JPH04501207A - Ｄｎａ領域における長さ多型を分析する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ領域における長さ多型を分析する方法本発明は単純なまたは潜伏的に単純 なりＮＡ配列の領域の長さ多型を分析するための方法に関する。

ＤＮＡの長さ多型を決めるための既知の方法はすべて、制限エンドヌクレアーゼ の使用に基づいている。したがって、以後にハイブリダイゼーション法によって 検出される特定のＤＮＡ断片を調製する。これらの方法によれば、制限エンドヌ クレアーゼに対する相当する認識部位間で形成されるいずれかの長さの変種を検 出するか、または特定の制限開裂部位の欠如に基づいて形成される長さの変種を 検出する。最初の方法では、いわゆるミニサテライト領域における長さ変種（３ ，４）、および／または特定の単純なりＮＡ配列を有する領域の長さ変種（５） を利用する。制限断片長条型（ＲＦＬＰ）を検出する第２の方法は、経験に基づ いて見いだされる特定の場合にしか適用できず、また本質的に遺伝子疾患の分析 においてのみ適切に使用することができる。

これらの既知の方法は、ハイブリダイゼーション反応を行って長さ冬型領域を視 覚化しなければならないという欠点がある。これは、操作に時間を要し、高価に する。さらに、従来の方法を利用する単一の分析では通常、十分に確証ある結果 を得ることができないので、さらに別の独立した分析が必要となる。したがって 、これらの反応は連続した実験およびルーチン試験にとっては非常に適切な試験 とはいえない。さらに、上記の方法は自動化には不適切である。

したがって、本発明の目的は、高い感受性のあるＤＮＡ領域の長さ多型を分析す るための方法を提供し、時間を浪費することなく、信頼できる結果が得られ、さ らに連続実験とルーチン試験とに適切であり、要すれば自動化も行うことのでき る方法を可能にしようとするものである。

本発明によれば、以下の工程： （ａ）分析しようとするＤＮＡと少なくとも１つのプライマー対とのアニーリン グ［ここに、プライマー対の分子の一方は単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配 列における５′または３′のフランキングの相補鎖の１つと実質的に相補的であ り、またアニーリングは、該プライマーの一方とのプライマー−制御複製反応に よって得られる合成産物が変性後に他方のプライマーをアニーリングするための 鋳型として利用できるような方向で起こるものであるコ、（ｂ）プライマー制御 した複製連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）、および（ｃ）複製連鎖反応の反応産物の分離お よび分析からなることを特徴とする、ＤＮＡ領域の長さ多型を分析するための方 法が提供され、これにより上記の問題が解決される。

プライマー制御した連鎖反応は、ＥＰ−Ａ２　０　２００　３６２（１）および （２）などから知られている。これは、ＰＣＲ（複製連鎖反応）を行うことを特 徴とする特定のＤＮＡ断片の増幅方法を説明するものである。この方法では、逆 平行の態様で標的分子をフランキング（ｆ　ｌａｎｋｉｎｇ）するオリゴヌクレ オチドブライマーを使用することによって特定の増幅を行う。したがって、ポリ メラーゼによるプライマーの鋳型−依存性伸長反応においては、それ自身が新た なサイクルにおける鋳型として再度利用され得るＤＮＡ断片を合成させる。

このＤＮＡ合成は、出発分子の熱変性から始まり、対応するプライマーのハイブ リダイズ、およびポリメラーゼによる鎖伸長に至る。

さらなる熱変性によって、以後のサイクルを開始させる。これによれば、特異的 に増幅される領域が指数関数的に増加し、最終的に通常のゲル電気泳動によって 検出され得る断片が生成される。この断片の長さは、プライマーの５′末端およ び中間領域によって決められる。熱に安定な合成成分を使用することにより、単 純かつ容易に加熱および冷却サイクルを自動的に行う反応がなされ得る。

オリゴヌクレオチドプライマーに基づく標的分子の［逆平行のフランキング（ａ ｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ　ｆｌａｎｋｉｎｇ）Ｊによって、プライマ一対それぞ れの両プライマーの一方が標的分子の一方の相補的鎖とハイブリダイズされるの で、そのプライマ一対の３°末端が相互に向き合うことは理解されよう。

単純なおよび潜伏的に単純なりＮＡ配列とは、ある程度は原核生物ゲノムにも見 いだすことのできるすべての真核生物ゲノムの反復成分である。したがって、単 純なりＮＡ配列（ｓｉｍｐｌｅ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は、少なくとも１ つのヌクレオチドおよび、多くとも約６−１０のヌクレオチドを含有する短いＤ ＮＡモチーフを１２から約１００のタンデム反復（ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔ ）でもって含有している。これらの単純なりＮＡ配列は合成りＮＡ配列とのハイ ブリダイゼーション、およびこれまでに分析されたすべての真核生物ゲノム、さ らにヒトゲノムにおける直接配列決定によって見いだされる（８．１０）。短い モチーフの可能なすべての置換は異なる頻度で見いだすことができると推定され る（９）。潜伏的に単純なりＮＡ配列（ｃｒｙｐｔｉｃａｌｌｙ　５ｉｎｐｉｅ 　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の特徴は、偶発的な頻度よりも高いが、不規則で ある短いＤＮＡモチーフのダイレクト反復（ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ）であ る（９）。潜伏的に単純なりＮＡ配列は通常、相当するコンピュータープログラ ムによって、すでに配列決定されているＤＮＡ領域中に間接的にしか見いだされ ない。しかし、それは単純なりＮＡ配列の頻度と少なくとも同じか、またはそれ 以上の頻度である。単純なおよび潜伏的に単純なりＮＡ配列は、ｌ存在するあら ゆるＤＮＡ配列のモチーフの短い複製物をもう一度複製するか、またはＤＮＡ配 列モチーフにおける既に存在する単純なもしくは潜伏的に単純なりＮＡ配列のよ り長い領域を部分的に欠失させるという傾向を有する、ゲノムの機構によって形 成されるようである（８−１０）。したがって、これらの領域は通常、長さ多型 であるという仮定から研究を開始することができる。本発明の方法では、この長 さ多型を基礎としている。

本発明の方法に適切である単純な、または潜伏的に単純なりＮＡ配列はコンピュ ータープログラムを用いても、用いなくても既知のＤＮＡ配列内に見いだすこと ができる（９）。単純な、または潜伏的に単純なりＮＡ配列は約２０から３００ ヌクレオチドの長さの場合、およびランダムな配列、すなわち内部反復を有さな いＤＮＡ配列にフランキングされている場合には、適当である。次いで、内部配 列反復を有さないこのフランキングＤＮＡ配列の領域から断片を選択し、それと 適切に相補する合成オリゴヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレオチドにおけ るヌクレオチド組成およびそのヌクレオチド配列は最も高い可能性でも、調査す るゲノム内に１回しか見いだすことができず、したがって個々に分析するＤＮＡ 領域に対して特異的である場合に、そのオリゴヌクレオチドは本発明の目的に適 している。

本発明の方法では、実質的にトリヌクレオチドのモチーフから構成される、単純 なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配列の長さ多型を調査するのが好ましい。

このような単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配列の長さ多型を調査する場合に は、いわゆる「ずれた」人為産物（ｓｌｉｐｐａｇｅ−ａｒｔｉｆａｃｔｓ）は 排除する。このような産物は例えば、ジヌクレオチドのモチーフから構成される 単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配列の場合に認めることができる。したがっ て、所望の主産物よりも短い反応産物が形成される（実施例４を参照のこと）。

これらの人工のバンドはおそらく、「実際の」バンドと区別することが困難であ り、それは結果の解釈を複雑にする。単純なまたは潜伏的に単純なトリヌクレオ チド配列を使用する場合には、これら人為産物は存在しないか、または存在して もごく僅かである（実施例３を参照のこと）。

本発明の方法において特に好ましい態様では、単純なまたは潜伏的に単純なりＮ Ａ配列がトリヌクレオチドのモチーフ５’ＣＡＧ３’１５’ＣＴＧ３“から実質 的に構成されるものである。

本発明の方法では、プライマー対であって、その個々の分子が５０から５００ヌ クレオチドの距離だけ離れて、分析しようとするＤＮＡ領域とアニーリングし、 すなわちそれら分子が特定の距離だけ離れてその領域を取り囲むプライマー対を 使用するのが好ましい。

本発明の方法では、２つのプライマー対を使用するのが好ましい。

特に好ましい態様では、２から５０個のプライマー対を使用する。

本発明の方法で使用するプライマーは１５から２５ヌクレオチドの長さを有する のが好ましい。

幾つかのプライマー対を使用する場合における本発明の方法の好ましい態様では 、個々のプライマー対は、その個々のプライマー対に相当する特定の複製連鎖反 応（Ｐ　ＣＲ）産物が適当なゲル上で個々のバンドに分離できるように選択する 。

本発明方法のさらに好ましい態様では、放射活性標識化または非−放射活性標識 化、例えば蛍光性色素剤を使用して特定の複製連鎖反応産物の検出を行う。

このオリゴヌクレオチド対の標識化は、（１２）に記載されているようにして放 射活性または蛍光性色素剤を使用して行うことができる。

さらに、本発明の方法を実施することのできるキットも本発明の目的物である。

それに含まれるプライマーは所望により放射活性的に、例えば３５Ｓまたは”Ｃ によって、または蛍光的に標識する。

本発明の方法によって得られる合成産物は、通常の配列決定用ゲルなどの高融解 性ゲルシステムを使用して分離することができる。

同時に、合成産物の長さも決めることができる。単純なまたは潜伏的に単純なり ＮＡ配列の個々のまたは幾つかのモチーフを挿入し、または欠失させることによ り形成される冬型は、ゲル上におけるその合成産物の変更した位置によって認知 することができる。適当なプライマー対を選択し、適当なゲルシステムの融解能 を使用すれば、約２０から５０個の独立した各型領域を同時に調査することがで きる。したがって、得られた合成産物の長さ分布の個々の組合わせに応じて個体 が何であるかを信頼性をもって確認することができる。

適当である単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配列が調査するＤＮＡ領域中に認 められない場合は、それらは以下のようにすれば同定することができる： 調査するゲノムＤＮＡを部分的制限酵素分析にかける。単純なまたは潜伏的に単 純なりＮＡ配列中では普通は開裂を起こさない制限酵素を使用する。得られたＤ ＮＡ断片を適当なベクター、例えばλフアージ誘導体またはＭ１３ファージにク ローンし、次いで常法によって単純なまたは潜伏的に単純なりＮ、Ａ配列の配列 決定を行う（（１１）を参照のこと）。使用するプローブ分子は、単純なまたは 潜伏的に単純なりＮＡ配列の種々の置換物（ｐｅｒ＋＋＋ｕｔａｔ　ｔｏｎｓ） を含有する合成りＮＡ分子である。したがって、プラークをハイブリダイズすれ ば同定することができる。次いで、プラークに含有されている組換えＤＮＡを単 離し、配列決定によって特性化すればよい。このようにして得られたＤＮＡ配列 を、本発明に従った試験操作に適切であるＤＮＡ配列に関してスクリーニングす ればよい。

モデル系としてショウジヨウバエ（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｌＤ　Ｎ　Ａを使用し 、本発明の方法を実施した。単純なおよび潜伏的に単純なりＮＡ配列はすべての 真核生物ゲノムに存在し、さらに原核生物ゲノムにもある程度存在しているので 、ショウジロウバエモデル系を使用して得られる結果は、他のゲノムの分析、特 にヒトゲノムの調査でも得られる結果であると推定することができる。

したがって、本発明の方法は生物、例えばヒトの同一性と血縁関係の決定に適し ている。

ヒトの場合は、本発明の方法によって犯罪者の同一性を確かめるための父子試験 および法廷試験を実施することができる（実施例４も参照のこと）。

個体の同一性の決定に加えて、本発明の方法は、遺伝子座が知られており、配列 決定されている遺伝子疾患の遺伝的伝播の経緯を決定するのにも適している。こ の目的のためには、分析する遺伝子座内の、またはその隣に位置する１つまたは 幾つかの単純なまたは潜伏的に単純な配列を選択する。これらの領域の特定の長 さパターンを、既知のＲＦＬＰ−マーカーを使用し−Ｃ通常行うようにして、突 然変異された遺伝子座と相関させる［（１４）を参照］。この情報に基づいて家 系を考察すれば、遺伝学的な忠告を与えることができ、またはＲＦＬＰ−マーカ ーについて知られている同様の手法によって胎児期診断を行うことができる。こ の目的に本発明方法を適用すれば、予知できる多型の可能性あるすべてのＤＮＡ 領域が基礎となる一方で、ＲＦＬＰ分析では遺伝子座自身から遠く離れているこ との多い偶発的に見いだされる変動部に依存しているために診断の確実性が減少 しており、したがってこの場合は特に、本発明方法が意義深いものとなる。

本発明の方法はさらに、動物および植物の単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配 列における多型を決定するのにも適している。したがって、例えばウマ、イヌま たはウシなどの動物の血統の調査において、等級の高い血統の個体までの血縁関 係を信頼性高く証明することができる。

総合すれば、本発明方法の利点は、従来知られている方法と比較して、その広範 な適応性、迅速な実施可能性、およびその高い感受性にあると言うことができる 。長さ多型である単純なまたは潜伏的に単純なりＮＡ配列のために採用する本発 明方法における増幅工程により、個別に確かめる工程、例えば以後のハイブリダ イゼーション反応が不要になる。したがって、本発明の方法は、自動化、および ルーチン試験と連続実験とに特に適している。

以下に図面の簡単な説明を行う。

＊１［Ｋニブローブ分子としての単純なりＮＡ配列と遺伝子ライブラリーとのハ イブリダイゼーション 約２０．　ＯＯ０個の独立したファージクローンを１２Ｘ１２ｃｍの平板上にプ レートし、単純なトリヌクレオチド配列ＣＡＧ／ＣＴＧを含有するプローブ分子 とハイブリダイズする。このようにして３００から４００個の陽性のシグナルを 得る。陽性シグナルは点部分として認識できる。

！λ回：実施例２において多型について試験した領域の配列合成したオリゴヌク レオチドと相補する領域に波線で下線を引いている。単純なりＮＡ配列の領域に は二重線で下線を引いている。

８ヌクレオチドのダイレクト反復に２つの矢印を付している。Ｈａｅｍ−開裂部 位はイタリック文字で示している。

第３図：１１種のショウジヨウバエ野生車種の長さ変動の分析ＰＣＲ法によって 増幅し、Ｈａｅｍで開裂させたＤＮＡ配列を１列から１１列までに示している。

右側には、長さマーカーとして役立つ配列決定反応物を示している。目的とする 断片の位置は左側に矢印で示している。さらに観察されたこの断片のクラスの位 置を横線ショウジゴウバエ種３番のＤＮＡ調製物ｒＡＪを使用し、１０個の独立 したＰＣＲ−反応混合物を左側に適用し、またショウジヨウバエ種３番のＤＮＡ 調製物ｒＢＪを使用し、１０個の独立したＰＣＲ−反応混合物を右側に適用した 。配列決定反応物から得たマーカー断片を右側に適用する。観察された試験バン ドはすべて同一である。

！旦興：実施例４で使用しているＤＮＡ領域の配列合成したオリゴヌクレオチド と相捕的な領域を波線で下線を引いＰＣＲ法によって増幅させ、ゲル上で分離さ せたＤＮＡ断片を示している。最初の列には、母親のＤＮＡ、次ぎの列には試験 する父親のＤＮＡ、および試験した３人の子供のＤＮＡを適用した。６番目の列 （Ｃで示される列）には、サイズカテゴリーのみを表すための対照−ＤＮＡを適 用している。主要なバンドおよびそのサイズカテゴリーには右側に印を付けてい る。

以下に実施例を挙げて本発明を例示する。

ショウジヨウバエ−ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによって完全に 開裂させ、得られた断片をλベクター６４１にクローンする。ここに使用し、た 方法についての詳細は（１１）に見いだすことができる。この方法によって、約 ２０．０００個のファージがプレートされている遺伝子ライブラリーを得る。対 応する独立したプラークをニトロセルロース膜に移し、単純なりＮＡ配列モチー フＣＡＧ／ＣＴＧを含有するプローブ分子とハイブリダイズする。

この膜をハイブリダイズし、６５°Ｃで洗浄する。このハイブリダイズ溶液は、 ５ｘＳＳＰＥ、５　Ｘ　Ｄ　ｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液、０．１％ドデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ）、およびプローブ分子としての約１×１０８ｅｐｍ／　ｙ （ｌの放射活性標識化（”Ｐ）ＤＮＡを含有している。洗浄溶液は、２ＸＳＳＰ Ｅ、および０．１％ＳＤＳを含有している（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液および ５ＳＰＥの組成は（１１）に記載されている）。

形成された約３００から４００個のプラークは陽性シグナルを示す（第１図参照 ）。これらのプラークの幾つかを精製し、ＤＮＡを単離して配列決定する。得ら れたＤＮＡ配列領域において単純なりＮＡ配列ＣＡＧ／ＣＴＧが含有されている ことを同定すればよい［（７）を参照のことコ。

この実験のため、第２図に示した、（１３）に記載されているＤＮＡ配列を選択 した。以下の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを合成した： オリゴヌクレオチＩ’１　：　５’−ＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＴＣＡ−３’オ リゴヌクレオチド２　：　５’−ＡＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＣ−３’これら ＤＮＡ配列を第２図に示す配列の始点または終点に素早く配置する。プライマー として使用するため、合成した上記のオリゴヌクレオチドの５′末端をｓａｐで 標識する。次いで、この標識したプライマーを用いてＰＣＲ法を行う。９５°Ｃ における９０秒間の変性、４５°Ｃにおける９０秒間のハイブリダイズ、次いで ７２℃における１２０秒間の合成というサイクルをだいたい２０サイクル行う。

調査するＤＮＡとして、全世界にわたる種々の地域から得た１１種のキイロショ ウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）野生型種の ゲノムＤＮＡを使用する。これらショウジヨウバエ野生型様は始めは個々の受精 能の子孫であり、ここ１０年来採取されている。ＰＣＲ反応を行った後、増幅し た断片を制限エンドヌクレアーゼＨａｅｍで開裂する。これにより、通常、それ ぞれ長さが２０２および１７７ヌクレオチドの２つの断片が得られる。通常、こ の工程はルーチン実験では必要ない。ここでは、分析の評価のためにのみ行う。

得られた断片を５％配列決定用ゲル上で分離し、次いでそのゲルを乾燥し、Ｘ− 線フィルムを乾燥したゲルに当てる。期待されるこれら両ＤＮＡ断片は、種々の ショウジヨウバエ野生型様で顕著な多型を示す。単純なりＮＡ配列を含有する２ ０２ヌクレオチド断片は４つの異なるサイズカテゴリーを示す（第３図参照）。

これらのサイズカテゴリーはそれぞれ３つのヌクレオチドだけが変化している。

トリヌクレオナトの反復配列内ではフレームシフトが始まるので、これは予期さ れるものである。３つの場合に、２つの異なるバンドが同時に見いだされる（第 ３図の５．８および９列参照）。このことは、２倍体生物では、遺伝子座がそれ ぞれ２回見いだされ、異なる対立遺伝子によって表され得るという事実（いわゆ る均衡冬型現象（ｂａｌａｎｃｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ））から説明で きる。１７７ヌクレオチド断片のバンドは、５または８ヌクレオチド離れている ３つの異なるサイズカテゴリーを示している（第３図参照）。８ヌクレオチドだ け短いバンドは、ＤＮＡ配列を標識した８ヌクレオチドの反復配列の欠失により 得られたものと推定される。長いほうのバンドの由来は不明である。これらの欠 失または挿入体は、潜伏的に単純なりＮＡ配列の領域内に期待され得るものに相 当している。

この単純な実験で調査した種の大部分は、既に相互に区別することができる。種 ２．７および１１ならびに３および４のみが互いに区別することができない。し たがって、実際の試験では、さらにプライマー対を使用するであろう。例えば、 同定を確実にするためには、２０から５０個の個々のＤＮＡ領域を試験すればよ い。個々のシ目つジヨウバエ野生型種のサイズカテゴリーはそれ自身で均一であ り、したがって観察される多型はそれほど頻繁でないので、もはゃ血縁関係を調 査することはできないであろう、という仮定から始まらなければならない。シ冒 つジヨウバエ野生型種はすべ−Ｃ単−ＣＶ起源の対からの子孫であり、この試験 のために数百の個体のＤＮＡを混合した。これらの「家系」内にパターンの変化 が起こっているなら、最大２つ以上のバンドを期待することができよう。しかし 、ここで行った場合はそうでない。この場合は、観察される長さカテゴリーは少 なくとも数１０世代で安定である。

観察される長さの変動は、実験中のポリメラーゼのエラーによっても生じ得る。

この可能性を排除し、同時に全体の再現性を向上させるため、１０個の独立した 反応混合物におけるショウジヨウバエ種３番の２つの異なるＤＮＡＭ製物を用い て実施例２で実施した実験を繰り返す。第４図から、すべての反応混合物により 同じバンドが導かれると考察することができる。同様の実験を異なる遺伝子座に ついても行った。しかし、バンドの長さの変化はいずれの場合も観察することが できなかった。このことは、本発明の反応が信頼できる程に再現性を有している ことを示している。

実施例４ ヒトの父子試験（ｐａｔｅｒｎｉｔｙ　ｔｅｓｔ）常染色体のヒト心筋アクチン 遺伝子由来の連続した領域をフランキングするプライマー対を使用する。この配 列はＧＴ／ＣＡジヌクレオチドの反復構造を有する単純な配列を含有している（ 第５図）。

プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用するニプライマー１　：　５ ’−ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３゜プライマー２　：　５’−Ｔ ＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＧＡ−３゜プライマー２の５°末端をＦｔｐで 標識し、次いで両オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用する。９４°Ｃ１分間 の変性相、４５℃２分間のハイブリダイズ相、および７２℃１分間の合成桁（最 後の合成桁は５分間）からなるサイクルを全体で２５サイクル行う。次いで、得 られた反応産物を６％変性アクリルアミドゲル上で分離し、得られたゲルを乾燥 し、暴露する。

結果を第６図に示す。試験した個体はそれぞれ、２つの主要バンドを示しており （それ以外のバンドの説明は以下で行う）、すなわちそれはこの遺伝子座の異な る長さ変異種に対してヘテロ接合である。

母方および父方は普通ｒ１０９ｎｔＪの長さ変異種を有しているが、しかしそれ らは他の変異種とは、母方がｒ１２７ｎｔＪ、父方が「１２１ｎｔＪの変異種を 有している点で異なっている。その子供は、父方および母方由来のこれら変異種 のいずれか１つを遺伝的に受け継ぐはずである。２人の子供について、実際この ような場合が起こったが、第３子（「？」と命名）は新たなｒｌ１３ｎｔＪ変異 種を示し、これは母方または試験した父方のいずれからも誘導することができな いものである。したがって、この子供は別の父をもつと推定しなければならない 。

ｒＣＪ列では、１つの長さ変異種しか有していない、クローンした制御−ＤＮＡ も処置している。他の試料と同様に、これも主要なバンドと幾つかの副次的バン ドを示す。これらは、増幅期に生成されるＰＣＲの産物に由来する。本明細書で は、これら２つのタイプの人為産物が存在する。第１のタイプは、Ｔａｑ−ポリ メラーゼがさらなるヌクレオチドを相捕的に合成したＤＮＡ鎖と結合させる傾向 にあることに由来するものである。これにより、主要バンドの上方にヌクレオチ ドを移動させるバンドが形成される。この効果は反応毎に異なっているが、バン ドのパターン分析の障害になるものではない。第２のタイプの産物は、増幅反応 期の「ずれ」によって生成される。これは、主要バンドからジヌクレオチドの距 離だけ下方に認めることのできるバンドを導く。これらの産物のバンドは実際の 長さ変異種と重複する場合には、分析を妨害しかねない。

トリヌクレオチドの反復モチーフを有する単純な配列では、増幅期に起こる配列 の「ずれ」の頻度が低いので、上記の人為産物バンドを示さない（実施例２参照 ）。

文　献 １、　ＥＰ−Ａ２０２００３６２ ２、サイキ（Ｒ，Ｋ、　５ａｉｋｉ）らの５ｃｉｅｎｃｅ　２３９（１９８Ｂ） 、　４Ｂ？−４９１３、ジェフレイス（Ａ、　Ｊ、　Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）らのＮ ａｔｕｒｅ　３１．４（１９８５）、　６７−７３４、ジエフレイス（Ａ、　Ｊ 、　Ｊｅｆｆｒｅｙｓ）らのＮａｔｕｒｅ　３１６（１９８５）、７６−７９５ ．Ｅ’Ｐ　８７　１１　６４０８．３６、トーン（Ｄ、　Ｔａｕｔｚ）、　Ｐｈ Ｄ−Ｔｈｅｓｉｓ（学位論文）チュービンゲン大学７　、）　−ツ（Ｄ、　Ｔａ ｕｔｚ）およびレンツ（Ｍ、　Ｒｅｎｚ）のＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７ ２（１９８４）、２２９−２３５ ８、トーン（Ｄ、　Ｔａｕｔｚ）およびレンツ（Ｍ、　Ｒｅｎｚ）のＮｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２（１９８４）、４１２７−４１３８ ９、トーン（Ｄ、　Ｔａｕｔｚ）らのＮａｔｕｒｅ　３２２（１９８Ｂ）、６５ ２−６５６１０、レビンソン（Ｇ、　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）およびグツトマン（Ｇ 、　Ａ、　Ｇｕｔｍａｎ）のＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏ ｎ　４（１９８７）、　２０３−２２１１１、マニアチス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ 　ｉｓ）、フリッチｚ　（Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ）およびサンプルツク（ Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク、１９ｇ２１２、スミス（Ｌ、　Ｍ 、　Ｓｍ１ｔｈ）らのＮａｔｕｒｅ　３２１（１９８６）、６７４−６７９１３ 、ワートン（Ｋ、　Ａ、　Ｗｈａｒｔｏｎ）らのＣｅ１ｌ　４０（１９８５）、 ５５−６２１４、カン（Ｙ、　Ｗ、　Ｋａｎ）およびドジ−（Ａ、　Ｍ、　Ｄｏ ｘｙ）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＩＪ、　Ｓ、 　Ａ、　７５（１９７８）、　５６３１−５６３５Ｆｉｇｕｒ　１ ＴＭα■３刀脚ひＴＣＴＣＧω論℃刀メ工Ｃ苗℃工弘−工工工ω■Ｆｉｇｕｒ　 ２ ズーｈ− 調製判ハ　雛吸吻し φ〃− 易　二１１３　ｎｔ 劃−鴎　−１０９ｎｔ Ｆｉｇｕｒ　６ 国際調査報告 国際調査報告 ＰＣＴ／ＥＰ８９１つ１２０３ ＳＡ　３２０ｎ４

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）分析しょうとするＤＮＡと少なくとも１つのプライマー対とのアニー リング〔ここに、プライマー対の分子の一方は単純なまたは潜伏的に単純なＤＮ Ａ配列における５′または３′のフランキングの相補鎖の１つと実質的に相補的 であり、アニーリングは、該プライマーの一方とのプライマー一制御複製反応に よって得られる合成産物が変性後に他方のプライマーをアニーリングするための 鋳型として利用できるような方向で起こるものである］、（ｂ）プライマー制御 したＰＣＲ反応、および（ｃ）ＰＣＲ反応の反応産物の分離および分折からなる ことを特徴とする、ＤＮＡ領域の長さ多型を分抗するための方法。
2. ２．単純なまたは潜伏的に単純なＤＮＡ配列が実質的にトリヌクレオチドのモチ ーフから構成されている請求項１に記載の方法。
3. ３．単純なまたは潜伏的に単純なＤＮＡ配列がＣＡＧ／ＣＴＧの配列モチーフを 含有している請求項１または２に記載の方法。
4. ４．プライマー対の分子を、５０から５００ヌクレオチド離れて、分析しょうと するＤＮＡとアニーリングする請求項１から請求項３までのいずれかに記載の方 法。
5. ５．少なくとも２つのプライマー対を使用する請求項１から請求項４までのいず れかに記載の方法。
6. ６．２から５０個のプライマー対を使用する請求項１から請求項４までのいずれ かに記載の方法。
7. ７．プライマーが１５から２５ヌクレオチドの長さを有する請求項１から請求項 ６までのいずれかに記載の方法。
8. ８．プライマー対の特定のＰＣＲ反応産物が適当なゲルにおいて個々のバンドに 分離することができるようにプライマー対の位置を選択する請求項１から請求項 ７までのいずれかに記載の方法。
9. ９．特定のＰＣＲ反応産物を放射活性標識または蛍光性色素剤などの非一放射活 性標識によって検出する請求項１から請求項８までのいずれかに記載の方法。
10. １０．分析しようとする単純なまたは潜伏的に単純なＤＮＡ配列を、遺伝学的規 定された遺伝子座内、またはその隣に配置させて、見いだされる多型がその遺伝 子座のマーカーとして利用できるようにする請求項１から請求項９までのいずれ かに記載の方法。
11. １１．（ａ）単純なまたは潜伏的に単純なＤＮＡ配列をフランキングする、放射 活性または蛍光的に標識されていてもよい１から５０個のオリゴヌクレオチドプ ライマー対の等モル混合物を含有する１つまたは幾つかの管、 （ｂ）複製のための酵素を含有する管、（ｃ）４つのデオキシヌクレオシド３リ ン酸を含有する管、（ｄ）適当な緩衝化保存溶液を含有する管、および要すれば （ｅ）キットの成分を試験するために適した対照ＤＮＡを含有する管、 からなる請求項１から請求項１０までのいずれかに記載の方法を実施するための キット。