胞膜の既知のこわれやすい性質を考慮する場合、本発明の凍 結乾燥法により達成される結果は新鮮な細胞と比べて、再水和後生理学的作用特 性の保持、および達成される凍結乾燥された哺乳類細胞の安定性および保存寿命 について予期しない、驚くべき効果があるものと思われる。

本発明を具体的に実施する方法において、等張溶液に糖トレハロースを哺乳類細 胞の外面のみにおける保存または保護被覆として用いる。細胞膜の内面の被覆は 実施可能でない。優れた安定性および達成した保存寿命の長さは、本発明を免疫 学的検定のための、哺乳類細胞の流動細胞計測分析に適当な試料調製に用いるた めの、血液細胞の数の測定、大きさの測定、および赤血球および白血球のような 血液細胞成分のサブセットの分析のための、および種々の細胞タイプについての ＤＮＡ分析のための対照細胞の調製に適用することができる。それ故、種々のタ イプの細胞は凍結乾燥でき、しかる後に好結果の生物学的細胞分析のために再構 成することができる。

ステフィ　ウェイスブルド氏「脱水症拒抗死（Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｆｙｉｎｇ　Ｄ ｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）Ｊ　：　ｒｓｃｉｅｎｃｅ　ＮｅｗｓＪ　Ｖｏｌ、１３ ３、　ＮＯ，７、９７〜１１２ページ（１９８８年２月！り日）には、トレハロ ースを上記公表国際特許出願ＰＣＴ　Ｎｏ、　ＷＯ８６１０３９３８号明細書に 記載されているように用いてリポソーム凍結乾燥する方法について記載している 。この公表国際特許出願明細書には微生物についての研究について記載されてお り、トレハロース、低分子量糖質が脱水する際にこれらの微生物に高濃度で生成 したことを示している。

トレハロースか人工的細胞膜またはリポソームの安定性を高める脂質安定剤とし て作用するものと思われた。公表国際特許出願明細書には、トレハロースがすべ ての状態において有用な添加剤でないこと、およびトレハロースの毒物学に注目 することを警告している。

適当な試料予備技術および研究室試験器具作用を実現する試験試料と同時に検定 できる正確で、かつ信頼しうる対照媒体についての必要性は連続的必要性である 。流動細胞計測分析において、対照物は流動細胞計測操作パラメータを設定する のに用いる蛍光性ビーズまたはミクロスフェアを除いて、用いることができない 。最も望ましい対照物質は、利用された試薬について、および適当な器具作用に 伴う試料予備技術について対照することができる物質である。それ故、流動細胞 計測分析の場合、試験試料の細胞と共に検定すべき望ましい抗原決定基または決 定基を発現する保存哺乳類細胞は最適な対照媒体を与える。対照細胞について前 に定められた値は研究者によって得た試験結果と比べることができる。

すべての表面抗原についての流動細胞計測分析の性質は、細胞光散乱パターンお よび研究される細胞表面に対する最小損傷による膜完全性を保存する対照細胞に ついての予備的方法を必要とする。これらのファクターを比較する最良の基準は 研究すべき既知の特性を有する新鮮な細胞である。しかしながら、研究室環境状 態で新鮮な対照細胞を船積みおよび貯蔵することは経済的供給観点から実際的で ない。

それ故、使用において必要な特性を保持しながら、使用次において所望の保存寿 命期間にわたって船積みおよび貯蔵でき、および再構成でき、または再水和でき るような、凍結乾燥による保存哺乳類細胞は流動細胞計測分析についての望まし い対照物を与える。

また、かかる凍結乾燥哺乳類対照細胞は、血液学分析装置、例えばクールター　 コーポレーションに属するクールターエレクトロニクス　インコーポレーション 、フロリダ州ノ１イアレアにより市販されているクールター　カウンター■（Ｃ ＯＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ）血液細胞分析器により適当に用いられる。

出願人は、対照媒体として用いる哺乳類細胞の凍結乾燥が二三の理由により首尾 よく達成できなくなることを考慮している。

例えば、凍結パラメータがかかる細胞におけるタンパク質分子に悪い影響を及ぼ し、すべての膜完全性を破壊する場合である。

細胞内凍結の悪影響を考慮して種々の糖質をＤＭＳＯまたはグリセロールと組合 わせて用いる実験を行った。また、糖質のみを凍結乾燥処理に用い、この場合糖 を、凍結中および凍結乾燥処理中細胞を懸濁状態にする場合には、標準正常ヤギ 血清のような凍結乾燥担体溶液に添加した。糖を、燐酸緩衝アルブミン（ＰＢＡ ）　、ウシ退治血清、ヒトＡＢ血清および正常ヤギ血清を用いまたは用いない種 々の希釈について試験した。

担体として糖にスクロース、タウリンおよびグルコースおよびＤＭＳＯを用い試 験は許容しえない結果か得られた。例えば、新鮮な細胞に関するある抗原につい ての特殊な蛍光における減少により、許容しえない光散乱および特殊な蛍光特性 は、フラクトースを用いた場合に確認された。かかる糖を用いる細胞の処理は、 細胞が凍結中、主な損傷を防ぎながら適当に調製できないような、満足しない凍 結乾燥細胞を与えた。この損傷は、抗原形質発現に影響を及はす立体配座交替の ような細胞膜タンパク質における分子変化に現れる。細胞の凍結中、塩濃度の増 加および結晶形成の結果として生ずる上記損傷をごく普通のように防ぐために凍 結保護剤を必要とする。ＤＭＳＯおよびグリセロールのような上記凍結保護剤、 および他の血清は特許出願者によるヒト細胞の凍結乾燥において成功しないこと を確かめた。

細胞を凍結および凍結乾燥細胞濁するマトリックスまたは担体として正常ヤギ血 清を用いた場合には、最適な細胞表面標識残存物が得られなかった。血清におけ るタンパク質は酸化および他の破壊から細胞膜を保護できないように思われた。

また、正常ヤギ血清およびアルブミンとの混合物に用いたトレハロースはここに 暗示されている問題の解決に成功しないことを確かめた。

その後、正常ヤギ血清およびアルブミンによる混合物を含む二三の担体処方の１ 部として糖トレハロースを用いる試験を行ったが、許容しうる凍結乾燥対照細胞 媒体は得られなかった。

それ故、凍結乾燥中、細胞の膜脂質を安定化するためにトレハロースを含む糖の 使用は成功しなかった。

許容しうる凍結乾燥ヒト細胞を得るのに成功した本発明の方法は、凍結降下およ び凍結乾燥プロトコルの厳格さにより細胞を調製する等張液に等トレハロースを 用いることを含んでいる。

本発明の方法により調製された凍結乾燥対照細胞にはハイプリドーマまたは細胞 系および流動細胞計測分析に用いる最適特性を保有する末梢血液単核細胞を含め た。また、等張液における最適なトレハロース濃度は本発明の方法に用いるのに 最も強要しうる糖であるトレハロースにより定めた。本発明は凍結乾燥ヒト対照 細胞およびかかる凍結乾燥法により生成しうる他のヒト細胞を含んでいる。

光凱勿笠丞 本発明は免疫検定、流動細胞計測分析および微視的分析における生物学的対照と して用いる、および所望の抗原性を保有したヒト細胞系を保存するための凍結乾 燥ヒト細胞の調製方法である。凍結乾燥細胞は、細胞膜タンパク質配置または形 態学において損傷を与えずまたは悪く影響を及ぼさずに、上記糖について再構成 または再水和することができる。方法は哺乳類生理学的流体および組織における すべての細胞を凍結乾燥することができる。ある標準調製処理を用いることがで き、平均分析繰り返しおよび遠心作用によりペレット状にするように、全血液か らまたは培養細胞系または組織から所望の数の処理すべき細胞を採集するように する。先ず、このペレットを燐酸緩衝アルブミンにある時間にわたって懸濁し、 ペレット状態の細胞を再生処理する。凍結乾燥前に、細胞ペレットを特定の最適 濃度で調製した等張流体にトレハロースを溶解した溶液に懸濁し、室温で与えら れた時間にわたって培養する。等張流体に調製した与えられた割合のトレハロー スによる細胞のこよ懸濁処理は室温で与えられた時間にわたり繰り返し、次いで 細胞懸濁物をガラス瓶に入れ、与えられた時間にわたって凍結および凍結乾燥す る。

上述するようにして作った凍結乾燥細胞は、そのまま使用するためにガラス瓶の 全容量に相当する量の蒸留水で再構成することができる。再構成細胞は分析的対 照として用いるのに適当な最適な生理学的特性を保持している。

図面の簡単な説明 第１Ａおよび１８図はそれぞれＴｌ１−ＦＩＴＣおよびＭｓ［ｇ　Ｇｌ−Ｆ［Ｔ Ｃ標識で着色した同一の新鮮なＴ−細胞系および本発明の方法により凍結乾燥し たＴ−細胞系を比較する流動細胞計測ヒストグラムである。

第２Ａおよび２Ｂ図はそれぞれＢｌ−ＦＩＴＣおよびＭｓｌｇ　Ｇ２ａ−ＦＩＴ Ｃ標識で着色した本発明の方法により凍結乾燥した同一のＢ−細胞系および新鮮 なり一細胞系を比較する流動細胞計測ヒストグラフである。

第３図は２色着色したＴｌｌおよびＢ１モノクローナル抗体を用いる新鮮な末梢 血液リンパ球および凍結乾燥末梢血液リンパ球を比較する４つの枠に示した複合 流動細胞計測ヒストグラムである。

第４図は２色着色Ｔ４およびＴ８モノクローナル抗体を用いる新鮮な末梢血液リ ンパ球および凍結乾燥末梢血液リンパ球を比較する４つの枠に示す複合流動細胞 計測ヒストグラムである。

第５図は凍結乾燥対照細胞、細胞系および末梢血液リンパ球を生成する本発明の 凍結乾燥方法の段階を示す工程図である。

発明を実施する良好手段 ある術語を、第１〜４図に示すヒストグラムにより示した比較試験の結果を説明 するのに用いている。ここに用いる用語を次に説明する： １、「バックグラウンド蛍光」とは研究される特定の蛍光細胞以外の試料におけ る任意の材料から発する蛍光グローを意味する。

２、「自己蛍光」とは細胞から発する蛍光グローか染料のような蛍光化学物質以 外のものにより誘導される１つのタイプのバックグラウンド蛍光を意味する。

３、「非特異的結合Ｊとは細胞に結合するのに用いる特別の方法以外の手段によ って細胞表面に付着する蛍光化学の現象を意味する。

４、「光散乱」とは、例えばレーザー源からの入射ビームが細胞に衝突し、ある ビームが多方向に反射し、あるビームが細胞を通過する場合に、流動細胞計測器 装置に生ずる現象である。

反対角度および細胞を被覆した蛍光化学により生ずる蛍光を含む散乱光は、細胞 の大きさおよび容積、細胞表面滑らかさおよび細粒の数および細胞の細胞質にお ける他の構造のような細胞特性を調へるために検出および測定することかできる 。

これらの特性は正常細胞の特性と比較できる。

５６［平均チャンネル（ＭＣ）Ｊは分析した細胞についての平均相対量の蛍光を 意味する。

６、「％ポジティブＪはバックグラウンド蛍光より多く発光する分析細胞の百分 率を意味する。

本発明において凍結乾燥方法を実施するのに用いる成分を次に示す： Ａ、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　１００ｍ１にＰＢＡ　Ｉｇを含む燐酸緩衝アル ブミン溶液（ＰＢＡ）。

Ｂ０等張液１００ｍ１にトレハロース１０ｇを含むトレハロース溶液。

この好ましいトレハロース溶液はクールター　エレクトロニクス　インコーポレ ーションから登録商標「イソトン１１１（ｒｓＯＴＯＮ　”’　）　Ｊで独占的 に市販されている。

Ｃ９蛍光を発するイソチオシアネートによる標識ｒＦＩＴｃＪ。

Ｄ、クールター　コーポレーションにより用いられたフィコビリタンパク質蛍光 標識である標識ｒＲＤＩ　Ｊ。

第５図は本発明の方法を実施する手段を一般的に記載している。検定すべき被験 細胞に相当する哺乳類細胞を全血から、または検定により規定されるような培養 細胞系または組織から採集する。平均分析回数により、３０Ｘ１０’個の細胞を 採取し、１９６ｐｅｓ溶液に４〜８°Ｃで懸濁させる。懸濁細胞を室温で１５０ ＯＲＰＭで約１０分間にわたり遠心処理する。上澄みを傾瀉し、細胞ペレットを イトソン■のような等張流体で調製した１０９ルハロース溶液に懸濁させ、室温 で１０分間にわたり、または最適な目的のために２〜８°Ｃで１０分間にわたり 培養する。次いで、懸濁物を４〜８°Ｃで１０分間にわたり１５００ＰＰＭで遠 心処理し、生成ベレットを再びイトソン［Ｆ］で調製した１０％トレハロース溶 液に４〜Ｂ　”Ｃで懸濁する。トレハロース処理細胞懸濁物をガラス瓶当り３０ ０μｌの溶液で凍結乾燥ガラス瓶に入れ、ガラス瓶をぶたし、４°Ｃに冷却し、 次いで少なくとも１時間にわたり一７０°Ｃで冷凍器に入れる前に、細胞を均質 に分散するように攪拌する。

冷凍器における１時間経過した際に、ただちにガラス瓶を凍結乾燥器に約１５時 間にわたって入れる。

１５時間の経過後、凍結乾燥ガラス瓶を凍結乾燥器から除去し、２〜８°Ｃで貯 蔵する。再構成において、ガラス瓶を蒸留水または脱イオン水で３００μｌ容量 に充填する。流動細胞計測器において対照細胞分析をする場合、再懸濁細胞を着 色し、しかる後、標準流動細胞計測器手段により分析する。勿論、この対照細胞 は他のタイプの分析または他の適当な診断プロトコルに用いることができる。

本発明の方法により調製された凍結乾燥の効果および効力は第１〜４図に示す流 動細胞計測器ヒストグラムから明らかであり、次に説明する： 第１Ａおよび１８図に示すように、流動細胞計測器ヒストグラムでは、ＰＢ４４ として同定した同じ新鮮なおよび凍結乾燥したＴ−細胞系を着色し、クールター 　コーポレーション（フロリダ州　ハイアリア）により市販されているＥＰＩＣ ３■流動血球計算器で比較した。ＰＢ４４Ｔ−細胞の２個の別々のロフトを２週 問おきに作り、本発明の方法により凍結乾燥した。細胞を脱イオン水を用いて再 構成および再水和し、染色モノクローナル抗体Ｍｓ１ｇｌ−ＦＩＴＣおよび登録 商標［クールター　クローネ■（ｃＯｕｔ、ｒｐＲＣ［，０ＮＥ）　Ｊでクール ター　コーポレーションから市販されている染色モノクロナール抗体Ｔｌ１−Ｆ ＩＴＣを用いる細胞表面標識により着色した。使用した直接免疫蛍光細胞表面着 色についての手段はクールター　コーポレーションから市販されているｒｃｏｕ ｌｔｅｒ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　Ｂｏｏｋ　Ｊ第４頁に記載されている。着色 後、これらの再構成された凍結乾燥細胞をＥＰＩＣ３■流動細胞計測器で分析し て各抗体についてのパーセント　ボジテビティ（ｐｅｒｃｅｎｔｐｏｓｉｔｉｖ ｉｔｙ）および相対的量の平均チャンネル蛍光を調べた。

分析を行った同じ日に得た新鮮な培養ＰＢ４４　Ｔ−細胞を分析し、同様にして 分析した着色凍結乾燥細胞の結果と比較した。ヒストグラム結果は次の通りであ る： ＰＢ　４４　Ｔ−細胞 新鮮細胞　凍結乾燥細胞 ＭＣ％ポジティブ　ＭＣ％ポジティブ Ｔｌ１−ＦＩＴＣ８４９９９２１００ ＭｓＩｇＧ１００Ｍ５Ｉ　−０１６５ 凍結乾燥Ｔ−細胞におけるパーセント反応性は分析した新鮮なＴ−細胞のそれと 同等であった。また、いずれの場合においても、平均細胞蛍光は実質的に同等で あり、８４〜９２の僅かな矛盾は許容しうる分析結果に干渉するのに不十分であ る。新鮮なＴ−細胞についての第１Ａ図のヒストログラムと凍結乾燥Ｔ−細胞に ついての第１Ｂ図のヒストログラムとの間の明らかな類似性がある。明らかに、 本発明の凍結乾燥方法は本発明に貢献する望ましい利益が与えられる。

ＰＢ４４細胞系の新鮮なおよび凍結乾燥したＴ−細胞について、一連のクールタ ー　クローネ■モノクローナル抗体を用いるＥＰＩＣ３＠流動細胞計測器におけ る付加試験を行った。使用した着色細胞の調製手段は上述すると同様に行った。

付加分析の結果を次に示す。

ＰＢ　４４　Ｔ−細胞結果 クール９−　’１０−ネ■　新鮮なＰＢ４４細胞　凍結乾燥ＰＢ　４４ＩｇＧ１ −ＦＩＴＣ１１００１９１３ （イソタイプ対照）２１２０　１６５ ［ｇＧｌ−ＲＤＩ　１　３　０　４　１（イソタイプ対照）２６０’５０ Ｔｌｌ−ＦＩＴＣ１８４１００８６９９Ｔ８−Ｆ［ＴＣ１８６９７９６９８ Ｔ４−ＦＸＴＣｌ　４０　７１　５０　８４４Ｂ４−ＦＩＴＣ１４０７９５１９ ２ Ｔｌｌ−ＲＤＩ　１　９８　１００　７７−　９５Ｔ８−ＲＤＩ　１　１１０　 ９１　１０９　９８凍結乾燥ＰＢ４４細胞におけるパーセント反応性は試験した 各抗体についての新鮮な細胞の反応性と実質的に同等であった。更に、着色細胞 の相対的蛍光強さの評価を与える平均チャンネル値は凍結乾燥した対新鮮細胞と 類似していた。ある場合には、凍結乾燥細胞は［ｇＧｌ−ＦＩＴＣイソタイプ対 照で着色することにより判断するように、非特異的蛍光の大きい程度を示した。

しかしながら、その低い強さのために、この蛍光の程度は許容しつる分析解読に 干渉するのに不十分であると思われる。

第２Ａおよび２Ｂ図の流動細胞計測ヒストログラムにおいて、ＰＢＩＩとして同 定された同一の新鮮なおよび凍結乾燥したＢ−細胞系を着色し、Ｂｌ−ＦＩＴＣ を用いるＥＰＩＣ３■流動細胞計測器で比較した。２週問おきに調製したＰＢＩ Ｉ−細胞の２つの別々のロットを本発明により凍結乾燥した。細胞を脱イオン水 を用いて再水和し、クール、ター　コーポレーションから登録商標「クールター 　クローネ」として市販されているＢｌ−ＦＩＴＣおよびＢ４−ＦＩＴＣ細胞標 識で着色した。着色手段は第１Ａおよび１８図において記載していると同様であ った。着色後、再水和した凍結乾燥細胞をＥＰＩＣ３■装置で分析してパーセン ト　ボジテビティおよび各抗体についての相対的量の平均チャンネル蛍光を調べ た。分析を行った同じ日に培養容量から得た新鮮なＰＢＩＩＢ−細胞を分析し、 分析した着色凍結乾燥細胞の結果と比較するために同様に分析した。８ｌ−Ｆｒ ＴＣおよびＢ４−ＦＩＴＣデータの結果を次に示す：ＰＢ　Ｉｆ　Ｂ−細胞 新鮮細胞　凍結乾燥細胞 ＭＣ％ポジティブ　ＭＣ％ポジティブ Ｂｌ−ＦＩＴＣ８２９９１１８１００ Ｂ４−ＦＩＴＣ９２１００６９９９ 凍結乾燥Ｂ−細胞におけるパーセント反応性および平均チャンネル蛍光は新鮮な 細胞のそれらと同等であった。凍結乾燥細胞はイソタイプ対照における大きい程 度の非特異的蛍光を示したが、このことは毎日基準でこの細胞系で観察した非特 異的バックグラウンド着色に貢献する。低い強さのために、この程度の非特異的 蛍光は分析解読を妨げない。

第３図に示すように、１）、　２）、　３）および４）のそれぞれで示す４つの 枠に示す複合流動細胞計測ヒストログラムは、二色ＴｌｌおよびＢｌクールター 　クローネ■モノクローナル抗体を用い新鮮な抹消血液リンパ球（ＰＢＬＳ）お よび凍結乾燥血液リンパ球を比較している。細胞はフィコルーハイパキュ■（Ｆ ｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）標準方法により分離した。細胞の凍結乾燥および 着色は上述する処理により行い、細胞を分析した。結果を次に示す：新鮮細胞　 凍結乾燥細胞 ＭＣ％ポジティブ　ＭＣ％ポジティブ Ｂｌ−ＦＩＴＣ７０１２５９１９ Ｔｌｌ−ＲＤＩ　６４　７７　５７　６７抹消血液リンパ球の凍結乾燥調剤に対 するパーセント反応性は、各供試抗体に対する新鮮なＰＢＬＳＯものとほぼ同じ であった。

平均チャンネル蛍光もまたほぼ同じであった。

第４図において、４つの番号をつけた枠に示す複合流動の細胞計測ヒストグラム は、２色で着色したＴ４およびＴ８クールタークローネ■モノクロナール抗体を 用いて新鮮な凍結乾燥した抹消血液リンパ球（ＰＢＬＳ）を比較する。第３図に ついて記載したと同様の予備操作をこれ等の検定に用いた。得た結果を次に示す ：新鮮細胞　凍結乾燥細胞 ＭＣ％ポジティブ　ＭＣ％ポジティブ Ｔ４ＲＤ１　１０２　４７　１０５　５８Ｔ８−Ｆ［ＴＣ１１９３１９９３２ 凍結乾燥ＰＢＬＳのパーセント反応性は、各供試モノクローナル抗体に対し新鮮 なＰＢＬＳのものとほぼ同じであった。平均チャンネル蛍光もまた両種のＰＢＬ Ｓに対しほぼ同じであり、凍結乾燥ＰＢＬＳのＴ８８色モノクローナル抗体は僅 かに低下したが、これはすべての分析または比較に干渉しなかった。

凍結乾燥した哺乳類の細胞を２〜８°Ｃの温度で冷蔵庫に貯蔵し、保存寿命試験 を行った。この試験で得た結果は、凍結乾燥した生成物の５ケ月以上の真の時間 安定性を示した。

本発明により凍結乾燥したヒトＴ細胞およびＢ細胞の２つの安定化した調剤をＥ ＰＩＳ■流動細胞計測器で試験して新鮮なヒトＴ細胞およびＢ細胞に比較してそ れ等の構造保存が延びることを確かめた。一つの混合物は８ｏ９６のＴ細胞と２ ０９６のＢ細胞より成り、第２の混合物はＴ細胞とＢ細胞がそれぞれ５゜９６か ら成る。凍結乾燥した細胞を、蒸留水で再構成し、流動細胞計測器上の細胞の光 散乱パターンを図に示し、即ちフォーワード・アングル（ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎ ｇｌｅ　）光散乱（ＦＡＬＳ）および９０光散乱を図に示した。同じ光散乱試験 パターンを、ＥＰＩＣ８■流動細胞計測器で新鮮なＴ細胞およびＢ細胞の対応す る調剤に対して図に示した。図に示した試験結果は、凍結乾燥した細胞混合物の 光散乱パターンが対応する新鮮な細胞混合物のパターンと同様であって凍結乾燥 した細胞の優れた構造保持を示すことを確定した。

試験は、また細胞の細胞表面抗原性がそこなわれなかったことを示した。適当に 染色したクールター　クローネ０モノクローナル抗体を用いたが、これにはＴ４ ．　Ｔ８．　Ｔｌ　１．　Ｂｌ。

Ｂ４，１２および４Ｂ４モノクローナルが含まれた。

凍結乾燥した細胞を積極的に染色し、ＤＮＡ分析用の生物学的対照としてＥＰＩ Ｃ３Ｏ流動細胞計測器で試験した。新鮮なおよび凍結乾燥した細胞を染色し、試 験して新鮮なおよび凍結乾燥した細胞集団における細胞サイクルの発現を分析し た。

新鮮なおよび凍結乾燥した細胞を、異なる日々、種々のドナー（ＰＢＬの呼称） から得、ＰＢＩＩおよびＰＢ４４と称する異なる培養菌を得た。これ等の試験の 図示する結果は、細胞周期分析用対照細胞として使用するための凍結乾燥した細 胞の適合性を確かめた。新鮮なおよび凍結乾燥した細胞を比較する際の細胞周期 分析における若干の偏倚は試験した細胞の取得期間の差に帰せられる。

本発明により凍結乾燥した細胞と対応する新鮮な細胞との間の前記比較分析から 次の結論が得られる：１、　これ等の凍結乾燥した細胞は、流動細胞計測法の品 質制御におけるインビトロ診断分析に使用することができる。

２、　これ等の凍結乾燥した細胞は、流動細胞計測器の使用による細胞表面識別 分析に積極的染色生物学的対照として機能し得る。これ等の関数で、凍結乾燥細 胞を使用して、試薬の保全、サンプル製造技術および適当な流動細胞計測関数を 決めることができる。凍結乾燥細胞は細胞活性化抗原および白血病抗原に対する モノクローナル抗体の特殊パネルに対する細胞対照として役立つ。また細胞表面 の抗原密度を定量する際の標準として役立つ。

３、　これ等の凍結乾燥した細胞はＤＮＡ分析用の積極的に染色した生物学的対 照として作用し試薬の保全、サンプルの製造技術および適当な流動細胞計測関数 を決めることができる。

また、これ等の凍結乾燥した細胞は細胞集団の細胞サイクル分析用標準として役 立つ。

これ等の凍結乾燥した細胞の保持した形体および細胞表面の抗原性は、ＥＬＩＳ Ａおよび鏡検法形のような他の型の検定において対照細胞として使用することが できると思われる。本発明の凍結乾燥法により調製した細胞はすべての正常なま たは異常な哺乳類の細胞、例えば癌細胞の免疫測定に使用することができる。こ れは、分析媒体、例えばモノクローナル抗体が分析を完成するのに検出目的に利 用される限り可能である。本発明の凍結乾燥法はまた同様に血液学の粒子分析計 の場合に使用するのに適する凍結乾燥した対照細胞を生成することができる。

組繊細胞は本発明の方法によって保存することができる。

現在実施されている蛍光ビーズまたはマイクロスフェアを使用するのと比較して 、流動細胞計測法でこれ等の凍結乾燥した対照細胞を使用することから誘導され る多くの利点が評価される。蛍光マイクロスフェアはサンプル製造の対照とする のに適さず、細胞の光散乱分析用の適当な流動細胞計測装置を選定するのに有用 でなく、それ等の蛍光は細胞内であり、細胞表面でない。更に、凍結乾燥した細 胞は流動細胞計測法により分析される新鮮な細胞と構造的に一層類似している。

更に本発明により凍結乾燥され保存された細胞は、凍結保護剤を用いることによ り保存されまた液体窒素温度で貯蔵される正常な末梢血液細胞（ＰＢＬ）が遭遇 する絶対的貯蔵条件または複雑な取扱処置を必要としない。

本発明の方法を実施するに当って僅かな変化例えば培養期間または試薬の分量の 僅かな変化が、請求の範囲に規定するように本発明の精神から逸脱することなく 当業者にはおこり得る。

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Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．流動細胞計測法光散乱分析によって実証され得る凍結乾燥哺乳類細胞に対応 する新鮮な細胞に類似する細胞表面抗原性および構造保全を持続し且つ数ヶ月間 ２〜８℃の温度で貯蔵した後においても凍結乾燥した細胞として真の時間安定性 を示すことを特徴とする水中で再構成することができる凍結乾燥した哺乳類細胞 。
2. ２．流動細胞計測法に対する生物学的対照として使用するため積極的に染色する ことができることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。
3. ３．流動細胞計測法によるＤＮＡ分析に対する生物学的対照として使用するため 積極的に染色することができることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細 胞。
4. ４．細胞集団の細胞サイクル分析用標準として使用することができることを特徴 とする請求の範囲３記載の凍結乾燥細胞。
5. ５．上記細胞がヒト末梢血液細胞または培養細胞から誘導され得ることを特徴と する請求の範囲１，２または３記載の凍結乾燥細胞。
6. ６．上記細胞が生理学的状態で正常または異常であるヒト組織細胞から誘導され 得ることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。
7. ７．免疫検定に使用する生物学的対照細胞として機能するため染色することがで きることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。
8. ８．流動細胞計測器において積極的に染色した生物学的対照として次いで使用す るのに適する最初の膜構造および細胞表面抗原性を保持したことを特徴とする冷 凍温度で５ヶ月以上貯蔵した後蒸留水中で再構成することができる凍結乾燥した ヒトおよび培養した細胞。
9. ９．上記細胞が凍結乾燥前に適用されるトレハロース等張流体の保存被膜を有す ることを特徴とする請求の範囲１記載の凍結乾燥細胞。
10. １０．ＤＮＡ分析に適する生物学的対照であることを特徴とする請求の範囲８ま たは９記載の凍結乾燥細胞。
11. １１．およびＢ細胞集団の細胞周期分析に対する標準として使用することができ ることを特徴とする請求の範囲８または９記載の凍結乾燥細胞。
12. １２．再構成される場合に細胞膜構造の保全および細胞表面抗原性を保持する凍 結乾燥した哺乳類細胞を製造するに当り、Ａ．選定した容量の燐酸緩衝アルブミ ン中に懸濁する所定のサンプル数の細胞を集め、 Ｂ．細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得、Ｃ．細胞ペレットをトレハロ ースの等張流体溶液中で所定時間周囲室温で培養して細胞懸濁液を得、Ｄ．細胞 懸濁液を容器に導入し、規定した低温に冷却し、均一７０℃で約１時間凍結し、 Ｅ．容器を取出し凍結乾燥器に規定した凍結乾燥サイクルで入れついで、 Ｆ．凍結乾燥した細胞を内蔵する容器を２〜８℃の冷却温度で次に蒸留水中で再 構成するため貯蔵することを特徴とする凍結乾燥した哺乳類細胞。
13. １３．Ｂ工程で誘導された細胞懸濁液を先ずＢ工程で処理して細胞ペレットを生 成し細胞ペレットをＣ工程の操作で再び処理し然る後生成した細胞懸濁液をＤ工 程で処理することを特徴とする請求の範囲１２記載の方法。
14. １４．培養を１０％トレハロース等張溶液中で行うことを特徴とする請求の範囲 １２または１３記載の方法。
15. １５．細胞ペレットを燐酸緩衝アルブミン中４℃で１時間懸濁させることを特徴 とする請求の範囲１２または１３記載の方法。
16. １６．細胞ペレットを１０％トレハロース等張溶液中周囲室温で約３０分間培養 することを特徴とする請求の範囲１４記載の方法。
17. １７．凍結乾燥サイクルが約１５時間であることを特徴とする請求の範囲１２ま たは１３記載の方法。
18. １８．検定試薬および装置について標準化するため対照媒体を使用する哺乳類の 生理学的細胞の検定において、生物学的対照として機能するため水中で再構成す ることができる凍結乾燥した哺乳類細胞を用い、対応する新鮮な正常哺乳類細胞 に類似する細胞膜構造の保全および細胞表面抗原性を保持することを特徴とする 哺乳類細胞の検定。
19. １９．上記哺乳類細胞を末梢血液細胞、培養した細胞、ハイブリドーマ細胞系ま たは組織細胞から選定することを特徴とする請求の範囲１８記載の検定。
20. ２０．検定が、末梢血液細胞の分離した細胞集団を検出するためであることを特 徴とする請求の範囲１８記載の検定。
21. ２１．２〜８℃で数ヶ月間冷却温度で貯蔵した後蒸留水中で再構成することがで きる凍結乾燥した哺乳類細胞であって、新鮮な細胞と比較してほぼ同等の生理学 的パラメータを保持することを特徴とする凍結乾燥細胞。
22. ２２．哺乳類細胞分析用分析対照として機能的に適することを特徴とする請求の 範囲２１記載凍結乾燥した細胞。