JPH04501211A - ニューモシスティス・カリニの検出用核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ニューモジステイス・カリニの検出用核酸プローブ発明の分野 本願発明は二ニーモジステイス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉ ｎｉｉ）種に属する真菌９１１　（ｆｕｎｇｉ）の検出に関するものであり、さ らに具体的に言えば、ニューモジステイス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ 　ｃａｒｉｎｉｉ）の特殊検出用の核酸プローブ及び組成物をその使用方法とと もに提供するものである。

発明の背景 本願明細書中で用いられている「ニューモジステイス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃ ｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）　Ｊという術語は、小サブユニットｒＲＮＡの塩基 配列に基づく系統発生学的分類法によってこのように分類された真菌を指す。（ エドマンＪ、　Ｃ，（Ｅｄｍａｎ。

Ｊ、Ｃ，）、：ｌパックス、　Ｊ、Ａ、　（Ｋｏｖａｃｓ、Ｊ、Ａ、）、　７シ ユ＋、　Ｈ９（Ｍａｓｕｒ、Ｈｌ）、サンティ。

Ｄ、Ｖ、　（Ｓａｎｔｉ、ＤＪ、）、　ｊ−ルウラド、　Ｈ，Ｊ、　（Ｅｌｗｏ ｏｄ、　Ｈ，Ｊ、　）とソーギン、　Ｍ、Ｌ、　（Ｓｏｇｉ氏A　Ｍ。

Ｌ、）［１９８８コネイチヤー（Ｎａｔｕｒｅ）、　３３４　：　５１９）　ニ ーニーモジステイス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）は ニューモジステイス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　）属の一種である。ニューモ ジステイス・カリニは気道下部を冒す日和見性病源体である。

この原虫は小さい単細胞生物で、哺乳類宿主中に２つの基本型すなわち栄養体（ ｔｒｏｐｈａｚｏｉｔｅ）と嚢胞（ｃｙｓｔ）で存在すると信じられている。ニ ューモジステイス・カリニは人及び大部分の哺乳類宿主に感染する。

この寄生生物は正常個体中では稀にしか病気を引き起こさないにもかかわらずあ る種の免疫不全の状況では、生命をおびやかす間質性肺炎（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔ ｉａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を特徴として引き起こし、後天性免疫不全症候群 の罹患及び死亡をもたらす最大原因の１つである。

肺嚢腫肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の現在の診断方 法は、気管支肺胞洗浄（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ　ｌａｖａｇｅ）サン プルやもっとよく扱われるものでは、誘発喀痰サンプルのような気道サンプルに 対するゴモリメセナミン銀（Ｇｏｍｏｒｉ’　ｓ　ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ　５ ｉｖｅｒ）染色、トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　Ｂｌｕｅ）染色、ギ ムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染色というような組繊学的技術の利用を含む。これらの染 色法は、結果の解釈に細胞学者の専門的知識を必要とする。多数の迅速な実験室 内での方法が最近利用可能になった。抗体に基づく検査法もあれば、ＤＮＡに基 づ（検査法もある。ニューモジステイス属に特異的で採取した物質中に存在する 他の真菌類や細菌類とは反応しない核酸プローブを提供することが本発明の一つ の側面である。このようなプローブは伝統的方法に伴う多くの不便を避けるよう な種々のアッセイ系において利用可能である。通常のアッセイ条件下でプローブ にとって結合しやすい標的領域にハイブリダイズ可能なプローブを供給すること も本発明の様相である。コーンら（Ｋｏｈｎｅ　ｅｔ　ａｌ）はｒＲＮＡ配列に 対するプローブの作成方法について論じている（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　８　：　１１０４−１１１８．　１９６８）が、彼らは、ニューモ ジステイス・カリニに特異的にプローブの作成に必要な教示内容は与えていない 。

ペースとキャンベル（Ｐａｃｅ　ａｎｄ　Ｃａｍｐｂｅｌｌ）は様々な細菌種か らとったリポソームリポ核酸の類似性とその類似性の程度を定量的に測定するた めのハイブリダイゼーション法を論じている（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙ　１０７　：　５４３　５４７．１９７１）、同様に、ソーギ ン（Ｓｏｇｉｎ）、ソーギン及びウーズ（Ｗ。

ｅｓｅ）は、系統発生学的関係の評価に、異なるリボゾームＲＮＡ分子の一時構 造の特徴づけを用いる理論的及び実際的側面について論じている（Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎ　１　：　１７３１８４．　 １９７２）　。フォックス（Ｆｏｘ）。

ペックマン（Ｐｅｃｈｍａｎ）とウーズは原核生物の系統化へのアプローチとし て１６Ｓリポソーム：ＲＮＡの比較分類について論じている（Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　２７　 ：　４４−５７．１９７７）、　しかしながら、これらの文献では、真菌類及び 、とくに人の二ニーモジステイス・カリニに関してコーンの数えの欠陥をおぎな うことは不可能であり、臨床サンプル中におけるニューモジステイス・カリニ検 出アッセイに有用なニューモジステイス・カリニに特異的なプローブを提供しな い。

ホーガンら（Ｂｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ）は真正細菌類（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ） 及び真菌類の広範な代表的生物にハイブリダイズすると主張されている多くのプ ローブについて記述している（ヨーロッパ特許公報ＷＯ３８１０３９５７）。し かしながら、ホーガンらは本発明のプローブの開示はしておらず、またそのよう なプローブのデザインに必要な教示内容も与えていない。

エドマン（Ｅｄｍａｎ）　、：ｌパックス（Ｋｏｖａｃｓ）、　７スール（Ｍａ ｓｕｒ）　、サンティ（Ｓａｎｔｉ）　、　ｘルウラド（ＥｌｗｏＯｄ）とソー ギン（Ｓｏｇｉｎ）は（Ｎａｔｕｒｅ　３３４　。

ｐｐ５１９−５２２．１９８８）はラットのニューモジステイス（Ｐｎｅｕｍｏ ｃｙｓｔｉｓ）の１８３ｒＲＮＡに対する３種のプローブセットについて記載し ている（Ｎａｔｕｒｅ、３４３．ｐｐ５１９−５２２．１９８８）。ラットのニ ューモジステイスが人間の疾患を引き起こし得るか否かがわかっていないため、 ラットのニューモジステイス感染と人のニューモジステイス感染との間の相互関 係で、明らかになっているものではない。

エドマンら（Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）は本発明に係る人の二ニーモジステイス プローブもフエレット（Ｆｅｒｒｅｔ）ニューモジステイスプローブも開示して おらず、またそのようなプローブのデザインに必要な教示内容も与えていない。

リポソームは遺伝的情報を細胞のタンパク質や、生命の主要な構成および触媒要 素に翻訳する唯一の公知手段として使えるのでリポソームはすべての生物にとっ て深く重要である。すべての細胞にリポソームが存在することが、この重要性の 明らかな現われである。

リポソームは、少なくともサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ５ｉａｅ）では５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓ　ｒＲＮ Ａとして示される４つの別個のｒＲＮＡ分子を含む。これらの名称は歴史的に、 その沈降速度により決定されたＲＮＡ分子の大きさに関連している。しかし、実 際には、リボゾームＲＮＡ分子の大きさは生物種間で微妙に異なっている。にも かかわらず、５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、２８ＳｒＲＮＡは、通常どのような真正 菌類細胞（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ）でも相同ＲＮＡ分子に対する総 称的名称として使用されており、本明細書中においても、この慣例に従う。本明 細書中で用いているように、プローブとは、定義された、前もって決定しておい たストリンジエンシー（ｓ　ｔ　ｒ　ｉｎｇｎｃｙ）条件下で、プローブが特異 的に（すなわち２．優先的に下記のハイブリダイゼーションを参照）標的核酸配 列にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を、デザイ ンもしくは選択によって含む、合成のあるいは生物学的に産生された核酸（ＤＮ Ａ又はＲＮＡ）を言う。ハイブリダイゼーション特性に加えて、プローブは、特 定のアッセイ条件下で、適切に最適に機能することに関係するある種の構成要素 も含んでも良い。例えば、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を改善したり （すなわち末端のキャッピング（ｅｎｄ　ｃａｐｐｉｎｇ）によって）、検出リ ガンド（すなわち蛍光、３２Ｐ。

ビオチンなど）を持ったり、あるいは固相支持体上への保持を容易にする（すな わちポリープオキシアデノシン“テール（ｔａｉｌｓ）”）ために、プローブに 部分的な修飾を施しても良い。このような修飾は、ハイブリダイゼーションアッ セイにおいて標的、非標的組織間の識別を有効に行える能力という、基本的なプ ローブの機能をさらに精巧なものに作りあげる。ハイブリダイゼーションは、伝 統的に、あらかじめ設定した反応条件下で２つの部分的もしくは、完全に相補的 な核酸鎖が反平行なかたちで集まって、特異的かつ安定な水素結合を有する二本 鎖の核酸を形成する過程として理解されている。

具体的な−組みのハイブリダイゼーション条件中のストリンジエンシーは、２つ の核酸間の誤対合（ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）の度合い及び幾何学的性質とともに 、プローブ／標的二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）の塩基組成によって定義される。

ストリンジエンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃 度及び種類、存在する変性剤の種類と濃度、及び／あるいはハイブリダイゼーシ ョンの温度によっても支配されうる。通常、ハイブリダイゼーション条件が厳し くなるにつれて、安定な複合体の形成が可能ならば、プローブは長い方が好まれ るようになる。当然の結論として、ハイブリダイゼーション条件（例えば、行れ るアッセイのタイプに基づく）のストリンジエンシーは使用されるに好ましいプ ローブにある種の特徴を要求する。このような関連はよく理解されており、した がって当業者による巧みなとり扱いが可能である。一般的に、プローブの長さに もよるが、当業者の間では、約０．　９モルの塩溶液中でおよそ３５℃−６５℃ がストリンジントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）として 理解されている◇本発明の種々な原理と側面に従って、特定の条件下でニューモ ジステイス・カリニのリポソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）もしくは、ｒＲＮＡ遺 伝子（ｒＤＮＡ）にハイブリダイズしテストサンプル中に存在すると予想される 他の真菌類、細菌類のｒＲＮＡやｒＤＮＡには同じ条件下でハイブリダイズしな いようなりＮＡあるいはＲＮＡ塩基配列からなる核酸プローブ及びプローブセッ トが提供される。

つまり本発明のプローブは、臨床サンプル中のニューモジステイス・カリニの特 異的検出に役立つ核酸ハイブリダイゼーションアッセイの開発の基礎を提供する 。

本発明者らの経験では、このような核酸ハイブリダイゼーションに基づくアッセ イは、テストサンプル中の細菌類、真菌類の検出のための目下のところもっとも 有効な微生物学的方法に関して高度の利用可能性をあたえるべく発見されたもの であり、下記の一般的特徴を有する。

ａ）　増大感度、すなわち与えられたサンプル中の細菌類あるいは真菌類をより 高頻度で検出する能力； ｂ）　安価な試薬の使用と労力削減によるアッセイコストの潜在的に重要な削減 。

Ｃ）　標的細菌類あるいは真菌類の生化学的に特異な菌株でさえ正確に同定でき る能力； ｄ）　このような検査が検査前にサンプルからの標的細菌類あるいは真菌類の単 離を必要としないことによって得られるより迅速な結果。

本発明のプローブをｒＲＮＡに対応するものにすることによって受ける他の利点 には、検出されるｒＲＮＡは、細胞質量（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｓｓ）の重要 成分を構成しているという事実が含まれていることが認識されている。細胞内リ ポソーム含有量の推定はさまざまであるが、活発に増殖しているニューモジステ イス・カリニは、細胞あたり５０，０００リポソ一ム以上、したがってｒＲＮＡ の各々について５０．０００コピ一以上（リポソーム中に化学量論的に１＋１： １：１で存在）含有し得る。これに対して、遺伝子やそのＲＮＡ転写産物のよう な他の細胞内標的分子となりうるものは、含有量がはるかに低いためリポソーム のように理想的伝子）は同世代での微生物（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）間で側方転位 （ｌａｔｅｒａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を受けにくいと見られることである。し たがって、例えば、同世代微生物間に側方伝達（ｌａｔｅｒａｌ　ｔｒａｎｓｍ ｉｓｓｉｏｎ）を受ける可能性のある、プラスミドに運ばれる遺伝子又はその生 成物について多分あてはまる遺伝子特異的標的よりむしろ微生物特異的分子標的 をｒＲＮＡの一次構造は与える。加えて、本発明では、これまでに検査されたす べてのヒト由来ニューモジステイス・カリニの単離物において十分に類似してい るニューモジステイス・カリニｒＲＮＡ標的配列に対するプローブを提供し、当 該プローブはこのようなすべてのヒトのニューモジステイス・カリニにおける標 的領域にハイブリダイズすることができる。都合のよいことに、はとん°どのヒ ト以外のニューモジステイス・カリニｒＲＮＡでは、これらの同一のｒＲＮＡ標 的配列は十分に異なっているため、プローブ１４８５及び１４８７がヒトのニュ ーモジステイス・カリニｒＲＮＡにハイブリダイズする条件下では、これらはほ とんどヒト以外の二ニーモジステイス・カリニｒＲＮＡにはハイブリダイズしな い。これらのプローブの特性は、おのおの包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）及 び排他性（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｔｙ）として定義される。

本発明の他のプローブである１１５９，１１６２．１４８４，１４８６，１４８ ８．１４９１，１４９２．１４８６は、プローブ１４８５．１４８７と同様にテ ストされたヒトのニューモジステイス・カリニのすべての単離物に関して包括的 （ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）であり、さらに、これらのプローブはヒト以外ニューモ ジステイス・カリニにもハイブリダイズする。プローブ１４９３，１４９４，１ ４９５゜は白イタチ（ｆｅｒｒｅｔ）のニューモジステイス・カリニにはハイブ リダイズするがヒトのニューモジステイス・カリニにはハイブリダイズしない。

プローブ１１５９は他の真菌類にもハイブリダイズし、ある種のアッセイ方式で は特に役立ち得るプローブの組みあわせの有用な構成要素の１つである。現在の ところ、ヒト以外の起源の二ニーモジステイス・カリニも人に感染可能かどうか 明らかではないので、すべての上記のプローブは、少なくとも研究アッセイで初 期のうちは有用であろう。

ニューモジステイス・カリニに関する本発明のプローブの顕著な包括性及び排他 性を有するプローブを作成できたという発見は、予測不可能かつ予想外であった 。

図面の簡単な説明 以下の表及び図を参照することで、本発明の原理及び様相をさらに深く理解しつ ると推測する。

第］１表一本発明の望ましい１８Ｓ　ｒＲＮＡを標的とするプローブのヌクレオ チド配列をこれらのニューモジステイス・カリニ標的ヌクレオチド配列と並べて 示す。サツカロミセス・セレビシｘ　（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）由来の１８ＳｒＲＮＡの対応部位を比較のため示す。ＲＮＡ　（ 標的）塩基配列は５′から３゛の向きに記されており、プローブの塩基配列はＤ ＮＡで３゛から５′の向きに記されている。プローブは、その包括性及び排他性 の反応（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を左右するバリエーションのコア領域とともに示し である。

第２表−ドツトプロット・ハイブリダイゼーション・アッセイにおいて、ニュー モジステイス・カリニ菌株からのＤＮＡ及びＲＮＡ調製物の代表的サンプルに対 する望ましい１８Ｓ　ｒＲＮＡプローブの包括性反応を例示している。

第３表−ドツトプロット・ハイブリダイゼーション・アッセイにおいて、ニュー モジステイス・カリニ以外の真菌類及び細菌類の代表的サンプルに対する望まし い１８Ｓ　ｒＲＮＡプローブの排他性反応を例示している。

第１図−インーサイチュ−（Ｉｎ−ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションデータ： ローダミン−Ｘでラベルしたプローブ１４８６の（Ａ）ニューモジステイス・カ リニ陽性の患者の気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　ｌａｖａｇｅ）サンプル（ １００ＯＸ）、及び（Ｂ）ニューモジステイス・カリニ陽性の患者の誘発喀痰サ ンプル（１００ＯＸ）に対するイン−サイチューハイブリダイゼーションの結果 本発明のプローブの開発の第１段階は、まず、１８Ｓ　ｒＲＮＡ中で、ニューモ ジステイス・カリニ特異的核酸プローブの標的部位として役立ちうる領域の同定 を含む。実際には、ニューモジステイス・カリニ以外のどの生物がどんなテスト サンプル中に存在するかを非分析的に予想することは困難である。ニューモジス テイス・カリニ以外のかかる潜在的な真菌類及び細菌類が非常に多数いるためど の与えられたプローブの塩基配列についても排他性を証明することは、予測不可 能なだけでなく、非常に困難でありかつ骨が折れる。最終的にプローブを使用し てスクリーンするすべてのテストサンプル中に存在しうるニューモジステイス・ カリニ以外の真菌類及び細菌類がどのような種類のものであるか調べる必要を除 くため、より厳格な基準を採用した。

これは、ニューモジステイス・カリニ間及びニューモジステイス・カリニと他の 真菌類間の系統発生論的関係についての知識を必要とする。具体的には、効果は あるが前もって立証されていない仮説が採用された。その仮説とは、ニューモジ ステイス・カリニの代表的かつ進化論的な近縁種のｒＲＮＡにおける相同領域と は十分具なる、ニューモジステイス・カリニｒＲＮＡにおける特定の標的領域が 同定可能ならば、そのような配列に対するプローブは、ハイブリダイゼーシジン アッセイによってニューモジステイス・カリニとその近縁種を識別するために使 用できるということを決定することで排他性の基準が満足され得るというもので ある。系統発生学的観察にもとづいて、そこで、その実際の同一性は必ずしもわ からない場合でも、より離れた関係にある微生物のｒＲＮＡ塩基配列は、前述し たニューモジステイス・カリニの進化論的な近縁種をよりさらに、塩基配列の特 定領域において、予想可能であるほど異なっているはずであると推定した。しか しながら、このような領域が存在するか、また存在するとしてｒＲＮＡのどこに そのような領域は位置しているかを非分析的に推測することは不可能である。

核酸ハイブリダイゼーションプローブの有効な標的部位となりうるニューモジス テイス・カリニｒＲＮＡの領域を同定する際の最初の段階として、数種の代表的 なニューモジステイス・カリニの１８Ｓ　ｒＲＮＡの核酸塩基配列を決定した。

ニューモジステイス・カリニの１８３　ｒＲＮＡ遺伝子コード領域を遺伝子増幅 法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第４， ６８３，２０２号）によって、約ｏ、５から１．０μｇのヒトあるいは白イタチ の肺組織に感染したニュ−モジステイス・カリニの全ＤＮＡをプライマー９３６ （フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー）とプライマー９３５（リバース（ ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー）を用いて増幅した。プライマー９３６はその真菌 の１８Ｓ　ｒＲＮＡに相補的な１８Ｓ　ｒＤＮＡ遺伝子鎖にハイブリダイズする ようにデザインされる。プライマー９３５は１８ＳリポソームＲＮＡ遺伝子のｒ ＲＮＡ類似の鎖にハイブリダイズする。増幅した１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を標準 的な研究室用プロトコール（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ）　 １９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｏｌｎｉｎｇ　；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｖ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ盾Pｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｐｐ、　 ５４５　）によって、このプライマーに組み込まれた制限エンドヌクレアーゼ部 位を用いてクローニングした。塩基配列決定は、サンガーら（Ｓａｍｇｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ）、　１９７７．　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ　７４：５４６３−５４ ６７の方法に従って行われた。決定されたニューモジステイス・カリニのｒＲＮ Ａヌクレオチド配列は、他の入手可能なｒＲＮＡヌクレオチド配列、とくにサツ カロミセス・セレビシェのものと比較した。異なる宿主特異的ニューモジステイ ス・カリニとその近縁種であるサツカロミセス・セレビシェとのｒＲＮＡヌクレ オチド配列の比較は特に有用であることが判明した。異なる宿主特異的ニューモ ジステイス・カリニとニューモジステイス以外の真菌との間で異なるような、配 列のいくつかの領域を同定した。１３Ｓ　ｒＲＮＡ配列中におけるこれらの領域 の位置を第１表に示す。本発明の目的とする状況において、ヒト、ラットあるい は白イタチ（ｆｅｒｒｅｔ）のニューモジステイス・カリニ；もしくは３つすべ てに選択的にハイブリダイズするようなオリゴヌクレオチドプローブ（３３−４ ８ヌクレオチド長さ）がデザインされた。

これらは次のようにデザインされた。１）　ニューモジステイス・カリニをサツ カロミセス・セレビシェから、あるいはニューモジステイス・カリニを他の真菌 類から識別するような核酸塩基配列の違い［コア、バリエーション領域中で大文 字を入れる上段の活字ケース中の文字で示されているコを最大限利用する。２） 標的ｒＲＮＡ中及びプローブ分子間両方に局在している自己相補的効果を最小限 にする。他の上記の（背景）中で議論されているものと同様にこれらのパラメー ターを最高に活用することは、望ましい特異性をハイブリダイゼーション効率を 備えたプローブに帰結する。

第２表はニューモジステイス・カリニの代表的サンプルに対する望ましいプロー ブのサザン・プロットハイブリダイゼーションアッセイによる包括性の反応を例 示している。

第３表はニューモジステイス・カリニ以外の真菌類及び細菌類に対する望ましい プローブのドツトプロット・ハイブリダイゼーション・アッセイで示す排他的反 応を例示している。

プローブの物質的説明 前述のプローブ選択方法により臨床サンプル中の二ニーモジステイス・カリニ同 定に有用な数種のプローブを与えた。１１５９，１１６２，１４８４．１４８５ ．１４８６，１４８７，１４８８，１４９１，１４９２．１４９３，１４９４゜ １４９５．１４９６．１４９７のプローブはすべて１８Ｓ　ｒＲＮＡ塩基配列か らデザインされている。以下の望ましいオリゴヌクレオチドプローブを本明細書 に開示する； プローブ　１４９１：　５−ｃＡＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴｒＧＡＴＣＡＡＣＴＴ ＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧ−３’プローブ　１４９４：　５’−ｃＧＡＡＣＡＴＣ ＧＡＡＡＣＣＡＡＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＣＧＡＡ−３゜プローブ　１ ４９５：　５’−ｃＧＣＣＡＴＣＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡ ＧＴＣＣＧＡ＾−３゛１０−１１４９６：　５’−ｃＧＡＡＧＧＧｃＡＴＧｃＴ ＧＧτＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣ−３゜１０−ブ　１４９７：　 ５°−ｃＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴ Ｃ−３’プローブと、ニューモジステイス・カリニの１８３　ｒＲＮＡにおける 前記プローブの標的配列を表１に示す。サツカロミセス・セレビシェ１８Ｓ　ｒ ＲＮＡの対応するヌクレオチド位置も同様に示す。加えて、２種のオリゴヌクレ オチドブライマー９３５と９３６が、このような培養不可能な生物中のこれらの 遺伝子解析を容易にするため、ニューモジステイス１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＰ ＣＲ増幅のためデザインされた。これら２つのプライマーはり、メトリン（Ｍｅ ｄｌｉｎ）、　Ｈ。

Ｌ、エルウッド、Ｓ、Ｓ、スティッケル（Ｓｔｉｃｋｅｌ）とＭ、　Ｌ、ソーギ ン（Ｇｅｎｅ７１　；　４９１−４９９．１９８８）に記載されている。これら のプライマーの塩基配列は以下に示しており、明確に表されている。

１ライ？−９３６：　５°−ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＣＴＧＧＴＴ ＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ−３’ブライ？−９３５：　５°−ｃｃｃｇｇｇａｔ ｃｃａａｇｃｔＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣ−３’プラ イマー９３５と９６３に関して、小文字活字ケース中の文字部分は有用な制限エ ンドヌクレアーゼ認識クローニング部位を増幅産物に付加するようデザインされ ている。大文字活字ケース中の文字部分は、１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の５′（プ ライマー９３６）もしくは３′（プライマー９３５）末端に特異的にハイブリダ イズするヌクレオチドに対応する。

表１に示されているいくつかの標的領域に対して２以上のプローブがデザインさ れた。その標的領域は、１）ニューモジステイス・カリニの異なる単離物の配列 の補体（この場合そのような単離物はい（つかの配列差異を示す）、又は２）す べてのニューモジステイス・カリニ（この場合、ニューモジステイス・カリニ単 離物間にほとんど又は全く配列バリエーションが見い出せなかった）に対応して いる。各々のプローブの基礎となっている（即ち相補的である）特定の塩基配列 が表１にプローブと標的塩基配列を並べたものを観察することで与えられている 。したがって、例えば、表１をみればプローブ１４８４はヒトのニューモジステ イス・カリニ配列に対して、この標的領域を通して相補的であり、関連したプロ ーブ１４９３は白イタチ（ｆｅｒｒｅｔ）のニューモジステイス・カリニに相補 的であることがわかる。（塩基対の法則は、ＡはＴもしくはＶとＧはＣと１対に なるように指示しているが、第１近似（ｆｉｒａｔ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏ ｎ）に応じて種々の非標準的塩基対［すなわち、Ｇ：Ｕ、ＧＥＴ又はＡ　：　Ｇ ］が、特定の目的のためにプローブに導入され得る。）しかしながら、ニューモ ジステイス・カリニ菌株間で１つもしくは両方のプローブによるクロス−ハイブ リダイゼーションが起こることが期待される（とともに望ましい）。上述したプ ローブの特異的ハイブリダイゼーション反応は、それらが使用されたアッセイ方 式に、たいへん強く依存している。逆に、アッセイ方式は特定のプローブの最適 デザインの特徴をある程度指示する。本発明のプローブの“本質（ｅｓｓｅｎｃ ｅ）”は上で名づけたプローブ中のヌクレオチド鎖に限定されると解釈されるべ きではない。例えば、後述するドツトプロットアッセイ（及びある種の他の予期 されるアッセイ）中では、これら特定のオリゴヌクレオチドの長さが用途により 最適化された。当業者間では、最適プローブ長は、選択されたハイブリダイゼー ション条件のストリンジエンシーの１つの機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であること は、よく知られており、従って、本発明のプローブの長さも、それに伴って変化 させてもよい。また１つ以上のプローブからなる組みわわせについて考慮すると 、すべてのその用いられるどの特定の方式においても一致した挙動をすべてのプ ローブが示すことが望ましい。したがって、ある特定のプローブの正確な長さは 、ある程度まではその特定の意図されている使用法を反映すると予想される。

本明細書に記されたプローブの“本質（ｅｓｓｅｎｃｅ）”は、上記した、また 表１（コア・バリエーション）に記載されたニューモジステイス・カリニに特異 的な配列の発見及び利用に存する。

プローブ反応のハイブリダイゼーション解析表］、に示される塩基配列データは 、本発明によるプローブが他の真菌類や細菌類を排除し、二ニーモジステイス・ カリニを特異的に検出する点に於いて、プローブの有効なハイブリダイゼーショ ン反応が多様であることを示唆する。しかし、相対的にニューモジステイス・カ リニの塩基配列はほとんど調べられていない。

塩基配列解析により調べられていない他のニューモジステイス・カリニに塩基配 列のバリエーションが存在することもあり得る。そのようなバリエーションはこ れら未調査のニューモジステイス・カリニ単離物に対して使える見込みのあるプ ローブによるハイブリダイゼーションを弱めるか又は排除する可能性もある。

プローブの包括的な性質と同様に重要なのは、プローブの排他的な性質、即ちニ ューモジステイス・カリニ以外の真菌類や細菌類に対するプローブの反応性であ る。

潜在的にニューモジステイス属の微生物を含むテストサンプル中にひよつとして 存在するかもしれないニューモジステイス・カリニ以外の菌株数や種類は非常に 多い。

それ故に、代表的なニューモジステイス・カリニ及びニューモジステイス・カリ ニ以外の真菌類や細菌類に対するプローブの特性をドツトプロット法を利用した ハイブリダイゼーション分析により決定した。

本発明の個々のプローブの各々に対するハイブリダイゼーションデータが提供さ れている一方で、個々のプローブの総和であるハイブリダイゼーション特性を示 すプローブの有用な組み合わせ（セット）もまた、このデータによって明確に予 測されることが留意されるべきである。

実施例１：　プローブハイブリダイゼーション反応のサザンプロット解析すザン プロット解析は、周知の手法に従い、アクリルアミド又はアガロースゲル上でＤ ＮＡをサイズ分け（ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ）　Ｌ／、ゲル内で ＤＮＡを変性させ、電気泳動又は毛管現象（すなわち、プロッティング）により ＤＮＡを当該ゲルからニトロセルロース、ナイロン或いは他の誘導体化膜（ｄｅ ｒｉｖａｔｉｚｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）のようなフィルター（これらは特に この目的のための市販品を容易に入手できる）上に移して固定する。続いて、そ のＤＮＡに対し様々な条件（即ち、ストリンジエンシーズ）のいずれかに於て、 目的のヌクレオチド配列やプローブを用いてハイブリダイゼーションテストを行 う。ストリンジェントな条件下では、標的となる塩基配列に刻してより高い相補 性をもつプローブが、相補性のより低Ｌ％ものより強くハイブリダイズする。

表２に示した実験に用いたＤＮＡはニューモジステイス・カリニ陽性の（ヒト） 患者の気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　ｌａｖａｇｅ）サンプル又は誘導化痰 （ｉｎｄｎｃｅｄ　ｓｐａｔｕｍ）サンプルから標的な方法で調整した。１８ｓ 　ｒＲＮＡ特異的プライマー９３５（正向き（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー）及 び９３６（逆向き（ｒｅｖｅｓｃ）プライマー）を用いた遺伝子増幅法（ポリメ ラーゼ・チェイン・リアクション：ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２） により０．　５μｇから１．０μｇの全ＤＮＡからニューモジステイス・カリニ の１８Ｓ　ｒＤＮＡ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ試料の１０分の１を１％アガロ ースで電気泳動し、サザンの示した方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ　 Ｍａｎｕｅｔ）によりニトロセルロースフィルター上に移した。リン３２　（” Ｐ）で末端標識したオリゴヌクレオチドプローブをフィルターにハイブリダイズ させた。　ハイブリダイゼーション液（０，９Ｍ　ＮａＣ１，０，１２Ｍ　Ｔｒ ｉｓ−ＭＣＩ　ｐＨ７，８，６ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＫＰＯ４，０，１％ ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸、０．００２％フィコル（ｆｉｃｏｌｌ）、　０． 　０２％ＢＳＡ。

０．００２％ポリビニルピロリジンを含む）中で、６０℃、１４時間から１６時 間、標的のｒＤＮＡに対し、ここに記述したオリゴヌクレオチドプローブをハイ ブリダイズさせ、６０℃で１５分間、３回（０，０３Ｍ　ＮａＣ１，０，００４ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７，８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中で ）ハイブリダイゼーション後の洗浄を行い、結合していないプローブを除いた。

上述のハイブリダイゼーションと洗浄に引き続き、そのハイブリダイゼーション フィルターをＸ線フィルムに露光させ、既知量の標的材料（ＤＮＡ）の対照レー ン（ｃｏｎｔｒｏｌ　１ｉｎｅ）と比べ、視覚的にシグナルの強さで“計測（ｓ ｃｏｒｅ）”　シた。

ハイブリダイゼーション強度は＋＋＋＋（塩基配列の決定により、明らかにプロ ーブと標的の塩基配列が完全に一致する対照ニューモジステイス・カリニのレー ンと同等の７ゾブリダイゼ一シヨン強度を示すもの）から＋（Ｘ線フィルムに長 時間露光させ、ようやく検出できるもの）又は（ハイブリダイゼーションなし） までの段階を用い、種々の微生物とそのプローブ間のハイブリダイゼーション強 度を比較し易くした。この表示形式（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　ｆｏｒｍａｔ）はハ イブリダイゼーションの程度を示す要約データを即座に視覚的に一覧できるため 、未処理の生の数値で表示するよりも好まれる。

表２から明らかなように、プローブ１１５９，１１６２，１４８４，１４８６゜ １４８８．１４９１及び１４９２は調査したすべてのニューモジステイス・カリ ニの単離物の増幅した１６ＳリポソームＲＮＡ遺伝子及びＲＮＡとハイブリダイ ズした。その他のプローブは様々な潜在的に有用なパターンで、種々の宿主特異 的なニューモジステイス・カリニとハイブリダイズした。

実施例２・　プローブハイブリダイゼーション反応のドツトプロット解析周知の 手法に従い、ドツトプロット解析は一種類或いは１群の核酸を、特にこの目的の ための市販品を容易に入手できるニトロセルロース、ナイロン或いは他の誘導体 化膜のようなフィルターに固定化する。ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれもこれらのフ ィルター上に容易に固定され、続いて様々な条件（即ち、ストリンジエンシーズ ）のいずれかに下で目的のヌクレオチド配列やプローブを用いてハイブリダイゼ ーションテストを行うことができる。ストリンジェントな条件下では、標的の塩 基配列に対してより高い相補性をもつプローブが相補性のより低いものより強く ハイブリダイズする。

表３に示した実験では、示した微生物より調整した１７１０マイクログラムの精 製ＲＮＡ　（レーンら（Ｌａｎｅ　ｅｔ　ａｌ）、　１９８５　、　Ｐｒｏｃｅ ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆｓｃｉｅ ｎｃｅ、ＵＳＡ　８２：６９５５−６９５９）をニトロセルロースフィルター上 にスポットした。オリゴヌクレオチドプローブは標準的な方法により放射性のリ ン３２で末端標識した。

ドツトのｒＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーショ ンは実施例１で記載したのと同じ方法で行った。

ハイブリダイゼーションと洗浄に引き続き、ハイブリダイゼーションフィルター をＸ線フィルムに露光させ、前述（実施例１）のように既知量の標的材料（ＲＮ Ａ）の対照スポットと比較し、視覚的にシグナルの強さを“計測（ｓｃｏｒｅｄ ）“した。

表３に示されるように、１］５９を除（すべてのプローブが卓越した排他性（即 ち、ニューモジステイス・カリニ［表２コとはハイブリダイズし、他の真菌類や 細菌類とはハイブリダイズしない）を示した。プローブ１１５９は他のプローブ に比べてより広い包括性をもつ。テストしたすべてのニューモジステイス・カリ ニ単離物にハイブリダイズするのに加え、他のいくつかの真菌類や哺乳類のｒＲ ＮＡとも（様々な程度で）ハイブリダイズする。プローブ１１５９は“仲間（ｃ ｏｍｐａｎｉｏｎ）”探索リガンドを持ったプローブとして設計され、以下の実 施例４で記載するような二重プローブハイブリダイゼーション方式で記載された ニューモジステイス特異性プローブとともに使用されると有用である。

実施例３：イン・サイチュー（ｉｎ−ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションアッセ イによるプローブハイブリダイゼーション反応の包括性の解析の位置と量の決定 に広く用いられている（ゴール、Ｊ、Ｇ及びパーデユー、Ｍ、Ｌ。

（Ｇａｌｌ、Ｊ、Ｇ　ａｎｄ　Ｐｏｒｄｕｅ、Ｍ、Ｌ、）［１９６９コ　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　５３　：　３７８：ブリガティ、Ｄ 、、マイエルシン、リアリ、Ｊ、Ｊ、　、　スバルホルツ、Ｂ、。

トラビス、Ｓ、Ｚ、　、フォノ、Ｃ，Ｋ、Ｙ。、シャン、Ｇ、Ｄ、　、ワード、 Ｄ。

Ｃ１，（Ｂｒｉｇａｔｉ、Ｄ、、）ｌｙｅｒｓｏｎ、Ｌｅａｒｒｙ、Ｊ、Ｊ、、 ５ｐａｌｈｏｌｚ、Ｂ、、Ｔｒａｖｉｓ、Ｓ、Ｚ、、Ｆｏｎ■AＣ，Ｋ。

Ｙ、　、］ｌＩｓｕｎｇ、Ｇ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｗａｒｄ、Ｄ、Ｃ，、）　［１９ ８３］　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２６　；　３２　；　：ｌ−^クス。

Ｋ、　Ｃ，、ディリオン、　Ｄ、Ｖ、、アンガラ−、Ｌ、Ｂ、、アンガラ−、Ｒ ，Ｃ，、（Ｃｏｘ、に、　Ｃ，、Ｄｅｌｅｏｎ。

Ｄ、　Ｖ、、Ａｎｇｅｒｅｒ、Ｌ、Ｍ、　、ａｎｄ　Ａｎｇｅｒｅｒ、Ｒ，Ｃ， 、）　［１９８４］　Ｄｅｖｅｌ、Ｂｉｏｌ、　１０１　；@４８ ５、ローレンス、Ｊ、Ｂ、、ヴイルネイブ、Ｃ，Ａ、、シンガー、　Ｒ，Ｈ，、 （Ｌａｗｒｅｕｃｅ、　Ｊ、　Ｂ、　、　Ｖｉｌｌｎａｖｅ、Ｃ，Ａ、、ａｎｄ 　Ｓｉｎｇｅｒ、Ｒ，Ｈ，、）　［１９８８：］　Ｃｅ１ｌ　５２　二５１　： デロング、Ｅ、Ｆ。

、ウィッカム、Ｇ、Ｓ、、ペース、　Ｎ、Ｒ，、（Ｄｅｌｏｎｇ、Ｅ、Ｆ、　、 　Ｗｉｃｋｈｅｍ、　Ｇ、　Ｓ、　、ａｎｄ　Ｐａｃｅ、　m、Ｒ，。

［１９８９コ５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：１３６０）　。固定した未処理の細胞 又は組織切片に１８ＳリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）に相補的な蛍光標識した オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、蛍光顕微鏡で観察した。

ニューモジステイス・カリニ陽性の患者から採った気管支洗浄サンプルや痰のサ ンプルは遠心分離により元の体積の１０分の１に濃縮し、その３０μｍをきれい なスライドガラス上に塗布した。肺の組織は直接スライドガラスに接触させて調 整した。組織を接触させて塗布したサンプルを風乾させ、７５％メタノール−２ ５％氷酢酸中、室温で１０分間処理して固定し、再び風乾した。サンプルを−連 のエタノール（５０％、７０％、９０％、１００％の順に）に浸して脱水し、風 乾した。

もし既に組織がパラフィンに包埋されているならば、サンプルをキシレン処理（ １０分間処理を３回）し、組織のパラフィンを除去する。過剰のキシレンを１０ ０％エタノールですすいで除き、風乾する。５倍ＳＥＴ　（７５０ｍＭ　ＮａＣ １，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）と０．２ ％ウシ血清アルブミン（シグマ社製；　ｆｒａｃｔｉｏｎＶ）、　１０％デキス トランサルフェート（シグマ社製；平均分子量５０，０００）及びローダミン− Ｘ標識した１゜７−２．０ｎｇ／μｍのオリゴヌクレオチドプローブ１４８６を 含むプローブハイブリダイゼーション混合液をそれぞれのスライドに塗布した。

オリゴヌクレオチドのローダミン−ｘｍ識はプロングら（Ｄｅｌｏｎｇ　ｅｔ　 ａｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３　：１６６０；１９８９）の方法によった。ス ライドをカバースリップ（ｃｏｖｅｒ　５ｌｉｐ）で覆い、蒸気室中で６０℃で １６−１８時間インキュベートした。２ｘＳＥＴに浸してカバースリップを外し 、スライドは直ちに０．２ＸＳＥＴ中、６０℃１０分間の洗浄を３回行った。ス ライドを風乾し、直ちに観察、或いは観察するまで４℃の暗所に保管した。サン プルをＡＣＣＵ、ＭＯＵＮＴ　６０ＴＭマウンティングメディウム（Ｍｏｕｎｔ ｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）に載せ、油浸で５００倍及び１０００倍で検鏡した。

ニューモジステイス・カリニ陽性を示す気管支洗浄サンプル又は痰のサンプルの 本実験の結果は図１に示す。

図ＩＡ及び図ＩＢから明らかなように、ローダミン−Ｘ標識したニューモジステ イス・カリニに特異的なプローブ１４８６は気管支洗浄サンプル及び誘導化され た痰のサンプル中のニューモジステイス・カリニに対してのみ強（ハイブリダイ ズした（明るい赤色蛍光で示される）。ヒト、ラット、白イタチ（ｆｅｒｒｅｔ ）の′試料を用いた他の実験でも（データは示さない）すべてのプローブは表２ 及び表３に示されるハイブリダイゼーションパターンから予期される通りの結果 を示した。

実施例４．　液相ハイブリダイゼーションアッセイによるプローブハイブリダイ ゼーション反応の包括性の解析 本発明によるプローブ及びその誘導体は様々なハイブリダイゼーションの形式に おいて重要な価値をもつ可能性を秘めている。そのような形式の一つ、二重プロ ーブのサンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイ形式（例えば、ＵＳＳＮ （米国特許出願）２７７．５７９．ＵＳＳＮ　１６９，６４６又はＵＳＳＮ２３ ３．６８３に記載されているホモポリマー捕獲二重プローブ液相ハイブリダイゼ ーション形式）をこの実施例で示す。このような方法においては、一般に、プロ ーブの３′末端に約２０から２００長のある領域のデオキシアデノシン（ｄＡ） 残基を付加する修飾を施す。この修飾は（液相ハイブリダイゼーションに続いて ）サンプルからこの目的のためにポリデオキシチミジン（ｄＴ）を適当に付加し た固相の支持体（例えばビーズ、プラスチックの表面、フィルターなど）に目的 のｒＲＮＡを“捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）”するのに用いられる。第二のプローブ は“検出用（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）”プローブで、適当な検出可能なリガンド（ 例えば３２ｐ、フルオレセイン、ビオチンなど）を付けておく。原則として、検 出用プローブはオリゴヌクレオチド又はより長いＤＮＡやＲＮＡのプローブであ って良い。テストサンプル中における標的核酸の存在は、一連のハイブリダイゼ ーション作用によって固相の表面に検出すべきリガンドが捕獲されることにより 検出される。

固相　１　＼　（標的核酸）　／ ｎＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（捕獲１０−ブ）　（検出用プローブ）リガンＦ　リガン Ｆ この現象は当該テストサンプル中に標的となる核酸が存在する場合にのみ生じ得 る。原則として、上の図式は例えばアッセイの感度を高めるなどの目的で複数の 捕獲と検出用プローブ（プローブのセット）に適用し得るであろう。

本発明の上記記述ではｒＲＮＡ検出に関して言及したが、明細書で記載したプロ ーブ及び明細書で記載したプローブと、相補的なプローブは、ｒＲＮＡを特定す る遺伝子（ＤＮＡ）の検出にも有用であることが容易に理解され、従ってそのよ うなプローブは明細書に記載したプローブと均等であると見なされ、本発明及び 添付の特許請求の範囲の精神及び範囲に包含されるべきものである。

国際調査報告 ｕｕ＊、−−１，＋＋、＋ｎ、−＝、、、、−−−−ｐｒＴ／ＩＩ（（ｉｎ／ｎ ＋１（５１国際調査報告 Ｔｈ１ｓｔ＊ｈｅｔ１噸１１ｔ１ｈ＊ｅ畠瞥ｅｎｌｌａｍ＋ｌｙＭｍｂｅｎｍｍ ｈ・言ａＩＭＩＩ−τｅｎ＋ｄ＋＋ｃす１１＋１１１１１１■撃撃狽рhｌｌ１ ｍａｍ−門自−ｎ１１ｔ−Ｏｎ−−−−Ｒ噌ｒｎｓｌｌｆｌａｌｔ＊ａＣ電＝ｈ ｍｐＨ’ＬＴｈｅＭａｍｂａｎＩｆｆＭｌｅａｎｕ１ｎｓνｎ＋ｈ＊ｌ１１６Ｍ １ＲＰａｕｒｎ０１ず１１１４１１１番、扉２８／１２／９０Ｔｈｅ［ｕｒｅＮ ｊＦｐＨｔＩＩ＋６１１１Ｃ＠ｌｌ１ｆｉ＋１６＋＃Ｖ１１ｍｋ１１１ａ「＋ｈ ｍｓｕｎ：ｃｖ１畠Ｍｌ−嗜１１ｃＮＡｒ高lｍＹ＠−四ｎｊａｒＩｎＮＣ１− Ｏ−１ｍｓｌＩＲずｅ＋ｖ＋＋ａｌ＋ｅａ。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．予め決定したストリンジェンシー条件下でニューモシスティス・カリニ（Ｐ ｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）のｒＲＮＡ或いはｒＲＮＡ遺伝子（ ｒＤＮＡ）にはハイブリダイズ可能であるが、非ニューモシスティス（ｎｏｎ− Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）属の真菌と細菌のｒＲＮＡ及びｒＤＮＡにはハイブ リダイズ不可能な核酸フラグメント。
2. ２．表３に記載した非ニューモシスティス（ｎｏｎ−ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ）属の微生物のｒＲＮＡ及びｒＤＮＡと前記の条件下ではハイブリダイズできな い請求項１に記載の核酸フラグメント。
3. ３．プローブ１１６２，１４８４，１４８５，１４８６，１４８７，１４９１， １４９２，１４９３，１４９４，１４９５，１４９６及び１４９７並びにこれら と相補的な塩基配列のプローブより成るプローブのグルーブから選択されたプロ ーブの塩基配列を含む、請求項２に記載の核酸フラグメント。
4. ４．プローブ１１６２，１４８４，１４８５，１４８６，１４８７，１４９１， １４９２，１４９３，１４９４，１４９５，１４９６及び１４９７の任意の連続 した１０ヌクレオチドからなる塩基配列の９０％以上に相補的な、請求項２に記 載の核酸フラグメント。
5. ５．プローブ１１６２，１４８４，１４８５，１４８６，１４８７，１４９１， １４９２，１４９３，１４９４，１４９５，１４９６及び１４９７の任意の連続 した１０ヌクレオチドからなる塩基配列の９０％以上相同な、請求項２に記載の 核酸フラグメント。
6. ６．２つ以上の核酸フラグメントからなり、そのうち少なくとも１つがプローブ １１６２，１４８４，１４８５，１４８６，１４８７，１４９１，１４９２，１ ４９３，１４９４，１４９５，１４９６及び１４９７並びにこれらと相補的な塩 基配列をもつプローブより成るプローブのグルーブから選択されたプローブのセ ット。
7. ７．プローブ１１５９の任意の連続した１０ヌクレオチドからなる塩基配列の９ ０％以上に相補的なフラグメントからなる核酸フラグメントのセット。
8. ８．請求積７のフラグメントと相補的なフラグメントからなる核酸フラグメント のセット。
9. ９．ａ）試料中にニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃ ａｒｉｎｉｉ）が存在する場合、請求項２の核酸フラグメントをニューモシステ ィス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）のｒＲＮＡ又はｒ ＤＮＡとハイブリダイズさせる条件下で、前記試料を請求項２の核酸フラグメン ト類から選択された少なくとも１つのプローブと接触させてハイブリッド核酸複 合体を形成すること、及び ｂ）前記試料中にニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃ ａｒｉｎｉｉ）が存在することを示唆するものとして前記のハイブリッド核酸複 合体を検出すること、 からなることを特徴とする試料中のニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏ ｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）の存在を検出する方法。