JPH04501204A - 異種タンパク発現を安定させる方法およびそれに使用するベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 異種タンパク発現を安定させる方法およびそれに使用するべ本発明は、一般に生 物工学の分野に関する。特に、本発明は、タンパク発現、および細菌宿主におい て良好に発現しない哺乳類ポリペプチドの収率を同上させるための組換えＤＮＡ 技術の分野に関する。

及豆ユ！見 真核タンパクの多くは、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて、測定可能な収率で発現される ことが可能ではなく、また検出可能であったとしても、宿主による外来タンパク 分解のために商業的な回収レベルでは発現され得ない。スモールタンパク（例え ハ、アミノ酸１００個未満のペプチドホルモン）は、特に分解に敏感なようであ る。タンパク分解の程度は、宿主およびタンパクによって様々である。Ｅ、　ｃ ｏｌｔにおける真核タンパクの可能な最高発現レベルは、γインターフェロンに よって観察されており、全細胞タンパクの約６０％で発現された。真核タンパク の高度な発現レベルの達成は数少ない。なぜなら、それらは、細胞中において、 集まって封入体または屈折性塊体（ｒｅｆｒａｃｔｉｔｅ　ｂｏｄｙ）と呼ばれ る不溶性塊体となる濃度に達するからである（例えば、ウシ成長ホルモンＧ　５ ｃｈｏｎｅｒら（１９８５）、　Ｂｉｏｔｅｅｈ匹胆ｕ３：１５Ｌ−１５４）　 ｏ　このような形態においては、真核タンパクは分解されにくい。

それ目身では、不溶性にならないタンパクでも、原核タンパクのような他のタン パクと結合すると、封入体を形成することがある。少数の原核タンパクがこのよ うに使用されている：例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ、　ｍＥ、およびｒｅ ｃＡ遺伝子ならびにλ二１１遺伝子。

クロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）は、選択可能マ ーカー（クロラムフェニコール耐性）として、異なるプロモーターからの真核細 胞および原核細胞における発現の効力をモニターするために容易にアッセイされ る酵素（Ｄｅｌｅｇｅａｎｅ、　Ａ、Ｍ、、ら（１９８７）Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ　７：３９９４−４００２）として、調節配列および／またはリポソー ム結合部位として使用され、ならびに真核タンパクをコードする配列を、成熟天 然ＣＡＴをコードするヌクレオチド配列（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＨａｙａｓｈｉ 　（１９８６）　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２０４：１２０−１２５；　１ ９８５年１１月２１日公開のヨーロ／バ特許出願公開第１６１．９３７号）また はＣＡＴのカルボキシ末端断片（通常、ＣＡＴ活性を保持する）と結合させる遺 伝子融合のために使用されている。

文献には、融合タンパクが細菌中で異種タンパクを発現するのに有用であり、天 然ＣＡＴ遺伝子配列がそのような目的のために使用されていることが記載されて いるが、アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチド１１ アジプシン／Ｄならびに肺界面活性物質５Ｐ−Ｂおよびｓ　ｐ−ｃのような異種 哺乳類タンパクを回収可能な収率で発現し、またはその収率を高めるために、切 形形態のＣＡＴを使用する試みがなされたことは記録されていない。多数の重要 なタンパクが、商業的に回収可能な収率で、細菌中において、あまりうまく発現 され得ないという事実を考慮すると、細菌発現およびそのようなタンパクの回収 のためのシステムを開発する必要がある。

ｉ児旦鼠丞 本発明の１つの局面は、以下を含む原核宿主中の異種タンパク発現を安定させる 方法に関する： （ａ）アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチドエ、ア ジプシン／Ｄ、肺界面活性タンパク５Ｐ−Ｂおよび肺界面活性タンパク５ｐ−ｃ からなる群から選択される哺乳類ポリペプチドをコードする異種遺伝子配列とフ レーム内において融合された、３′部分が切形のクロラムフェニコールアセチル トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子および異種遺伝子の 順に含むハイブリッド遺伝子を構築すること；ここで、該ポリペプチドは、正常 状態においては細菌発現系において回収され得ず、そして、翻訳の際に、該ハイ ブリッド遺伝子は回収可能な収率で融合タンパクを生産する； （ｂ）該ハイブリッド遺伝子の発現のためのベクターを提供すること； （Ｃ）該発現ベクターによって形貫転換された該原核宿主を培養すること、およ び （ｄ）該融合タンパクを回収すること。

本発明の２番目の局面は、非安定で、細菌によって生産された異種ポリペプチド の発現レベルを高めることが可能な細菌発現ベクターに関する。この発現ベクタ ーは、アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチド■、ア ジプシン／Ｄ、肺界面活性タンパク５Ｐ−Ｂおよび肺界面活性タンパク５ｐ−ｃ からなる群から選択される哺乳類ポリペプチドをコードする異種遺伝子配列にフ レーム内において融合した、３′部分が切形ＣＡＴ遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子 および異種遺伝子の順に含むハイブリッド遺伝子を含み、（ここで、該ポリペプ チドは正常状態においては細菌発現系において回収され得ない）、それによって 該切形のＣＡＴ遺伝子配列は、生じた融合タンパクをタンパク分解酵素による分 解に対して抵抗性にすることが可能である。

本発明の方法およびベクターの好ましい実施態様では、１８０個以下のアミノ酸 、好ましくは７３個から１８０個の間のアミノ酸配列をコードするＣＡＴを使用 する。生じたＣＡＴタンパクは、天然のＣＡＴタンパクと比較して実質的に減少 しているが、驚いたことに、切形のＣＡＴタンパクが、発現されたタンパクの安 定性に実質的に貢献し、従って、所望の異種タンパクを増加した収率で回収する ことを可能にすることが発見されてる。

本発明の他の局面では、非安定で、細菌によって生産された異種ポリペプチドの 発現レベルを高めることが可能な、改良された細菌発現ベクターが提供される。

ここで、該ベクターは、異種遺伝子配列に結合した、３′部分が切形の修飾され たＣＡＴ遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子および異種遺伝子の順に含むハイブリッド 遺伝子を含む。この改良ベクターは、ＣＡＴタンパク内の可能性のある化学的開 裂部位を除去するために、切形のＣＡＴ遺伝子の１つまたはそれ以上のＤＮＡコ ドンを変換することを含む。

本発明のその他の局面は、以下の説明および実施例から当業者に明らかである。

二ｉΔ！星久説ユ 第１図は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃタンパク分解酵素開裂部位を含む２ ４１のアミノ酸（ａａ）　ＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブリッドタンパクについてのア ミノ酸および対応するヌクレオチド配列を示す。このハイブリッドタンパクのア ミノ末端部は、ＣＡＴの最初の２１０個のアミノ酸をコードし、その配列は、本 発明を通じて言及される。

第２図は、本発明のＣＡＴ−ｈＡＮＦハイブリッドタンパクのクローニングおよ び発現に使用される一連のベクターおよび合成断片を示す。第２Ａ図は、Ｅ、　 ｃｏｌｔ　ｍプロモーターオペレーター記載、リポソームの結合部位および下流 のクローニング部位を含むＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ１合成断片を示す。第２Ｂ図は、 プラスミドｐＴｒｐ２３３の制限部位および機能マツプである。第２Ｃ図は、プ ラスミドｐｃＡＴ２１の制限部位および機能マツプである。第２Ｄ図は、エンド プロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ開裂部位によって先行されるｈＡＮＰ　（１０２−１ ２６）遺伝子をコードする樫ＲＩ−旧ｎｄ　Ｉ　Ｉ　［合成断片である。第２Ｅ 図から第２Ｇ図までは、それぞれプラスミドｐｈＮＦ７５、ｐｃｈＮＦ１０９お よびｐｃｈＮＦＩＺｌの制限部位および機能マツブである。東２Ｈ図は、Ｎｄｅ ｌ−Ｈｉｎｄｌ　ｌ　＋断片内に含まれる１−７３アミノ酸の合成ＣＡＴ遺伝子 配列を示す。第２Ｉ図は、プラスミドｐＣｈＮＦ１４２の制限部位および機能マ ツプであり、ＣＡＴ遺伝子の残基１６および３１をＴｙｒおよびＳａｒコドンに それぞれ置換するために部位特異的変異が使用されている。

第３図は、２つの異なる調製５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す。第３Ａ図 は、　ＣＡＴ−Ａ４−７５１ｉハイブリツドタンパクの５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲルである。レーン１＝分子サイズ標準品；レーン２；誘導Ｗ３１１０　（ ｐｃＡＰｉ１３２）　；レーン３＝誘導！３１１０　（ｐＴｒｐ８３）ベクター コントロール；レーン４＝非誘導Ｗ３Ｌ１０　（ｐｃＡＰｉ１３６）　；および Ｌ／−７５＝誘導Ｗ３１１０（ｐｃＡＰｉ１３６）。

第３Ｂ図は、ＣＡＴ−ＧＬＰ−１ハイブリツドタンパクの５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲルである。レーン１；分子サイズ標準品；レーン２ｚ非誘導Ｗ３１１０ 　（ｐｃＧＬＰ１３９）　；　Ｌ／　−７３＝誘導Ｗ３１１０　（ｐＣＧＬＰｉ ３９）　；およびレーン４＝誘導Ｗ３１１０　（ｐＴｒｐ８３）ベクターコント ロール。

第４図は、本発明のＣＡＴ−Ａ４−７５１ｉハイブリツドタンパクおよびＣＡＴ −ＧＬＰ−１ハイブリツドタンパクについてのアミノ酸および対応するヌクレオ チド配列を示す。第４Ａ図は、化学的開裂に次いで合成Ａ４−７５１ｉ遺伝子に フレーム内において結合したＣＡＴタンパクのアミノ末端をコードする最初の７ ３個のコドン、およびＡｓｎ−Ｇｌｙによりコードされる部位を示す。第４Ｂ図 は、Ｍｅｔコドンによって先行される合成ＧＬＰ−１遺伝子にフレーム内におい て結合したＣＡＴタンパクのアミノ末端をコードする最初の７３個のコドンを示 す。

第５図は、２つのプ５７．ミド、ｐＣＡＴ７３およびｐ　ＣＡＴ　２１０を示し 、テトラサイタリン耐性の遺伝子がこれらのＣＡＴ発現ベクター中において復帰 している。

第６図は、５Ｐ−Ｂ発現構築物である匹２１（ＩｓＰ−Ｈのヌクレオチド・配列 および対応するアミノ酸配列であり、幻１プロモーター領域に先行するＥｃｏＲ １部位から翻訳終止コドンを含む旧ｎｄｌ１１部位にまでわたっている。ここで 、ＣＡＴ、　リンカ−およびＳＰ−８Ｍ域は、それぞれ矢印によって示される。

第７図は、ＣＡＴ：５Ｐ−Ｂ融合タンパクの調製５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルである。レーンＡ＝分子サイズ標準品；レーンＢ＝　ｐＴｒｐ２３３ベクター コントロールを含む誘導！３１１０細胞；およびＬ／　−７（＝誘導ｐｃ２１０ ｓＰ−Ｂ／Ｗ３１１０細胞。

第８図は、２５１残基のＣＡＴ：５Ｐ−Ｃ融合タンパクのプラスミドｐＣ２１０ ＳＰ−Ｃからのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。ここで、 ＣＡＴ遺伝子、リンカ−配列および５Ｐ−Ｂ遺伝子は、この配列順に矢印によっ て示される。

第９図は、ＣＡＴ：５Ｐ−Ｃ融合タンパクのそれぞれの分子量の決定を示す。レ ーンＡ−分子サイズ標準品；レーンＢ　＝　ｐＴｒｐ２３３ベクターコントロー ルを含む誘導Ｗ３１１０細胞：レーンＣ＝誘導ｐｃ１０６ｓＰ−Ｃ；　レ−７Ｄ −ｐｃ１４９ｓＰ−Ｃ；　レ−ｙ　Ｅ　＝ｐＣ１７９ＳＰ−Ｃ；およびレ−ンＦ 　＝　ｐｃ２１０ｓＰ−Ｃ。

第１０図は、ｃＤＮＡおよびヒトアジプシン／Ｄのアミノ酸配列を示す。

日を　るための此 Ａ、　１１ 本願で使用される用語「タンパク発現を安定させる」は、組換え宿主細胞による 外来タンパクの分解を阻止するための融合タンパクの特性をさしていう。

タンパクに対して言及される「不溶性」は、タンパクが、界面活性剤またはカオ トロピック剤を用いた抽出によってのみ回収され得る状態をさしていう。通常、 不溶性タンパクは、クローン化された遺伝子生産物の細胞内集合の結果、形成さ れる。

「高度なタンパク発現」または「高められたタンパク発現」は、融合タンパクが 、各細胞によって生産された全タンパクの１０％以上を含み得る、発現レベルを さしていう。高度なタンパク発現レベルの好ましい範囲は、全細胞タンパクの１ ０−２０％である。

本願で使用される「回収され得ない」は、所望のタンパクは、感度の良い技術、 すなわちウェスタンプロット分析を使用して検出され得るが、タンパクが、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ ィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは等 電点電気泳動法のような従来の精製技術を使用すると商業的には回収され得ない 、発現レベルをさしていう。

「哺乳類」は、すべての哺乳類種を指し、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、霊長類 およびヒトを含む。好ましくは、ヒトである。

本願で使用されるように、用語「異種」タンパクは、このタンパクを生産するた めに形質転換された宿主細胞に対して外来のタンパクをさしていう。従って、宿 主細胞は、一般にそれ自身でこのようなタンパクを生産しない。

Ｂ１％コ１含 ＣＡＴは、２１９のアミノ酸成熟タンパクをコードし、遺伝子は、その全長にわ たって、高度なレベルの発現をさせるための遺伝子融合をテストするのに適切な 多数の制限エンドヌクレアーゼ部位（５°−ＰｖｕＩｌ、匡Ｒ１，匣１．独１． および論１−３’　）を含む。これらの制限部位は、本発明のハイブリッド遺伝 子配列の構築を容易にするために使用され得、または遺伝子配列内の他の部位は 、当業者に一般に既知の技術゛を使用して形成され得る。生じたＣＡＴ配列はす べて、生じたＣＡＴ融合体が所望の異種ペプチドの発現を高める能力を保持する 限りにおいて、有用であると考えられる。

本発明の発現構築物においては、ＣＡＴをコードする遺伝子配列の大半、または 所望の異種ポリペプチドをコードする遺伝子と連結されるＣＡＴタンパクのＮ末 端部をコードする配列の、実質的に切形とされた部分が使用され得る。本発明の １つの実施態様においては、融合体のＣＡＴ部分は、ＣＡＴ配列のＮ末端から約 ３分の１までをコードする。

様々な異種タンパクの、高められた発現レベルを示した、本願で例示される発現 構築物においては、サイズが７３個から２１０個のアミノ酸の範囲にわたるＣＡ Ｔタンパクの種々の長さのものが使用される。この７３個のアミノ酸ＣＡＴ融合 成分は、Ｅｃ。

Ｒ１制限部位において、ＣＡＴヌクレオチド配列を消化させることによってうま く形成される。同様に、２１ｏのアミノ酸ＣＡＴ融合成分は、ＣＡＴヌクレオチ ド配列をＳｅａ　ｌで消化させることによって形成される。次いで、これらは、 他のＣＡＴ制限断片と同様に、所望のタンパクの発現を高めるために所望のタン パクをフードするすべてのヌクレオチド配列と連結され得る。

融合タンパクの発現レベル（全細胞タンパクの約ｌ５−２０％）は、ＣＡＴ（１ ０６のアミノ酸）　−５Ｐ−Ｃ融合物およびＣＡＴ（２１０のアミノ酸）−ＳＰ −Ｃ融合物の場合と同様であったが、前者の場合は、実際に、所望の５ｐ−ｃポ リペプチドの発現レベルの著しい増加を示す。なぜなら、前者の場合、５ｐ−ｃ ポリペプチドは、全融合タンパクの実質的に大半部分を構成するからである。

融合ＣＡＴタンパク配列のサイズを減少させることによって所望のポリペプチド の発現レベルを高める能力は、従来技術の経験を考慮しても全く予想外の発見で あった。一般に、従来技術では、細菌のリーダー配列のサイズを減少させても、 それと同時に生じる、融合タンパクの発現レベルのより大幅な減少のために、融 合異種ポリペプチドの生産を高めるには至っていなかった。

１つの例外として、本願で例示される様々なＣＡＴ−異種融合タンパクが、全細 胞タンパクの約１０−２０％の範囲で発現されることが発見された。従って、Ｃ ＡＴ融合体の多面性は、すなわち所望のタンパクの発現を高める能力を有する様 々なＣＡＴをコードする配列を使用する能力によって、ＣＡＴハイブリッド遺伝 子を構築する際に、多大な選択の柔軟性を可能にする。

ヌクレオチド配列をタンパクに翻訳するためのリーディングフレームは、ＣＡ、 Ｔの７ミノ末端部分から始まり、その長さは様々であるが、フレーム内において 発現されるタンパクにまでリンカ−配列を有してまたは有さずに連続し、そして 、該タンパ、りのカルボキシ末端において終止する。酵素によるまたは化学的開 裂部位は、ＣＡＴ配列の下流側に導入され得、ハイブリッドタンパクから開裂し た生産物の回収を可能にする。

このような開裂配列は、開裂が起こり得る条件として、当該技術分野において既 知である。開裂に続いて、所望の異種ポリペプチドが、既知のタンパク精製の技 術を使用して回収され得る。適切な開裂配列には、メチオニン残基に続く開裂（ 臭化シアン）、グルタミン酸残基（エンドプロティナーゼＧｌｕ−Ｃ）、トリプ トファン残基（Ｎ−クロロスクシンイミド、および尿素またはドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）　）ならびにアスパラギンおよびリジン残基の間の開裂（ヒド ロキシルアミン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

ＣＡＴ配列内の内部開裂を避けるために、アミノ酸置換が、従来の部位特異的変 異誘発技術（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ、、およびＳ＋ｅｉｔｈ。

Ｍ、　’（１９８２）、　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１０：６４８７−６５ ００．およびＡｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、Ｐ、、ら（１９８３）、　ＤＮＡ　２：１ ８３−１９３）を使用してなされ得る。これは、変異を起こさせる一末鎖ファー ジＤＮＡと、限られたミスマツチ（それにより所望の変異が起こる）をのぞいて は相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してなされる。

ＣＡＴ発現が優位に影響されないときにこれらの置換がなされ得る。短いＣＡＴ 配列のように、ただ１個の内部システィン残基が存在するところでは、この残基 は、ジスルフィド架橋を介して、重合を減少させるために置換され得る。

Ｃ０臥」１訟Σム久二 原核系は、ＣＡＴ融合記列記載現するのに使用され得る。もちろん、原核宿主は 、クローニング手法に最も適切である。原核生物は、Ｅ、　ｃｏｌｔの様々な菌 株によってもっとも頻繁に示されるが、他の細菌株もまた使用され得る。複製部 位、選択可能マーカーおよび宿主と適合する種由来の制御配列を含むプラスミド ベクターが使用される。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｔは通常、Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇ ｅｎｅ　２：９５　（１９７７）によってＥ、　ｃｏｌｔ種由来のプラスミドで あるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換される。

ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むため 、所望のベクターを構築する際に保持されるかまたは破壊され得る多数の選択可 能マーカーを提供する。

ポリペプチド生産物の開裂および精製を容易にする、上記の修飾に加えて、テト ラサイクリン耐性を供与する遺伝子は、プラスミド選択および維持の代替方法と して、例示されたＣＡＴ融合ベクターに回復され得る。

Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ　トリプトファンプロモーター−オペレーター配列は、本発明 のＣＡＴベクターにおいて例示されているが、異なる制御配列がｍ調節配列に入 れ変えられ得、これも本発明の範囲内であると見なされる。本願で、転写開始の ためのプロモーター、および必要に応じてオペレーターとリポソーム結合部位配 列とを共に含むと定義されていて、一般に使用される原核制御配列は、βラクタ マーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａ ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）、λ由来のＰＬプロモーター（Ｓｈ ｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８　（１９８１））およびＮ− 遺伝子リポソーム結合部位およびｔｒｐ−１ａｃ　（ｔｒｅ）プロモーター系（ ＡｇａｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ、　Ｇｅｎｅ　４０：１Ｂ３　（１９８５）） のような通常使用されるプロモーターを含む。

これらのＣＡＴベクターの一般的使用は、非常に種々の哺乳類ペプチド（タンパ クのサイズ、ジスルフィド結合の有無、および疎水性であるか親水性であるかと いうこと）を使用して確立されているため、独特の制限部位を有するベクターが 形成されるか、または本実施例で例示されるｐＢＲ３２２由来のベクターの代わ りに用いられ得る。

Ｄ、タンパクの ＣＡＴのアミノ末端ＤＮＡ配列は、細菌宿主Ｅ、　ｃｏｌｔ中で高度なレベルの 発現をさせるために、ヒトポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合された。

本願に記載のポリペプチドは、約３０個から７６個の範囲のアミノ酸残基の比較 的小さな哺乳類ポリペプチドである。細菌中で、これらのポリペプチドのそれぞ れを、例えば非融合形態で直接発現させる試みは、成功していない。これは、ｍ ＲＮＡ生産物を翻訳する際に起こるタンパク分解酵素による分解によるものと思 われる。疎水性の強いポリペプチドの場合、β−ガラクトシダーゼ融合体を使用 してそのようなポリペプチドを発現させようとすると、検出は可能であるが、非 常に低レベルの量のタンパクが生産された。

切形のＣＡＴ融合体を使用して、細菌中において十分高いレベルで発現したポリ ペプチドの例には、アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペ プチドＩ５アジプシン／Ｄ。

肺界面活性タンパクＳＰ５　（ＳＰ−Ｃ）および肺界面活性剤５Ｐ１８　（ＳＰ −Ｂ）を含む様々な哺乳類ポリペプチドが含まれる。哺乳類タンパクとしては、 他の起源もまた本発明の範囲内であると見なされるが、゛ヒト起源が好ましい。

Ａ４−７５１は、アルツハイマー　（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病と関連するＡ４ア ミロイドタンパクの前駆体内で同定される５７のアミノ酸配列であり、セリンプ ロテイナーゼ阻害剤のクニフツ（Ｋｕｎｉｔｚ）属と相同性がある（　Ｐｏｎｔ ｅ。

Ｐ、、ら（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２５−５２７；　Ｔａｎｚｊ 、、　Ｒ，Ｅ、ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２８−５３０）　ｏ　 グルカゴン様ペプチドＩ　（ＧＬＰ−１，７−３１）は、インシュリン放出の強 力な刺激体であり、グルカゴン遺伝子中で共にコードされる３１のアミノ酸ホル モンである（　Ｍｏｊ　ｓｏｗ、　Ｓ、ら（１９８７）Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅ ｓ　７９：６１６−６１９）　ａアジプシン／Ｄは、脂肪細胞中で合成されて分 泌されるセリンプロテアーゼである（Ｚｕｓａｌａｋ、に９Ｍ、ら（１９８５） Ｊ　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　５：４１９）。肺界面活性物質５Ｐ−Ｂは、 ７６のアミノ酸疎水性タンパクである。肺界面活性物質５ｐ−ｃは、３５のアミ ノ酸疎水性タンパクである。５Ｐ−８および５Ｐ−Ｃは両方とも、空気と水の界 面において、界面活性リン脂質の拡散を著しく高める。

宿主菌株は、以下のようである。

クローニングおよび配列決定、ならびにほとんどの細菌プロモーターの制御下で の構築の発現には、ＭＣ１０６１、ＤＨＩ、ＲＲＩ、！３１１０、ＭＭ２９４、 ＢＣ６０ｆ）ｈｆｌ、、に８０３、ＨＢｌｏｌ、ＪＡ２２１およびＪＭＩＯＩ（ ７）ようすＥ、　ｃｏは菌株が使用され得る。

Ｆ、二級ｎ亙迭 組換えＤＮＡ方法は、特に以下の実施例において引用されていない場合には、Ｍ ａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇｘＣｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋに記載されているものである。この文 献にはまた、封入体の可視化、封入体の細胞からの単離、次いでハイブリッドタ ンパクの可溶化、精製および開裂方法が記載されている（例えば、ｒｔａｋｕｒ ａ、　Ｋ、、ら（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６−１０６３： 　５ｈｉｎｅ、　Ｊ、、ら（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８５：４５５−４６ １）　ｏ必要に応じて、タンパク生産物を再び折りたたんだ状態とする方法も得 られる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　 Ｇｅｎｅｘ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｎ＋ｐｏｓｉｕｍ、　１９８５．　Ｋｉｎｇｓｔｏ ｎｅｓ　（印刷中）。これらの引例のすべての教示を本願に参考のために取り入 れる。

実Ｊｌ性 １、　Ｅ、　ｃｏｌｔにおけるクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラ ーゼ−ヒト心　ナトリウム　ペプチドハイブリッド　ンパクの Ａ、及３こ濠−り二郵狙肛上１ 発現ベクターｐｃｈＮＦ１０９は、エンドブロティナーゼＧｌｕ−Ｃタンパク分 解酵素開裂部位を含む２４１のアミノ酸ＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブリッドタンパク をコードする（第１図）。大抵のＣＡＴ遺伝子（アミノ酸１個−２１０個）は、 フレーム内においてリンカ−配列（５個のアミノ酸）を介してり、ＡＮＰ　（１ ０２−１２６）遺伝子および開裂部位（２６個のアミノ酸）と結合されている。

ｈＡＮＰポリペプチドは、約１０％のハイブリッドタンパクを含む。このベクタ ーは、プラスミドｐＴｒｐ２３３、ｐｃＡＴ２１、およびｐｈＮＦ７５から構築 された。

これらのプラスミドは、プラスミドバプクボーンおよびｔ■プロモーター−オペ レーター；　ＣＡＴ遺伝子；ならびにｈＡＮＰ　（１０２−１２６）遺伝子およ び開裂部位をそれぞれ供給する。

１、匹巨■姐玄１笈 プラスミドｐＴｒｐ２３３を、Ｅ、　ｃａｌｆ　、Ｌ！Ｊプロモーター−オペレ ーター配列、リポソーム結合部位および下流のクローニング部位を含む合成Ｅｃ ｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片を、強力な転写終止シグナル、ＴＩＴ２およびβ−ラクタ マーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＨ２３３−２−Ｎｄｅｌに挿入することによっ て構築した。合成断片（第２Ａ図参照）は、Ｖｌａｓｕｋら（１９８６）　、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋＊　２６１：　４７８９−４７９６の方法およびＳａｎ ｇｅｒら（１９７７）　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７ ４：５４６３−５４６７の方法によって確認されたＭ１３ｍｐ８およびＭ１３ｍ ｐ９内の配列を使用することによって組み立てられた。プラスミドｐＫＫ２３３ −２−Ｎｄｅｌ　（１９８５年５月８日に出願され、本願で参考として取り入れ た同時係属中の米国特許出願第７６６、０３０号において開示されている）をＥ ｅｏＲｌおよびシ±■で消化させ、その末端を仔つシ腸ホスファターゼを使用し て脱リン酸化して、合成ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片と連結した。プラスミドｐＴ ｒｐ２３３を、アンピシリン耐性に形質転換したＥ、　ｃｏｌｔ　ＪＡ２２Ｌか ら単離した（第２Ｂ図）。

プラスミドｐｃＡＴ２１は、ＣＡＴ遺伝子（トランスポゾンＴｎ９、ム１ｔｏｎ およびＶａｐｎｅｋ、　（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：１１６４−８６ ９からの）を江２プロモーターーオペレーターの制御下でプラスミドｐＴｒｐ２ ３３に挿入することによって構築した。プラスミドｐＡＬＬ３ＡＴＣＡＴ　（１ ９８７年９月１１日に出願され、本願で参考として取り入れた１時係］、中の米 国特許出願第０９５．７４２号に開示されているプラスミド）を、±１およびＨ ｉｎｄｌｌ［で消化し、ＣＡＴ遺伝子を（回が部位においてコードされる開始Ｍ ｅｔ残基と共に）含む約７５０　ｂｐのＮｄｅＩ−Ｈｔｎｄｌｌｌ断片を、アガ ロースゲル電気泳動法を使用して精製した。ＣＡＴ遺伝子をＴ４ＤＮＡリガーゼ を使用してＮｄｅｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化したｐＴｒｐ２３３と連結した 。旦、刈旦ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎら（１９８０）、　Ｉ　Ｍｏｌ　 Ｂｉｏｌ　１３８：　１７９−２０９）アンピシリン耐性形質転換体から、プラ スミドｐｃＡＴ２Ｌを単離した（第２Ｃ図）。

プラスミドｐｈＮＦ７５は、タンパク分解酵素開裂部位によって先行される合成 ｈＡＮＰ遺伝子をプラスミドｐＢｇａｌに挿入することによって構築された（Ｓ ｈｉｎｅら（１９８０）、Ｎａｔｕｒｅ　２８５：４５６）。８つのオリゴデオ キシリボヌクレオチド（第２Ｄ図）を、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ開裂部 位によって先行される合成ｈＡＮＰ　（１０２−１２６）遺伝子に組み込んだ（ ’／１ａｓｕｋら（１９８６）の方法、前出）。合成りＮＡ断片（５′にＥｃｏ ＲＩテールおよび３′に平滑末端を有する）を、ＤＮＡ配列決定の目的でＴ４Ｄ ＮＡリガーゼを使用して、ＥｃｏＲｌおよびＳｍａｌ制限エンドヌクレアーゼで 消化したＭ１３ｍｐ１９に連結した（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）の方法、前出 ）。適切な配列、すなわちＭ２Ｓ−ｈＮＦ７を有するクローンを、醜！旧および ｍＩｒで消化し、ｈＡＮＰ遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動法で精製 し、その断片を、随旧で消化して細菌アルカリホスファターゼで脱リン酸化した ｐＴｒｐ２３３にＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。ｈＡＮＰ遺伝子の３ ′末端に隣接してＨｉｎｄｌ　ｌＩｓ　Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲ１部位を与える ような方間に挿入物を有するプラスミド、ｐｈＮＦ？３を、Ｈｔｎｄｌｌ！およ びＰｖｕ［で消化することによって生成する断片のサイズによって同定した。プ ラスミドｐｈＮＦ７３をＥｃｏＲＩで消化し、ｈＡＮＰ遺伝子をポリアクリルア ミドゲル電気泳動法を使用して精製し、この遺伝子を、ＥｃｏＲｌで消化して細 菌アルカリホスフォターゼで脱リン酸化したプラスミドｐＢｇａｌに連結した。

Ｅ、　ｃｏｌｉＭｃ１０６１アンピシリン耐性形質転換体から、プラスミドｐｈ ＮＦ７ｓ　（５１４２Ｅ図）を、匡１および±ｄｌｌ＋で消化することによって 生成したＤＮＡ断片のサイズによって同定した。

発現ベクターｐｃｈＮＦ１０９は、ＣＡＴ、　ｈＡＮＰオヨヒ９　ンハク分解！ 素開裂部位を含むＤＮＡ断片ならびにリンカ−配列をプラスミドｐＴｒｐ２３３ に挿入することによって構築した。プラスミドｐｈＮＦ７５をＥｃｏＲｌおよび Ｈｉｎｄｌｌｌｒ消化し、ｈＡＮＰを含む約８０　ｂｐ（７）ＥｃｏＲ［−Ｈ１ ｎｄｌｌｌ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製し、Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼを使用して、馳旦Ｒ１および旧ｎｄｌｌ■で消化したｐＴｒｐ２３３ に連結した。プラスミドｐｈＮＦ８７をＥ、　ｃａｌＬ　ＭＣ１０６１アムビシ リン耐性形質転換体から単離してシ１■で消化し、その断片を細菌アルカリホス ファターゼを使用して脱リン酸化した。ｐｃＡＴ２Ｌを５ｅａｌで消化させ、　 ＢａｔｅＨＩ合成リンカ−（５°−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３°）をＴ４　ＤＮＡリ ガーゼを使用して平滑末端に付着させ、その連結物をジ！旧で消化し、アガロー スゲル電気泳動法によって７４０　ｂｐの抛旧断片を精製させることによって、 ｍプロモーター−オペレーター、リポソーム結合部位およびＣＡＴ遺伝子の大き いアミノ末端断片を含むｂ！旧カセットが生成した。このＢａａ旧カ上カセツト びプラスミドｐｈＮＦ８７を、Ｔ４リガーゼを使用して連結させ、アンピシリン 耐性形質転換体、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１６１を得た。ＣＡＴ遺伝子がフレーム 内においてエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ開列部位に融合し、それにｈＡＮＰ 遺伝子が続くような方向性を有するシ１旧カセットを持つ、プラスミドｐｃｈＮ Ｆ１０９　（第２Ｆ図）を、該プラスミドのＥｃｏＲＩ消化物中のＤＮＡ断片の サイズに基づいて選択した。

２、プラスミドＣｈ　ＮＦ　ｔｏ　９から１７）ＣＡＴ　１−２１０−ｈＡＮＰ 　１０２−１２６　バイブ１ツド　ンパクの プラスミドｐｃｈＮＦ１０９は、Ｅ、　ｃｏｌｆ　ｔｇ４プロモーター−オペレ ーターの制御下でＣＡＴ−ｈＡＮＰ（１０２−１２６）ハイブリッドタンパクを 発現する。このプラスミドを使用してＥ、　ｃｏｌｉ　Ｗ３Ｌ１０　（ＡＴＣＣ 受託番号第２７３２５号）を形質転換してアンピシリン耐性とし、１ツノコロニ ーヲ、Ｍ９（７）塩、２　ｍＭノＭｇ５Ｏ４，０，１ｍＭノｃａｃ１２．０９４ ％のグルコース、０．５％のカザミノ酸、４０　ｕｇ／＋ａｌのトリプトファン 、２　ｕｇ／＋１の塩酸チアミンおよび１００　ｕｇｌｏｌの硫酸アンピシリン を含むＭ９の完全培地中で一晩３７°Ｃで培養した。−晩装置した培養物を上記 と同様のＭ９の培地中に１００倍に希釈しく非誘導培養物）、そして、トリプト ファンを２５　ｕｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸によって置換したＭ ９の培地中に１００倍希釈した（誘導培養物）。

この培養物を３７０Ｃで６時間振り浸した後、評価した。非誘導培養物は、高い 細胞密度（定常期）に達していたが、誘導培養物は、低い細胞密度（対数期）で あった。位相差顕微鏡により、非誘導培養物においては、通常形態の細胞が示さ れ、誘導培養物においては、いくつかの屈折性封入体を含む細長い細胞が示され た。細胞ベレットを、ラエムリ（１，ａｅｒａｒｓｌｉ）１１衝液中で５分間沸 騰させることによって全細胞タンパクサンプルを調製し、１２％の５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲルによる電気泳動法、次いでこのタンパクをクーマシーブルー で染色することによって分析した。

Ｂ、茜１と一乙又ニ上島呈巳刀。

発現ベクターｐｃｈＮＦ１２＋は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃタンパク分 解酵素開裂部位を含む９９のアミノ酸ＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブリッドタンパクを コードする（第４Ａ図）。ＣＡＴ遺伝子の約３分の１（アミノ酸１−７３）が、 介入するリンカ−なしでｈＡＮＰ　（１０２−１２５）およびタンパク分解酵素 開裂部位（２６のアミノ酸）に融合した。ｈＡＮＰポリペプチドは、ハイブリッ ドタンパクの２５％を含む。このベクターは、プラスミドｐｃｈＮＦ１０９およ びｐｈＮＦ８７から構築された。これらのプラスミドは、ＣＡＴ遺伝子のアミノ 末　一端断片およびｈＡＮＰ遺伝子、ならびにタンパク分解酵素開裂部位をそれ ぞれ供給する。

（以下余白） １、四囲ＩＦ１２１（耐ｉ艮 プラスミドｐｈＮＦ８７をＥｃｏＲｌで分解し、その末端を細菌性アルカリフォ スファターゼにより脱リン酸化し、そしてｔｒｐブロモ・−ター・オペレーター と、リボゾーム結合部位と、ＣＡＴ遺伝子のアミノ末端部分とを有する。約３２ ０ｂｐの■旦Ｒ１断片に連結した。このＥｃｏＲＩカセットは、アガロースゲル 電気泳動法を用いて、ｐｃｈＮＦ１０９のＥｃｏＲＩ分解物から精製された。プ ラスミドｐＣｈＮＦ１２１（第２図Ｇ）は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のアン ピシリン耐性形質転換体から単離された。Ｐｖｕ　ｌ　Ｉ分解物由来のＤＮＡ断 片のサイズに基づいて、ＣＡＴ遺伝子およびｈＡＮＰ遺伝子は、フレーム内で融 合しており、ハイブリッドタンパクを生産すると推定された。

２、プラスミドＣｈＮＦ２１か゛のＣＴ　−７３−ｈＡＮＰ　１０２−１０６ハ イブリツドタンパクの発 プラスミドｐｃｈＮＦ１２１は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｆｉプロモーター・オペレータ ーの制御下で、ＣＡＴ−ｈＡＮＰ（１０２−１２６）ノ１イブＩルノドタンノｔ りを発現する。このプラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１ＬＯ（原栄養株 、ＴｒｐＲ＋）をアンピシリン耐性に形質転換させ、１つのコロニーを、完全Ｍ ９培地（Ａ、２節を参照）中で、３７°Ｃにて一晩培養した。−晩培養した物を 、完全Ｍ９培地中（非誘発培養物）、および４０μｇ／ｍｌのトリプトファンに 代えて２５μｇ／ｌ１ｌｌの３−β−インドールアクリル酸を用いたＭ９培地中 （誘発培養物）へ１００倍に希釈した。

培養物を３７°Ｃにて６時間振盪した後で９発現の評価を行った。非誘発培養物 は高い細胞密度に達していたが、誘発培養物の密度は、この密度の約１７３にと どまった。位相差顕微鏡を用いると、非誘発培養物には正常な形態の細胞が見ら れ、誘発培物には、いくつかの屈折性封入体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｆｎｃｌ ｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）を有する細長い細胞が見られた。すべての細胞タンパク試 料は、細胞ペレットを、ラエムリ（Ｌａａｍａ＋ｌｉ）緩衝液中で、５分間沸騰 させることにより調製され、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを泪いた電 気泳動にかけた後、クーマシー・ブルー　（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）で タンパクを染色することにより１分析発現ベクターｐｃｈＮＦ１４２は、９９ア ミノ酸のＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブリッドタンパクをコードする。このタンパクは 、ＣＡＴタンパクのアミノ酸残基７３に続く唯一のＴｒｐ残基を、化学的開裂部 位として有している。ＣＡＴ遺伝子のほぼ１／３（アミノ酸１−７３）が、ｈＡ ＮＰ（１０２−１２６）遺伝子および化学的開裂部位（２６アミノ酸）と融合し ている。ＣＡＴにおけるこのアミノ末端断片は、Ｔｒｐ［１６］をＴｙｒ残基で 置換し、Ｃｙｓ［３１］をＳｅｒ残基で置換するように改変されている。これは 、付加的な化学的開裂部位を取り除き、ジスルフィド架橋によるハイブリッドタ ンパクの多量体化を低減するためである。Ｔｒｐ残基をコードする配列が先行す る合成ｈＡＮＰ遺伝子が、このベクター用に構築された。

１、匹■■旦旦盈築 プラスミドｐＴｒｐ２３３をＥｃｏＲｌで分解し、その末端をＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ、クレノー（Ｋｌｅｎｏｖ）断片で埋め、（ＥｃｏＲＩ制限 エンドヌクレアーゼ開裂部位を除去するために）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて 連結した。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｍ（ＪＯ６１のアンピシリン耐性形質転換体から、プ ラスミドｐＴｒｐ８１を単離したところ、ＥｃｏＲｌによる開裂に耐性を示した 。プラスミドｐＴｒｐ８１を、ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで分解し、アガロ ースゲル電気泳動法により精製し。

そして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて９合成ＣＡＴ遺伝子断片に連結した。合成 Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄｌｌ［ＣＡＴ遺伝子断片（第２図Ｈ）は、前述の３組のオリ ゴデオキシリボヌクレオチドから構築された。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のアンピシリン耐性形質転換体から、プラスミド匹 ＡＴ１２７を単離した。また、ＥｃｏＲ［およびム１！で分解することにより２ 合成ＣＡＴ断片を有することが示された。このプラスミドを、Ｂａｎ＋ＨＩおよ びＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで分解した。ＣＡＴを含むシュ旧−臣１ｎｄｌｌｌ断片を 、アガロースゲル電気泳動法により精製し、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）（前出 ）の方法で配列決定することにより、正しいＤＮＡ配列を確認した。

プラスミドｐｃＡＴ１２７を、七旦Ｒ１および旧ユｄｌＩ＋で分解し、Ｔ４ＤＮ Ａ　！、Ｉガーゼを用いて、ＥｃｏＲ［−旧ｎｄｌ１１断片においてＴｒｐ残基 が先行しているｈＡＮＰ（１０２−１２５）をコードする１組のアニールされた 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドと連結した。プラスミドｐｃｈＮＦ１４２ （第２図■）を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のアンピシリン耐性形質転換体か ら単離した。ｈＡＮＰの挿入は、このプラスミドのＢａｎ旧およびＨｉｎｄｌｌ １分解物中におけるＤＮＡ断片のサイズによって確認された。ｈＡＮＰ遺伝子の 配列は、ｐｃｈＮＦ１４２から、ＥｃｏＲ［−５ｅａｌアガロ一スゲル精製断片 によって確認された。

２、ＣＡＴ　１−７３　Ｔ　ｒ　１６　Ｓｅｒ　１３−ｈＡＮＰ　１０２−１２ ６　ＣｈＮＦ１４２の。

１里 改変されたＣＡＴ−ｈＡＮＰ（１０２−１２６）バイブリドタンパクの発現は。

上記実施例Ａ、２およびＢ、２の教示内容に実質的に従って実施される。

■９　クロームフェニコールアセチルトランスフェラーゼ−アミロイドＡ４タン パク−人　Ａ４−７Ｓ１ｉからなるハイブリッドタンパクのＥ、　ｃａｌ　ｉ　 における全以下の実施例では、アミロイドＡ４−７５１タンパク内への５７アミ ノ酸挿入物による高レベルの発現は、　ｐＢＲ３２２由来プラスミド上で、Ｅ、 ｃｏｌｉ）リプトフアンプロモーター・オペレーターの制御下で９合成Ａ４−７ ５１ｉ遺伝子をＣＡＴのアミノ末端断片をコードするＤＮＡ配列に融合させるこ とにより達成された。合成Ａ４−７５１ｉ遺伝子は、化学的開裂部位Ａｓｎ−Ｇ ｌｙが先行している。アミロイドＡ４−７５１タンパク由来の２８９−３４５ア ミノ酸をコードする（Ｐｏｎｔｅら（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２ ７）。これら２つの残基間における。このハイブリッドタンパクのヒドロキシル アミン開裂により、アミノ末端にｃｔｙ残基を有する挿入タンパクが得られる。

Ａ０発現ベクターＣＡＰｉ１３２ 発現ベクターｐｃＡＰｉ１３２はヒドロキシルアミンで開裂する部位を有する１ ３２アミノ酸のＣＡＴ−Ａ４７５１ｉハイブリツドタンパクをコードする（第４ 図Ａ）。ＣＡＴ遺伝子のアミン末端部分の約１７３（アミノ酸１−７３）が、Ａ ４−７５１ｉ遺伝子および解裂部位（５９アミノ酸）とフレーム内で連結されて いる。Ａ４−７Ｓｌｉタンパクは、このハイブリッドタンパクの約４３％を占め る。このベクターは。

プラスミドｐＴｒｐＺ３３およびｐｃｈＮＦ１２１と９合成Ａ４−７５１　ｉ遺 伝子および開裂部位とから構築された。

１・　匹肚■旦旦！且 プラスミドＩ）Ｔｒｐ２３３を、七旦Ｒ１およびＨｉｎｄ［ＩＩで分解し、アガ ロースゲル電気泳動法により精製し、モしてＡ４−７５１ｉタンパクをコードす る合成遺伝子および開裂部位と、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この 遺伝子は、上記の方法を用いて、６つのオリゴデオキシリボヌクレオチドから構 築し、その配列を確認した（第４図Ａ）。プラスミドｐＡＰｉ１３１を、Ｅ、ｅ ｏｌｉ　ＭＣｌ０６１のアンピシリン耐性形質転換体から単離した。合成遺伝子 の挿入は、プラスミドのミニプレツブ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）ＤＮＡのＰｖｕ　 ｌおよびＢａｍ旧分解物に由来するＤＮＡ断片のサイズにより確認された。

プラスミドｐＡＰｉ１３１をＥｃｏＲＩで分解して、ベクターを線状化し、そし てその末端を細菌性アルカリフォスファターゼで脱リン酸化した。プラスミドｐ ｃｈＮＦ１２１をＥｃｏＲＩで分解し、ｔＸｉプロモーター・オペレーターと、 リボンーム結合部位と、ＣＡＴ遺伝子のアミノ末端部分くアミノ酸１−７３）と を有する約３２０ｂｐの旦ｃｏＲＩ断片を、アガロースゲル電気泳動法により精 製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、このＥｃｏＲＩカセットをｐＡＰｉ１３ １プラスミドと連結し、ＭＣ１０６１のアンピシリン耐性形質転換体を得た。

ミニプレツブプラスミドＤＮＡのＰｖｕＩＩ分解物中におけるＤＮＡ断片のサイ ズに基づき、ＣＡＴ配列およびＡ４−７５１ｉ配列がフレーム内で融合したプラ スミドＰＣＡＰｉ１３２を単離した。

２、プラスミドＣＡＰｉ１３２からのＣＡＴ（Ｌ−７３−Ａ４−７５１ｉハイブ リツドタンパクの発 プラスミドｐｃＡＰｉ１３２は＊　Ｌ」Ｌ、ｔｘｘプロモーター°オペレーター の制御下で、ＣＡＴ−Ａ４−？５１ｉハイブリッドタンパクを発現する。このプ ラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換し 、１つのコロニーを完全Ｍ９培地中で３７℃にて一晩培養した。−晩培養した物 を、４０μｇ／ｍｌのトリプトファンを含む完全Ｍ９培地中（非誘発培養物）、 およびトリプトファンの代わりに２５μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル 酸を含む完全Ｍ９培地中（誘発培養物）へ１００倍に希釈した。

培養物を３７℃にて６時間振盪した後２発現を評価した。非誘発培養物は高い細 胞密度に達していたが、誘発培養物の細胞密度は低かった。位相差顕微鏡を用い ると、非誘発培養物には正常な形態の細胞が見られ、誘発培養物には「前封入体 （ｐｒｅ−ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）Ｊを冑する細胞が見られた。ここで 用いられるように、　「前封入体」とは、ハイブリッドタンパクが細胞内に蓄積 するにつれて、やがてより屈折性の高い「封入体」へ変化すると思われる。より 屈折性の低いものとして定義される。すべての細胞タンパク試料は、細胞ペレッ トを。

ラエムリ緩衝液中で、５分間沸騰させることにより調製され。

１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にかけた後、クーマシ ー・ブルーで染色することにより１分析された（第３図Ａ）。このＣＡＴ（１− ７３）−Ａ４−７５１ｉハイブリツドタンパクは。

このゲル上を、リゾチーム（分子量１４．３００）タンパク標準物と。

β−ラクトグロブリンく分子量１１１．４ＱＱ）タンパク標準物との間に移動す る。コンテス（Ｋｏｎｔｅｓ）の光フアイバースキャナおよびヒユーレット・パ ラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）のインテグレータを用いて、この ゲルを走査することにより、全細胞タンパクの約７％がハイブリッドタンパクで あると見積られた。こトタンバクのほぼ半分がＡ４−７５１ｉである。

ハイブリッドタンパク中におけるＡ４−７　Ｓ　ｌ　ｉの存在を確認するために 、これらタンパク試料について、非染色１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル を用いたウェスタン・プロット分析を行った。タンパクはニトロセルロースにプ ロットされ、抗−Ａ４７５１ｉ血清（５７アミノ酸挿入タンパクのうち、アミノ 酸１１−２６を有する１６アミノ酸からなる合成ペプチドに対して調製された） と共にインキュベートされた。１２ｓＩ−タンノイクＡ（アメルシャム（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ）　）と共にインキュベートした後、プロ・ットを、−７０°Ｃにて 数日間、Ｘ線フィルム上に載せた。合成ペプチド抗血清により、ハイブリッドタ ンパクおよび他のいくつかのＥ、ｃｏ目タンパクが検出された。

Ｂ０発現ベクターＣＡＰｉ１３６ 発現ベクターｐｃＡＰｉ１３６は、ヒドロ半ジルアミン開裂部位を有する２７４ アミノ酸ＣＡＴ−Ａ４−７５１ｉノ１イブ１ルツドタンノイクをコードする。Ｃ ＡＴ遺伝子（アミノ酸１−２１０）の大部分は、リンカ−配列（５アミノ酸）を 介して、　Ａ４−７Ｓ１ｉ遺伝子および開裂部位（５９アミノ酸）にフレーム内 で連結されている。Ａ４−７５１ｉポリペプチドは、ハイブリッドタンパ゛りの 約２１％を占める。このベクターはプラスミドｐＡＰｉ１３ｉおよびｐｃｈＮＦ １０９から構築された。

１、匹が）ｉ１３６（配置互 プラスミドｐＡＰｉ１３１をＥｃｏＲＩで分解して、ベクターを線状化した。そ の末端は細菌性アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。ｐｃｈＮＦ １０９の部分的ＥｃｏＲＩ分解物から、患プロモーター・オペレーターを含む約 ７４０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片と、ＣＡＴ遺伝子（アミノ酸１−２１０）と、リン カ−配列とを、アガロースゲル電気泳動法により精製した。このＥｃｏＲ［カセ ットおよびベクターｐＡＰｉ１３１を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、 Ｅ、ｃｏｌｉＭＣ１０６１のアンピシリン耐性形質転換体を単離した。ジ１旧で 分解したプラスミドのミニプレツブ中のＤＮＡ断片のサイズから。

フレーム内にＣＡＴ遺伝子および合成Ａ４−７５Ｌｉ遺伝子を有するプラスミド ｐｃＡＰｉ１３６を単離した。

２、プラスミドＣＡＰｉ１３６か゛のＣＡＴ　ｌ−２１０−Ａ４−７５１ｉハイ ブリツドタンパクの発現 プラスミドｐｃＡＰｉ１３６は、Ｌμ江り１組プロモーター・オペレーターの制 御下で、ＣＡＴ−Ａ４−７５１ｉハイブリツドタンパクを発現する。このプラス ミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換させ、 １つのコロニーを、完全なＭ９培地中で、３７℃にて一晩培養した。−晩培養し た物を、同じＭ９培地中（非誘発培養物）、およびトリプトファンに代えて２５ μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸を含むＭ９完全培地中（誘発培養物 ）へ１００倍に希釈した。

培養物を３７℃にて６時間振盪した後２発現の評価を行った。

非誘発培養物および誘発培養物のいずれもが高い細胞密度に達していた。位相差 顕微鏡を用いると、非誘発培養物には正常な形態の細胞が見られ、誘発培養物に は封入体または前封入体（Ｓｏ’：　５０）を含有する細胞が見られた。すべて の細胞タンパク試料は、細胞ベレットを、ラムエ緩衝液中で、５分間沸騰させる ことにより調製され、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動 にかけた後、クーマシー・ブルーで染色することにより２分析された（第３図Ａ ）。このＣＡＴ−Ａ４−７５１ｉハイブリツドタンパクは、このゲル上を、α− キモトリプシノーゲン（分子量２５．７００）タンパク標準物と、オバルブミン （分子量４３，０００）タンパク標準物との間にを移動する。コンテスの光フア イバースキャナーおよびヒューレ、ｙ　ｈ・バラカードのインチグレーターを用 いて、このゲルを走査したところ。

ハイブリッドタンパクは全細胞タンパクの約１５％を占めると見積られた。これ は＋　Ｅ、ｃｏｌｉとしては、やや高いレベルの発現である。

ハイブリッドタンパク中におけるＡ４−７Ｓｌｉの存在を確認するために、これ らタンパク試料について、非染色１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用い たウェスタン・プロ・ソト分析を行った。上記の方法（ＩＩＳ、　Ａ、２）を用 いたところ１合成ペプチド抗血清により、ハイブリッドタンパクおよび他のいく つかのＥ、　ｃｏｔ　ｆタンパクが検出された。

■、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ−グルカゴン　ペプチド ｌ７−３７からなるハイブリッドタンパクのＥ、ｃｏｌｉ内における発 以下の実施例では、３１アミノ酸ＧＬＰ−１（７−３７＞の高レベル発現が、ｐ ＢＲ３２２由来のプラスミド上において、［：、ｃｏｌｉｈリブトフアンプロモ ーター・オペレーターの制御下で、ＣＡＴのアミノ末端断片をコードするＤＮＡ 配列に合成ＧＬＰ−１遺伝子を融合させたることにより達成された。この合成遺 伝子は、Ｍｅｔ残基が先行するＧＬＰ−１のアミノ酸７−３７をフードする（Ｍ ｏｊｓｏｖら（１９８７）、　Ｊ。

ＣＨｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　７９：６１６−６１９＞。シアノーゲンブｏｖイドで処 理すると、インシュリン性ペプチドが放出される。

Ａ、　ベクターＣＧＬＰ１３９ 発現ベクター匹ＧＬＰ１３９は、シアノーゲンブロミド開裂部位を有する１０５ アミノ酸ＣＡＴ−ＧＬＰ−１ハイブリツドタンパクをコードする（第４図Ｂ）。

ＣＡＴ遺伝子のアミン末端部分の約１／３（アミノ酸１−７３）は、ＧＬＰ−１ 遺伝子および開裂部位（３２アミノ酸）にフレーム内で連結されている。ＧＬＰ −１ペプチドはノ＼イブリッドタンパクの約３０％を占める。このベクターは、 プラスミドｐＴｒｐ２３３およびｐｃｈＮＦ１０９と１合成ＧＬＰ−］遺伝子お よび開裂部位から構築された。

１、匹匹■摺立皇且 プラスミドｐＴｒｐ２３３をシ辺Ｒ■およびＨｉｎｄｌｌｌで分解し、アガロー スゲル電気泳動法により精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて合成遺伝子に連結 した。この遺伝子は４つのオリゴデオキシリボヌクレオチドから構築されており 、その配列も確認されている（第４図Ｂ）。Ｅ、ｅｏＬｉ　ＭＣ１０６Ｌのアン ピシリン耐性形質転換体から、プラスミドｐＧＬＰ１３８を単離した。合成遺伝 子の挿入は、プラスミドミニ、ブレツブＤＮＡがＰｓｔｌで切断されないことに より確認された。

プラスミドｐＧＬＰＬ３８をＥｅｏＲＩで分解して、ベクターを線状化し、その 末端を細菌性アルカリフォスフォターゼで脱リン酸化し、そしてＴ４　ＤＮＡリ ガーゼを用いて、プラスミドｐｃｈＮＦ１０９由来の）：ｃｏＲＩカセットど連 結した。プラスミドｐｃｈＮＦ１０９は、旦ｃｏＲＩで分解され、ｔＸＪＬプロ モーター・オペレーターと、　リポソーム結合部位と、ＣＡＴ遺伝子のアミノ末 端断片とを有する約３２０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片はアガロースゲル電気泳動法に より精製されていた。プラスミドｐｃＧＬＰ１３９は、Ｍ（ＪＯ６１のアンピシ リン耐性形質転換体から単離された。プラスミド・ミニブレ・ノブＤＮＡのＡｖ ａｌおよび５■分解物におけるＤＮＡ断片のサイズに基づいて。

ＣＡＴ配列およびＧＬＰ−Ｉ配列がフレーム内で融合されていることが確認され た。

２．２′ラス　ミ　ド、Ｊ？ＣＧＬ２１３［芭」乏ヱと旦酊Ｕ二１１Σ二引」シ 」Ａユニ１ムし／％４ブリ１ドタンニｌ］すζ１ プラスミドｐｃＧＬＰ１３９は、）：、ｃｏｌｉ封上プ口上プロモーターレータ ーの制御下で、ＣＡＴ−ＧＬＰ−１／）イブリ・ツドタンノイクを発現する。こ のプラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３０００をアンピシリン耐性に形質転 換させ、１つのコロニーを完全Ｍ９培地中で３７℃にて一晩培養した。−晩培養 した物を、４０μｇ／ａ＋　１のトリプトファンを含む完全Ｍ９培地中（非誘発 培養物）２　およびトリプトファンに代えて２５μｇ／ｍｌの３−β−インドー ルアクリル酸が用いられている完全Ｍ９培地中（誘発培養物）へ１００倍に希釈 した。

培養物を３７℃に−〔６時間振盪した後２発現の評価を行った。

非誘発培養物は高い細胞密度に達していたが、誘発培養物の細胞密度は低かった 。位相差顕微鏡を用いると、非誘発培養物には正常な形態の細胞が見られ、誘発 培養物には３つまたはそれ以上の屈折性封入体を育する細長い細胞が見られた。

すべての細胞タンパク試料は、細胞ベレットを、）ムエリ緩衝液中で、５分間沸 騰させることにより調製され、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた 電気泳動にかけた後、クーマシー・ブルーで染色することにより分析された（第 ３図Ｂ）。

このＣＡＴ（１−７３）−ＧＬＰ−１（１−７３）ハイブリッドタンパクは、ウ シ・トリプシン阻害因子（分子＠　６．　Ｚｏｏ）タンパク標準物と、リゾチー ム（分子ｊ！１４，３００）タンパク標準物との間に移動する。コンテスの光フ アイバースキャナーおよびヒユーレット・パラカードのインチグレーターを用い て、このゲルを走査することにより、ハイブリッドタンパクは全細胞タンノ寸り の約２０％を占めていると見積られた（細胞ごとに観察される封入体の数を考慮 すると、ハイブリッドタンパクのすべてがラムエリ緩衝液に可溶化されないので 、これは過小評価であり得る）。これは、Ｅ、ｃｏｌｉにとっては、高レベルの 発現である。

ハイブリッドタンパクの分子量は、この遺伝子融合により予想されたとおりであ る。精製されたハイブリッドタンパクのアミノ酸組成分析、あるいはシアノーゲ ンブロマイド開ｆｆ後のペプチドのタンパク配列決定を行えば、その発現を確認 することができる。

■、ヒト５Ｐ−Ｂおよび５ｐ−ｃとのＣＡＴＡ成熟形態のヒｌ−’５Ｐ−Ｃおよ び５Ｐ−Ｂは、いずれも細菌性ＣＡＴの一部との融合物として発現される。界面 活性因子ペプチドは。

ヒドロキシルアミンに鋭敏なアスパラギン−グリシン結合により、ＣＡＴ配列の カルボキシ末端に連結されている。ＣＡＴ−界面活性因子の融合物は、細菌性ベ クターｐＴｒｐ２３３のトリプトファンプロモーターから発現される。

Ａ、　ベクター　Ｃ２１０ＳＰ−Ｂ ＳＰ−Ｂ発現ベクターｐｃ２１０ｓＰ−Ｂは、ヒドロキシルアミンに鋭敏な開裂 部位を有する７アミノ酸のリンカ−を介して、ＣＡＴの２１Ｏアミノ酸が５Ｐ− Ｂの７６アミノ酸に連結されている２９３残基の融合タンパクをコードする。ヒ ドロキシルアミンで融合物ヲ開裂させると、５Ｐ−Ｂの７６残基成熟型と、アミ ン末端のグリシン残基とを有する７７アミノ酸の５Ｐ−Ｂ生成物が放出される。

ｐｃ２１０ｓＰ−Ｂを構築するために、ＡＮＦ配列を有する短いＥｃｏＲ［−Ｈ １ｎｄｌｌｌセグメントを、ｐｃｈＮＦ１０９から取り除き、ヌクレオチド（ｎ ｔ）６４３（第６図）のム１１部位から、ｎｔ８０４の進止１部位に延びるヒト ５Ｐ−Ｂ　ｃＤＮＡ　＃３の一部と置換した。ＥｃｏＲ１部位は、２つの相補的 オリゴヌクレオチドを介して、Ｐｓｔ１部位で連結されている。これらのオリゴ ヌクレオチドは、ヒドロキシルアミンに鋭敏な開裂部位と、成熟５Ｐ−Ｂのアミ ノ末端残基とをコードしている（すりゴ＄２３０７＋５−ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＣ Ｇ　ＧＴＴ　ＴＣＣＣＣＡ　ＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＧＧ ＣＴＣＴ　ＧＣＡ−３°およびオリゴ＃２３０８：５−ＧＡＣＣＣＡ　ＧＣＡ　 ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣＧＴＴ　Ｇ −３°）。黴１部位は、第２組の相補的ヌクレオチドを介して、ＰＴｒｐ２３３ のＨｆｎｄｌ！１部位に連結している。これらのヌクレオチドは、成熟５Ｐ−Ｈ のカルボキシ末端残基をコードしている（オリゴ、ｔ３３１３：５’−ＡＧＣＴ ＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ 　ＧＧＧ　ＣＡＧＣＡＴ　Ｇ−３°およびオリゴ３３３１４：Ｓｏ−ＣＴＧ　Ｃ ＣＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＴＣ，ＣＴＣＣＧＧ　ＴＡ− ３°）。

この発現プラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ染色Ｗ３１１Ｑをアンピシリン耐性 に形質転換させた。Ｍ９培地中で急速に増殖しているｐｃ２１０ｓＰ−Ｂ／Ｗ３ １１０の培養物に、２５μｇ／ｍ　ｌの！ＡＡ（３−β−インドールアクリレー ト、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　！−１６２５）を用いて、Ｔｒｐプロモーターを誘 発した。誘発後１時間までに、増殖し続ける細胞の内部に屈折性の細胞質封入体 が存在することが１位相差顕微鏡により確認された。誘発の５時間後に、１０． Ｄ、ｓｓｓ当量の細胞を遠心分離によりペレツト化し１次いでＳＤＳ試料緩衝液 中で５分間沸騰させ、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動にかけ た後、クーマシー・ブルーで染色した（第７図）。

レーンＡ＝分子サイズの標準物；レーンＢ　＝ｐＴｒｐ２３３ベクターコントロ ールを有する誘発されたＷ３１１０細胞；そして、レーンＣ＝誘発されたｐｃ２ １０ｓＰ−Ｂ／Ｗ３１１０．　ＣＡＴ：５Ｐ−Ｂ融合タンパクの予想分子量は４ ５．０００ダルトンである。ハイブリッドＣＡＴ：５Ｐ−Ｂタンパクは、誘発培 養物中の全細胞タンパクの１５−２０％を占めると見積られた。

Ｂ、５Ｐ−ＣとのＣＡＴ融合 一連のベクターは、成熟したヒト５ｐ−ｃが、ヒドロキシルアミンに鋭敏なアス パラギン−グリシン結合を介して、ＣＡＴの様々な部分のカルボキシ末端に融合 している融合タンパクをコードするように構築された。各構築物によって生産さ れる融合タンパクをヒドロキシルアミンで開裂させると、天然ヒト５Ｐ−Ｃの一 部に見られるアミン末端フェニルアラニン残基を欠く、３５アミノ酸の成熟５ｐ ＝ｃが放出される。

１・　匹り工注≦ ２５１残基からなる融合タンパクのアミノ酸配列は、プラスミドｐｃ２１０ｓＰ −Ｃをコードしていた。ＣＡＴの２１０アミノ酸は、　６アミノ酸のリンカ−を 介して、成熟５ｐ−ｃの３５アミノ酸に連結されている。全融合タンパク中の成 熟５ｐ−ｃ部分は１４％を占める。

第８図には、ｐｃ２１０ｓＰ−Ｃのヌクレオチド配列が示されている。

このヌクレオチド配列においては、５Ｐ−８配列を有するｐｃ２１０ｓＰ−Ｂの む旦Ｒ１−Ｈ１ｎｄｌｌ！断片が、ヌクレオチド１２３の畠Ｌ　１部位からヌク レオチド１６１のＡｖａＩｒ部位にまで延びるヒト５Ｐ−ＣｃＤＮＡ＃１８のセ グメントで置換されている。ＣＡＴベクターのＥｃｏＲ１部位は、２つの相補的 なオリゴヌクレオチドを介して、ＳＦ３　酊ホＬ１部位に連結されている。この オリゴヌクレオチドは２　ヒドロキシルアミンに鋭敏な開裂部位と、成熟５ｐ− ｃのアミノ末端残基とをコードしている（オリゴ８２４６２：５°−ＡＡＴ　Ｔ ＣＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＣＣＡＧ−３°およびオリ ゴ＃２４６３：５−ＴＧＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　 ＣＣＧ　ＴＴＧ−３’）。５ｐ−ｃの心旦！■部位は、第２組の相補的ヌクレオ チドを介して、ｐｃ２１０ｓＰ−Ｈの±ｄｌ１１部位に連結している。このヌク レオチドは、成熟５ｐ−ｃのカルボキシ末端残基と、停止コドンとをコードする （オリゴ＃２８７１：５−ＡＧＣＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＣＡＴ　ＧＡ Ｇ　ＣＡＧ　ＧＧＣＴＣＣＣＡＣＡＡＴ　ＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＡＴ　ＧＡＧ− ３’およびオリゴ９２８７２：　５°−ＧＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧ 　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＣＣＴＧ　ＣＴＣＡＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＣＣＡ ＣＴＡ−３°）。

２・　匹旦Σヱ≦ ｐｃｉ？９ｓＰ−Ｃによってコードされる２１７残基の融合タンパクのアミノ酸 配列は、第８図に示されている配列を若干改変したものである。ｐｃｉ７９ｓＰ −Ｃでは、ＣＡＴの１７９アミノ酸が３アミノ酸（Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ ）のリンカ−を介して、成熟５ｐ−ｃの３５アミノ酸に連結されている。全融合 タンパクの５ｐ−ｃ部位は１６％を占める。

ｐｃｉ７９ｓＰ−Ｃを構築するために、ＣＡＴの配列の一部を、ｐｃ２１０ｓＰ −Ｃから取り出した。ｐｃ２１０ｓＰ−Ｃから出発して、　ｎｔ６０３　（東８ 図）のＮｃｏ１部位から、１ｔ７２ＢのＥｃｏＲ１部位にまで延びるＤＮＡ断片 を取り出し、ＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩの粘着末端を、２つの相補的オリゴヌク レオチド（オリゴ＃３０８３：５’−ＣＡＴ　ｃｃｃ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＴＴＡ 　ＴＡＣＧＣＡ　ＡＧ−３°およびオリゴ＃３０８４：５°−ＡＡＴ　ＴＣＴ　 ＴＧＣＧＴＡ　ＴＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＣＣ−３°）と再び連結させた。要す るに、ＣＡＴの３１残基と、　リンカ−ポリペプチドの３残基とが、ベクターｐ ｃｉ７９ｓＰ−Ｃによってコードされる新しい融合タンパク中で欠失している。

３、　バｌ（園辷工 ｐｃ１４９ｓＰ−Ｃによってコードされる１８７残基の融合タンパクのアミノ酸 配列は、第８図に示されている配列を若干改変したものである。プラスミドｐｃ Ｌ４９ｓＰ−Ｃでは、ＣＡＴの１４９アミノ酸が３アミノ酸（Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ 、　Ａｓｒ＋）のリンカ−を介して、成熟５ｐ−ｃの３５アミノ酸に連結されて いる。全融合タンパクの５ｐ−ｃ部分は１８．７％を占める。

の一部を取り出し、２つの相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ８３０８２：５’ −ＴＣＡ　ｃｃｃ　ＡＡＴ　ＣＣＣＧ−３°およびオリゴ＃３０８１：５°−Ａ ＡＴＴＣＧ　ＧＧＡ　ＴＴＧ　ＧＣ−３°）の組で置換した。

４、匹避ｌ上匹 ｐｃ１０６ｓＰ−Ｃによってコードされる１４４残基の融合タンパクのアミノ酸 配列は、第８図に示されている配列を若干改変したものである。プラスミドｐｃ １０６ｓＰ−Ｃでは、ＣＡＴの１０６アミノ酸が３アミノ酸（Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ 、　Ａｓｎ）のリンカ−を介して、成熟５Ｐ−Ｃの３５アミノ酸に連結されてい る。全融合タンパクの５ｐ−ｃ部分は２４％を占める。

ｐｃ１０６ｓｌ’−Ｃは、アニールした後に相同性領域を介して互いに連結した ２組の相補的オリゴで、ｐｃ２１０ｓＰ−ＣのＥｃｏＲｌ断片（ｎｔ３０２から ｎｔ７２８．　第８図）を、置換することにより構築された。

これら相補的オリゴは以下のとおりである（オリゴ＃３０７９：５’−ＡＡＴ　 ＴＣＣＧＴＡ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＧＣＴＧ Ｇ　ＴＧＡ　ＴＡＴ　ＧＧＧ　ＡＴＡ　ＧＴＧ　ＴＴＣＡＣＣＣＴＴ　ＧＴ−３ °は、オリゴ：３０８５：５°−ＡＣＡ　ＣＴＡＴＣＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＴＴ　ＧＣＣＡＴＡ　ＣＧＧ〜３゜とア ニールされた：オリゴ＃３０８０：５°−ＴＡＣＡＣＣＧＴＴ　ＴＴＣＣＡＴ　 ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＴＣ：Ｇ　ＣＴＣ ＴＧＧ　Ｇ−３’は、オリゴ＃３０７８：５°−ＡＡＴ　ＴＣＣＣＡ、Ｇ　ＧＡ Ｔ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＡ　 ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ−３’とアニールされた）。

５、鉦ヨと膠７９二女」ピυｌ又 各５Ｐ７Ｃ発現ベクターを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株をアンピシリン 耐性に形質転換させた。急速に増殖している培養物を。

上記のように誘発した。誘発後１時間までに、増殖し続ける細胞の内部に屈折性 の細胞質封入体が存在することが２位相差顕微鏡により観察された。誘発の５時 間後に、１０．Ｄ、５５６当量の細胞が遠心分離によりベレット化し１次いでＳ ＤＳ試料緩衝液中で５時間沸騰させ、】２％５ＤＳ−ポリアクリルアシドゲル中 で電気泳動にかけた後、クーマシー・ブルーで染色した。その結果は第９図に与 えられている。レーンＡ＝分子サイズの標準物；レーンＢ　＝　ｐＴｒｐ２３３ ベクターコントロールを有する誘発されたＷ３１１０細胞；レーンＣ−誘発され たｐｃ１０６ｓＰ−Ｃ；　レーンＤ　−ｐｃ１４９ｓＰ−Ｃ；　レーンＥ　−ｐ ｃｉ７９ｓＰ−Ｃ；　レーンＦ　＝ｐＣ２１０ＳＰ−Ｃ，各ベクターによって生 産されたハイブリッドＣＡＴ：５Ｐ−Ｃタンパクは、誘発培養物中の全細胞タン パクの１５−２０％を占めると見積られた。

■、ハイブリッド　ンパクをＥ、ｃｏｌｉ　で　させるために良されたＣＡＴベ クター 以下の実施例では、基本的なＣＡＴ遺伝子融合ベクターを、いくつかの方法で改 良されている＝（１）発現させるべき遺伝子を挿入するのに特有のクローニング 部位を形成すること；（２）ペプチドの開裂および／または精製を最適化するよ うに、ＣＡＴ遺伝子を改変すること；および（３）テトラサイクリン耐性を付与 する遺伝子を回復させて、プラスミドを選択および維持する他の方法を与えるこ と。

Ａ、現ヘク９−ＣＡＴ７３およびＣＡＴ２ＬＣｌ発現ベクターｐＣＡＴ７３は、 アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子と９発現さ せるべき遺伝子を挿入するのに特有のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｕクローニング 部位と、ＣＡＴ遺伝子のアミン末端断片（１−７３）を有する。開裂部位は、挿 入遺伝子と共に含まれているが、特有のものではな−）。

このプラスミドは、プラスミドｐＢＲ３２２，ｐＴｒｐ２３３．　ｐｃＡＴ２１ ．　およびオリゴデオキシリボヌクレオチドから構築されて（する。

発現ベクターｐｃＡｒｚｔｏは、ｐＣＡＴ７３と以下の点で異なって０る。

つまり２発現ベクターｐＣＡＴ２１０は、残基７２および７３（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ ）をコードする配列におけるＥｃｏＲ１部位が取り除かれているＣＡＴ遺伝子の より長いアミノ末端断片（１−２１０）を有する点である。

（他のコドン選択を行っても、このＧｌｕは保存されて℃）るので。

特有のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の使用が可能になる。

）所望の融合点にＥｃｏＲ１部位を挿入することにより、ＣＡＴ遺伝子のアミン 末端をコードし、７３アミノ酸より小さ０力ｉ。

あるいは７３アミノ酸と２１０アミノ酸との間にある。他のＤＮＡ［ｒ片を構築 することもできる。

１、匹■坦旦！策 テトラサイクリン耐性に対する遺伝子の回復には、ＣＡＴ発現ベクターに、ｐＢ Ｒ３２２のジ１旧−り工ｄｌＩＩ−Ｅｃ旦Ｒ１断片を回復させることが必要であ る。このベクターに所望される特有のクローニング部位は、ＥｃｏＲＩおよびＨ ｊｎｄｍであるので、これは、これらの部位を除去するが、テトラサイクリンに 対する耐性を保持するようになされなければならない。コード領域の上流にある Ｈｉｎｄｍ部位にＤＮＡを挿入すれば、遺伝子の発現が阻害されることが多いの で、この部位は、Ｈｉｎｄｍ部位において点変異を起こすことにより取り除かれ る。プラスミドｐＢＲ３２２はＥｅｏＲＩおよびＨｉｎｄＤＩで分解され、ベク ターバックボーンはゲル精製された。このバックボーンは合成ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄｍ断片と連結された。これらの断片は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、オ リゴヌクレオチドの組をアニールすることにより形成される。これらの断片は、 認識配列５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’の最初のアデニンに点変異（ＧまたはＣ）が 見られることを除いて、正常のＥｃｏＲＩ−旧ｎｄＩ［［配列を有する。中間体 プラスミドは、プラスミドミニブレアブＤＮＡがＨｉｎｄＩｆｆにより分解され ない、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性のＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０ ６１から単離された。

もはやＬユｄＩＩＩ部位を有さない氾］旧−ＥｃｏＲＩ断片は、プラスミドｐＴ ｅ　を旧の■旧とＥｅｏＲ１分解物から、アガロースゲル電気泳動法により精製 された。この断片は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、プラスミドｐＴｒｐ２３ ３と連結された。ただし、ｐＴｒｐ２３３もまた、シ徂旧および釘旦Ｒ１で分解 され、アガロースゲルで精製された。連結により形質転換されているので、Ｅ、 ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のコロニーはアンピシリン耐性および／あるいはテトラ サイクリン耐性について選択された。プラスミドｐＴｒｐＴ２３３は両方の抗生 物質に耐性を有していた。

他の実施態様では、ＥｃｏＲＩによるｐＴｒｐＴ２３３の分解、ＤＮＡポリメラ ーゼエ、クレノー断片による末端の平滑化、およびＴ４　ＤＡＮリガーゼを用い た連結により、ＥｃｏＲ１部位が除去される（しかし、テトラサイクリンに対す る耐性には影響がない）。不必要なＩ（ｉｎｄｍおよびＥｃｏＲ１部位を欠失し ているテトラサイクリン耐性のプラスミドＩ）Ｔｒｉ）Ｔ２３４は、この連結に より形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１のコロニーから単離される。

ＣＡＴ遺伝子は、ｐｃＡＴ２１のＮｄｅ［−ＨｌｎｄＩ［［分解物のアガロース ゲル電気泳動により精製された±［−Ｈｉｎｄｍ断片として得られる。

プラスミドｐＴｒｐｄｅｌ　ｔａＨｉｎｄは、ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩ［［で 分解され。

アガロースゲル電気泳動法により精製され、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ ＡＴ遺伝子と連結された。ＣＡＴ遺伝子の取り込みを確認するために、ＥｅｏＲ ＩおよびＨｉｎｄｍで分解したＥｃｏＲＩＭＣ１０６１のアンピシリン（または テトラサイクリン）耐性の形質転換体から、プラスミドＩ）ＣＡＴ７３　（３１ （５図Ａ）が単離される。

２、四酊」ユ４１！ ｍプロモーター・オペレーターと、リポソーム結合部位と。

ＣＡＴ遺伝子とを有する論旧−Ｈｉｎｄｍ断片は、プラスミドｐｃＡＴ２１の醜 ！旧およびＨｉｎｄｍ分解物のアガロースゲル電気泳動により精製される。Ｍ２ Ｓおよび変異誘発性オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、この断片に部位 特異的変異処理を施すことにより、ＥｃｏＲ１部位５°−ＧＡＡＴＴＣ−３’内 におけるＧｌｕのＧＡＡ　：ｌトンを、ＧＡＧ（やはりＧｌｕ）に変更した。こ のようなプラスミドの１つであるＭ２Ｓ−ＣＡＴｄＲは、５ｅａｌで分解され、 ベクターを線状化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、ム旦ＲＩリンカ−（ｐｃ ＡＴＴ３と同じ読取り枠に対するもの）と連結される。形質転換体から２Ｍ１３ −ＣＡＴＲＩが単離され、ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩＩ［で分解された。新しい ＣＡＴ遺伝子は、アガロースゲル電気泳動法により精製され、Ｔ４　ＤＮＡリガ ーゼを用いて、慰匡Ｉ−旧ｎｄｍ分解プラスミドｐＴｒｐＴ２３４と連結される 。プラスミドｐｃＡＴ２１０（第５図Ｂ）は、Ｅ、ｃｏｌｉＭＣ１０６１のアン ピシリン（またはテトラサイクリン）耐性の形質転換体から単離される。

Ｂ０発現ベクターＣＡＴ７３−ＴおよびＣＡＴ７３−Ｍ発現ベクターｐＣＡＴ？ ３−ＴおよびｐＣＡＴ７３Ｍは、ＣＡＴのアミノ酸配列を２部位特異的変異処理 法を用いて変更し、生成物タンパクの精製を容易にした例である。これらの場合 、１６位のＴｒｐ残基をＴｙｒで置換し、６７位のＭｅｔ残基をｌｉｅまたはＬ ｅｕで置換することにより、ＣＡＴ内部の化学的開裂可能部位を取り除き得る。

さらに、３１位のＣｙｓもまた。保存的なアミノ酸変更、つまり生物学的活性に 悪影響を与えないアミノ酸での置換により、置換し得る。好ましい残基としては 、アニリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンが挙げられ、セリ ンが最も好ましい。これら後者の変更は、ジスルフィルド架橋による多量体化を 低減させることを意図したものである。

Ｃ０されたＣＡＴ−ＧＬＰ−１の発 プラスミドｐＴｒｐｄｅｌ　ｔａＨｉｎｄは、ｐＴｒｐＺ３３から回復されたＴ ｅｔ”遺伝子（ｌ（ｉｎｄｍ部位が欠失しているが）と；　ＣＡＴ遺伝子配列に おけるＴｒｐ１６のＴｙｒへの、ＣＹＳ３１のＳｅｔへの、ＭｅｔｅｒのＬｅｕ への各置換と；メチオニン残基を介し、て、改変されたＣＡＴ遺伝子とフレーム 内で融合Ｌ７た（実施例■に示した）ＧＬＰ−１遺伝子とを有する。このベクタ ーを用いて、　Ｗ３１１０．　ＭＣ１０６１，ＤＨＩ、ＭＭ２９４．　およびＲ 旧を含むいくつかのＥ、ｃｏｌｉ株を形質転換させた、。

Ｅ、ｅｏｌｉ　ＲＲＩ形質転換体は、他のどの宿主よりも安定であり。

Ｔｒｐプロモーターの誘発／抑制の制御をより良好に行うようである。このベク ターを構築する他の方法には、ＴｅｔＲ遺伝子を反転させることにより（本発明 の構築物中において、Ｔｅｔ”プロモーターと、Ｔｒｐプロモーターとが逆向き に配置されることを避けるためＹ、ＲＲＩ形質転換体以外の細菌宿主を用いた場 合に観察される安定性の問題を軽減することが含まれる。

Ｖｌ、Ｔｒ　ＣＡＴ７２：　ｄｉ　ｓｉｎ　Ｄの成熟ヒト・アジプシン／Ｄのコ ード配列をｐＣＡＴ７２に融合させて、融合タンパクを生産した。この融合タン パクは９例えば。

ヒト・アジプシン／Ｄに対する抗血清を生成させるのに適している。

Ａ、酊」設訂ＩＬ並盈Ｆ目４区 プラスミドｐｃＡＴ７２　Ｑ３Ｓ１は、ＣＡＴに融合したペプチドがヒト得るＡ ｓｎ残基を除去するために構築された。ＣＡＴのＴミノ酸２６位、５１位、７８ 位のＡｓｎ残基はＧｉｎ残基に変更された。同時に２３１位にある唯一のＣｙｓ は、多くのＣＡＴ融合タンパクに見られる凝集の１を低下されるために、Ｓｅｒ に変更された。

ベクターｐｃＡＴ７２　Ｑ３Ｓ１は次のようにして構築された：オリゴＣＡＴ７ ２−１〜６（以下参照）をアニールし、■１およびＥｃｏＲ［で開裂させたｐｌ Ｊｃ−９に連結した。このようにして、変異させたＣＡＴ７２を、ｐＵＣプラス ミドのポリリンカー領域に連結した。次いで。

ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄｍで開裂させることにより、ポリリンカーをｎｄｍとの 間に挿入するごとにより、、　ｐＴｒｐｃＡＴ７Ｚ　Ｑ３Ｓ１を得た。

ＣＡＴ７２−１ ＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡ　ＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧ　ＧＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＴ ＧＡＴＡＴＡ　ＴＣＣＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＧＴＡＡＡＧＡ　ＡＣＡＴＴＴＴＧ ＡＧ　ＧＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴ７２−２ ＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡ　ＴＡＴＣＡ ＡＣＧＧＴ　ＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴ　ＴＣＴＣＣＡ （以下余白） ＣＡＴ７２−３ ＴＣＡＧＴＴＧＣＴ　ＣＡＡＴＣＴＡＣＣＴ　ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＣ ＡＧＣＴＧ　ＧＡＴＡＴＴＡＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＡＡ　ＧＡＣＣＧＴＡＡＡ Ｇ　ＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧ　ＣＣＧ ＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧ　ＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＡＧＧＴＡＧＡＴ ＴＧ　ＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＡＴ７２−５ ＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡ　ＴＣＣＧＧＣＣＴＴＴ　ＡＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣ ＣＣＧＣＣＴ　ＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＣＣＧＧ ＣＡＴ７２−６ ＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴ　ＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴ　ＣＡＧＧＣＧＧＧＣＡ　ＡＧＡ ＡＴＧＴＧＡＡ　ＴＡＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＴ ＧＴＴ　ＴＢ、Ｔｒ　ＣＡＴ７２　６Ｓ３の ｐｃＡＴ７２　Ｑ３Ｓ１から出発して、ｐｃＡＴ１ｓ３　Ｑ６Ｓ３は、ＣＡＴの １３０位。

１４１位、および１４８位のＡｓｎ残基をＧｉｎ残基に変更し、９１位および１ ２６位のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に変更するように構築された。

ｐＵＣ−９中のプラスミドＣＡＴ７２　Ｑ３ＳＬをＥｃｏＲＩで開裂させた。オ リゴＣＡＴＩＳ３−１〜６（以下参照）をアニールして、ｐｃＡＴ７２に連結す ることにより、ｐｃＡＴ１５３　Ｑ６Ｓ３を得た。次いで、Ｎｄｅｌおよび■ｎ ｄｍで開裂させることにより、改変されたｐｃＡＴ１５３を、ｐｕｃから取り除 き、そして得られた断片をｐＴｒｐ２３３に挿入することにより、ｐＴｒｐｃＡ Ｔ１５３　Ｑ６Ｓ３を得た。

ＣＡＴ１５３−１ ＡＡＴＴＴＣＧＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡ　ＧＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴ ＧＡＴＡＴＧ　ＧＧＡＴＡＧＴＧＴＴ６０　７０　’８０ ＣＡＣＣＣＴＴＣＴＴ　ＡＣＡＣＣＧＴＴＴＴ　ＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴ１ ５３−２ ＡＡＡＡＣＧＧＴＧＴ　ＡＡＧＡＡＧＧＧＴＧ　ＡＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＡ ＴＣＡＣＣＡ　ＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡ ＣＡＴ１５３−３ １０　２０　３０　４０　Ｓ。

ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴ　ＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴ　ＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡ　ＴＡＣ ＣＡＣＧＡＣＧ　ＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡ６０　Ｔｏ　８０ ＧＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＡＴＴＣＧＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴ１５３ −４ １０　２０　３０　４０　Ｓ。

ＧＣＧＡＡＴＡＴＡＴ　ＧＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴ　ＣＧＴＣ ＧＴＧＧＴＡ　ＴＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡ　ＡＣＧＴＴＴＣＡ ＧＴ　ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＴ１５３−５ ＧＴＣＴＴＴＡＣＧＴ　ＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧ　ＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡ ＧＧＧＴＴＴ　ＡＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＧＴ　ＣＴＣＡＧＣＣＣ ＡＧ　ＣＣＣＧＣＡＴ１５３−６ ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴ　ＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣ ＡＡＴＡＡ　ＡＣＣＣＴＴＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣ ＣＧＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＣＡＴＣＴＴ（以下余日） 次いで、ヒ）−７ジブシ７／Ｄ　ｃＤＮＡ　ｈｇ３１−４０（第１０図）を構築 した。成熟コード領域を有するし！旧−紀ｌｌ断片を、ゲル精製して、ｂ！旧お よびＨｉｎｄｍで開裂させたｐＵｃ−９中に挿入した。

このｃＤＮＡの鉱ｌＩ末端を、２つのオリゴ（：３８８６　Ｓ’−ＣＡＴＧＧＧ ＴＧＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＡ−３°および３３８８７５−ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣ ＣＣＣＧＧＣＡＣＣ−３°）を用いて、ｐｕｃの旧ｎｄｍ末端に連結した。この ように、アジプシン／ＤのＢａｍＨＩ−ニＩ断片をｐＵＣに挿入することにより 、アジプシン／Ｄのコード配列を、ｐＵＣ−９のＥｃｏＲ１部位と共にフレーム 内に配置した。この構築物のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ■断片を、ｐＵｃ−９から取 り出し、ｐＴｒｐｃＡＴ７２のＥｃｏＲ１部位とＨｉｎｄｌＩＩ部位との間に挿 入して。

ｐＴｒｐＣＡＴ７２　ニアドブシン／Ｄを得た。

この構築物は、　Ｗ３１１０Ｓ細胞中おける誘発により、１０−１５％レベルの 融合タンパクを与えた。

本発明を実施するための上記様式については、その改変は分子生物学、タンパク 化学、細胞生物学、あるいはそれらの関連分野における当業者にとって自明であ り、以下の請求の範囲内にあることが意図されている。

８円　３円　将　訊５ 引「　唇ざ　４シ ＦＩＧ、　２８ ＦＩＧ、　２Ｃ ＩａｃＺ ＦＩＧ、　２Ｅ ＦＩＧ、　２Ｆ ＦＩＧ、　２Ｇ ＦＩＧ、　２Ｈ Ｍｒ　１２３４５　４３２　１　Ｍｒ ＦＩＧ、　３Ａ　ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、　５Ｂ Ｃ５に　ロコ ポ　ロッ Ｌｕ１ｌ　Ｃ！ｌ　コ ８１シ３ Ｌｌ、−Ｉ　ＣＪΦ ←−ト− Ｌｌ＞　＜１−１ ＜慢　Ｑ− Ｑ−１句 Ｃ５＜　ロ〉 市　１３ゴ Ｃ帽　ロ：＋＋、ｐｂ。

Ｌ）Ｆ−１＜＋　（ｊｌ−＋ ｕ＜　Ｃ！＋Ｌｌ　ｕ＜ ■　■　■ Ｃ！＋１１１　（ｊ５　Ｌ）− 委か　じ３　目ｇ Ｏロ　Ｕ碑　Ｑ：＋ ８社　とむ　■ Ｕ　ｂｅ　（ｊ　ｍ　（Ｊ　Ｏ リ　１．ｌ０Ｌ−ＬＬ）１．Ｉ Ｑ＜　ロ＜　○− じ切　ロー　ロコ ３　し謬　じ３ υΦ　ロク　０Ｉ−１ １−１，−１！−１Φ　Ｉ−Ｉ閣 ＜Ｈ（Ｊ、Ｊ　（＋工 ｔ５　糀ミ　ｌ ←−＜−０＞ （Ｊ、−１４＋Ｉ　Ｑ− ｕ＜　ｕ＞　ｕａ ｃｐｂｏ　Ｌ）ｌ−１ｕコ 足二　ｊ；’２　ｅ５ ＣＢＡ ― ＦＩＧ、　７ 託　賎：　荘　馨占　荘　託　臼 の ― 日！　日！ ４８ＣＤ　Ｅ　Ｆ 一 ＦＩＧ、９ −５ｃｐｂｏ　ａｏｕ−ｃｑｕｍ　ｗｃｐｔａ　ｏｕｂｏ　−ｓｕｗ″′’ｅ３ ＜　Ｅ：；　：３．＝：ｓご　；　８＜　Ｆ’ｌ！；’；”：葺１　眠　眩ｊ　 Ｉｃ　訃　興暫 ｕｒａ　ｔＪｂｏ　Ｌｌ：５　ｕａ　ｕＩ＋Ｉｕｐ。

８′５　８二　七：！Ａ　ご−Ｅ品　ご４８′！＞　し、２　と１　８二　８巳 　８巳ｈｕ　ｕ＜　ロ＞　Ｕ＜　ω−Ｑ− ＵＳ　○Ｃ１ｌ　ＣＪ＞　Ｑａｌ　Ｃｊ　り　ｃｐｅｔＪ　Ｐ−１＜　−ｓ　Ｃ ｊ　？　ＣＪ　Ｐ−１４Ｆ−１＜　−ｕ＜　ｕｓｅ　ｃ、ｐ＋、ｐ　ａ＜　（Ｊ Ｃ５ｕ＋、ｐｐｅａ　ｃｐｒａ　＜ｍ　ω−Ｃ５０ローＣＪ　＋−Ｉ　ＣＪ−Ｃ Ｊ　？　（ψ　（ＪＷ（ｊΦａ＜　ａ＜　Ｃ５＜　Ｑ＜　ｕｃｂ　＜Ｃ／）Ｃ５ ＋’６　ロ＝＋Ｕり　（Ｊ：５　ｃｐｅ　ｕａＬ）ｐ−１＜ｐｓ　Ｃ５＞　（１ ニー＜ｒ−＋　＜＋ａｃｐ＜　ＣＪＬＩ　ｈｐ　ｕｃｐ　ｕｃｐ　ａ＜く＞　○ １）　Ｃコ　Ｑコ　リ−０口 ８己　８；　し３　じ３　とδ　８よ くコ　Ｑコ　Ｑψ　Ｑ的　ロコ　Ｑ切 し３　ご己　ご；　どご　し３　ご； Ｉ＋＋ｕ＝＋　ｔ−＋＜ｂｏ　ｕ”ｔｕｍ　ｃｙ＋ｕｗ　ｃ−”＋ｕ−トｕ。

ＮｔＧ５　Ｏｗｌ淀ミ　＝８曜　＝巴苗　シとδ　カ８と０−　ω＞　０＞　０ 句　０り　リ一 し＞　、ｇ　８亡　８；　ご苗　しｇ ロコ　ｕ＞　ｐｃ　Ｃｊ１−　ロ１）　く田じ５　８己　１屯　：＝　ａ＝　、 ＝ 国際調査報告 １、＃、ｌ、　１１１．　ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３４１７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 独占的な権利、つまり特権をクレームする、本発明の実施態様を以下に説明する 。 １．原核宿主中の異種タンパク発現を安定させる方法であって、 （ａ）アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチドＩ、ア ジプシン／Ｄ、肺界面活性タンパクＳＰ−Ｂおよび肺界面活性タンパクＳＰ−Ｃ からなる群から選択される哺乳類ポリペプチドをコードする異種遺伝子配列とフ レーム内において融合された、３′部分が切形のクロラムフェニコールアセチル トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子および異積遺伝子の 順に含むハイブリッド遺伝子を構築すること；ここで、該ポリペプチドは、正常 状態においては細菌発現系において回収され得ず、そして、翻訳の際に、該ハイ ブリッド遺伝子は回収可能な収率で融合タンパクを生産する； （ｂ）該ハイブリッド遺伝子の発現のためのベクターを提供すること； （ｃ）該発現ベクターによって形質転換された該原核宿主を培養すること；およ び （ｄ）該融合タンパクを回収すること；を包含する方法。 ２．前記原核宿主が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。 ３．前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２に記載の方法。 ４．前記３′部分が切形のＣＡＴ遺伝子配列が全細胞タンパク中に存在する異種 タンパクのレベルを高める、請求項１に記載の方法。 ５．前記切形のＣＡＴ遺伝子配列の長さが約７３から約２１０のアミノ酸のＣＡ Ｔペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。 ６．前記ハイブリッド遺伝子がさらに、前記ＣＡＴ遺伝子配列および異種遺伝子 配列の間に位置する選択的開裂部位をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１ま たは５に記載の方法。 ７．前記選択開裂部位がトリブトファン、メチオニン、アスパラギン−グリシン またはグルタミン酸で構成される、請求項６に記載の方法。 ８．原核宿主中の異種タンパク発現を安定させる方法であって、 （ａ）アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチドＩ、ア ジブシン／Ｄ、肺界面活性タンパクＳＰ−Ｂおよび肺界面活性タンパクＳＰ−Ｃ からなる群から選択される哺乳類ポリペプチドをコードする異種遺伝子配列とフ レーム内において融合された、約７３から約１８０のアミノ酸のＣＡＴペプチド をコードする３′部分が切形のクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラ ーゼ（ＣＡＴ）遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子および異種遺伝子の順に含むハイブ リッド遺伝子を構築すること；ここで、該異種タンパクは、正常状態においては 細菌発現系において回収され得ず、翻訳の際に、該ハイブリッド遺伝子は回収可 能な収率で融合タンパクを生産する；（ｂ）該ハイブリッド遺伝子の発現のため のベクターを提供すること、 （ｃ）該発現ベクターによって形質転換された該原核宿主を培養すること、およ び （ｄ）該融合タンパクを回収すること；を包含する方法。 ９．前記ハイブリッド遺伝子がさらに、前記ＣＡＴ遺伝子配列および異種遺伝子 配列の間に位置する選択的開裂部位をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項８に 記載の方法。 １０．非安定で、細菌によって生産された異種ポリペプチドの発現レベルを高め ることが可能な細菌発現ベクターであって、 アミロイドタンパクＡ４−７５１挿入配列、グルカゴン様ペプチドＩ、アジブシ ン／Ｄ、肺界面活性タンパクＳＰ−Ｂおよび肺界面活性タンパクＳＰ−Ｃからな る群から選択される哺乳類ポリペプチドをコードする異種遺伝子配列に連結する ３′部分が切形のＣＡＴ遺伝子配列を、ＣＡＴ遺伝子および異種遺伝子の順に含 むハイブリッド遺伝子を含み、該ポリペプチドが正常状態においては細菌発現系 において回収され得ず；それによって該切形のＣＡＴ遺伝子配列は生じた融合タ ンパクをタンパク分解酵素による分解に対して抵抗性にすることが可能である、 発現ベクター。 １１．前記切形のＣＡＴ遺伝子配列の長さが約７３から約２１０のアミノ酸のＣ ＡＴペプチドをコードする、請求項１０に記載の方法。 １２．前記ハイブリッド遺伝子がさらに、該ＣＡＴ遺伝子配列および該異種遺伝 子配列の間に位置する選択的開裂部位をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１ ０または１１に記載の細菌発現ベクター。 １３．前記３′部分が切形のＣＡＴ遺伝子配列を有するハイブリッド遺伝子が、 発現の際に細胞の総タンパク中に存在する異種タンパクのレベルを高める、請求 項１２に記載のベクター。 １４．非安定で、細菌によって生産された異種ポリペプチドの発現レベルを高め ることが可能な細菌発現ベクターであって、 該ベクターは、正常状態においては細菌発現系において回収され得ないポリペプ チドをコードする異種遺伝子配列に連結した３′部分が切形のＣＡＴ遺伝子配列 を、ＣＡＴ遺伝子および異種遺伝子の順に有するハイブリッド遺伝子を含み、該 切形のＣＡＴ遺伝子配列が、生じた融合タンパクをタンパク分解酵素による分解 に対して抵抗性にすることが可能であり、そして、該発現ベクターにおいて、 該ＣＡＴタンパク内の可能性のある化学的開裂部位を除去するために該切形のＣ ＡＴ遺伝子の１つまたはそれ以上のＤＮＡコドンが変換されている、改良細菌発 現ベクター。 １５．前記変換が、ａ）ＣＡＴの６７位におけるメチオニンをコードするＤＮＡ をイソロイシンまたはロイシンをコードするＤＮＡに；ｂ）ＣＡＴの３１位のシ ステインを、セリンをコードするＤＮＡに；またはｃ）ＣＡＴの１６位における トリブトファンをコードするＤＮＡをチロシンをコードするＤＮＡに置換するこ とを含む、請求項３２に記載の改良された細菌発現ベクター。