JPH04501254A

JPH04501254A - 癌治療剤としてのサイクリックａｍｐ誘導体

Info

Publication number: JPH04501254A
Application number: JP1506479A
Authority: JP
Inventors: チョー　チュン，ヨーン　サング
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1988-05-23
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1992-03-05
Also published as: WO1989011487A1; US5902794A; IL90368A0; AU3760489A; CA1335572C; US5792752A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】癌治療剤としてのサイクリックＡＭＰ誘導体発明の分野本発明は癌化学療法における改良に関し、特に癌化学療法において使用するサイクリックＡＭＰ誘導体に基（組成物および方法に関する。

発明の背景サイクリック　アデノシンモノホスフェ−）　（ｃＡ！ｌｉ［Ｐ　）は細菌から人間まですべての細胞や組織に存在する天然の化合物である。動物細胞において、ｃＡＭＰは分化された（％異的な）性質の発現を促進するようである。よく知られている例は、肝におけるグルコース新生、脂肪組織における脂質の分解、およびヒキガエル膀胱上皮における水透過性のｃＡＭＰによる刺激である。乳腺の機能的発育はもう一つの例である。ラット乳腺におけるｃＡＭＰ含量は妊娠サイクル期間中に二相パターンを示す。

ｃＡＭＰレベルは妊娠の終りに向って連続的に上昇し、次いで授乳１６日目までに最低値にまで低下金続ける。分娩時における転換は授乳開始による乳腺代謝活性の相当な上昇と一致する。

試験管内（イン　ビトロ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）培養細胞においてｃＡＭＰにより誘導される形態変化には、甲状腺細胞における腺房形成および微細構造変化、線維芽細胞における伸長とアレイ形成、神経芽細胞腫細胞における軸索様成長の発現、グリオーマ細胞における突起の生育、および色素細胞の色素形成が含まれる。細胞形態における急速な変化は、恐らく、細胞骨格に対するＣａ”＋と相互作用したｃ　ＡＭＰの効果を介している。ｃＡＭＰの機能的効果の中には、特別な酵素の誘導、線維芽細胞におけるコラーゲン台底の刺激、および神杼起源の細胞における神経伝達物質合成がある。ｃ　ＡＮ　Ｐ−誘導分化が同時に細胞分裂全阻害することなしに起ることは意味がある。

細胞分化におけるｃＡＭＰの役割りは明らかになったように見えるものの、細胞増殖の調節におけるこのヌクレオチドの一般的機能を定めることはより一層困漏である。

現有のデータは様々に解釈されている。

線維芽細胞において、血清添加やトリブタン処理のような休止細胞での生育阻害を解除する処理はアデニレート　シクラーゼ活性の低下を起し、ＤＮＡ合成開始前のｃＡＭＰ　１！を急速に減少させることが多くの研究で示され、ｃＡＭＰレベルの低下が細胞分裂の引金になる決定的信号であるという考えを支持している。しかしながら、ｃＡＭＰの減少が休止状態からの最初の解放に原因的に関係しているという決定的な証拠は示されていない。培養ヒト細胞において、血清添加後の最初の８時間の間でｃＡＭＰの減少を防ぐためにＤＢｃＡＭＰまたはメチルインブチルキサンチンを加えると、引き続＜　ＤＮＡ合或は遅れなかった。一方、これらの薬剤は血清後の８時間以後に加えるとＧ１中期、Ｇ１後期および８期で阻害的であった−この事は、ＣＡＭＰの減少が血清刺激ＤＮＡ合成のための最初の引金として関与するのではなく、ＤＮＡ複製に向う後の進行過程に必要な、後での段階での因子であることを示している。しかし、血清によって刺激されたＢａ１ｂ３Ｔ３細胞（Ｃａ　欠失）においては、Ｇ１後期でｃＡＭＰの増加があり、線維芽細胞のＤＮＡ複製調節に対するｃＡｒｄＦのポジティブな役割全示唆している。

見かけ上矛盾するデータがリンパ球の研究においても存在する。低濃度のサイクリックＡＭＰ　（１０から１０−６Ｍ）はラット胸腺リンパ球の懸・嬰培業でＤＮＡ合成の引金となり、ｃＡＭＰの生育促進的役割の王たる理由の一つを提供している。末梢リンパ球の実験はこの結果を一部支持し、一部矛盾するデータを与えた。肝細胞ではＣＡＭＰが生育にポジティブな効果を持つという証拠が増えているＯｃＡＭＰによる生育阻害を示している研究は、生育促進を示して−る、たぶん見られた生育阻害効果が一層生理的でないことを示している研究よりも、ＤＢｃＡＭＰや他の薬剤金より高濃度で使用しがちであった。高濃度のｃ　ＡＭＰまｆｃはＤＢｃＡＭＰを生物学的系に添加し九後で見られる効果はｃＡＭＰの必須の直接効果ではな（，５’−ＡＭＰ。

アデノシンま念はブチレートのよう：よ代謝物によシ起きると論う証拠が増えてきている。同様にメチルキサンチンは、恐ら（ｃＡＭＰ　ｆ：介さないであろう効果を持っている。生理的に、ＣＡＭＰはほとんどまちがいなく羊−生育調節因子ではなめが、正常細胞に対してい（つかのサイクル間変調効果を持つらしい。

恐らく、種々の生育因子がｃＡｘ（Ｐ　ＩｔＣ依丁しない機構で働くのであろう。事実、ｃＡＭＰは細胞サイクル進行目体に必須ではないかもしれないＯ培養した悪性化細胞の多くの場合において見られるｃＡＭＰの効果は、顕著な再分化で埋められており、これは、形態的性質、吸着性、レクチン１ｊｋｌ細胞運動、生化学的機ｈニ、および固定依存生育を含む形質転換細胞の多くの性質の見かけの再正常化となる。

この「正常化」がどの位基本的なものかは明らかでない。例えば、ＤＢｃＡＪＡＰ処理神経芽細施臘細胞の膿瘍原性は減少しているとプラサド、バイオロジカル　レビエー他の報告では変らないことがわかった。フルマンスキー等、ジェイ　シュルツ、およびエイチ、ジー、グランツナ−編、ザロールオブサイクリックヌクレオチヅインカルシノジェネシス、２３９−２６１　頁、二為−ヨークアンドロンドン：アカデミック　プレス１９７５年（Ｆｕｒｍａｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｊ、　５ｃｈｕｌｚ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｇ、　Ｇｒａｎｔｚｎｅｒ　。

Ｅｄｓ−ｓ　Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｉｃ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｃｉｎｏ−ｇｅｎｅｓｉｓ、　ｐｐ　２３９−２６１　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９７３　）。細胞表面の形質転換関連抗原の存在はｃＡＭＰによって妨げられない。ｃＡＭＰに対する形態的反応は＋）４１１により、線維芽細胞の中でも非常に変化がある。

動物実験により、種々のｃＡｆｄＰ誘導体が生体内（インビボ、ｉｎ　ｖｉｖｏ　）　で腫瘍増殖を阻害することがわかった・参考：ケラー、ライフサイエンス１１巻、４８５−４９１頁、１９７２年（Ｋｅｌｌｅｒ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　１１　：　４８５−４９Ｌ１９７２　）およびチ璽−チャン等、サイエンス　１８５巻。

８７−８８頁、　１９７４年（Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ−＋　５ｃｉｅｎｃｅ１８３　：　８７−８８．１９７４）。

興味ある観察は強力なアデニレート　シクラーゼ活性化剤であるコレラ毒素を１回投与すると、動物に対して毒性は認められないのに、マウスにおいて４日間までＹＡＣリンパ腫細胞の増殖がほとんど完全に阻害される；ホルムグレン等、エクスペリメンタルセル　リサーチ１０８巻：５１−３９頁、　１９７７年（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ　＋ｌ　Ｅｘｐ、　Ｃｅｌ　１Ｒｅｓ、　１０Ｂ：３１−３９．１９７７）。インビトロでのｃＡＭＰにより悪性化細胞分化の最も驚くべき例のいくつかが神経芽細胞腫培養で観察された：グラサド、バイオロジカルｖビｒｙ−５０巻、　１２９−１６５頁、　１９７５年（Ｐｒａｓａｄ。

Ｂｉｏｌ、Ｒｅｖ弓ｉｎ　：　１２９−１６５．１９７５　）。

はとんどの場合、他の薬剤に反応しない伝染性神経芽細胞腫に対する併用薬剤レジメンに含まれているホスホジェステラーゼ阻害剤パパペリニンの予備臨床試験で、有望な結果が得られた：ベルノン等。ジャーナル　オプナシ１ナルキャンサー　インスティテエート５７巻ニア２７−７２９頁、　１９７６年（Ｈｅ１ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ−＊　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、５７　：　７２７−７２９．１９７６　）。イン　ビトロでＤＢｃＡＭｐ処理したヒトのオート細胞肺癌細胞はノイロン様細胞に分化した：ツジ等キャンサー　レター１巻、　３１１−！１１８頁。

１９７６年（Ｔｓｕｊｉ　ｅｔ　ａｌ、＊ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ、　１　：３１１−３１８゜１９７６）。　もう一つの興味ある例は、多転移するスピンドル細胞肉腫のＤＢｃＡＭＰＩＣよる分化誘導である：ウィリアムス等、プロシーディングズオプアメリヵン　アソシエイシ冒ン　フォアキャンサー、リサーチ２５巻、１４２頁、　１９８！５年（Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ａｍ、　Ａｓ５ｏｃ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２５　：　１４２．１９８３　）。後者の例で、患者は１８目から９日目まで、更に４７７日目ら５６６日目で毎日、５時間にわたってＤＢＣＡ、’１ｌｌＰ　（Ｓ　−６帆△０を静脈内に投与された。腫瘍の大きさは再点滴期間中にプラトーに達し、また減少さえ見られ、投与をしない中間期と二回目の投与の体薬後に増大した。２．１４および６００日目生検の腫瘍組織学検査でＤＢ　ｃ　ＡＭＰ点滴中の分化が明らかになった。

ｃＡＭＰはほとんどいたる所で生物学的効果を示すので、前記化合物のために生ずる非生理学的高レベルの細胞ＡＭＰは多（の細胞反Ｅｈｋ非籍異に妨害し、増殖調節のようなｃＡＭＰの特異的機能をかくす結果になる。

哺乳動物細胞のサイクリックＡＭＰは、ＣＡＭＰ依存蛋白質キナーゼの調節サブユニットである受容体蛋白質に結合することで機能する。ｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼには少くとも２種の区別できるアイソザイム、すなわちタイプ■とタイプｌ蛋白質キナーゼがあり、これらは異る調節サブユニットと同じ触媒サブユニットを持つ。これらのアイソザイムの分別発現が細胞増殖と分化の調節に関係していることが示されている。最近、ｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼの二つの異る触媒サブユニット（ＣαとＣβ）をコードする二つの遺伝子が同定された。しかし、これらの触媒サブユニットのどちらか一つとタイプＩｔ、たはタイプＨＩ；ｉ１節サブユニットいずれかとの優先的同時発現は見い出されていない。

タイプＩとタイプ■キナーゼアイソザイムの混合物がほとんどの組織に依存する。休止細胞におけるこれらのアイソザイムの選択的変調がｃＡＭＰの決定的機能であるかもしれない、ａ胞増殖のｃＡＭＰ調節についてのすべての過去の研究では、非生理的に高いミリモル範囲の効果的濃［を要求する二三の初期に矧られたｃＡＦｄＰ類似体、あるいは細胞ｃＡＭＰ　ｔ−異常で連続的に高いレベルに上昇させる薬剤を使用していた。この実験条件では、高レベルのＣＡＭＰがタイプ ■およびタイプｌキナーゼアイソザイムを区別なしに最大で、同じように活性化するため、両アイソザイムの変調を区別できない。

蛋白質キナーゼアイソザイムのｎＩ製標品をイン　ビトロで使った広範なＣＡＭＰ結合速度論の最近の研究により、ｃＡＭＰ受容体蛋白質上の二つの異る結合部位のどちらか一方に選択的に結合する部位選択的ｃＡＭＰ類似体が同定された。

更に適当な組合せにおいて、その部位選択的類似体は結合の相乗性を示し、タイプ！ま九はタイプｌ蛋白質キナーゼいずれかに対する特異性を示す。部位選択的ｃＡＭＰ類似体の特別な部位特異性はｃＡＭＰ自身または前に研究された初期の類似体では模倣できない。

ヒト乳癌はホルモン療法、すなわち卵巣切除を行うことの多い治療後に、退行することが度々ある。

癌退行は、腫瘍中のｇ凡の存在に関係し、受容体を測定するｔめにつ（られ九分析法が、現在ホルモン療法に応答するであろう患者を定めるために広く使用されている程度に関係する。しかしながら、Ｅ几の単なる存在がホルモン療法への乳腫瘍の反応の信頼できる基準ではないことが明らかになった。腫瘍ＥＲが検出できないようなレベルの患者はホルモン療法にほとんど応答しないが、Ｅ１％陽性ヒト乳癌の５０−６０鴫がホルモン療法後に退行するにすぎない。それ故、ＥＲ −陽性腫瘍グループの中でホルモン依存の癌を同定する必要がある。いくつかの研究において、ＥＲ−陽性腫瘍にＰｇ几が存在することがホルモ／反応性の予見を改善すると報告されているが、他の報告では、Ｐｇ几は予見を改良しなかりた・したがりて、Ｐｇ几の存在はＢＲの予見値を必ずしも改善しない。

更なる区別因子が明らかに必要である。

ｃＡＭＰ受容体蛋白質がそのような因子であるという証拠が、ホルモン依存孔腫瘍退化がジブチリルサイクリックＡＭＰ投与に起り、その効果はＣＡＭＰ受容体蛋白質を介しているらしいという研究から出てきた。サイクリックＡＭＰ受容体蛋白質は動物腫瘍におけるように、限られた数のヒト乳癌におけるように、ホルーＥ：ｙ治療への腫瘍感受性のマーカーであるようである。

ホルモン依存孔腫瘍の増殖調節はエストロゲンとサイクリックＡＭＰ間の拮抗作用に依存することが示唆され次。

ラットにおいて１１２−ジメチルベンズ（２）アントラシン（ＤＭＢＡ）で誘導された乳腺癌の増殖を１エストロゲンは促進し、ｃＡＭＰは阻止する。卵巣切除によるホルモン除去、ある論は宿主ｔ−Ｎ　、ｏ　−ジブチリル−ＣハｉＰ（ＤＢｃＡＭＰ）で処理した後での腫瘍増殖阻止中に、腫瘍細胞のサイトフルおよび核で、エストロゲン結合は低下し、一方、ｃＡＭＰ結合とｃｋＭＰ依存蛋白質キナーゼ活性は上昇する。更に、ＤＭＢＡ−鐸導乳腫瘍の増殖は細胞の腫瘍遺伝子、ｃ−ｒａｓの発現強化と関係していることが示された。ｒａｓ遺伝子産物のｐ２１形質転換蛋白質は生育中の腫瘍のｍＲＮＡの主要なインビトロ翻訳産吻であり、翻訳ｐ２１蛋白質の急速な低下が卵巣切除またはＤＢｃＡＭＰ処理後の腫瘍の退化に先行した。

ｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼ精製標品を使ったｃＡＭＰ結合速度論の最近の研究から、蛋白質キナーゼの強力な活性化剤で蛋白質キナーゼの二つの異るｃＡＭＰ結合部位のいずれかの一方に選択的に結合するｃ　ＡＭＰ類似体が同定された。

ランネルズ等、ジャーナルオプバイオロジカルケミストリ−２５５巻、　７０８５−７０８８頁、　１９８０年１９８０）参照。一般に、アデニン環のＣ−８位を修飾した類似体は部位１−選択的であり、Ｃ−６位を修飾したものは部位２− 選択的である。更に、部位１−および部位２−選択的類似体を組合せると蛋白質キナーゼへの結合およびその活性化の相乗性が示される：ロビンソンースタイナー等、ジャーナルオプバイオロジカルケミストリ−２５８巻、１０３２−１０４０頁、１９８３年（几ｏｂ　ｉ　ｎ５ｏｎ−５ｔｅｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　：　１０５２−１０４０゜１９８！Ｓ）。

発明の要約本発明の目的は先行技術の欠点を克服することである。

更なる目的は、癌および白血病化学療法における改善を提供することである。

本発明もう一つの目的は癌および白血病化学療法（有用な化合物を提供することである。

本発明の更なる目的は癌および白血病化学療法に有用な化合物の相乗的組合＜を提供することである。

また、更々る目的は改善された抗癌療法を提供することである。

本発明の更にもう一つの目的は白血病を治療する改善された化学療法レジメンを提供することである。

本発明によれば、以前に研究された類似体よｐ　ｃＡＭＰ受容体蛋白質への結合が何倍も活性の高い部位選択的ｃＡＭＰ類似体は多数のヒト癌ａ旭系に強力な増殖阻害を示す。

ｃＡＭＰ受容体蛋白質は二つの異るｃＡＭＰ結合部位を持ち、その二つの結合部位のいずれか一つに選択的に結合するｃＡＭＰ類似体は部位１選択的（Ｃ−８類似体）または部位２選択的（Ｃ６−類似体）いずれかとして知られている。

その群の中で現在までの所、最も強力とされる三つの化合物はｃＡＭＰの８−ＣＡ、Ｎ’−ベンジル、およびＲ６−フェニル−８−ｐ−クロロフェニルチオ−類似体である。

Ｃ−８類似体のハロゲンまたはチオ誘導体と組合せて使用するＣ−４類似体は増殖阻害の相乗的強化を示す。

増殖阻害は細胞形態の変化♂ｃＡＭＰ受容体蛋白質の強化、およびｐ２１ｒａｓ蛋白質の減少と並行する。

本発明の部位選択的ｃＡＭＰ類似体は種々のヒト癌細胞の増殖を調節する新しい生理学的手段を提供する。

図面の簡単な説明第１図は部位選択的ｃＡＭＰ類似体による乳および結腸癌系の増殖阻害を表わす。

本図において、ＩＣ，値（細胞繁殖の５０％阻害ｔ−誘導する濃度）は非処理対照細胞の増殖を参考にして得られ九。コノ図で、１μＭＣＦ−７，２ｑＴ−４７Ｄ、　３ハＺＲ−７５−１ｉ：４はＭＣＦ−７ｒａｓ　−１５はＭＤＡ−ＭＢ− ２３１，６はＢＴ−２０，７はＨＢＬ−１ｏ　ｏ、８はＬＳ−１７４Ｔ、　９はＷ［）ｒ。

１０はＨＴ−２９を表わす。

第２図は乳癌細胞系の形態に対するｃＡＭＰ　ｆＡ似体の影響を表わす。第２Ａ図および第２Ｂ図、Ｔ−４７Ｄ：　第２０図および第２Ｄ図、ＨＢＬ−１００：第２Ｅ図オヨび第２Ｆ図、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：第２Ｇ図および第２Ｈ図、ＭＣＦ−７ｒａｓ　：第２Ｂ、２Ｄ、２Ｆおよび２Ｈ図は０８目と２日目に５０４Ｍの８−　Ｃｊ　−ｃＡＭＰ　で処理；第２Ａ。

２Ｃ，２Ｅおよび２Ｇ図は非処理対照細胞。写真は４日目と１６０日目に撮影。

第３図はＬＳ−１７４Ｔ結腸癌系の増殖に対する８−Ｃｊ−ｃ　ＡＭＰと８−Ｃトアデノシンの効果の比較を表わす。口、非処理対照細胞：０．Δ、、それぞれ３日間、６日問および９日間、８−　Ｃ１ｔ−ｃＡＭＰ（１０，＊Ｍ）で処理した細胞；・、ム、マ、それぞれ５日間、６日問および９日間、８−ＣＪ−７デノシン（５μＭ）で処理した細胞。ＩＸｌ　０″細胞７６０■皿を接種し、２４時間後（０日目）に培地を除去して新鮮な培地と添加物をその時およびその後４８時間毎に加え念。矢印は添加物の除去ｔ−表わす。各実験時点での三重の細胞数計測値は１０憾以上変らなかった。

第４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ図はＨＴ−２９結腸癌細胞を８−　Ｃｊ　−ｃＡＭＰで処理した後の細胞抽出物の）ｉＰＬｃ分析を表わす。ヌクレオチドのＨＰＬＣ分析は８−　ＣＺ　−ｃＡＭＰ（５０ＡＭ）で７２時間処理した細胞および非処理対照細胞の細胞抽出物について下記のようにして行った。

第５図はｃＡＭＰ　＠囲体処理および非処理の１８−１７４細抱からのサイトツルのＤＥＡＲセルロースクロマトグラフィーを表わす。非処理（第５Ａ図）および処理（１５ＡＭ　Ｎ’−ベンジル−ｃＡＭＰ　＋　１　μＭ　Ｂ　−ＣＪ−ｃＡＭＰで３日間、第５Ｂ図）の細胞からサイトツルを調製し、下記のようにクロマトグラフィー全行った。Δ、　ＮａＣＡ濃度。

各画分１００μｊｔ−使って、５μＭ　ｃＡＭＰの非存在（・）および存在（０）の下での蛋白質キナーゼ活性およびｃＡＭＰ結合活性？下記のようにして測定した。蛋白質キナーゼ酵素活性１単位を標準分析法で５０℃において７分間に［ ”Ｐ　］　ＡＴＰから回収された蛋白質に対してｌ　ｐｍｏｌの３２Ｐを転移させる酵素量として定義した。ｃＡＭＰ結合は、ブランク値（過剰の非放射性ｃＡＭＰ存在下で結合された（　’Ｈ）　ｃＡＭＰＯ量）を放射性ヌクレオチドのみで得られた慣から差し引くことによって計算した特異的結合として表わした。カラムから溶出プロファイルはいくつかの類似の実験の一つを表わす。

第６図は乳癌（ＭＤＡ　−ＭＢ　−２５１）および結腸癌（ＬＳ−１７ＪＴ）系の几ＸＲｎ受容体レベルに対するｃＡＭＰ類似体の影響を表わす。８−８３　（ ”Ｐ　）　ｃＡＭＰの光活性化取込を下記のようにして行った。Ｒ１分子１ｉ４１１１，０００の８１ｃＡＭＰ受容体蛋白質；Ｒ９分子量ｓ　４ｏ　ｏ　ｏのＲｃＡＭＰ受容体蛋白質。

レーン１，２および５において、細胞をそれぞれ８−Ｃ１ｋ−ｃＡＭＰ　（１０ μＭ）　、　Ｎ’−ベンジル−ｃＡＭＰ　（１０μＭ）、およびＮａ、　ＯＭ’ −ジブチリル−ｃＡＭＰ　（１ｒｎＭ　）で３日間処理した；レーン４は非処理対照細胞。Ｍは分子量既知のマーカー蛋白質である。

各レーンには１９Ｄｓ−ＰＡＧＥのために５０μｑの蛋白質を含め九。

第７図はｃＡＭＰ類似体処理前後のＭＣＦ−７細胞におけるｐ２１ｒａｓ蛋白質のウェスタンブロッティングを表わす。ｐ２１蛋白質のウェスタンブロッティングは下記のようにして行っ九。レーン１は対照である；レーン２゜３、および４はそれぞれ８−（Ｊ−ｃＡＭＰ　（１０ＡＭ）で５日間処理した細胞である。ＶはＨａ−Ｍｕ８Ｖ−形質転換ＮＩＨ３Ｔ３クローン１３−３Ｂ−４の細胞破砕物である。Ｍは既知分子量のマーカー蛋白質である。

各レーンには８ＤＳ−ＰＡＧＥのために１００μりの蛋白質を含ませた。

第８図はＤＭＢＡによる乳臘瘍誘導の率（第８人図）および数（第８Ｂ図）に対する８　−ＣＩ　−ｃＡＭＰペレットの影響を表わす。

第９図はｃＡＭＰ受容体蛋白質およびｃ−ｍｙｃ蛋白質のレベルに対する部位選択的ｃ　ＡＭＰ類似体の影響を表わす。

発明の詳細な説明本発明の化合物は種々の癌細胞に対してインビトロおよびインビボいずれにおいても活性であることがわかった。本発明の化合物および組成物の増殖調節活性を、ｃＡＭＰ受容体蛋白質が応答の仲介体であるかどうかを定める試験ｔ−便って、インビボのｃＡＭＰ介在過程に含まれるサイクリック　ヌクレオチドエフェクター機構を便りて研究踵また、部位１および２への化合物の結合は協同的であり、そのため、未処理細胞におけるｃＡＭＰ受容体蛋白質への結合における相乗性に対する化合物の感受性を測定することができる。

もしいっしょに投与した化合物が癌細胞の増殖阻害で相乗性を示した場合、両化合物の低い方の金製Ｉｎ、さもなければ単一化合物ｋｆって得られる同じ細胞応答を行うために使用することができる。

細胞培養すべての乳癌細胞系ｉ１０％ウシ胎仔血清、ＨＥＰＥ８２０　ｍＭ、ペニシリン −ストレプトマイシン、およヒ別にグルタミンを補ったＩＭＥＭ中で生育させた。結腸腺癌細胞系ｑ　１０　％　ＦＢＳ　、　ＥＭＥＭ、　ＮＥＡＡ、　ＨＥＰＥ８２０ｍＭ、別にグルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＥＭＥＭ中で生育させた。細胞上５０僑ＣＯ１の雰囲気下、加湿インキエペーター中、３７℃で生育させた。

細胞増殖実験では、２−！Ｓ：ｌ　Ｏ細胞／　６０　ｒｍ皿を接種し、２４時間後（Ｏ８目）に培地を除去し、その時、およびその後４８時間毎に新鮮な培地および添加物を加えた。本発明の化合物ｔ−１００倍濃度の保存溶液全便って加えた。望みの時間に、温和なトリプシン処理をして細胞を果めた後、コウルター　カウンター（Ｃｏｕｌ　ｔｅｒＣＯｕｎｔｅｒ　）により細胞数音二重に計測し友。

細胞抽出物の調製すべての操作ｔｏ−４℃で行った。す／酸緩衝化食塩液で２回洗浄後、２Ｘ１０細胞からなる細胞ベレッ）ｋ（Ｌ５＋ｄ１７）緩衝液１０　（［ｌＬＩＭＮａｃＪ、　５ｍＭＭ９ＣＡ、、１　憾ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ　）　Ｐ−４０， α５％デオキシコール酸ナトリウム、２ＫＩＵ／−ウシ　アプロチニン、および２０ｍＭ　）リス−ＨＣｂ　、　ｐＨ７，４）に懸濁し、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモゲナイザーで１００ストロークしてホモゲナイズした０ホモシネ−） ’ｊｉ７００Ｘ９で２００分間遠心離した。上澄を細胞抽出物として使用し九。

蛋白質キナーゼのＤＥＡセルロースクロマトグラフィーｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼのホロ酵素と調節サブユニット２０ビンソンースタイナーおよびコルビン、ジャーナルオプバイオロジカルケミストリ−２５８巻、　１０！５２−１０４０頁、　１９８３年（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−８ｔｅｌｎｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏｒｂｉｎ＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　：　１０３２−１０４０．１９８５　）　Ｏ方法Ｋｌ。

たがってＤＥＡＥセルロース金使い分離した。ＦＢＳで２回洗浄した後の２−４Ｘ１０細胞の細胞ペレットを３−の緩衝液Ｂ　（１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｆ含む１０ｍＭリン酸カリウム。

ｐＨ６，８）中でダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモゲナイザー全使って６０ストロークする手によるホモゲナイズ全行った。

ホモシネ−）　＠　ＩＱ、０００　Ｘ　ｇで２００分間遠心離した。得られた上澄（２−２，５ｄ）ｔ−緩衝液Ｂで予じめ平衡化した（Ｌ９Ｘ！＆０（至）カラムにかけた。洗浄後、カラムを、両分容量ｔｏ−ｔｚ−として、緩衝液Ｂ中で０から（１４ＭのＮａＣＪ勾配、全［６０−を使って溶出した。

ｃＡＭＰ受容体蛋白質の光親和係識８−　Ｎｓ　［Ｐ　）　ｃＡＭｐの光活性化取込金ボメランツ等、バイオケミストリー、１４巻、　３８５Ｂ−５８６２頁、　１９７５年（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４　：　３Ｂ５Ｂ−５８６２゜１９７５）によ）記載され九ものを少し変えて行りな。終容量５０μｊの反応混液は１０一’Ｍ　８−Ｎ、（”Ｐ〕±ｔｏ００倍過剰の非標ｗ＆ｃＡＭＰおよび１００−１５０μり蛋白質の試料を緩衝液１０中に含む。９６穴イムノプレートで６０分間、２℃１℃で反応させた。次いで、プレート上に直接ミネラライト（Ｍｉｎｅｒａｌ　ｉｔｓ　）　ＵＶ８−１１　／Ｍ　ンドランプを置いて、反応混液に２５４μｍで３０秒間照射した。試料を２５μｊの３Ｘの試料緩衝液（５チ８Ｄ８．１５１ｐ−メルカプトエタノール、３０　ｍＭ　）リス、３０嘩グリセロール、１憾ブロモフエノールブルー飽和溶液）と混合し、５分間煮沸、７００）ｌで５分間、遠心分離し念。蛋白質５０−１００μ９ｔ−含む試料を１０５１８Ｄ８−１２チＰＡＧＥにかける。ゲルを固定し、乾燥して、Ｘ線フィルムに一夜暴露した。蛋白質濃度は標準としてウシ血清アルブミンを使いラウリー等、ジャーナルオプパイオロジカルケミストリー１９５巻、　２６５−２７５頁、　１９５１年（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３　：　２６５−２７５．１９５１　）の方法で測定し念。

ｐ２１蛋白質のウェスタン　プロッティング細胞抽出物に存在する細胞の蛋白質を１２優８Ｄ８−ＰＡＧＥで分離し、転写緩衝液（２５ｍＭ　）すｘ、１９２ｍＮグリシン、２０％メタノール、ｐＨ７，４）中でニトロセルロース　シートに転写した。ニトロセルロース　シートを洗浄し、先ず、ＮＴＥ−ＮＦ２０　（５０ｍＭ　）すｘ　ＨＣｌ−、ｐＨ７，５。

１５０ｍＭ　ＮａＣＪ、　２ｍＭＥＤＴＡ、　ｌ　１　％ノニデｙ　）　（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０）中で５慢ウシ血清アルブミンと５７℃で３時間反応させ、次いで、Ｈａ−Ｍｎ８Ｖ−：ｒ−ドｐ２１に対するｐ２ｔモノクローナル抗血清ＹＩＳ−２５９−（ｉ−含む培地と４℃で１６時間、ウサギ抗ラフ）ＩｇＧと氷水浴中で２．５時間、および５　Ｘ　１　Ｇ　’　ｃｐｍ／ｄ　”″ニープロティン人と氷水浴中で１時間と次々に反応させた。このニトロセルロースシートを風乾し、コダック（Ｋｏｄａｋ　）　ＸＡＲフィルムに２０℃で１２−５６時間暴露した。得られたオートラジオダラム？、ｐ２ｊモノクローナル抗体全正常ラット血清と置換して得たものと比較することによりｐ２１ｉ同定でき穴。参考標準の９２１ｔ−得るため、細胞破砕物をＨａ−Ｍｎ８Ｖ　ＤＮＡでトラフ　スフ　＄りＶ、７したＮ（Ｈ３’１クローン１５−５Ｂ−４から調製した。

高性能液体クロマトグラフィー細胞４　ＦＢＳで２回洗浄しく各回７ｏｏｘｇで５分間遠心分離した）、ペレットｔ−α４Ｎ過塩素酸に懸濁（２Ｘ１０’細胞／ｌ！Ｉｔ）、振とり攪拌し、上記のように遠心分離した。

上澄を５５Ｍ重炭酸カリウムで中和しく５７μｊ／−過塩素酸）、撮とう攪拌、上記のように遠心分離した。この上澄をＨＰＬＣナイロ７　７４ルター（５ｒｍ／　（１４５１１ｍポアサイズ）で−過してＨＰＬＣに使用した（１００μｊを注入）。

ＨＰＬＣは、レオダイｙ　（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　）−ｅ：デル７１２５サンプルインジエクター、強陰イオン交換体カラム１２．５Ｇｓ。

およびＬＫＢ２１４０迅速スペクトル　ダイオードアレイ全付けたパリアン（Ｖａｒｉａｎ　）　５５００　クロマトグラフ全便って行った。ヌクレオチドｔα Ｄ　Ｉ　Ｍ　ＫＨ，ＰＯ４（ｐＨＡ８３　）から（ＬＳ　Ｍ　ＫＨ，ＰＯ４（ｐＨ五５）への直線勾配で溶出した。溶媒の流速はＬＯｄ／ｍｉｎであり几。カラム溶出液′ｔ−１９０と５７ＱＱｍの間でスペクトルディテクターにより６０分間監視した（　１　ｎｍと１−ｓ間隔で）、保持時間、ピーク面積、および吸収スペクトルｆ：ＬＫＢ２１４０−２６０コンベア（ＣｏＭＰＡＲｋ：　）ソフトウェアを使って実験室コンビエータ−で決定し喪。

細胞サイクル分析ＤＮＡヒストグラムをブレイラン等、サイトメトリー２巻、　５５７−５４５頁、　１９８２年（Ｂｒａｙｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｍｅｔ−ｒｙ　２　：　３３７−３４３．１９８２）により記載されているように１）ＮＡインターカレイティング染料沃化グロビディウム金使いＦＡＣ８ｎにより得た。各サイクル相の細胞パーセントを、ＦＤＰ−１１７５４コンビエータ−とネッカーズ等、モレキエラー　アンドセリエラーバイオロジー６巻。

４２４４−４２５０頁、　１９８６年（Ｎｅｃｋｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　６　：　４２４４−４２５０．　ｔ９８６　）　Ｉｃよす記載サレテイルソフトウエアを１更って算出した。

増殖阻害に対する部位選択的ｃＡＭＰ類似体の影響アデニン残基のＣ−６またはＣ−ｓ位、またはｃ−ｂとＣ−Ｓ位両方を修飾した種のｃＡＭＰ　ｔＡ似体を癌細胞系への増殖阻害効果について試験し喪。第１表に報告した・研究は、０８目および２Ｂ目にいくつかの濃度の各化合物で細胞を処理した後に、３Ｂ目および４日目に細胞数を計測することによって行った。細胞数計測は５以上の別々の実験それぞれで行い、平均値全非処理対照細胞と比較してパーセント増殖阻害として表現した。

第　１　、表乳癌（ＭＣＦ−７）　＊ヨＵ結腸癌（ＬＳ−１７４Ｔ）細胞系Ｏ増殖に対する部位選択的ｃＡＭＰ類似体の効果ｃＡＭＰ類似体を示したようにアデニン環に修飾したものについて最高から最低効果の順に表に並べ加えたサイクリックヌクレオチド　チ増殖阻害８Ｃ−８８−クロロ　６７（６２−７５）　７５（６Ｂ−８＋）８−メ＋ルテオ　４６（４２−５２）　４２（３８−５０）８−７−ロモ　４１（３７−４４）　４Ｏ−（５５−４５）８−　ヨード　２６（２０−４１）　２５（２５−２７）８−ｐ−クロロフェニルチオ　２３（１９−２７）　２４（２０−２６）ａ−ｐ−ヒトａキシｚチルアミ／　１５（１２−１７）　２０（１５−２３）８−メチル丁ミ／　１４（１０−１４）　１５（１２−１８）８−Ｎ・　Ｎ−ジ゛メチ１しアミノ　０（０）　。（。）Ｃ−６Ｎ’−ヘン”）”し　５６（４９−６０）　７０（６５−７４）Ｎ’Ｌｚトキシカルボ：１し　３２（２７−４０）　４０（３６−４３）Ｎ　’　−／＜　ンｙ’ゞイ１し　３０（２６−４８）　２Ｂ（２５−３２）加えたサイリックヌクレオチド　係増殖阻害８類似体　（５０μＭ）　５Ｂ目　４日目Ｎ’ｔｏ２′−ジブチリル　ｏ（ｏ）　ｏ（ｏ）Ｎ６−Ａ：＞；’＊−８−ヘン’）ルチオ　２５（２０−３０）　２５（２０−２５）ａ　パーセント増殖阻害の値は用量反応曲線実験で測定した。６値は５以上の別々の実験から得られた平均値と範囲（括弧内）を示す。類似体で２回処理後（ＯＢ目と２Ｅｌ目）、二重の細胞数計測１３Ｂ目と４日目に行った（−１Ｂ目に接種）。

上記の第１表は乳癌（ＭＣＦ−７）および結腸癌（ＬＳ−１７４Ｔ）細胞系に対する１９の部位選択的化合物の増殖阻害効果を示している。化合物を、示されたアデニン環上の修飾について最高から最低の増殖阻害効果の順で並べた。第１表に示したように、Ｃ−８位金ハロゲンまたはチオ残基で修飾した類似体はＣ−８位をアミノ残基で修飾したものより効果が強かった。それ故、５０μＭ濃度で、８−ＣＪ−，８−メチルチオ−１および８−プロモー　ｃＡＭＰは４０−７５嗟増殖阻害を示したが、一方、８−β−ヒドロキシルアミノ−１８−メチルアミノ −１および８−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン−ｃＡＭＰは、４２０１％の増殖阻害効果すにすぎなかった。Ｃ−ｂ類似体は一般にＣ−８類似体より増殖阻害効果が低（、Ｃ−６，０−８類似体はいっそう効果が低かった・５０μＭ濃度で、Ｎ６− ベンジル−１およびＮ−エトキシカルボニル−ｃ　ＡＭＰは３０−７０１増殖阻害を示した。以前に既知の類似体であるジブチリルｃＡＭＰは５０μＭ！１度で増殖阻害を示さなかった。Ｃ−６，０−８−類似体のＮ６−フェニル−ａ−ｐ− クロロフェニルチオ−ｃ　ＡＭＰは構造的にＮ−ベンジル−および８−　（Ｊ　 −ｃＡＭＰ両方に似て匹るが、Ｃ−６，−８ジ置換類似体中では最も強い増殖阻害を示した。

第１図は乳および結腸癌細胞に対して５種の最も強い化合物、Ｂ−（１，Ｎ’− ベンジル−１およびＮ６−フェニル−ａ−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰの増殖阻害効果を示している。これらの類似体は試験した１０の筋系すべてにおいて５−２５Ｘ１０　から２．５×１０　Ｍ濃度で５０憾増殖阻害（ＩＣ５゜）を示した。したがって、部位選択的化合’４ＥｄホＮモン依存（ＭＣＦ−７，Ｔ− ４７Ｄ、　ＺＲ−７５−１）　オよび＊Ａｔモア非依存（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＣＦ−７ｒａｓ、　ＥＴ−２０）乳癌系および結腸癌系にμＭ濃度で強い増殖阻害を示した。チェーチャン、セルラー　アントモレキエラーバイオロジー、２６巻、　５９５−４０３頁、１９８０年（Ｃｈｕ−Ｃｈｕｎｇ、　Ｃｅ１１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２６　：　３９５−４０３．１１１０　）　：チ嘗− チャン等、サイエンス、２１４巻、７７−７９頁。

１９８１）：およびフェンティマン等、モレキエラー　アンドバイオロジカルタデ４フフ２巻、８１−８８頁。

１９８４年（Ｆｅｎｔｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　２　：　８ｊ　−８８、１９８４）によって前に報告されているよう罠、ジブチリルｃＡＭＰま几はＮ−ブチリルｃＡＭＰは画濃度でホルモン依存乳癌系に増殖阻害を示すのみで、ホルモン非依存乳癌および結腸癌細胞系には阻害を示さない。テオフィリン（０，１ｍＭ　）　ｉたは１−メチル−３−インブチルキサンチン（（１５ｍＭ　）のようなホスホジェステラーゼ阻害剤は、それぞれ単独ではほとんど、または全（増殖阻害効果がな（、特にホルモン非依存乳癌および結腸癌系に対してそうであるが、これらの阻害剤は部位選択的化合物と組合せて加えた時でさえも、部位選択的化合物の効果を強めることができなかった。増殖阻害に対する部位選択的ｃＡＭＰ類似体の効果は非形質転換細胞よシ形質転換癌細胞に対してより選択的のようである。というのは、部位選択的化合物はＨａ −Ｍｎ８Ｖ−形質転換ＮＩＨ１５Ｔ５クロー７１５−５Ｂ−４細胞と比較して非形質転換Ｎｉ１（／３Ｔ３細胞に対し５０−７０％効果が低かったからである。

増殖阻害に対する化合物の組合せの効果以前のインビトロ研究は、蛋白質キナーゼ調節サブユニット上のいずれかの鎖間部位に選択的ｃＡＭＰ類似体の結合は他方の部位に対する選択的ｃ　ＡＭＰ類似体の結合を刺激する二うンネルズ等、ジャーナルオプバイオロシカルケミストリ−２５６巻、７８７１−７８７６頁、　１９８１年１９８１　）　ニコルビン等、ヨーロッピアン　ジャーナルオブバイオケミストリ−１２５巻、　２５９−２６６頁、　１９８２年（Ｃｏｒｂｉｎ　ａｔ　ｅｌ−＋　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１２５　：　２５９−２６６゜１９８２）、および、組合せた二種のそのような部位選択的化合物は蛋白質キナーゼ活性化に相乗作用金示す：ロビンソンースタイナー等、ジャーナルオプバイオロジカルケミストリ−２５８巻、　１０３２−１０４０頁、　１９８５年（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−８ｔｅｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５１１１　：１０５２−１０４０．１９８３）およびオグレイド等、ヨーロッピアン　ジャーナルオブバイオケミストリ−１５０巻。

２１９−２２７頁、　１９８５年（Ｏｇｒｅｉｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５０　：　２１９−２２７．１９８５）　。二群の部位選択的ｃＡＭＰ類似体の相乗作用はベーぺ等、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ−２５９巻、　５５５９−５５４７頁。

１９８４年（Ｂｅｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９　：　５５５９−５５４７、１９８４　）によって分離し九脂肪細胞での脂質分解で示され、タグリアフェリ等、バイオケミカルアンドバイオフィジカル　リサーチコミユニ７４７１７１３０巻。

１１９３−１２００頁、　１９８５年（Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｙｓ、　Ｒｅｉ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３０　：　１１９５−１２００＋１９８５）によってＨａＭｕＳＶ−形質転換Ｎ１１−１３ ’ｌ細胞の増殖阻害で示されている。

ｃＡＭＰ類似体組合せの効果全試験するために、部位１選択的なＣ−８類似体と部位２選択的Ｃ−ｂ類似体を、それらが単独でそれぞれ１０−２０％増殖阻害を示すように組合せ、効果を相乗係数によシ定量した。相乗係数金類似体組合せの真の増殖阻害効果全翼の類似体の増殖阻害効果の合計で除したものとして定義した。〉１の係数は相乗効果を示し、く１の係数は反対の（アンタボニスティック）効果を示す。Ｃ−６，８化合物がＣ−ｂｌたはＣ−８化合物いずれよりも効果が低いことヲ特に考慮すると、Ｃ−６およびＣ−ａ化合物の同時使用がＣ−ｂまたはＣ−ｓ化合物いずれかの使用よりいっそう良いということは驚くべきである。

第２表はＭＣＦ−７ｒａｓ細胞系の増殖阻害におけるＣ−６とＣ−ａ類似体間の相乗作用の代表的例を示す。Ｎ６−ベンジル−またはＮ−ヘンシイルーｃＡＭＰいずれかと併用したａ　−ＣＩ−ｃＡＭＰ　（１μＭ）は各類似体単独の合計から期待できるものと比較して最大度の増殖阻害を与え、Ｌ７１乃至１．８３の相乗係数であった。すなわち、Ｎ６−ベンジル−ま念はＮ−ベンゾイル−ｃＡＭＰ（ＬＬ５μＭ）いずれかと組合せた８　−ＣＩ　−ｃＡＭＰは８−　ＣＩ　−ｃＡＭＰま念はＮ６−類似体単独いずれもの２０−２０μＭ濃度によって示されるものとほとんど同じ増殖阻害効果を与えた。Ｎ６−類似体も８−　メｆＡｔｆオー　ｃＡＭＰ　（相乗係ａ　ｔ５０−ｔ８４　）　−？　８−ブロモ−ｃＡＭＰ　（相乗係数ｔｓ）のような他のＣ−８類似体と増殖阻害の相乗性を示した。しかし、Ｎ６−類似体を８−アミノ誘導体と組合せた場合、相乗作用は限られ念ものであった（相乗係数１．１２−１．２５　）。したがって、Ｎ６−類似体は８ −アミン類似体と組合せるより８−チオま九は８−ハロゲン類似体と組合せた時にはるかに高い相乗性を持って作用したつＣ−６およびＣ−ａ類似体の組合せによる増殖阻害の類似の相乗作用が他の乳および結腸癌細胞系においても認められる。増殖阻害の相乗作用は、部位１−選択的類似体を部位２−選択的類似体といっしょに加えた時にのみ見られ、２種の部位１−選択的または２種の部位２−選択的類似体を組合せた時には見られなかった。このような例の二つを第２表に示す。

第　２　表ＭＣＦ−７ｒａｓ乳癌細胞系におけるＣ−ｂおよびＣ−８類似体の相乗的増殖阻害効果増殖阻害の相乗作用ｔ−０日目ε２日目にＣ−６類似体とＣ−８類似体の単独および組合せで細胞を処理し４日目に細胞数計測することで決定した。

類似体組合せ　どＭｌ増殖阻害１　相乗係数５類似体組合せ　ｐＭ　％増殖阻害１　相乗係数５ａ　データは、非処理対照細胞の増殖に対するパーセント増殖阻害として表わし、３以上の別々の実験での二重の細胞数計測の平均値と範囲（括弧内）を表わしている。単独で加えた時の各類似体のパーセント増殖阻害値は２０９６（８−Ｃｊ−ｃＡＭＰ）、　１５％　（メチルチオ−ｃＡＭＰ　）　、　１０％（８−メチルアミノ−ｃＡＭＰ）、　１５％（Ｎ・−ベンジル−ＣＡＭＰ　）　、および１０％（Ｎ＠−ヘンシイルーｃＡＭＰ　）であった。

ｂ　相乗係数は前に記載したように定義した。

細胞形態学に対するｃＡＭＰ　Ｍ似体の効果部位選択的ｃＡＭＰ類似体の増殖阻害効果は細胞形態学の変化と相関していた。第２図に示すように、ホルモン依存（第２Ａ図）とホルモン非衣存（第２０．２ｇおよび２Ｇ図）の乳癌細胞は５（１Ｍ８−ＣＪ−ｃＡＭＰ、４乃至５日間の処理後に特徴的形態変化を示した。細胞は長く伸びた腺維芽細胞様の見かけを持つ細胞質の拡大を示した（第２Ｂ、２Ｄ、２Ｆおよび２Ｆ図）。乳癌および結腸癌細胞全Ｎ６−ベンジ／ｌ／　−ＣＡＭＰ　（５０ｔｔＭ　）　、および８−メチルチオ−ＣＡＭＰ（１００μＭ）で５乃至４日間処理すると、すべて形態変化を誘導した。更に、Ｃ−６とＣ−ａ類似体組合せの相乗的増殖阻害効果も細胞形態変化に反映された。すなわち、１７ＡＭ８−ＣＩ−ＣＡＭＰｔｆｔは（Ｌ５μＭＮ’−ベンジル−ｃＡＭＰ　いずれかの４日間処理は細胞形態変化を誘導しなかったが、細胞を８−　Ｃｊ　−ｃＡＭＰ（１μＭ）とＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰ　（１５ａＭ）の組合せで処理すると、その細胞は形態変化を示し比。同じ相乗作用が増殖阻害の相乗性を示す他のＮ＠−ｅＡ似体とＣ−８類似体の間でもみられた。

増殖および細胞サイクル進行に対する８　−ＣＡ　−ｃＡＭＰと８−Ｃｊ−アデノシンの効果部位選択的ｃＡＭＰ類似体の増殖阻害効果について、アデノシン代謝物による細胞毒性効果も存在するかどうかを調べた。第３図はＬＳ−１７４Ｔ結腸癌系における８　−ＣＡ−ｃＡＭＰと８−　ＣＡ−アデノシンの増殖阻害と阻害から開放のタイムコースを示している。非処理対照細胞が細胞数で対数的増加を示すのに対し、８−　ＣＩ　−ｃＡＭＰまたは８−　（Ｊ−アデノシンいずれかで処理した細胞は細胞増殖の懸重な低下を示し、３乃至４日以内に複製を最終的に止めた。処理の中止により、一方の８−　ＣＡ　−ｃＡＭＰで９日間まで処理した細胞はほとんど直ちに増殖を再開して、細胞増殖速度は二、三日以内に非処理対照細胞のものと同じようになったが、８−　（Ｊ−アデノシン処理細胞は増殖が阻害でれ元ままであり、処理開放から２週間まで増Ｎを再開しなかつ九〇すなわち、８−（１’＃−ｃＡＭＰおよび８−　ＣＡ−アデノシンにより生ずる増殖阻害は二つの異る機構全弁していた：前者は細胞の生存に影響せずに複製速度を低下させることにより、そして後者は殺細胞によるものである。

本発明の化合物で処理した後に癌細胞で観察される細胞繁殖の低下が細胞サイクルの一つの相の９４的ブロツクによるかどうかを決めた。第３表に示すように、Ｇ１゜ＳおよびＧ２／Ｍ相の細胞画分は対照細胞（非処理）と８−　ＣＩ　−ｃＡＭＰまたはＮ６−ベンジル−ＣＡＭＰいずれかで処理し九細胞の間で評価し得る程異っていなかった。したがって、ｃ　ＡＭｐ類似体により誘導される細胞増殖阻害は細胞サイクルの一つの相の特異的ブロックと結びついていなかった。しかじながら、８−ＣＡ−アデノシン処理は８期の顕著な減少を伴う０１期細胞数の評価し得る増加を誘導した。

第　５　表乳癌および結腸癌細胞系の細胞サイクル進行に対する部位選択的ｃＡＭＰ類似体およびａ　−（Ｊ−アデノシンの効果対数増殖期（非処理対照）および８−　ＣＬ　−ｃＡＭＰ（１０ａＭ）、Ｎ−へ／ジルーｃＡＭＰ　（５５μＭ）、および８−（Ｊ−アデノシン（５μＭ）処理３日後の乳癌（ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ −２５１）および結腸癌（ＬＳ−１７４Ｔ　）細胞について下記のようにしてフ四−サイトメトリー分析によってＤＮＡ１分析した。同様の結果が他の乳癌および結腸癌細胞系で得られた。

ＭＣＦ−７対照　５２　２３　２５　１００Ｂ−ＣＡ　５５　２２　２５　４０（１０ａＭ）ＭＤＡ　−ＭＢ対照　５７　２５　１８　１０Ｇ（３５μＭ）ＬＳ−１ｙａＴ対照　６０，５２　１７．２３　２３．２５１Ｇ０，１００ａ− Ｃｊ６５．５５　１５．２２　２２．２５　５０．５２（１０ａＭ）８−Ｃｊ−アデノシン　７２．６８　８．１４　２０．１８　３０．３０ａ　対の数字は二つの別々の実験から得られた。

Ｃ人〜ＩＰ　ｇｉ似体による癌細胞処理後の細胞抽出物のＭＰＬＣ分析第４人、４Ｂおよび４０図に示すように、５２μＭａ−（Ｊ　−ｃＡＭＰで７２時間処理シフｔ）ｉＴ−２９結腸癌細胞系の細胞抽出物は非処理対照細胞抽出物に存在しな＾いくっかの明らかなビークを示した。標皐ヌクレオチドの溶出プロファイルを参照して、これらのビーク’ｌＨ８−Ｃｊ−ｃＡＭＰ　（ビークａ　）　、　８−　ＣＡ−ＡＭＰ　（ビークｂ）、５−（Ｊ−ＡＤＰ　（ビークＣ）および８−ＣＩ−ＡＴＰ　（ビークｆ）と同定した。約ｔ５分の保持時間でのビークは処理および非処理細胞抽出物両者で同じであった。このビークはもし試料に存在するとすればアデノシンおよび１ｉ−Ｃｊ−アデノシンを含む。実際は、吸収スペクトルから証明されるように８−　ＣＪ−アデノシンはこのビークに存在しなかった。８−ＣＩ−ｃＡＭＰ　（５０μＭ）　Ｔ：　４９時間処ｆｌＬｆｅｍ胞からの培地に８−　ＣＩ−ｃＡＭＰの単一の大きなビークが検出されたが、８−ＣＡ−アデノシンは存在しなかった。

これらのデータは、そのままの８−　ＣＩ　−ｃＡＭＰが膜結合ホスホジェステラーゼにょつて代謝されることなしに細胞に進入し、一部の８−　ＣＩ　−ｃＡＭＰが８−ＣＪ−ＡＭＰ、５１−　ＣＡ　−ＡＤＰおよび８−　（Ｊ−人ＴＰに変ることを示した。

しかしながら、１００μＭのように高濃度の８−　ＣＡ　−ＡＭＰで細＠全処理しても評価できる程の増殖阻害を起さなかった・１％Ｉおよび几”　ｃＡＭＰ受容体蛋白質のレベルに対するｃＡＭＰ類似体の効果ｃＡＭＰ　類似体のＣ−６おＬＵＣ−ａチオｔ＊はｃ８−ハロゲン誘導体の組合せによる癌細胞の増殖阻害で示される相乗作用は、類似体効果におけるタイプ１キナーゼよシむしろタイプ■蛋白質キナーゼの反応を示していた。

遊１１１ＲＩおよび几１とホロ蛋白質キナーゼ、タイプＩとタイプ■の相対的比率ｔ−ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグーｙｙイーを使って決定し虎。処理および非処理ＬＳ−１７４Ｔ細胞からのサイトツルのクロマトグラフィーを第５図に示す。触媒サブユニツ）ｉＮａｃｊ勾配の開始前に溶出した。

第５人図の非処理？ａ胞は、ｃＡＭＰ結合活性のビークと一致するｃＡＭＰ−依存蛋白質キナーゼ活性の二つの主要なビーク、ビーク１とビーク２を示した。ビーク１は（ＬＯ７ＭＮａＣ７で溶出され、ビーク２はａ２２　Ｍ　Ｎａ（ｌで溶ｆｆ１−ｇれ、ビーク１のキナーゼと結合活性はビーク２のものの約５倍であった。その上、ｃ　ＡＭＰ−依存蛋白質キナーゼ活性のない二つの主要なｃＡＭＰ結合ピーク、ビーク５とビーク４がそれぞれＣＬ　１５　Ｍ　Ｎａ（Ｊと（ＬＳ　０　Ｍ　ＮａＣＡ　テｍ　ｌｆｉ　サれた。溶出画分の８−アジド−［Ｐ］ｃＡＭＰによる元親和標識後のラジオオートグラフィーと８ＤＳ−ＰＡＧＥ　実施により、ビーク１とビーク３は４ａＯＯＱＭｒル　を含み、ビーク２とビーク４は５２，０００　ＭｒＲｔ’含んでいることがわかった。これらの結果は、ビーク１およびビーク２はタイプＩおよびＵホロ蛋白質キナーゼに類似し、ビーク５とビーク４は哺乳動物組織サイトツルに見−出される遊離のＲ１および几１サブユニットに似ている。

細胞ｔＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰ　（０５μＭ）と１μＭの８−０ｊ−ｃＡＭＰで３日ｌ″Ｊ！１逃理した時、第５Ｂ図に示したようにクロマトグラフィー　パターンはかなシ変りた。ビーク１のｃＡＭＰ−依存蛋白質キナーゼ活性とｃＡＭＰ結合活性の両方は非処理細胞に２けるもののＳＯｓに減少し、一方、ビーク２のｃ　ＡＭＰ−刺激キナーゼとｃ　ＡＭＰ結合活性はそれぞれ５倍と２倍に上昇した。更に、ビーク４のｃ　ＡＭＰ結合活性は非処理対照細胞のそれを２倍高くなり、一方、ビーク５は特に変化はな込ままであった。したがって、タイプＩホロ酵素、ビーク１の減少はタイプＩホロ酵素、ビーク２と１サブユニツト、ピーク４両方の上昇全件った。増殖阻害で相乗作用金示す他のＣ−６とＣ−８類似体の組合せで細胞全処理し念時に、同様の溶出パターンの変化が見られ、一方、これらの化合物それぞれ単独は、はとんど、′ｔ、九は全く増殖阻害を示さな一１ μＭで、溶出プロファイルに明らかな変化がなかつ念。

し九がって、増殖阻害で観察するものと同じＣ−６およびＣ−８類似体咀合せの相乗作用が蛋白質キナーゼ変化に見られた。何もしな論非逃理細胞金集める直前に類似体組合せを含む培地で洗った時、その溶出プロファイルは非処理細胞からのサイトツルのものと同じであっ九。

したがって、類似体処理細胞で観察されるビーク１，２゜シよび４の変化は細胞破砕中のサイトツルと培地の相互作用からの残存類似体の結果ではなかつ几。

類似体処理後に見られたビーク２および４での増加は、類似体がタイプ■蛋白質キナーゼの解離および上昇両方金利き起したことを示唆する。更に、かなりの量のタイプ■ホロ酵素、ビーク２が処理細胞に存在することは、ビーク２が少くとも部分的に、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーで凡、Ｃ，から分解されない凡、Ｃのようなホロ酵素の部分的解離型を含んで込ること全示唆する。

タイプＩとタイプ■蛋白質キナーゼはその調節サブユニット、すなわちｃＡＭＰ結合受容体蛋白質が異るのみで触媒サブユニットは同じであるため、受容体蛋白質金癌細胞の処理中に測定した。

第６図に示すように、非処理乳癌（ＭＤ人−ＭＢ−２３１）と結腸ｆｌ（ＬＳ− １７４）細胞は、レーン４に見られるＭｒａａ、ｃｏ。

の主要なｃＡＭＰ受容体蛋白質を含んでいた。この蛋白質は、ウサギ骨格筋の４ａＯＯＯＭｒ＆”の精製標品（レーンＲＩ）と８ＤＳ−ＰＡＧＥ　で同一泳動されるので、Ｂ−”　ｃＡＭＰ受容体蛋白質、すなわち、タイプ１キナーゼの調節サブユニットであるらしい。細胞ｔ？８−ＣＪ−ｃＡＭＰ（レーン１）、１ｆｃはＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰ（レーン２）で３日間処理した時、分子量ｓｚ、ｏｏｏのｃＡＭＰ受容体蛋白質は明らかに増加し、同時に４１％０００Ｒ１受容体蛋白質が減少し念。Ｍｒ５へ０００−５２．ＯＤＤ　ｃＡＭＰ受容体蛋白質が種々の組織で几Ｉ受容体蛋白質と同定されて匹るので、ｓｚ、ＯＯＯＭｒ蛋白質はＲｌｌｃＡＭＰ　受容体蛋白質であるらしい。？ａ胞を、細胞増殖全阻害しないＤＢｃＡＭＰで処理した時、レーン３とＶ−７４を比較してわかるように　ＢＩと８１受容体レベルは不変のままである。

オートラジオダラムｔデ／シトメトリーで追跡して定量し九所、癌細胞を８−　（Ｊ　−ｃＡＭＰま几はＮ−ベンジル−ｃＡＭＰで処理して４５−７０％増殖阻害が見られ、Ｒ１に対する几１の比が２乃至３倍上昇することがわかった。

弱め阻害剤（１５唾）であるＤＢｃＡＭＰの１ｍＭ濃度は、第Ｉ１０表に見られるように、＆またはり受容体レベルに見るべき影＃を与えなかった。

ｐ２１ｒａｓ蛋白質レベルに対するｃ　ＡＭＰ類似体の効果本発明の部位選択的ｃＡＭＰ類似体は、増殖阻害と並行して、細胞形質転換遺伝子産物のｐ　２１ｒａｓ蛋白質のレベル全低下させることがわかった。第７図に示すように、ｐ２１蛋白質のウェスタンブロッティング分析により、５７チ増殖阻害を示す（第１１表参照）１０μｇＢ−ＣＪ−ｃＡ〜ＩＰ、３日間処理したＭＣＦ−７細胞は、第７図、レーン２に示されるように、顕著に低下したレベルの９２１Ｑ含んでいた。Ｎ６−ベンジル−ｃＡＭＰで処理した細胞におｈても同様のｐ２１蛋白質の減少が観察された。第１１表に見られるように２０チ増殖阻害しか示さな＾弱い増殖阻害剤のＤＢｅＡＭＰ　（５００μＭ）はレーン４に示すように９２ルベルの低下はわずかであった。５−Ｃｂ−アデノクンの５μＭは強い増殖阻害を示すが、第７図のレーン３に示すようにｐ２ルベルに評価できる程の影響を与えなか・りた。したがって、８−８−０Ａ−ｃＡのものと異る機構で増殖阻害を起す８− ＣＪ−アデノクンはｃＡＭＰＪｉｌ似体で−誘導できる生化学的変化金蔵すことができなかった。

インビボ隠遁増殖に対する８　−ＣＬ　−ｃＡＭＰの効果８−　ＣＡ　−ｃＡＭＰの抗腫瘍活性を多くのインビボ実験腫瘍モデルで評価した。腹腔内にＬ１２１０白血病を接種し、腹腔内に投与して得られ次最初のデータでは、抗隠瘍活性を示すにはこのｃＡＭＰ誘導体の接続した存在が必要であると示唆された。腫瘍のないＢＤＦ　、マウスにおける本化合物の最大非致死用量は１０４Ｍ１Ｉ／Ｋｐであった。この用量ｔ−１回の注射投与、７日間連続してもＬ１２１０を持つマウスは耐えられたが、抗腫瘍効果はなかった。しかし、このサイクリック　ヌクレオチド金１０４ダ／（７日の用量で５日間、常に注入すると平均生存期間が５７％延長された。

Ｌ１２１０　白血病モデルの知見に基づき、８−（’＃−ｃＡＭＰ　−Ｎ　ａ　注入の有効性を後期ヒト膿瘍異種移植モデルで評価した。約１４ＩＩＰの腫瘍片金無胸腺ＣＤ−１雌マウスの皮下に移植し、平均腫瘍重量が５ｏｎ−４００１９に達した５週間後から、サイクリック　ヌクレオチドの７日間腹腔的注入を開始した。腫瘍の測定全投与の初ｌ：ｌ（ステイジングデイ）、および投与完了後１日目（スティジングデイ＋７）に記録し、腫瘍重量変化の計算に使う光。２種の乳、１種の肺および１ａｌの結腸腫瘍で得られたデータ（第８および９表参照）は、Ｂ　−Ｃｂ　−ｃＡＭＰ　−Ｎａ　の注入によシ投与中に腫瘍停滞が生じることを示した。もう−りの研究にお＾で、約４２ダ／Ｋｇ１日（ＩＩＩＩＦ／マウス）の７日間、皮下注入は約３００ＩＮ９の後期ヒ）　ＬｏＶ、結腸腫ｇｓｔ −持つ無胸腺ＮＣＲ−ＮＵマウスに有毒であるようであった。α６７ダ／マウス／Ｂの注入は弱いａ瘍増殖遅延金起しただけであった。再移植性ＤＭＢＡ−１およびＭＮＡ　−２ラツト乳癌を使った短期試験（７日間）で、腫瘍移植時に移植した８　−（Ｊ　−ｃＡＭＰのペレットは腫瘍増殖の４０−５０％阻害金起し北。

第４表に示すように、２週間毎に２再移植し１９−ａ−Ｃａ−ＣＡＭＰ　１０ダベレツトは腫瘍増殖を完全に止めた口処理された腫瘍は３０日以内にほとんど１００４退化する。

ＤＢｃＡＭＰ投与は退化音生ぜずに耀瘍増殖金止めるだけでラットにおけるＤＭＢＡ誘発乳癌のイン　ビボ増殖に対する８　−ＣＩ　−ｅＡＭＰベレプトの効果％　２０　１．２　ｙ、ｔ、５　２．２ｘＡ２　＋７６０±１５０”ｌ３−ＣＪべＶｙト”　２０　１Ｊ　ｘｔ８　ａｓ　ｘａｓ　−９６±ｚ。

ａ　平均直上８．　Ｅ。

ｂ　ａ　−ＣＪ−ｃＡＭＰ　（ラｙ　ト”ｋＤ、ｔｏＩＩＰａ−ＣＡ−ｃＡＭＰと１０＋ｗｐコレステロールからな７）２０１１９ベレツト）を０ａｌと１４４ａｌ移Ｍ。

第５表に示すように、これらの腫瘍はＤＢ−ｃＡＭＰに対して完全に耐性である。一方、８−ＣＡ−ｃＡＭＰ　１　（１＋ｐペレ、トは１週間以内に４０−５０憾増殖阻害金示した。浸透ポンプによる８　−ＣＩ　−ｃＡＭＰの連続供給は更に良い阻害効果を与えるかもしれない。

変法として、化合物をインタイム（１ｎ−ｔｉｒｎｅ　）放出型ま几はインタイム（ｉｎ−ｔｉｍｅ　）放出リボソームで投与してよいＯ第８ＡおよびａＢ図に示すように、発癌剤ＤＭＢ人管挿入１日前に８−ＣＡ−ｃＡＭＰ　（１（ｌｙべＬ／ｙト）移植すると、ＤＭＢＡのみの効果と比較して、最初の臓＠ａｉ現全５０日遅らせ、生じる腫瘍の総数を７０憾減少させた。

この結果は、ＤＭＢＡ発癌の最初の時期のブロックに対する８　−Ｃ１ｐ　−ｃＡＭＰの効果を示している・次のデータはイン　ビボ悪性新生物増殖に対する８ −Ｃｊ−ｃＡＭＰの効果を示している：第　５　表可移檜性、ホルモン非依存、および転移性ラット乳癌ＣＤＭＢＡ−１，ＮＭＶ− ２）　オ［Ｊ：ＬＳ−１７４Ｔ　ヒ）　ＭｋＳ系ｔＤイン　ビボ増殖における８　−Ｃｊ　−ｃＡＭＰベレットの効果宿主　腫瘍　処理　全腫瘍数　平均腫瘍容積変化（−）　ｌ＠ラット　可移檀性　無　１５　２−６５　１０１００Ｄ人−［８−Ｃｊ　１５　Ｌ６０　６１ＤＢ　１５　２．６０　９？転移性　無　Ｉｓ　２．１４　１００Ｎ１００Ｎ　８−（Ｊ　１５　ｔ、１０　５１ＤＢ　１５　２−１５　ｆ００ヌードマウス　ＬＳ−１７４Ｔ　無　１０　α９７　１００Ｂ−Ｃｊ　ＩＤ　α ５８　６０ＤＭＢＡ　１　、　−次的にホルモン依存ＤＭＢＡ腫瘍の変種で、ホルモン非依存性で可移植性。

ＮＭＵ−２，−次的にホルモン感受性ＮＭＵ朧瘍の変種で、ホルモン非依存性、可移植性で転移性。

ＬＳ−１７４Ｔ、ヒト結腸癌系全ヌードマウスで皮下増殖させ、固型腫瘍で可移植性のものを得た。

８−ＣＡ−ｃＡＭＰおよびＤＢ−ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ類似体１０ダとコレステロール１０ダからなる２０ｍｇペレットとしてＯＢ目に与え、腫瘍容積変化ｔ− ７日目区側定し穴。

第　６　表１回注射によって腹腔内に与えた時の非担癌ＢＤＦｌマウ　−スの生存期間に対する８　−ＣＬ　−ｃＡＭＰ　−Ｎａ＋の影響４８０　ｉｐ　：　ｑｄ、　ｄＢ　１　５１５２８８　ｉｐ：　ｑｄ、　ｄａｙ　１５１５１７３　ｉｐ：ｑａ、ｄａｙ　１　２１５１０４　ｉｐ：ｑｄ、　ｄａｙ　１　０６２　ｉｐ：ｑｄ、ｄａｙ　１　Ｇ５７　ｉｐ：ｑｄ、　ｄａｙ　１　０２２　ｉｐ：ｑｄ、ｄａｙ　１　０非担癌ＢＤＦ、マウスに１Ｂ目から毎日投与すると、８−　Ｃｊ　−ｃＡＭＰ　 −Ｎａ　４８Ｇおよび２８０１１ｐ／ＫｌＦ投与量がすべての投与マウスに対して致死的に有毒でありた。１７３′ｍ９７〜投与量で５匹中２匹のマウスが死亡し、より低い投与量では致死的に有毒ではなかつた。

第　７　表注入または一回注射により与え穴時のＬ１２１０　接種ＢＤＦ。

マウスの接種後の生存期間に対する８　−ＣＩ　−ｃＡＭＰ　−Ｎａ”の影響１０４　ｉｐ：ｑｄ、ｄ象ｙ１−７９８６２　ｉｐ　：ｑｄ、　ｄａｙ　１−７　１０５５７　ｉｐ：　ｑｄ、　ｄａｙ　１−７９５２２　１Ｐ　：　（ｌｄ、ｄａｙ　１−７　１０５ａｏｏ　ｉｐ　：　２４−１ｒ注入、　ｄａｙ　１−５　６２　毒性４８Ｇ　ｉｐ　：　２４−ｈｒ圧注入ｄａｙ　１−５　９Ｓ　毒性２８Ｂ　ｉｐ　：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１２１３　毒性１７３　ｉｐ　：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１３１１０４　ｉｐ：２４− ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１３７６２　ｉｐ　；　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１７５７　ｉｐ　：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１２６２２　ｉｐ：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１２６１５　ｉｐ：２４− ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１１３ａ、ｓ　ｉ　ｐ　：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１００ｔ７　ｉｐ：　２４−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　１００（１６１９：　”−ｈｒ圧注入　ｄａｙ　１−５　ｔｏ。

最初の投与の２４時間前に、マウスにネズミ科動物白血病Ｌ１２１０のｌＸ１０ ’細胞を接種し九〇各投与群は５匹のマウスで構成した。ＣＬ９ｃｓＮａＣＡ溶液を投与された２０匹のマクスは＆２±α６日間生存した。注入した時、８−Ｃｊ−ｃＡＭＰ　−Ｎａ　８００　オよびａ　ａ　ｏ　ｑ／ｈ投４はすヘテノ投与マウスに致死的に有毒で、２８８９／Ｋｌ投与で５匹中２匹のマウスが死亡した。

バーバード（Ｈａｒｖａｒｄ　）ポンプにより注入。

１回腹腔内投与　ＬＤ、・　〜１９５■／麺ＬＤ１６　〜１２２　”９７に４第　８　表ヒト乳腫瘍異種移楢の増殖に対する８　−Ｃｂ　−ｃＡＭＰ　−Ｎａ”の効果異種移植　（ｗ７Ｋｖ’ｄａｙ）　ａ瘍重量　腫瘍重量　ま念は７日間　ＣＩＩＰ）”　Ｃ■）　係ΔＴ／託参拳Ｍｘ−１乳癌　Ｎ’！ｉ、　Ｓ　３４　５４９１７５　５７５　５５６　−１゜１０４　５４６　５２５　−Ｑｙ６２　５７５　４７１　＋２６３７　５６７　５１６　＋４１牟　ステイ、ジングデイにおける詳当りの平均腫瘍重量私　ステイジングデイ＋７における群当りの平均腫瘍重量・Φ　試験膿瘍重量変化（最終−最初）／最初の試験腫瘍重量試験腫瘍サイズが投与中に減少し九所で使用。負の壇で示す。

■　試験ノ虚瘍重歎変化／対照腫瘍重量変化試験臓瘍サイズが投与中に増加した所でｌ用。正の１直で示す。

第　９　表ヒト結腸および肺雁瘍異橿移檀の増殖に対する８−（Ｊ−ｃＡＭＰ　−Ｎａ　（Ｄ効果腹腔内注入　最初の平均　最終の平均　嗟ΔＴ／Ｔ　軸異橿移植　（ａｔｚＡｃｑ／ｄａｙ　）　憾瘍重量　膿瘍重量　または結腸癌　１０４　２８８　３１７　−３５ＬＸ−１−対照　３３２　５１５肺癌　１０４　５２４　２７０　−１７５７　５５０　５４１　＋０６拳　スティジングディにおける群当りの平均腫瘍重量番　スティジングディ＋７における群当りの平均腫瘍重量中・　試験腫瘍重量変化（最終−最初）／最初の試験腫瘍重量試験腫瘍サイズが投与中に減少し次所で使用。負の堰で示す。

参番　試験腫瘍重量変化／対照腿瘍重量変化試験虐瘍サイズが投与中に増加し九所で使用。正の値で示す。

上記から、ＣＡＭＰの部位選択的類似体がμＭ濃度で腫瘍増殖を止める効果があることがわかる。部位選択的類似体は、インビトロでのＣＡＭＰ受容体蛋白質への結合にお匹て、したがってｃＡＭＰ依存蛋白質キナーゼ活性化におい”Ｃ１早い時期に知られていた類似体より何倍も高い活性があるが、これは何倍も低論濃度で効果金示した。

したがって、ここで試験した部位選択的類似体で起る増殖阻害にｃ　ＡＭＰ依存蛋白質キナーゼが直接関与している。

第１０表はオートラジオグラムのＡ５６（ｌｎｍにおけるデンシトメトリー追跡を示す。受容体蛋白質レベルｔ１それぞれＬ　ＯＯ，Ｄ、に等しくなるようにし穴ＭＤＡ−ＭＢ−２５１とＬＳ−１７４’ｌ’の非処理対照ａ胞８ルベルに相対的に示した。低濃斐バンドを分別する定めにスケールを広げた。

第１０表ｔ　８−Ｃ１（Ｌ２５±［１０３（Ｌ１５±０．０１　Ｃ６０４５八賜−ｍ−ｚｓｔ　２．　ＮＧ−ベンジルα２５±α０３α０７±α０１　α２８　５５五シフ）トリル　ＬＯ±ａ１　（ＬＯ７±（ＬＯＩ　Ｃ０７１００歳対照　ｔｏ±［１１（１０５±α０１α０５１００ｔ８−Ｃｔ　α２０±（１０２（１２５±（１０２ｔ２５　５０ＬＳ−１７４Ｔ　２．　ＮＧ−ヘンシル　１２０±［１０２（Ｌ２５±［１０２ｔ２５　５５五ジフヂリル　α８０±［Ｌｌｏ　α１５±０．０２　［Ｌｌ９　８５４対照　１．０±α１０　（ＬＩＯ±α０２α１０１００第１１表を対照　ｔｏ±［Ｌｌ　１０Ｇ２．８−８−Ｃ２−ｃＡ　α１±［Ｌｏｌ　４５（１０μＭ）（５００μＭ）第１１表はオートラジオグラムの一０ｎｍにおけるデンシトメトリー追跡を示す。ｐ２を蛋白質レベル＠、ｔｏ　［ＬＤに等しくなるようにし几非処理対照細胞のｐ２ルベルに相対的に示した。

白血病治療の現在の手法は細胞を殺すというよ夕細胞の分化を促進することである。本発明の部位選択的ｃＡＭＰ類似体は、以前に研究されたｃＡＭＰ類似体よ、り蛋白質キナーゼ活性化で何倍も高い活性を持つが、ヒト白血病細胞系スペクトルに対して主要な増殖調節効果を及ぼす。

下記の実験に使用し之白血病細胞系はＭＬ−６０（急性前骨髄球性）、Ｋ−５６２（慢性骨髄球性）、ｍｙｃ−に５６２（慢性骨髄球性）、およびＭｏ１ｔ−４（急性’ｌ’　＋７ンバ球性）であり九。

細胞ｉ、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（５０Ｕ／、ｍ／）、ストレプトマイシｙ（ｓｏａｐｇ／ｄ）、１０　ｎｍｏ　ｌ／　Ｌ　）ｉＥＰＥ８緩衝液、および更にグルタミンを補り＊ＥＬＰＭ１１ｂａａ中、懸濁培養で増殖させた。細胞増殖実験では、接ａＳ時間後に１回、ｃＡＭＰ類似体で細胞を処理し、４８および７２時間後にコールタ−（Ｃｏｕｌ　Ｌｅｒ）カウンターで細胞数計測を二重に行り几。ＲＬ　−６０細胞の表面抗原分析を、骨髄細胞または単球いずれかと反応するモノクローナル抗体パネルを使った７０−サイトメトリーで行った。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランス７エラーゼ（ＴｄＴ）　ｖｉ−ＴｄＴ蛍光キッ）ｔ−使りて免疫ペルオキシダーゼ法で分析した。ｃ−ｍｙｃ蛋白質のウェスタンブロッティングをｃ　−ｍｙ　ｃ抗体１５２０６Ｄ１１（スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　７アクンデイシジン、ラホヤ、カリフォルニア、８ｅｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｌｉｏｎ、　ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）　ｆ使って行り几。

゛　アデノシン残基のＣ−６またＦｉｃ−８位いずれかを修飾Ｌ７を種々のｃＡＭＰ類似体を櫨々の濃度で、第１１茨に示すように、白血病細胞系に対する増殖阻害効果について試験した。試験したＣ−８類似体（部位１選択的）の中で、　８−　Ｃ１−ｃＡＭＰが最も力価が高く、４徨すべての白血病細胞系に５　”２０１ｘｒＵｏｌ　／　Ｌ濃度で５ｏチ増殖阻害（ＩＣｓ）’に示し九。８−Ｂｒ −，８−メチルチオ−１および５−７１チル７ミ／　−ｃＡＭＰは８−　ＣＬ− ｃＡＭＰより５乃至２０倍低い力価であり之、Ｎ・−ベンジル−ｃＡＭＰ　ｈ試Ｍし九Ｃ−６類似体でｆｌｔも強く、１０−１ＡＭ／ＬのＩＣ騎値であり友。構造的にＮ・−ベンジル−ｃＡＭＰに類似しｚ　Ｎｌ−ベンゾイル−ＣＡＭＰは４０乃至５０　／ＪｍＯ１／　Ｌ　ＯＩ　ＣＨ値金示した。以前の研究で、１４．一般に使用され九類似体であるＤＨｃＡＭＰは５００乃至１０００　ｐｍｏ　ｊ／　Ｌ　ノＩ　ＣＨ値と最低力価金示し、ＭｏＨ−４においては５０チ増殖阻害が得られなかり之。部位選択的ｃＡＭＰ類似体による増殖阻害は殺細胞によるものでない；細胞ニトリバンプルー染料排出で調べると８０乃至９０％生存であり友。

第１２表白血病細胞系の増殖に対する部位選択的ｃＡＭＰ類似体の効果サイクリック　増殖阻害ＩＣ５ｏ（ｍｏｌ　／Ｌ）ヌクレオチド　ＣＡＭＰ類似体、　似体）ｉｔ、−６０Ｍａｌｔ−４Ｋ−５６２ｍｙｃ−に５６２Ｃ−８８−クロロ　１００　５　２０　２０８−ブロモ　５０　１００　１００　１００８− チオメチル　１ｏｏ　ｊｏｏ　１００　１００８−７ミノメチル　１００　１００　１００　１００Ｃ−６Ｎ・−ベンジル　２０　１０　２７　３０テオフイリン（（Ｌ　１　ｍｍｏｌ　／　Ｌ　）　または１−メチル−３−インプチルキサンチン（α５　ｍｍｏ　１　／　Ｌ　）のようなホスホジェステラーゼ阻害剤は、それぞれ単独では増殖阻害効果がほとんど、’Ｅ７ｔｔｌ！全くなく、類似体と組合せて加えた時に類似体の効果を強めることができなかりた。これらの結果は、類似体が増殖阻害金、ホスホジェステラーゼによる分解が起るより低い濃度で行い、ｌた、その増殖阻害は細胞のｃＡＭＰ　ｆ高めることが原因ではないことを示唆している。

）ｉＬ−６０細胞における分化マーカーの発現に対する部位選択的ｃＡＭＰ　３位体の効果を、増殖停止に−ＬＬ−６０細胞が非処理細胞より分化されているかどうかを調べて検討しｚ　、　ｓ　−ＣＬ−ｃＡＭＰ　テ３日間処理すると９０％生存率を示し、単球特異的表面抗原（ＭＯ２，ＯＫＭ、　）の発現の顕著な増加と未成熟始原細胞（Ｍｙｒ　、　ＭＹ’）に関係するマーカーの減少全誘導し友。第１５表参照。

第１３茨８−　Ｃ７−ｃＡＭＰによる）ｉｌ、−６０細胞における分化マーカーの変調対照　８−８−Ｃ２−ｃＡチ陽性Ｍｙ’　８１　１１ＭＹ”　７５　５４ＬｅｕＭ１　７２　ｇＬｅｕＭ５　０　０ＭＱ、　０　７５ＯＫ橘　０５１米　９０％の細胞生存率を持ちつつ７０％の増殖阻害細胞ＴｄＴの消失はヒ）Ｔリッツ球性白血病の分化マーカーと考えられている。Δｄｏｌｌ−４（急性リンパ球性）白血病細胞ｆ　８−　ＣＬ−ｃＡＡｉＰ　（１０μｍｏｌ／Ｌ　）で処理するとＴｄＴ活性の時間依存減少？起す；処理２日後、ＴｄＴ活性は非処理対思細胞のものの５０％に低下し、４日月ｌでに、その活性は非処理対照レベルの１０％に低下し九。

更に、Ｎ番−ベンジル０品？（２０μｍｏ　１　／　Ｌ　）と組合せｔ８−　Ｃ１−ｃＡＭＰの４日間処理で、ＴｄＴ活性のほとんど完全な欠失（〉９５％）を起した。　ＴｄＴ欠失を示すこれらの細胞は〉９０％の生存率金示した。類似体処理後に白血病細胞系に見ら扛る細胞増殖低下が細胞サイクルの一つの相の特異的ブロックによるものかどうかを調べる友めに、グロピジウム沃素染色法を用いた。その結果は、細胞サイクルの各相における細胞の画分は対照細胞と類似体処理細胞間で評価できる種変らなかつ友。

ｃＡ、ＭＰ依存蛋白質キナーゼのタイプｎアイソザイムは細胞増殖および形質転換に関与すると考えられ、一方、タイプｎアイソザイムは細胞分化と細胞増殖の阻害に関与する。タイプＩとタイプ■蛋白質キナーゼはその調節サブユニットのみが異っているので、　ｃＡＭＰ結合受容体蛋白質、すなわち、ｃＡＭＰ受容体蛋白質を、光親和リガンド８−　Ｎ３−　（”Ｐ　）　ｃＡＭＰ　ｆ使っテ、これらの白血病細胞の類似体処理中に測定した。第９Ａ図に示すように、非処理Ｍｏ１ｅ−４白血病細胞は几ｃＡＭＰ受容体蛋白質（タイプＩ蛋白質キナーゼのＡ節すブユニット）である主要な分子量４ａＯＯＯのｃＡＭＰ受容俸蛋日質（レーン１ンを含んでい友。細胞５８−　ＣＬ−ｃハＬＰで５日間処理すると（レーン２）、ル受容体蛋白質はｗＡ着に減少し、一方、細胞全ＤＥＣＡＭＰで処理ブると（レーン３）、几蛋白質は見るべき変化なく止１り几。８−　Ｃ４−ｃ屁庁処理後に見られｋＲ１受容体光親和標黛の減少がル１受容体に結合した８　−Ｃ１ −ｃＡＭＰの存在が原因であるということは余り考えられない；　８−　Ｃ１− ｃＡＭＰは８−ピペリジノ−ｃＡＭＰのようにＲ１の部位１に選択的に結合するが、Ｒ１受容体の部位２に結合する。したがりて、Ｒ１の部位２に結合した８− ８−Ｃ１−ｃＡは８−　Ｆ％−（”Ｐ）ｃＡＭＰの部位１−選択的結合を妨害する代りに、相乗的に強化する。

８−　ＣＬ−ｃＡＭＰｕ第９Ｂ図、レーン２に見られるように、ｃ−ｍｙｃ蛋白質レベルの顕著な低下をも起し、一方、レーン３のＤＢ　ｃ　ＡＡｉＰはｃ−ｍｙｃ蛋白質に影響しなかつ几。これら？１８−　ＣＬ−ｃＡＭＰ処理によりて起されるＲ１およびｃ　−ｍｙ　ｃ蛋白質レベルの減少は一般に増殖阻害または細胞死を単に反映していないことを示している　Ｂｌおよびｃ−ｍｙｃ蛋白質レベルの同様の低下が、８−　ＣＬ−ｃＡＭＰ処理後に他の白血病細胞系のに−５６２，ｍｙｃ−に５６２、およびＭＬ−６０にも起った。凡ｃＡＡ４Ｐ受容体蛋白質はＭｏ１ｔ−４で検出されなかったが、他の白血病細胞系で測定できた。類似体処理はこれらの白血病細胞のＲレヘルに影響しなかりた。

第９Ａ図は８−　Ｎ３−　（”Ｐ）ｃ、品伊の光活性化取込みを表す；第９Ｂ図はｃ−ｍｙｃ蛋白質：凡、すなわち分子蓋５へ０００のＲｃＡＭＰ受容体蛋白質：　ｃ−ｍｙｃ蛋白質、すなわちｃ−ｍｙｃ蛋白質の精製標品のウェスタンブロッティングｋＡわす。レーン１は非処理対照細胞：レーン２からレ−ｙ４ｉそれぞれ５　ｔｔｍｏ　ｌ／　Ｌ　８−　ＣＬ−ｃＡＭＩ！　、　ＤＢｃＡＭＰ（１ｍｍｏｌ　／　Ｌ、　）　、およびａ−ＣＺ−アデノシｙ（５μｍｏｌ／Ｌ）で３日間処理した細胞である。Ｍは分子量既知のマーカー蛋白質である。各レーンにドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（Ｓｎ２−ＰＡＧＥ）の几めに１００μｇの蛋白質全含１せ次。リン酸塩緩衝化食塩液で２回洗浄後、細胞ベレットを緩衝液１０（α１ｒｎｏｌ／Ｌ　ＮａＣＬ、　５ｍｍｏｌ／　Ｌ　８ｇＣ４＊　１％ノニデットＰ−４０゜［Ｌ５９Ｇデオキシコール酸ナトリウム、２ＫＩＵ／ｄウシアプロチニｙ、２０ｍｍｏｌ／１７）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４）　（２Ｘ１０γ細胞／ｄ）に懸濁して振と５攪拌し、２２ゲ一ジ注射針ｉ１０回通して４℃で５０分間放置しｔ後、４℃で２０分間、７５０Ｘｔで遠心分離した。得られた上澄全細胞破砕液として使用し友。パネルの数字は７つの別々の実験の平均僅±８．　Ｅ−（ｉ−表す。ＮＤは検出されなかりたとの意味である。

上記のように、本発明のｃＡＭＰ類似体は前骨髄球性、慢性骨髄球性、および急性Ｔリンパ球性ヒト白血病細胞系の増殖に５Ｍ２１度で主たる効果を与える。この類似体効果ハ、類似体とホスホジェステラーゼ阻害剤を併用しても効果を強めなかつ几ことから、従来信じられていたように細胞のｃＡＭＰレベルを高めることが原因ではなかった。

類似体はＣＡＭＰ受容体蛋白質を介して直接ＣＡＭＰ依存蛋白質キナーゼの調節サブユニットに作用した。試験した部位選択的類似体の中で、８−Ｃｔ−ｃＡＭＰが最も高に力価を示した。類似体効果は二つのタイプのｃＡＭＰ受容体蛋白質の選択的変調と相関した細胞増殖および形質転俟と関係しているとされている几１受容体の顕著な諷少するが、増殖停止と分化に関係するＲ受容体は変化しないことである。

凡１および几”　ｃＡＭＰ受容体蛋白質のこの選択的変調は初期に既知の類似体であるＤＢｃＡＭＰでに起らない、増殖阻害はｃ−ｍｙｃ蛋白質レベルの顕著な低下をも引起した。細胞＠５−Ｃｔ−アデノシンで増殖停止させた時には　Ｒ１ｃＡＭＰ受容体およびｃ−ｍｙｃ蛋白質レベルの低下ハ観察されず、類似体の効果がそのアデノシン代謝物によるものではないことを示している。

類似体による増殖停止は、ＨＬ−６０細胞での単球分化に特異的ないくつかの表面抗原の発現と、ＭｏＨ−ａ細胞での細胞未成熟のマーカー酵素であるＴｄＴ活性の欠失で示されるように、白血病細胞の分化を伴った。類似体処理細胞で見られた成熟表現型マーカの出現と明らかな増殖停止にもかかわらず、処理および非処理細胞間の細胞サイクル相分布は類似していた。

正常な骨髄細胞前駆体において、増殖誘導剤は細胞生存および細胞数増加を、ｌた分化誘導剤の産生をも訪導する。したがって、白血病細胞において、最後の分化を行うために分化誘導剤の連続的産生が必須である。部位選択的ｃＡＭＰ類似体は正常な細胞サイクルをより遅い速度で進行させつつ増殖停止を行うが、これは分化誘導剤の連続的産生を許すので白血病細胞を最後ｌで分化させるかもしれない。したがりて、本発明の部位選択的ｃＡＦｉｉＰ類似体は白血病細胞の増殖と成熟の間のバランスを修復する。

Ｃ−ｂ類似体ｔ−８−チ第１たは８−ハロゲン類似体と組合せた時のＣ−６類似体による増殖阻害の相乗作用は、Ｃ−６類似体と８−アミノ誘導体を組合せた時のＣ−６類似体による作用をはるかに越えることもわかった。これはタイプ■蛋白質キナーゼよりむしろタイプ…の応答を示唆する。事実、増殖阻害中に見られるＰＬｆ受容体蛋白質の減少を伴５　Ｒ”　ｃＡＭＰ受容体蛋白質の“増加は、第５および６図でみられるように、類似体の増殖阻害効果と相関していた。癌細胞でＲ１および几”ｃＡＭＰ受容体蛋白質の選択的変調を示す部位選択的類似体の特異な挙動は、初期の既知の類似体、ｃＡＭＰ自身、’ｆ７’ｃＦｉ細胞（Ｄ　ｃＡＭＰ　Ｖベルを高める薬剤では真似ができない。部位選択性を持たない高レベルのｃＡＭＰはタイプ■とタイプｎ蛋白質キナーゼ　アイソザイムの両方を区別せずに最大で同等に活性化する。

部位選択的ｃＡＡＬＰ類似体を組合せると相乗効果を示すので、単独の類似体を使りて得られるであろうものと同じ増殖阻害効果を得るために、組合せることでょシ低い全類似体濃度を使うことができる。すなわち、組合せた部位選択的類似体は低Ｋｍ　ｃＡＭＰホスホジェステラーゼについて報告されているＩＣ紳の少くとも１／１０低い濃度で増殖阻害した。この低＃度では、類似体は代謝されて有毒なアデノ７ン類似体になることにないであろう、事実、）１ＰＬｃ分析によシ、５０μＭという高さの濃度のＳ　−Ｃｔ−ｃＡＭＰで４８−７２時間細抱會処理した後の細胞抽出物や培地中に８−Ｃ１−７デノシンは検出されなかりた。

細胞増殖の阻害における５−Ｃｔ−アデノシンの役割に、細胞サイクル、増殖阻害からの開放、およびｐ２１　ｒａｓ蛋白質の変調における８　−ＣＬ−ｃＡＭＰと５−ＣＺ−アデノシンの間の異る挙動を示す実験により、除外された。したがって、ここに記載した部位選択的化合物の増殖阻害効果は、アミノ置換Ｃ−８類似体およびプリン類似体のサイクリックヌクレオチドのいくつかを使ってラット肝癌細胞に致死的な強い細胞挿性を示した以前の報告におけるものとは明らかに異る。

本発明の化合物による増殖阻害は生化学的および形態学的変化を伴ったが、試験した癌細胞で０１停止を生じなかりた。したがって、本発明化合物は、細胞サイクル進行を遅らせ、恐らく細胞分化を促進することによって増殖阻害を行うらしい。実際に、分化促進における部位選択的ｃＡＭＰ類似体の役割が白血病細胞系で見られた。

本発明の部位選択的類似体は比較でさるｍ度のＤＢｃＡＭＰに耐性の癌細胞の増殖を停止できた。したがりて、本発明の部位選択的ｃＡｍＰ類似体は、他のｃＡＭＰ類似体あるいは細胞内ＣＡＭＰｔ−増加させる薬剤に耐性であると前に分つているものを含む癌細胞の広いスペクトラムの増殖調節における生物学的道具として有用である。

本発明の化合物を患者の血清中に約０１乃至約１１００Ａの濃度になるような量で投与する。化合物は、浸透ポンプにより、ペレット移植、ｌたは化合物を連続的に供給する他の方法を含む、種々の方法で投与されてよい。

本発明の化合物は薬剤学的に許容できる支持体に含ｌれた撞々の方法によりて有効量を投与されてよい。本発明の範囲内の組成物は口論んだ目的を実施するに有効な量で化合物を含む組成物を含む、有効量の決定は本分野の技術の範囲内にある。

本発明のｃＡＭＰ類似体ｌｆｃはｃＡＪｄＰ類似体の組合せおよび薬剤学的に許容されるその塩に加えて、薬剤学的組成物は、薬剤学的に使用できる調剤品に活性化合物を加工するのを容易にする賦形剤および補助材を含む、好適な薬剤学的に許容できる担体を含んでいてよい。望１しくに、特に、錠剤、糖衣錠、およびカプセル錠のような経口投与され、望ましい型の投与に使用できるもの、および、座薬のように直腸内に投与され得る調剤品、ｌた注射ｌたは経口的に投与する好適な溶液は、活性成分を約１１乃至９９重量％、望’ＥＬ（は約２５乃至８５重量−を賦形剤と共に含む。

本発明の薬剤学的組成物を公知の方法、例えは従来の混合、造粒、糖衣錠化、溶解、または凍結乾燥によシ製造する・したがって、紡口使用の′Ａ剤品を、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を、もし望みｌたは必要ならば好適な補助材を加えた佼に、加工して錠剤’ Ｅ７’Ｃは糖衣錠コアを得る。

好適な賦形剤は、特に、例えば乳糖、庶抛、マンニトール、ｌたはソルビトールのよ５な糖；セルロース調製品：および／またはリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムのようなリン酸カルシウムのような充填剤、およヒ、例えばコメデンプン、コーンスターチ、コメデンプン、ポテトスターチを使ったデンプン糊：ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルロースナトリウム、および／’Ｅｆｃはポリビニルピロリドンのようなバインダーである。望むならば、上記のスターチ類およびカルボキシメチルスターチ、架橋したポリビニルピロリドン、原人、またはアルギン酸ｌたはアルギン緻ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてよい。

補助剤は、就中、シリカゲル、タルク、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムｌたはステアリン酸カルシウムのようなその塩、および／ｌたはポリエチレングリコールのような流動調節剤および滑沢剤を含む、糖衣錠コアは、もし望むならば、胃液に耐性の、好適な被覆をして得られる。この目的のために、濃厚塘浴液を使用でき、これは望みに応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／ｌたは二殴化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでよい。胃液に耐性の被覆金つくるため、アセチルセルロースフタレートｌたはヒドロキシグロビルメチルセルロースフタレートのような好適なセルロース調製品の溶＊ｉ使用する。染料や顔料ｔ１例えば識別ｌたは活性化合物用量の異る組合せを特徴づけるために、錠剤！ｆｃは糖衣錠被覆に加えてよい。

経口的に使用される他の調剤品は、ゼラチンでつくりたプツシニーフィツトカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤からっくりたソフト、シールドカプセルを含む。プツシニーフィツトカプセルは、乳糖のような充填剤、スターチのようなバインダー、および／ｌたはタルクｌたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および望みに応じて安定化剤と混合される顆粒の形状で活性化合物を含んでよい。

ソフトカプセルには、活性化合物は脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような好適な液体に溶解ｌたは懸濁されていることが望ｌしい。更に安定化剤を加えてよい。

直腸内投与で使用される可能な調剤品は、活性化合物と展剤ベースとの組合せからなる座剤を含む。好適な展剤ベースは、例えば天然１７ｔは合成のトリグリセリド、パラフィン、炭化水素、ポリエチレングリコール、ｌたは高級アルカノールである。更に、活性化合物とベースの組合せからなるゼラチン直腸カプセルを使うこともできる。可能なベース材は、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、１ｆｃはパラフィン炭化水素金倉む。

非経口的投与のために好適な製剤には水溶性ｌｆｃは水分散性形状の活性化学物の水溶液が含１れる。これらの水溶性ｔｆｔ、ｈ水分散性形状は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のような薬剤学的に許容さ　−れる類似体の塩である。更に、適当な油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与できる。好適な親油、性溶媒また蝶賦形剤には例えばゴマ油のような脂肪油、または例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセライドのような脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁液はカルボキシメチルセルロースナトリウム、ンルビトールおよび／またはテキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含んでいてよい。望みに応じて懸濁液は安定剤を含んでいてもよい。

活性取分を、脂質層（疎水性）に付着した水性同心層からなる微粒子内に活性成分が分散ｌたは種々の状態で存在して含ｌれる薬剤学的組成物である、リボリームとして投与してもよい。薬剤は、水層および脂質層（内側ｌたに外９１）の両方に、または、いずれにせよ、リポソーム懸濁液として一般に知られる非均質系に存在していてよい。

疎水層は、一般に、しかしこれだけではないが、レシチンやスフィンゴミセリンのようなリン脂質、コレステロールの工５なステロイド、多かれ少かれ、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミンｌたはホスファチジン酸のようなイオン性界回活性剤、および／または他の疎水性の物質を含む。

本発明全いくつかの特定の実施態様に関連付けて上に記載したが、多くの変法が可能であシ、筐た、本発明からはずれることなしに他の材料や試ａｍを使用できることを理解すべきである。ある場合には、このような変法や代換物をｆ５時にいくらかの実験を必要とするかもしれないが、それは単に日常的試験である。

特定の実施態様についての上記の記載は本発明の一般的性質を十分に明らかにしているので、この一般的概念からはずれることなくこの特定の実施態様を現行の知識をつかつて容易に修飾し、および／ｌたは種々の適用に応用できる。したがりて、そのような応用や修飾は開示した実施態様と同等物の意味と範囲の中にあると理解される。　本明細書の語法または用語は記載を目的とし、これに限定されるものではない。

ＦＩＧ、１細胞系ＦＩＧ、３時間（日）保持時間（分）ＦＩＧ、５Ｂ　画分番号ＦＩＧＵＲＥ　ＯＭＯＡ−ＭＢ−２３１ＬＳ−１７４７ＦＩＧＵＲＥ　７４３Ｋ　−＋ＦＩＧ、８Ａ時間（ＤＭＢＡ後の日数）時間（ＤＭＢＡ後の日数）ＦＩＧ９Ａ　ＦＩＧ、９ＢＭＲ”ＲｒＬｌ　２３４　Ｍ謂。１２３４蛋白質国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｃＡＭＰ部位１−選択的誘導体および部位２−選択的誘導体および薬剤学的に許容できるそれらの塩、およびそれらの混合物からなる群から選ばれた少くとも一つのｃＡＭＰの部位−選択的誘導体の有効量を癌を患っている患者に投与することからなる癌の治療法。
２．誘導体が、８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンジル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンゾイル−８−メチルチオ−ｃＡＭＰ，８−メチルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンゾイル−ｃＡＭＰ，８−プロモ−ｃＡＭＰ，８−ヨ−ド−ｃＡＭＰ，８−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，８−β−ヒドロキシエチルアミノ−ｃＡＭＰ，８−メチルアミノ−ｃＡＭＰ，８−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−フェニルカルパモイル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−プチリル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−Ｏ２′−ジプチリル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−フェニル−８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６Ｎ６−ジエチル−８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，６−ピペリジノ− ８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンジル−８−ベンジルチオ− ｃＡＭＰ，Ｎ６−エトキシカルボニルｃＡＭＰ、およびＮ６−ｎ−ブチル−８− ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰおよびその混合物からなる群がら選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
３．誘導体が８−メチルチオｃＡＭＰである請求の範囲第１項記載の方法。
４．誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１項記載の方法。
５．誘導体がＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰである請求の範囲第１項記載の方法。
６．少くとも一つの誘導体がｃＡＭＰの部位１−選択的誘導体と部位２−選択的誘導体の混合物を含む請求の範囲第１項記載の方法。
７．部位１−選択的誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第６項記載の方法。
８．部位２−選択的誘導体が、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰとＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰからなる群から選ばれる請求の範囲第７項記載の方法。
９．誘導体が、Ｎ６−フェニル−８−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰとＮ６ −ベンジル−８−Ｃｌ−ｃＡＭＰからなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
１０．ｃＡＭＰの部位１−選択的誘導体およびｃＡＭＰの部位２−選択的誘導体の有効量を薬剤学的に許容できる担体とともに含む癌治療用組成物。
１１．部位１−選択的誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１０項記載の組成物。
１２．部位２−選択的誘導体がＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰである請求の範囲第１１項記載の組成物。
１３．部位２−選択的誘導体がＮ６−ペンノイル−ｃＡＭＰである請求の範囲第１１項記載の組成物。
１４．少くとも一つのｃＡＭＰの部位選択的誘導で、その部位選択的誘導体がｃＡＭＰの部位１−選択的誘導体および部位２−選択的誘導体および薬剤学的に許容できるその塩からなる群から選ばれたものの有効量を白血病を患っている患者に投与することを含む白血病の治療法。
１５．誘導体が、８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンジル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンゾイル−８−メチルチオ−ｃＡＭＰ，８−メチルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンゾイル−ｃＡＭＰ，８−プロモ−ｃＡＭＰ，８−ヨード−ｃＡＭＰ，８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，８−β−ヒドロキシエチルアミノ−ｃＡＭＰ，８− メチルアミノ−ｃＡＭＰ，８−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−フェニルカルパモイル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−プチリル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−Ｏ２′−ジプチリル−ｃＡＭＰ，Ｎ６−フェニル−８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６，Ｎ６−ジエチル−８−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，Ｍ６−エトキシカルボニルｃＡＭＰ，６−ピペリジノ−８−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰ，Ｎ６−ベンジル−８−ペンジルチオ−ｃＡＭＰ，およびＮ６−ｎ−ブチル− ８−Ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰからなる群から選ばれる請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．誘導体が８−メチルチオ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１４項記載の方法。
１７．誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１４項記載の方法。
１８．誘導体がＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰである請求の範囲第１４項記載の方法。
１９．少くとも一つの誘導体がｃＡＭＰの部位１−選択的誘導体と部位２−選択的誘導体の混合物を含む請求の範囲第１４項記載の方法。
２０．部位１−選択的誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．部位２−選択的誘導体がＮ６−ベンゾイル−ｃＡＭＰとＮ６−ベンジル− ｃＡＭＰからなる群から選ばれる請求の範囲第２０項記載の方法。
２２．誘導体がＮ６−フェニル−８−ｐ−クロロフェニルチオ−ｃＡＭＰである請求の範囲第１４項記載の方法。
２３．ｃＡＭＰの部位１−選択的誘導体かよびｃＡＭＰの部位２−選択的誘導体の有効量を薬剤学的に許容できる担体とともに含む白血病治療のための組成物。
２４．部位１−選択的誘導体が８−Ｃｌ−ｃＡＭＰである請求の範囲第２３項記載の組成物。
２５．部位２−選択的誘導体がＮ６−ベンジル−ｃＡＭＰである請求の範囲第２３項記載の組成物。
２６．部位２−選択的誘導体がＮ６−ベンゾイル−ｃＡＭＰである請求の範囲第２３項記載の組成物。