JPH04501230A

JPH04501230A - 陰イオン交換体

Info

Publication number: JPH04501230A
Application number: JP2509471A
Authority: JP
Inventors: エングストリヨーム，ビヨルン
Original assignee: フアーマシア・ビオテク・アクチエボラーグ
Priority date: 1989-06-27
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 1992-03-05
Also published as: WO1991000145A1; SE8902315D0; DE69011650T2; EP0436684B1; DE69011650D1; US5147536A; DK0436684T3; EP0436684A1; ATE110006T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】陰イオン交換体本発明はクロマトグラフィー分離の技術分野に関し、そして特に荷電の遮蔽が最小限に抑えられた構造中に相互に２原子の距離をおいた２つの正荷電を含む新しいタイプの陰イオン交換体に関する。特に意図されているイオン交換体は２個の第四級アミノ基を含むものである。

イオン交換クロマトグラフィー（検体を、反対電荷の検体成分に結合する固定荷電基を含有するマトリックスに通す技術）は、特に、生体分子例えばタンパク質、ペプチドおよび核酸の分離に用いられている。これは最も古い分離方法の一つであるが、現代の生化学分離法の基本的技術の一つであり続けている。陰イオン交換体、すなわち正荷電基を含むイオン交換体に関する限り、かかる交換体として用いられる物質はまずはアミンをなにがしかの種類の固相に結合させて荷電基自体、またはある特定の環境で荷電状態となり得る基を形成したものである。第一級、第二級および第三級アミン官能は弱陰イオン交換体基として分類されるのに対し第四級アミン官能は強陰イオン交換体基として分類される。しかしながら、これら「弱」および「強」という用語の使用はイオン交換体の機能の定性的評価を全（反映していない。むしろそれは「強」イオン交換体がより広いｐｎ域にわたって荷電されているということを言及している。実際の応用にあたっては、弱イオン交換体の方が強イオン交換体よりも好ましいことがあり、また逆も真である。多年にわたり商業的に入手できる陰イオン交換体例としては、官能基としてそれぞれジエチルアミノエチルおよび第四級アミノエチル基を含むＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘおよびＱＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）を挙げることができる。アミノ基含有イオン交換体は極めて多（の刊行物にも開示されており、例えばＩＱ　８９１０４２０３およびＥＰ　１６７４８８を参照されたい。

あらゆる形態のクロマトグラフィー分離技術において、検体成分を個々の成分または個々の成分群に可及的最良に分離／分割することが必須である。分解能は特に使用カラムの効率および選択性の関数である。これらのファクターは、第一に、分離マトリックスの性質とカラムの幾何学によって決まり、従ってこれらのファクターはシステムの固定パラメータを構成する。分解能に影響する他のファクターは、例えば検体ローディング、流速、温度、ｐ■、勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）などであり、これらは従って与えられた各分離状況における任意の与えられたカラムについて至適化する必要がある。近年の傾向として粒度のより小さいカラム充填材料を用いることにより効率を増大、またそれに伴って分解能を増大させようという努力がなされている。他方、イオン交換体の選択性を向上させようという努力に対してはほとんど研究がなされていないように思われる。選択性に影響するファクターの一つはマトリックスに結合した荷電基の構造である。

イオン交換体のもう一つの重要な性質はイオン交換容量であり、移動相イオンが小さな一部イオンのときはこの容量はマトリックス中の荷電数に等しい。小さなイオンは荷電置換基によって形成された表面層を貫通することができ、そして更に狭い細孔内部深くに存在する荷電に到達する。しかし、生体分子の結合となると事情は異なる。イオン交換体に結合し得るタンパク質量を決めるのはゲル上の荷電数のみならず、マトリックス表面における荷電の露出の仕方であり、このことは、マトリックスの多孔度およびイオン交換基の構造が決定的に重要であることを示唆している。もちろん、タンパク質の荷電特性も結合度に影響する。今般我々は対として配列した荷電を有する官能基を導入し、これらの荷電を、荷電遮蔽が最小限に抑えられる故に周囲媒質に対し該荷電が至適に曝露される特別な構造中に位置させることにより強陰イオン交換体の選択性および容量を相当に向上させることができることを見出した。

本発明により意図される官能基はなる構造を有するが、ここでの特徴は２個の荷電窒素原子が相互に２原子の距離をおいて位置していることである。（１）、（２）および（３）の構造では、その窒素原子は更に環状構造の一部をなしている。イオン交換体上に（１）および（３）の構造を選択することにより、イオン交換体に接触する溶液中の検体分子との相互作用を妨害する立体障害は最小限に抑えられよう。

官能基を結合するための支持用マトリックスの選択に関しては、本発明の一部を構成しない点であり、当業者は、クロマトグラフィー分離法に用いるためとして記載されている多（の支持用マトリックスに対し本発明の考えを適用することができ、またこれらの中から他の分離パラメータに関し望ましい性質を有するものを選択することができる。かかるマトリックスの例は、特に、多糖類例えばデキストラン、スターチ、セルロースおよびアガロースなどのゲルであり、これらを所望により、材料の剛性を高め、それによってその圧縮および流動（ｆｌｏｗ）特性を向上させるために架橋後に用いる。他の例はポリスチレン−ジビニルベンゼン、シリカおよびアクリレートに基づく支持用マトリックスである。

本発明によるイオン交換体の合成は、選択されたマトリックスに反応性基を導入し該基をイオン交換基またはその誘導体と反応させることにより、あるいはイオン交換基の反応性誘導体を直接マトリックスと反応させることにより行われる。

結合（カップリング）は、その一端がマトリックスに、モして他端が前記構造（１）〜（４）のうちの一つを生成させることになる試剤に結合するいわゆるスペーサーを用いて行われる。一方におけるスペーサーへのゲルへのカップリング、および他方における試剤へのカップリングは、特にアフィニティクロマトグラフィー分野においてこのタイプの技術的コンテキストでのカップリング目的に開発された多（の方法のいずれかによって行われる。かかる方法の例には、多くのものがあるが、そのうちのほんのいくつかを述べればＣＮＢｒ、エポキシド、シアネート、ヒドラジドおよびスルホニルカップリングである。マトリックス上に官能基を露出させるためにスペーサーを用いることも、同じくこの技術分野において極めてよく知られた方法であり、本発明の一部をなすものではない。

現時点で好ましいとされる構造はこれまでに行われた実験で最良の結果を与えているＮｏ、（１）の構造である。

■、４−ジアザビシクロ（２，２，２）オクタン（ＤＢＢＣＯ）分子の窒素原子の一方はスペーサーを介してマトリックスに結合され、またそれによって四級化され、次いで他方の窒素原子はメチル化を受けることにより四級化される。あるいはまた、モノメチル化されたＤＡＢＣＯを直接スペーサーを介してマトリックスに結合される。

すなわち、本発明はクロマトグラフィー分離用陰イオン交換体に関し、そして該陰イオン交換体は−８−Ａなる構造を有し、式中Ｐは不溶性支持体であり、好ましくは分離した（ディスクリート）粒子状、例えば１〜５００μ薦の粒子直径を有するこの技術分野において知られているようなタイプの球状粒子状である。

Ｓは、検体分子とはいわゆるスペーサー、すなわち、分離手順を妨害するように相互作用することは全くないが粒子表面における荷電構造の露出を促進する分子鎖である。例えばある量の疎水性基を分離手順に用いることが所望される場合には、自体知られた方法でスペーサーを疎水性にすることができることは勿論である。

Ａは相互に２原子の距離をおいた二つの正荷電基を含む荷電リガンドである。好ましいのは、２個の第四級アミノ基を有する構造、特に次のものである：イオン交換体の合成およびそれらイオン交換体のクロマトグラフィー分離手順への使用を扱う以下の非制限目的の例によって本発明を例説する。

実施例 ■、アガロースマトリックスに基づくイオン交換体の合成Ｉ　（ａ）アガロースマトリックスへのジアミン結合、それに続（四級化工程水（２５０＋＋１り　、固体状水酸化ナトリウム（１４５９）　、硫酸ナトリウム（６５９）およびナトリウムボロハイドライド（２ｇ）を撹拌しながら、架橋アガロースゲル（５００ｍＡ’、水中で膨潤）に添加した。温度を５０℃に高めた後アリルグリシジルエーテル（７００ｍ／）を添加した。その混合物を５０℃ で一夜撹拌した。そのゲルをガラスフィルター上で、水、次にエタノール、次いで最後に再び水を用いて洗浄した。その際得られたゲルをゲル床に最初のひびが目視できるようになるまでガラスフィルター上で吸引に付した０このゲルのうちから次に１００ｇを取り、これを酢酸ナトリウム（ＮａＯ＾Ｃ９３Ｈ，０，３９）と共に５０Ｉ１１の水に添加した。

色が黄色のままとなるまで臭素を添加し、次いで臭素過剰分をギ酸ナトリウムの添加により除去した。

選択されたアミン（０，２モル）をその混合物に添加し、次いで４５℃で一夜合成を放置進行させた。そのゲルを水、酢酸／水、次いで再び水で洗浄した。

次にそのゲル（２５９）を１００＋＋１のエタノールで５回、次いでアセトニトリルで５回洗浄後、それを５０ｍ１のアセトニトリルに移した。温度を３０℃に調節しそして沃化メチル（１ｍｌ＞を添加した。

この後、その時点では第二窒素の四級化を伴う合成を一夜放置進行させ、次いでそのゲルをまず水、次にエタノールそして最後に水で洗浄した。

Ｉ　（ｂ）ジアミンのモノメチル化、それに続（アガロースマトリックスへのカップリングＤＡＢＣＯ（５６，１９）をアセトニトリル（２００ｍＡ’）に溶解し、次いで沃化メチル（７１９）を撹拌しながら、また温度が３５℃を超えないような速度で添加した（約３０分間）。最終滴の沃化メチルを添加しつつある時に沈殿が生じた。反応を３０℃で一夜放置進行させた。ジメチル化ＤＡＢＣＯより成る沈殿を濾別した。溶媒を回転蒸発器で留去し、そして残留結晶塊（１４６９）をイソプロパツール（７３（１＋１）から再結晶した。結晶を濾別しそして真空乾燥した。収量は１０３、３９であり、また融点は２０４〜２０８℃の範囲内であった。

モノメチル−ＤＡＢＣＯ（前記参照）　（６，０６９）を実施例Ｉ　（ａ）に従ってアリル化および臭素化された架橋アガロースゲル（１５ｍＡ’）に添加した。次にその反応混合物を３０℃に放置し、そのｐＨはｐ■スタットにより１０．５に維持した。次にそのゲルを、水、次いで酢酸／水および再び水で洗浄した。

■、モノメチルーＤＡＢＣＯ（Ｍｅ−ＤＡＢＣＯ）のポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリックスへのカップリングヒドロキシル化ポリスチレン／ジビニルベンゼンゲル（２３ｍ／）を０．０３％ナトリウムボロハイドライド含有１０％ＮａＯＨ溶液（１７５ｍＡりで洗浄した。そのゲルを９．２ｍｌの前記アルカリ性溶液に添加し、そしてアリルグリシジルエーテル（２７，６Ｎ６）を添加した。

その混合物を４５℃で一夜撹拌し、次いでゲルをまずエタノール、次に水で洗浄した。

前述の如く調製されたゲル（１０ｇ）、水Ｃ６ｍＡ’）および酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ、３Ｈ２０，０，３８ｇ）に臭素を色が黄色のままとなるまで添加した。過剰臭素を添加した固体ギ酸ナトリウムと反応させることにより除去した。

次にモノメチル−ＤＡＢＣＯ（６，０６９）を添加し、そしてその混合物をｐ旧１．０に設定したｐｌＴ−スタットのコントロール下に３０℃で一夜撹拌した。

そのゲルを水、次に酢酸／水そして最後に再び水で洗浄した。

ｍ、ＤＮＡ断片分離のための、デキストラン処理ポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリ・ソクスに基づく輩ｅ−ＤＡＢＣＯイオン交換体の合成アリル化非多孔性３μ厘ヒドロキシル化ポリスチレン／ジビニルベンゼンゲル（１５９）を濾過された０、０３％ナトリウムボロハイドライド含有１０％ＮａＯＨ溶液（１１４ｍｌ）で洗浄した。そのゲルを次いで前記アルカリ性溶液に添加し、アリルグリシジルエーテル（３６ｍＡ’）を添加し、そしてその混合物を４５℃で一夜撹拌した。次にそのゲルを水、次いでエタノール、そして最後に水で洗浄した。

臭素化およびデキストランカップリング前記のアリル化されたゲル（３ｇ）を酢酸ナトリウム（Ｎａ０Ａｃ、　３１１ｚ０．０．１９）と共に水（１０ｍＡ’）に添加し、次いで臭素水を撹拌しながら、安定な黄色が得られるまで添加した。

過剰臭素をギ酸ナトリウムを用いて除去し、次いでそのゲルを水洗しそして乾燥するまでガラスフィルター上で吸引にかけた。次にそのゲルを平均分子量２０、０００を有するデキストラン（１，９９）の水（５冨ｌ）溶液に添加し、次いで４０℃で１時間撹拌後に水酸化ナトリウム（０，３４９）およびナトリウムボロハイドライド（０，０２ｇ）を添加した。次いで反応混合物を４０℃で撹拌しながら一夜放置した。次にそのゲルを水洗した。

デキストラン結合ゲルのアリル化デキストランをカップリングさせた後、そのゲル（３ｇ）を水（２，５ｍＡ’）　、水酸化ナトリウム（０，８７ｇ）　、硫酸ナトリウム（０，３９９）およびナトリウムボロハイドライド（０，旧ｇ）と混合した。次いで５０℃でアリルグリシジルエーテル（４，２ｍ１）を激しく撹拌しながら添加した。その反応混合物を一夜放置し、次いでそのゲルをまずエタノール、次に水で洗浄した。

臭素化およびＤＡＢＣＯのカップリング「臭素化およびデキストランカップリング」の見出しの下に前述した如（臭素化を行い、次いでそのゲル（３９）を水（２ｍｌ）に添加し、モしてＤＡＢＣＯ（０，７９）を添加した。４５℃で一夜撹拌後、そのゲルを水洗した。

ＤＡＢＣＯ結合ゲルのメチル化前記ゲル（３ｇ）をエタノールで３回、次にアセトニトリルで３回洗浄した。次にそれを乾燥するまでガラスフィルター上で吸引にかけた。次いでそのゲルをアセトニトリル（３菖ｌ）に添加し、沃化メチル（０，５ｍＡ’）を３０℃で添加し、そしてその混合物を次にその温度で一夜放置した。このようにして得られたゲルをアセトニトリルで１回、エタノールで３回、次に水で洗浄した。

■、アガロースマトリックスに基づく、リガンド３を有するイオン交換体の合成架橋アガロースゲルを実施例１に従ってアリル化した。

５０９のアリル化ゲルをエタノール、次にアセトンで洗浄し、そして最後にベンゼンをそのゲルに流し込んだ。次いでそのゲルを乾燥するまで吸引にかけ、そしてベンゼン（２５ｍｊ？）に添加後、恒常的な黄色が得られるまで臭素を添加した。３０分後に、過剰臭素を水溶液と【ノて添加したギ酸ナトリウムと反応させることにより除去した。そのゲルをアセトニトリルで洗浄し、乾燥するまで吸引にかけ、そしてアセトニトリル（２５ｍＡ’）中でスラリー化した。次いでピペラジン（８，６９）を添加し、そしてその混合物を撹拌しながら５０℃で一夜放置した。次にそれをエタノール、次いで水で洗浄した。次に、そのゲルを０．１Ｍ水酸化ナトリウム（１００ｉ＋／）および水で洗液が中性となるまで洗浄した。次に、エタノールで洗浄し、そして最後にアセトニトリルで処理した。そのゲルを乾燥するまで吸引にかけた後、アセトニトリル（２５ｍ１）中でスラリー化し、そして沃化メチル（４１１／）の添加後、その混合物を３０℃で一夜撹拌した。そのゲルをエタノールで次に水で洗浄し、これで使用準備が整った。

■、イオン交換体の選択性の確認トランスフェリン　エ０肩ｇ／ｍｌ卵アルブミン　２０菖ｇ／肩！ β−ラクトグロブリン　２０Ｈ９／冨ｌより成る試験混合物を用いて、生成イオン交換体の選択性を溶出容量ｖｅ、差を空隙容量ｖ０で除した値、（Ｖｅ２ｍ− ｖｅ、。）／ＶＯ（ここでｍおよびｎはクロマトグラムのピークに付けられた連続番号を表わす）を測定することによって確認した。

カラム：　ＨＲ１０／　１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ社）：容量７．８５ｍｊ’検体ローディング：　０．３１ｍ９タンパク質／ｍｌゲル緩衝液Ａ　：　２０ｍＭピヘラジンｐＨ６，０緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ　＋　０．６Ｍ　ＮａＣ１流速：　１００ｃ諺／時勾配二〇〜７５％緩衝液Ｂ／１５カラム容量（１２０ｍ／）前掲の試験混合物はｐＨｆｉ、　ｏで強陰イオン交換体で溶出されると５個のピークを生じる。その混合物は様々なサイズのタンパク質を含有する。また実際上は、ｖ０値はそれら様々なタンパク質の各々について異なるものである。

何故ならば、それらはイオン交換相互作用によってそれらのいずれもが遅延を受けないとしたとしても異なる容量で溶出されたであろうからである。これはゲル濾過現象である。しかしながら、すべてのタンパク質は１カラム容内で溶出されたであろう。試験系列において、ｖｏはこの効果について補正されていない。何故ならば同じ支持用マトリックスについてなされた諸比較においては、ｖ。誤差は異なるイオン交換体上の各タンパク質について同じだからである。簡素化のために、ｖｏはカラム総容量であるとしておく。

比較のために、従来技術によるイオン交換体であるＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ旧ｇｈ　ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅおよびＭｏｎｏ　Ｑ　（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて得られる対応値も掲げておくが、これらのイオン交換体は次の官能基を有する：島３第１表実施例１によるアガロース基イオン交換体について行われた分離結果０　０．１６　０．１６　１．７１　０．８８　１．３４　１．６６　５．５９１　０．１０　０．２０　２．１８　１．６４　２．４２　２．０５　８．２９２　０．１２　０．２４　２．０５　１．５３　２．３８　１．９７　？、９３３　０．０４　０．０８　２．４６　０．９１　０．８８　１．３ｇ　５．６２４　０．１２　０．２４　１．９３　１．２４　２．１６　１．７６　７．０９第２表ポリスチレン／ＤＶＢ基イオン交換体について行われた分離結果０　０．３０　０．３０　１．１２　０．０２　１．３２　１．６３　５．０９１　０．０８　０．１６　２．２４　１．６３　２．０４　２．１３　８．０４第１表および第２表から分るように、本発明のイオン交換体は従来技術によるイオン交換体よりも良好な選択性を有し、またリガンド（１）を用いることにより最高度の選択性が得られる。

前述のものと同様の比較試験で２個の第四級窒素原子が相互に３個またはそれ以上の数の原子の距離をおいて位置している構造の選択性を検討した。窒素原子間距離が広がる程選択性は悪化する。更に、それらの結果は、リガンド１および２の分子コンホメーションが・本発明の意味あいにおいて最適な諸性質を与えることを明確に示している。

■、タンパク質結合容量の検討最高に選択的なリガンド（前記参照、リガンド１）のタンパク質結合容量の測定をアガロースマトリックスについて行い、そして従来技術のリガンド（０）と比較した。

静的容量と動的容量の双方を測定した（前者は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）についての吸着等温線を記録することにより、そして後者は充填カラムにおけるタンパク質出現曲線をプロットすることによる）。

ゲル＜０．３ｍ１．３０％）を試験管に充填した。そのゲルスラリーに様々な量のＢＳＡ溶液（２００１１９／　ｗ＋１＞を添加し次いでその容量を緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＩＣ１ｐＨ７，５）の添加により０．４ｍｌとした。それら試験管を２時間振盪し、次いで遠心分離後、上清中のＢＳＡ濃度を測定するために２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。結合タンパク質量は、添加タンパク質量から平衡状態の溶液中の量を引いた差として算出した。

結果は、最大取り込みが従来技術のリガンド（０）を用いた場合には６２．６ｔｑ／　ｗ＋１．そしてリガンド（１）を用いた場合には８６．３ｔｑ／　ｍｌであることを示した。（０）の場合にはリガンド数が０．１６＋＋ｍｏＡ’／　ｍｌゲルであったのに対しく１）の場合にはリガンド数が０．１２ｍｇｏ／／　ｍｌゲルであったことに留意すべきである。この事実にもかかわらず、静的タンパク質結合容量は３８％高かった。

動的タンパク質結合容量を検討するために、１ｇのゲルを２個のＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ）の各々に充填し、次いで検体としての１％アセトン溶液について、１０ｃｍ／時の直線的流速でプレート数を測定した。ＢＳＡの溶液（５ｍｇ／　ｍｌ、　Ｔｒｉｓ／■Ｃ１！、　ｐＨ７，５；　Ｏ，ＬＭ　ＮａＣＡ’）を各カラムにタンパク質出現が起きるまでポンプ給送して通すことによりタンパク質出現曲線を得た。

カラム効率は（０）についてはＮ＝６３７０／ｍまた（１）についてはＮ　＝　６６３０／藁であった。（０）の場合、５．１ｋｌのタンパク質溶液がカラムをポンプ給送により通過した時点でタンパク質出現が認められたのに対し、（１）の場合には、１０．１ｍｌの後にタンパク質出現が生じた。このことは本発明によるリガンドを用いた場合、その動的容量が従来技術によるリガンドを用いた場合よりも７４％高いことを意味している。この実験においても０．１６対０．１２というリガンド濃度関係は、実際、従来方法によるゲルの方に有利なものであった。この事情にもかかわらず、本発明によるイオン交換体の容量の方が著しく良好であった。

■、ペプチド分離特性の検討実施例１による、すなわちアガロースマトリックスを有するゲルをＨＲ１０／１０カラムに充填しそして各場合につき八ＣＴＩＩとテトラペプチドＶａｌ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｇｌｕの混合物を含有する２０１Ｉ／検体で試験した。緩衝液Ａ　：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，１；緩衝液Ｂ：緩衝液＋０．１Ｍ　ＮａＣ１０流速１　ｍｌ１分。

溶出：緩衝液Ａで５分間。次に３０分間の時間幅にわたって直線勾配Ｏ〜４０％の緩衝液Ｂを使用。

検出：　ＵＶ　２１５ｎｍ。

従来技術によるイオン交換体（０）では、前記混合物をカラムにかけた場合ペプチドは同じピーク内に溶出された。それらペプチドは個別に、それぞれ２４．４および２４．８ｍｌの溶出容量を与えた。本発明のイオン交換体（リガンド（１））を用いた場合には基線の分離が得られ、またそれらペプチドを別々に流すとこの場合に得られる溶出容量はそれぞれ２７．３および３０．６ｍｌであった。

■、　ＤＮＡ断片の分離リガンド（１）を３μ肩非多孔性ポリスチレン／　ＤＶＢマトリックス（実施例 ■に従って製造）に結合させ、そして５×３０■カラムに充填した。次いで特にこのタイプの分離のために開発された商業的に入手し得る製品であるＧｅｎＰａｋ−ＦＡＸ　（Ｗａｔｅｒｓ）との比較を行った。検体は制限酵素Ｈａｅｌ［［（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理されたバクテリオファージφＸ１７４　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ −ｎｏｌｏｇｙ）からのＤＮＡであった。ＧｅｎＰａｋ−ＦＡＸ（Ｐ）の場合には製造元の勧める方法に従って分離を行った。すなわち緩衝液Ａ　：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＩＣ１ｐＩＩ８．５緩衝液Ｂ　：　Ａ　＋１．０Ｍ　ＮａＣ／カラム：　４．６Ｘ　１００諷寓リガンド（１）の場合には、５Ｘ３（１＋ｓ＋カラムおよび以下の緩衝液を用いた：緩衝液Ａ　：　２０ｍＭ　Ｔｒｆｓ／１１ｃＩ！ｐＨ８，３＋０．８Ｍ　ＮａＣ１緩衝液Ｂ　：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＡ’　ａｌ１８．３＋１．５Ｍ　ＮａＣ１実験条件が全面的には対等でない点は強調されるべきであるが、にもかかわらず従来技術によるイオン交換体（Ｐ）に比べ明らかに改善された分離結果が本発明によるイオン交換体（Ｕ）を用いた場合に得られることは注目に値する。

このことは両力ラムの（Ｖｅｌｍ　−ｖｅ＋　、、）／　Ｖｏ値を与える下記データから明白である（ここでｍおよびｎはクロマトグラムのピークの連続番号である）。

ｍ　＝　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１１ｎ＝　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１（Ｐ）　１．４１．１０．５０．２　”　 ”　１．００．１０．１０．１　４．６（Ｕ）　９．０５．９２．６１．２０．５１．０４．２１．４０．７０．７２７．２本）　ＧｅｎＰａｃｋ−Ｆａｘの場合は、ピーク６および７は分離されなかった。

国際調査報告Ｔ１１１１１ｍ１ｌ。１１１Ａ□ｔ、１．。、。ｐｃｉｌｓ＋：　９０１００４１５国際調査報告Ｔｈ１ｌＩＩＩＩＩ＠１１１１１１ｔｈｅＨｔｅｍｌａｌｌ’Ｈ１ｙｍ１ｍｂａｎｎｍ１Ｍ９ｍｌｈ＃ｕｌｐｍａａｃｖｍｅｎｎＣ１瞳ｄｌ■奄撃■狽＆_ｉ）ｅｍ１ａ＋ｔ＜Ｉｎｌ！Ｔｎｍ１１６ａ＋ｌＩ彎ＩＲＮｌ＃１’６１１ＴｍｌＩ＋ｍわ―ｌ１１１「１ｊＩ＋６１１１ａｌｌｌＮＩｌｌ＋ｐｔ＄＋ｅ６ｎｈｐａ＋ｒｎ＋０１−−＋ｅ［０１１１１ａｎ９０−Ｑ３|０２ＴＭＳ＋＋−ｄｖれＰａ＋ｍ＋０ｌ−１８１１１ｆｉＲｆｉ＋ｎＴ１１ａｂ＋＊ｌ＋ｔｌＩｈｅ＋ｌ１ｅａｒｈζｖｌａｍ＋れｌｌｈａｎ１lＴＩｌｌｙ＠Ｉｎｎ１０１１ハｅ＠ｕｒｚｅａ４ｍｏｔｍａ＋１６ｈ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｐ−Ｓ−Ａ（式中Ｐは不溶性支持体であり、Ｓはスペーサーであり、そしてＡは相互に２原子の距離をおいた２個の第四級アミノ基を含むことを特徴とする官能性リガンドである）で示される構造を有するクロマトグラフィー分離用イオン交換体。２．官能性リガンドＡが次の構造、すなわち▲数式、化学式、表等があります▼ （１）▲数式、化学式、表等があります▼（２）▲数式、化学式、表等があります▼（３）▲数式、化学式、表等があります▼（４）のいずれかを有する請求項１記載のイオン交換体。３．官能基Ａが ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される構造を有する請求項２記載のイオン交換体。４．官能基Ａが ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される構造を有する請求項２記載のイオン交換体。５．支持体が架橋アガロース、またはポリスチレン−ジビニルベンゼンマトリックスの粒子より成る請求項１〜４のいずれかに記載のイオン交換体。