JPH04501309A - 電流測定による診断分析の方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：電流測定による診断分析の方法及び装置本出願は、１９８８年３月 １５日付出願の米国特許第１６８２９５号の一部継続出願である。

［発明の分野］ 本発明は、使い捨てできる電気分析セルに関し、生物学的に重要な化合物（ｃｏ ■ｐｏｕｎｄｓ）、例えば、グルコース、ＴＳＨＳＴ４、ＨＣＧの如きホルモン 、ジゴキシンの如き強心性配糖体、リドカインの如き不整脈抗剤（ａｎｔｉａｒ ｒｈｙｔｈａ＋１ｃｓ）、フェノバルビタールの如き癩病抗剤（ａｎｔｉｅｐｉ ｌｅｐｔｉｃｓ）、ゲンタミシンの如き抗生物質、コレステロール、非治療性薬 剤（ｎｏｎ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｄｒｕｇｓ）等のように、体液から化合 物の存在を、定量的に決定するための方法及び装置に関する。

本発明は広い範囲において適用可能であるが、本発明の説明では、生物学的に重 要なグルコースとコレステロールの２つの化合物を例示して、これら化合物の存 在を定量的に決定する場合について説明する。

［グルコースの場合］ 糖尿病、特に真性糖尿病は、膵臓で作られるインシュリンの欠乏を特徴とする代 謝疾患であり、血液グルコース値が異常になる。この糖尿病患者は、米国の人口 の約４％にすぎないが、その死亡原因は、心臓病、癌に続き第３位を占めている 。インシュリンを毎日注入し、食餌を厳密にコントロールして、患者の血糖を適 当な値に維持すれば、糖尿病の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）は極めて良好になる 。しかしながら、患者の血液グルコース値は、臨床機関が分析するか、或は、患 者が比較的簡単な非技術的方法を用いて毎日分析するかして、綿密にフォローし ていく必要がある。

現在、血液グルコースをモニターする場合、小さなプラスチック片に試薬を含ん だ乾燥パッドを載せ、酵素反応によって生じるカラー変化を、視覚又は器具を用 いて観察することにより行なっている。これらの比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒ ｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）は、グルコースの天然酸化剤と、グルコン酸、特に酸素に 対する関係を利用するもので、反応式は次の通りである。

Ｂ−Ｄ−グルコース＋島＋ＨＩＯ−→Ｄ−グルコン酸＋ｔｉｓｏ奪Ｈ倉０．十試 薬−→Ｈ雪０＋色 ［コレステロールの場合］ コレステロールの判定技術も、同様な方法に基づいて行なわれる。コレステロー ルの場合、現在使用されていル方法は、次の一般反応式に基づいて行なわれる。

コレステロール＋ＨｓＯ＋　Ｏｔ−→コレステノン＋Ｈ，Ｏ。

Ｈ２Ｏ，十試薬−→Ｈ１０＋色 現在のあらゆる技術において、自由コレステロール及び全コレステロールの両コ レステロールを定量する場合、酵素コレステロールオキシダーゼと使用される直 接の酸化剤（ｏｘｉｄａｎｔ）としては、ジオキシゲンが唯一のものである。従 来の試験方法を用いた場合、未希釈の血清及び全血液試料中の検体（ａｎａｌｙ ｔｅ）と完全に反応させるためには、使用中、センサー溶液の中に周囲の空気か ら酸素を拡散して十分な試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を供給できるようにしなければ ならない。

両方の場合とも、色を標準色と比較するか、又は過酸化水素を定量することによ り、物質の存在を決定するのである。本発明の検出方法は、分光器又は電気化学 的手段により生成した過酸化水素を直接測定する方法と、酵素過酸化物の存在下 で過酸化水素を種々の染料（ｄｙｅｓ）と反応させて着色し、その色をモニター する間接的な方法を含むものである。

これらの試験方法は、比較的簡単に使用できるが、結果を再現するためには、使 用者は熟練した技術を備えていなければならない。例えば、これらの試験を行な うには、試薬を含んだパッドから血液を所定の時間間隔で除去しなければならな い。色測定は試薬パッドの上表面で行なうため、所定時間を経過した後、過剰の 血液を、洗浄及び吸取り（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、又は吸取りだけにより取 り除く必要がある。色の検査は、反応直後に行なうか、或は所定時間の経過後に 行なう。

これらは、熟練した技術を必要とし、タイミングに十分な注意を払って行なう必 要がある。また、たとえ熟練した技術を有していても、例えばグルコースを比色 法で定量する場合、特に血糖値の低い範囲では精度に劣る問題がある。さらに、 比色分析に使用される器具によって、較正方法が多様である。使用者の較正を必 要としないものもあるし、第２標準を必要とするものもある。

体液中の生物学的に重要な化合物を調べるのに現在使用されている方法及び装置 は、一般的には、精度が低く、師は、そのような装置を用いて、値（ｌｅｖｅｌ ）又は適量（ｄ。

ｓａｇｅ＞をモニターするのに消極的である。また、患者自身にこの方法を実施 させることについては、特に消極的である。このため、医師だけでなく、患者臼 らがこれら化合物をよりすぐれた精度で検査できる方法及び装置の出現が要請さ れる。

本発明は、上記の要請に鑑み、全血、血清、その他の体液内の化合物をモニター できるようにした、酵素の電流滴定（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｅｒｏｍｅｔ ｒｙ）方法及び装置を提供することを目的とする。酵素の電流滴定方法は、使用 者の熟練を必要としないだけでなく、より直線的なダイナミックレンジ（ｄｙｎ ａ簡ｉｃ　ｒａｎｇｅ）を得ることができる。この方法であれば、医師は自分の 患者に対して、自ら検査を実施するように奨めることもできる。

酵素の電流滴定方法は、これまで、グルコース、血液の尿素窒素、乳酸塩等の多 くの検体を、実験室ベースで測定するのに用いられてきた。この方法では、これ まで、嵩ばった金属ワイヤ、円筒体、円板を絶縁材料に埋め込んだ電極が使用さ れてきた。しかし、各々の電極が個々の特性を有するから、製造工程において、 各センサーに対する較正を必要とする。また、これらの電極は、コストが高すぎ るため、使い捨てにするわけにはいかず、電極の信頼性を維持するために細心の 注意を払う必要がある。しかし、熟練していない素人の場合、このような維持管 理を適切に行なうことはできない。このため、素人である患者自身が酵素の電流 滴定方法を実施できるようにするには、センサーからセンサーへと出力を再生で きるように使い捨てのセンサーを使用することが前提である。従って、コストに ついても、従来の電極よりもはるかに低いコストで製造できるようにせねばなら ない。

本発明は、ミクロの部分標本（箇Ｌｃｒｏ−ａｌｉｑｕｏｔｅ）のサンプリング を精度良く行なうために、小型化して使い捨て可能にした試料セルを提供するこ と、試料の電気化学的還元を自動的に測定するための手段を内蔵した装置を提供 すること、及び前記セル及び装置を用いるための方法を提供することを目的とす る。

本発明にかかる使い捨てセルは、金属化（ｍｅｔａｌｌｉｚｅｄ）プラスチック と非導電性材料の層構造にすることが望ましい。金属化した層は、作用電極（ｗ ｏｒｋｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）と標準電極（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｌｅ ｃｔｒｏｄｅ）を備え、その面積は積層工程により規定され、再現可能である。

この層を貫通する開口を設け、試料の正確な測定を行なうために、試料を含む領 域すなわちセルを配備できるようにしている。本発明の装置は、セルを挿入すれ ば、自動的に測定サイクルが開始するようにしている。

測定工程をより良く理解するために、本発明の望ましい実施例では、２段階の反 応シーケンスを示している。

ここで、２段階とは、酸素以外の酸化剤を用いる化学的酸化の第１段階と、第１ 段階での反応生産物を定量（ｑｕａｎｔｉｆｙ）するのに適当な電気化学的還元 段階のことである。

ジオキシゲン以外の酸化剤を用いて検体を直接定量した場合、非常に過剰の検体 中のセンサーの中に予め配置することができるから、酸化剤が、最終的決定を左 右する試薬（ｌｉ■ｉｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）にならないという利点がある （酸素の場合、検体を定量変換するためのセンサー溶液中に当初から存在する酸 化剤は、通常、不十分である。）酸化反応においては、例えば、試料を含有する グルコースは、グルコン酸と、酸化剤の還元生成物に変換される。酵素、グルコ ースオキシダーゼの存在下では、この化学的酸化反応が先行することがわかった 。これは、特に、Ｂ−Ｄ−グルコースの基板の場合に特異であり、１個の電子受 容体（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ａｃｃｅｐｔｏｒ）及び２個の電子受容体で酸化反応 の触媒作用が行なわれる。しかし、この酸化反応は、グルコン酸が形成されてか らは進行しないから、この反応はグルコースの電気化学的測定に特に適している 。

本発明の望ましい実施例において、１個の電子受容体での酸化は、フェリシアン 化物、フェリジニウム（ｆｅｒｒｉｃｉｎｉｕｏ＋）　、コバルト（ＤＩ）オル トフエナントロレン、及びコバルト（ＩＩＩ）ジピリジルを用いるのが望ましい 。ペンゾキノーンは２個の電子受容体であり、電流滴定定量を行なうためにすば らしい電子酸化特性をもたらす。

例えば、本発明にかかるグルコースの電流滴定は、コットレル電流（Ｃｏｔｔｒ ａｌｌ　ｃｕｒｒｅｎｔ）のマイクロ−クロノアンベロメトリーを利用しており 、グルコースと、酸化された電子受容体が、グルコン酸と還元受容体を生成する 。

コノ方法は、副基質副産物（ｂｉ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｂｉ−ｐｒｏｄｕｃｔ ）の酵素機構による触媒作用により、化学酸化反応が先行する。これについては 、本明細書を通じて明らがなものとなるであろう。

この定量方法の場合、電位を加えた後、正確に設定した時間（例えば、２０．３ ０又は５０秒）に拡散コントロール電流を測定し、電流滴定の次の等式を適用し て電位をコントロール（Ｅ＝定数）しながら行なう。

’Ｃ０ＴＴＲＸ−”ＰＩＦＡ（”ｐＨ″″０・５°・ユ、ロシェＴΣａｔ　ｔ　 ＞　０　’　龜１１−０ ここで、ｉは電流、ｎＦはモル当たりのクーロン数、Ｄは試薬の還元された形態 の拡散係数、ｔは電流測定を行なうために予め設定された時間、Ｃは代謝産物（ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）の濃度である。本発明の方法に基づいて、受容体の再酸 化による電流を測定した場合、その測定結果は試料のグルコース濃度に比例する ことがゎがった。

本発明の方法及び装置の望ましい実施例では、血液グルコース、コレステロール 等を直接測定した。さらに、本発明の試料セルは、予め測定を実施することなく 、血液量をコントロールしながら分析試験を行なうことができる。試料セルを装 置内に挿入すれば、自動的に機能して反応のタイミングを決定するため、患者臼 らが試験を行なっても、非常に高い精密さ及び精度が得られる。

本発明の望ましい実施例の一例として、Ｂ−Ｄ−グルコースを測定する場合を例 示し、これについて詳細に説明する。特に、本発明の実施例にかかる方法及び装 置は、糖尿病患者が自ら血液グルコースをモニターできるようにしたものである 。本発明の試料セルを用いることにより、試料の量及び反応媒体（ｒｅａｃｔｉ ｏｎ　ｍｅｄｉａ）を管理するとともに、試料セルを電気化学センサーとして作 用させるものである。この実施例では、電子受容体として、ペンゾキノーンを用 いている。

本発明にかかる方法は、次の基本的な化学二元反応式％式％ 第１の反応は酸化反応であり、酵素グルコースオキシダーゼの存在下で反応が進 行する。電気化学酸化は反応の第２パートで生じ、酸化反応で作られたヒドロキ シーンの量を定量するための手段となる。これは、触媒酸化が、例えばフェリシ アン化物（酸化還元のカップルはＦｅ（ＣＭ）＊−”／Ｆｅ（ＣＮ）　、−ｉと なる）、フェリジニウム（ｆｅｒｒｉｃｉｎｉｕｌｌ）、コバルト（ＩＩ）三オ ルトフェナントロレン、及びコバルト（ＩＩＩ）三ジピリジルのように、２個の 電子受容体で行なわれる場合でも、或は１個の電子受容体で行なわれる場合でも 同じである。

グルコースオキシダーゼによる触媒酸化は、Ｂ−Ｄ−グルコースに対して特に有 効であるが、酸化剤に関しては選択性がない。前述した望ましい酸化剤は、殆ん ど全てのＢ−Ｄ−グルコースをグルコン酸に変換するのに十分な正電位を有して いることがわかった。さらに、この装置では、デシリットル当たりの試料につき 測定できるグルコースの量は、１■ｇ（望ましい実施例）から１０００ｍｇまで 可能である。これは、グルコースを用いたその他の自己テスト装置ではこれまで 得られたことはなかった。

本発明に基づいて、所望の定量を行なうための化学剤を含んだセンサーを作るこ とができる。これを自己テスト装置の携帯用メータと共に使用することができる 。使用に際しては、センサーをメータの中に挿入するとメータはオン状態となり 、試料を受け入れられる状態となる。

試料を入れると、電荷電流が突然流れるため、メータは試料が入れられたことを 感知する。これは、電極と、その上の試薬の層が、当初は試料液によりウェット の状態にあるからである。試料が入れられたことが感知されると、反応によって 培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）が開始しくその長さは化学剤により異なる）、酵 素反応が終了する。この間の時間は、グルコースの場合、１５〜９０秒のオーダ が望ましく、培養時間は２０〜４５秒が望ましい。培養時間の経過後、器具を用 いて既知の電位を電極に負荷し、コットレル電流が衰退する間、所定時間におけ る電流を測定する。

電流測定は、電位を負荷した後、２〜３０秒の範囲内で行ない、測定時間は１０ 〜２０秒が望ましい。次に、これらの電流値を用いて検体の濃度を計算し、これ をディスプレイに表示する。次にメータは待機状態となり、使用者がセンサーを 取り出すか、又は一定時間を経過した後、オフ状態となる。

本発明は、使用者によって測定値に差が生じることを防止し、精度及び信頼性に 悪影響を及ぼすことはなく、他の自己テスト装置よりもダイナミックレンジがは るかに大きい測定装置を提供するものである。

本発明のこれらの目的及びその他の目的については、゛　グルコース測定の一実 施例、及びコレステロール測定の他の実施例に関して、添付の図面を参照しなが ら説明する以下の詳細な記載によって明らかなものとなるであろう。

図面において、類似の要素については、類似した引用符号を付している。

第１図は本発明にかかる携帯式試験装置の分解図である。

第２図は本発明の試料セルの平面図である。

第３図は第２図に示す試料セルの分解図である。

第４図は本発明にかかる試料セルの他の実施例の分解図である。

第５図は第４図に示す試料セルの平面図である。

第６図は試料セルのさらに別の実施例である。

第７図は電流をグルコース濃度の関数として示したグラフである。

第８図はコットレル電流をグルコース濃度の関数として示したグラフ７ある。

第９図は第１図に示す装置に使用される電気回路の望ましい実施例を示したブロ ック図である。

第１０図は電気化学セルの望ましい実施例を示す図である。

第１図を参照すると、患者が血液グルコース値等を自ら調べることのできるよう にした携帯式の電気化学的試験装置（１０）を示している。装置（１０）は、前 部ハウジング（１１）と後部ハウジング（１２）を備えており、前部ハウジング には前部パネル（１３）、後部ハウジングには回路基板（１５）が夫々配備され る。前部パネル（１３）には、グラフィックディスプレイパネル（１６）が設け られ、該パネルに、情報を表示し、患者に指令を与え、試験結果が直接読み出さ れる。分析を開始させるためのスタートボタン（１８）を設けているが、試料セ ル（２０）が装置の窓部（１９）に挿入された時に分析動作を開始させるように することが望ましい。

第３図を参照すると、試料セル（２０）は、金属化したプラスチック基板を備え 、該基板に所定サイズの開口（２１）が形成される。この開口は、セルを組み立 てたとき、一定量の試料入れ（２１）を構成し、この試料入れに試薬パッド及び 分析用血液が入れられる。セル（２０）は、第１基板（２２）と第２基板（２３ ）を備えており、この基板は、スチレン等の実質的に非導電性プラスチックから 作ることが望ましい。第２基板（２３）の上に標準電極（２４）を配置する。

標準電極（２４）は、ポリイミドカプトン（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ　Ｋａｐｔ。

ｎ）の如き材料からなる基板に、真空メッキして作ることが望ましい。望ましい 実施例では、標準電極（２４）は、銀−塩化銀電極である。この電極は、基板を 用いてセルを作る前に、化学的手段又は電気化学手段の何れかの手段により銀層 の塩化銀をメッキすることができる。なお、試薬層がフェリシアン化物等の酸化 剤、及び下記反応に示される塩化物を含んでいるとき、塩化銀層は銀電極の上に その場で（ｉｎ−ｓｉｔｕ）作ることもできる。

Ａｇ　＋　Ｏｘ　−−４ａｇ”　＋　ＲｅｄＡｇ”　＋　Ｃ１−−一→ＡｇＣ１ 銀−塩化銀電極は、或はまた、酸化銀の層を（反応性スパッタリングにより）、 銀フィルム上にメッキすることにより作ることもできる。この酸化銀の層は、下 記反応式により、試験時にその場で塩化銀に変換される。

Ａｇ、０　＋　ＨｔＯ＋　２Ｃ１−−−→２ＡｇＣ１＋　２（ＯＨ）−センサー が試料液によってウェット状態であるとき、試薬層を含む塩化物が再び形成され る。銀電極は、塩化銀を含む層を有している。

標準電極は、一般に「擬似（ｐｓｅｕｄｏ）Ｊ標準電極として知られているもの を用いることができる。これは、酸化源（ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　５ｐｅｃｉｅｓ ）を過剰に多く有しており、貴金属電極において所定電位を得ることができる。

望ましい実施例では、同じ貴金属からなる２つの電極を用いているが、一方の表 面積を大きくして標準電極として用いている。酸化源が多いほど、また表面積が 大きいほど、標準電極の電位は変動しにくくなる。

インジケータ又は作用電極（２６）は、プラチナ、金、パラジウム又は金属化プ ラスチックの小片を、標準電極（２４）の上に配置したものでもよいし、或はま た、作用電極（２６）と標準電極を、電極（２６）を共面電極（２４）材料の間 に挟んだ共面ユニットにすることもできる。試料セル（２０）は、基板の間に電 極を挟んだ複合ユニットを形成することが望ましい。

第２図に示すように、第１基板（２２）の長さは少し短くして、電極（２４）　 （２６）の端部（２７）を露出し、装置内に配備された試験回路と電気的に接触 できるようにしている。

この実施例では、試料を試料入れ（２１）の中に入れた後、セル（２０）を前部 パネルの窓部（１９）の中に押し込むことにより、分析（ｔｅｓｔｉｎｇ）が開 始される。この実施例では、試薬を試料入れ（２１）の中に入れるが、望ましく は乾燥試薬のパッドをいれ、（１滴の）血液試料を、試薬の入った試料入れ（２ １）の中に入れることが好ましい。

試料セル（２０）の他の実施例を第４図ないし第６図に示している。第４図にお いて、試料セル（１２０）は、第１の基板（１２２）と第２の基板（１２３）を 有している。標準電極（１２４）と作用電極（１２６）は、基板（１２２）と（ １２３）の間に挟まれている。分析用試料を入れるための開口（１２１）が設け られる。端部（１３Ｇ）は、装置の中に挿入できるような構造とし、セルの切取 り部（１３１）　（１３２）を通じて、各電極と電気的に接続される。標準電極 （１２４）には、さらに切取り部（１３３）を形成し、作用電極（１２６）と電 気的に接続している。

第６図は、作用電極（２２６）を折り畳んだ形態を示して゛　おり、開口（２２ １）の周囲の表面積を大きくすることにより、感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ） 又は特異性（ｓｐｅｃ４ｆｔｃｉｔｙ）を高めている。この場合、標準電極（２ ２４）は、作用電極（２２６）の下方に配置される。作用電極には、切取り部（ ２３４）を形成して、基板（２２２）の切取り部（２３２）を通じて、標準電極 （２２４）と電気的に接触させている。基板（２２２）の端部（２３０）には、 切取り部（２３２）を形成し、作用電極（２２６）と電気的に接触させている。

本発明にかかる試料セルを窓部（１９）から挿入することにより、分析が開始す る。試料セルが挿入されると、電極（２４）（２６）の試料セルの端部（２７） に電位が加えられ、試料の存在が感知される。試料の存在が感知されると、電位 が取り除かれ、培養が開始される。培養中、必要に応じて、バイブレータ手段（ ３１）を作動させ、試薬を攪拌することにより、溶解力（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏ ｎ）を高めることもできる。なお、グルコースを定量する場合、培養時間は２０ 〜４５秒が望ましく、通常の場合、バイブレータ手段は不要である。次に、試料 セルの（２７）の部分から電極（２４）（２６）に電位を加え、試料を流れる電 流を測定し、ディスプレイ（１６）に表示する。

上記装置の利点を十分に発揮するために、自己テストに必要な化学剤を乾燥試薬 層に含ませ、その試薬層を使い捨てセルの中に配置して、所望通りの検体用セン サーを形成する。使い捨て式の電気化学セルは、金属化プラスチックと非導電性 物質の層状体であって、作用電極面積は精密に規定されている。試薬層は、セル の上に直接コーティングしてもよいが、フィルター紙、薄膜フィルター、織りフ ァブリック又は非線ファブリック等の支持マトリックスにコーティングし、それ をセルの中に入れることが望ましい。支持マトリックスを用いるとき、所望の精 密さ及び機械的支持強度に合わせて、細孔のサイズや空隙容積を調節することが できる。一般的に言って、試薬層の支持体の材料としては、薄膜フィルター又は 非線ファブリックが最も望ましい。細孔のサイズは０．４５〜５０μ論、空隙容 積は５０〜ｇＯ％が適当である。コーティングは、ゼラチン軸ｅｌａｔｉｎ）、 カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、メチルセルロース、ポリビニルアル コール、ポリビニルピロリドン等の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）により形成すること ができろ。コーティングは、試薬の溶解を遅延させる作用があり、その間に試薬 層が試料から液の大部分を吸収することができる。結合剤の濃度は、一般的には ０．１−１０％のオーダであり、１〜４％が望ましい。

試薬層が層の表面に施されると、試薬層は一定量の試料液を吸収するから、試料 の量を予め測定する手間を省くことができる。さらに、反射光ではなく、電流を 測定するから、反射分光光度法のように、測定前に試薬層の表面から血液を除去 する必要はない。試料液は直接試薬層に施し、試薬層の全表面に血液を拡げるこ とができるから、センサーは分散層がり層又はウィッキング層を設けるのが望ま しい。この層は、一般的には、非線ファブリック又は吸取り紙が用いて、試薬層 の上に設けられ、血液を試薬層の上に急速に拡散させる作用を有する。用途によ っては、この分散層に、更に試薬を含めることもできる。

グルコースを定量する場合、セルは共面構造のものを使用し、試薬層は次の組成 である。

グルコースオキシダーゼ　６００　ｕ　／ｍｌ　。

フェリシアン化カリウム　０．４Ｍ 燐酸緩衝液　０．１Ｍ 塩化カリウム　０．５Ｍ ゼラチン　２．０ｇ／ｄｉ これは、薄膜フィルターを上記組成の溶液でコーティングし、空気乾燥して作っ た。試薬層は、次にセルの窓部の開口面積に合わせて小片に切り取る。その小片 を窓部の内部に露出した電極の上に載置する。非線レーヨンファブリックのウィ ッキング層をこの試薬層の上に載せ、テープにて適当な位置に保持する。

本発明にかかる技術の適用法を明らかにするために、多数の実施例について、２ ５℃の水溶液中にて調べた。電解質をｐＨ６、８の燐酸緩衝液から作った。緩衝 液は、約０．１モルの全燐酸塩と、０．５Ｍの塩化カリウムの試薬を含んでいる 。電位は標準水素電極（ＮＨＥ）を基準としている。

これらの試験において、酸化剤としてペンゾキノーンを用いたとき、約＋０．８ ボルトと１．２ボルト（ＮＨＥに対して）の間の電位であればヒドロキシーンの 定量に適していることがわかった。限界電流はヒドロキシーンの濃度に比例し、 ０．０００１Ｍないし０．０５０Ｍ（７）範囲内である。

グルコースを、本発明にかかるコットレル電流（ｉυのマイクロクロノアンベロ メトリーで定量する場合、ヒドロキシーンのペンゾキノーンに対する反応中に作 り出される。コットレル電流は時間と共に次の式に基づいて衰退（ｄｅｃａｙ） する。

ｉ、・ｔｌ／２＝一定 これら２つの技術間における主な相違点は、グルコースーペンゾキノーン反応が 完了した後に、適当にコントロールされた電位を加えること、及びグルコース濃 度と、一定時間経過後に測定したコットレル電流とを関連づけることにある。電 流一時間の読出し結果を第８図に示している。第７図は、グルコース濃度とコッ トレル電流（電位を加えた後、ｔ＝３０秒で記録した）との間に比例関係のある ことを示している。

代謝産物のコットレル電流滴定法は、酵素触媒と、コントロールされた電位の電 気分解との二重の保護手段（ｄｕａｌ　ｓａｆｅｇｕａｒｄｓ）を必要とするこ とに留意すべきである。

９９．５十％のグルコン酸は、グルコースオキシダーゼの存在下にて得られた。

これに伴って、等量のペンゾキノー゛　ンがヒドロキシーンに還元される。これ は、静止した溶液中にて、定置パラジウム薄膜アノード又は試料セルで定量でき る。

これらの数多くの試験結果から、本発明のマイクロクロノアンベロメトリーによ る方法論は、糖尿病に罹患したとき、グルコースを自分でモニターするのに有用 である。

フェロシアン化物を用いた本発明の望ましい実施例において、多くのテストを実 施した結果、すぐれた性能を示すことが明らかにされた。

第９図に、装置ｔ（１０）に使用される回路（１５）の望ましい実施例を示して いる。試料セル（２０）の作用電極及び標準電極は、接点Ｗ（作用電極）及び接 点Ｒ（標準電極）にて夫々接触する。基準電圧（４１）は、アナログ電力スイッ チ（４３）を通じてバッテリー（４２）に接続される。電極Ｗ及びＲからの電流 は、可変抵抗器（４４）によって変換され、電圧−周波数変換器はマイクロプロ セッサ−に電気的に接続される。当該分野の専門家であれば、その他の回路を用 いて本発明の利点を得ることができることは明白である。

第１０図において、セル（４００）は、上部非電導材（４２２）と下部非電導材 （４２６）の間に平面を共通にした作用電極（４２６）と標準電極（４２４）を 介在して構成される。接着層（４２５）上に層を形成することもできる。上部材 （４２２）は、型取りした開口（４２８）を形成しており、作用電極材の幅方向 に沿って作用電極エリアを構成し、セルの試料投入口を構成している（なお、重 なる薬剤層の部分は図示していない）。

本発明にかかる装置を用いることにより、糖尿病患者（望ましい実施例）は、家 庭内で自らテストを実施することができる。本発明にかかる技術を、公知の４つ の方法と比較した結果を次の表に示している。次の表から明らかなように、公知 の方法と比べ、本発明は簡単であり、その簡単さ故に一定した結果を得ることが できる。

（以下余白） ルコースのと　の 一ニー１−−」−３２３４木光逝 装置をオンさせる　ｘｘｘｘｘ 較正装置　×　× 指の穿刺　ｘｘｘｘｘ （Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｕｎｃｔｕｒｅ） 血液の適用　ｘｘｘｘｘ 結果を読み取る　ｘｘｘｘｘ ＣＶ＊ｔ　８４本°り゛リセミフク　１５％　１５％　５％ｃ）Ｉｙｐｏｇｉｙ ｃｅ■ｉｃ） ユーク゛リセミック　１０％　１０％　３％（Ｅｕｇｌｙｃｅ＋５ｉｃ） へイバーり゛リセミック　５％　５％　２％（Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅ＠ｉｃ） 相互関係　０．９２１０．８６２　０．９５Ｒ８本　反射分光光度法 林　変動係数 本発明を用いたコレステロールの定量法に関し、−膜化した化学式で表わせば次 の通りである。

［機構（Ｓｃｈｅｔ＊ｅ）　１　］ コレステロール十〇Ｘ＋ＣＯ −一→コレステノン＋Ｒｅｄ　（２） Ｒｅｄ　−−−＊　Ｏｘ＋　ｅ　−（３）ここで、酵素コレステロールエステラ ーゼ（ＣＢ）は反応式（１）に、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）は反応式 （２）において触媒作用を及ぼす。ＣＯは、多様な電子活性カップル（Ｏｘ及び Ｒｅｄ）と共に電子を移動させる。反応式（２）は、酵素コレステロールの存在 下でコレステロールを酸化させるために、ジオキシアン以外の電子受容体を用い ることができるという点において新規である。反応式（１）は当該分野ではよ（ 知られており、全コレステロール（自由コレステロールとコレステロールエステ ル）の定量に必要である。反応式（３）はコレステロールを探し出して定量化す るための電気酸化プロセスである。

なお、異なる酸化剤を用いると、特異反応（ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｃｔｉｏｎ ｓ）は次のようになる。

Ａ： 上記の反応式（１） フェロシアン化物−一→フェリシアン化物＋１ｅ−Ｂ： 上記の反応式（１） 種々の源から得られるコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）は、コレステロール から種々の酸化剤への電子移動に対して触媒作用を呈する。なお、酸化剤として 、ペンゾキノーン、ペンゾキノーン誘導体、フェリシアン化カリウムが挙げられ 、ペンゾキノーン誘導体には、メチルベンゾキノーン、エチルベンゾキノーン、 クロロペンゾキノーン、オルトーベンゾキノーン（カテコールの酸化形態）、ス ルホン酸ペンゾキノーンが含まれる。更にまた、酵素は、その他の酸化剤に対し ても電子移動を可能ならしめることは予想される。反応式（３）に示されるよう に、還元生成物を電流滴定法でモニターし゛、コレステロールの定量を決定する ことができる。

酸化剤でコレステロールを酸化するときの触媒作用を行なう酵素源には、ノカル ジア、ストレプトマイシス、スキゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、 プソイドモナス、及びブレビバクテリウムからのＣＯが含まれる。実験条件下で は、ペンゾキノーンはコレステロールの酸化を急速に促進する触媒作用を呈する ことができる。その他の酸化剤については、酵素源により若干具なる。例えば、 ストレプトマイシスからのＣＯは、オクチルグルコノピラノシド及びＣＩＡＰＳ Ｏを含む種々の界面活性剤の存在下、燐酸緩衝液中におけるペンゾキノーンとの 基質酸化を著しく促進させる。同じ条件下で、ブレビバクテリウム又はノヵルジ アからのＣＯを使用した場合、反応は遅い。しかしながら、ノカルジアとブレビ バクテリウムの酵素源は、両方とも、別の条件で、別の酸化剤を用いてコレステ ロールの酸化反応を行なう場合、有効な触媒となる。

酸化剤は、酵素を最も活性にする役割を果たす。例えば、ノカルジアからのコレ ステロールオキシダーゼは、０．２モルのトリス緩衝液及び３　ｇ／ｄＬのＣＨ ＡＰＳＯの中で、ペンゾキノーンとの基質酸化反応を著しく促進するが、同じ条 件でも、フェリシアン化物の場合、反応は遅い。ブレビバクテリウムを源とする 酵素は、種々の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）を含むトリス（ＴＲＩＳ ）緩衝液中のフェリシアン化物とは比較的不活性であるが、ペンゾキノーンを酸 化剤として用いたとき、反応は非常に速い。また、スキゾフィラムを源とする酵 素のｃｏは、フェリシアン化物又はペンゾキノーンと種々の界面活性剤を含む燐 酸緩衝液中のコレステロールの酸化反応を著しく促進する。

前述したように、コレステロールオキシダーゼは、フェリシアン化物によるコレ ステロールの酸化反応の触媒として作用する。更に、ＣＯがフェリシアン化物に よるコレステロールの酸化反応の触媒として作用する例として、デオキシコール 酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、　Ｔｈｅｓｉ ｔ、　ＣＨＡＰＳＯ等の種々の界面活性剤が含まれるトリス緩衝液のノカルジア 源が挙げられる。さらに、ノカルジアからのＣＯは、ジオクチルスルホ琥珀酸ナ トリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム及 びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００等が含まれる燐酸緩衝液中でのフェリシアン化物と の基質酸化反応の触媒作用を呈する。緩衝液の濃度は、０．１〜０．４モルであ る。オキシダーゼ酵素の活性作用を最大ならしめるための界面活性剤の濃度は、 各々の浄化剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）によって異なる。例えば、デオキシコール 酸化物又はタウロデオキシコール酸化物の場合、０．２Ｍのトリス緩衝液中での 酵素は、浄化剤が２０〜９０ミリモル（ｍｉｌｌｉｓｉｏｌａｒ）のときに活性 力は最大となる。しかしながら、酵素触媒の活性が観察されるのは、濃度が１０ ％までである。オクチルグルコノピラノシドの場合、酵素がフェリシアン化物酸 化剤に対する活性が最大になるのは、浄化剤濃度が約１．２％のときである。し かし、酵素は、界面活性剤の濃度がそれより高くても低くても活性状態は維持さ れる。

エステラーゼとＣＯは両方とも、活性を高めるために界面活性剤を必要とする。

界面活性剤の具体例として、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコー ル酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、ＣＩＡＰＳ（３−（３− クロラミドブロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルフォネート）、Ｃ ＨＡＰＳＯ（３−（３−クロラミドブロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロ キシ−１−プロパンスルフォネート）、オクチル−グルコノピラノシド、オクチ ル−チオグルコノピラノシド、ノニル−グルコノピラノシド、ドデシル−グルコ ノピラノシド、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、スルフォ琥珀酸ジオクチル、Ｔｈｅ ｓｉｔ（ヒドロキシポリエトキシドデカン）、及びレシチン（ホスファジルコリ ン）が挙げられる。酵素との反応に使用できる緩衝剤として、燐酸塩、トリス（ ＴＲＩＳ）、ＭＯＰＳ、　ＭＥＳ、　ＨＥＰＥＳ、　ＴｒｉｃｉｎｅＳＢｉｅｉ ｎｅ、　ＡＣＥＳＳＣＡＰＳ、及びＴＡＰＳが挙げられる。血清その他の体液中 に含まれるコレステロールの測定を別の反応機構で一般化すると次の通りである 。

［機構■］ コレステロールエステル−ＣＥ −一→コレステロール＋脂肪酸　（１）Ｒｅｄ、　＋　Ｏｘ、　−−→Ｏｘ１＋ 　Ｒｅｄｓ　（５）Ｒｅｄｓ　−−−ｅＱ）（、＋　ｅ−（６）ＯｘとＲｅｄ　 鵞は、コレステロールと電子活性カップル（ａｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ　ｃｏ ｕｐｉｅ）Ｏｘ、／Ｒｅｄｓとの間の電子媒介カップル（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍ ｅｄｉａｔｏｒ　ｃｏｕｐｌｅ）として機能する。この場合、Ｏｘ、とＲｅｄ、 は、電気酸化プロセスに関与するため（反応式（６））、電子活性である必要は ない。しかしながら、熱力学及び運動掌上の釣合いのため、このカップルは、酵 素コレステロールオキシダーゼの補助を受けて、コレステロールからの電子を受 容し、その電子を電子活性カップル（Ｏｘ雪／Ｒｅｄｓ）に中継することができ なければならない。

この化学反応の具体例として次のものが挙げられる。

実施例１ 上記反応式（１） ％式％ フェロシアン化物−一→フェリシアン化物＋ｌｅ−コレステロールと機構■で示 す電気活性酸化物との反応速度が遅くてその使用ができないときに、この機構■ は利点がある。また、前述したように、電子媒体自体（Ｏｘｔ／Ｒｅｄｔ）が電 気活性でない場合や、酵素剤の存在下での電気化学的性質が乏しい場合にも、こ の機構■は有利である。これらの条件にあるとき、機構■が適用される。

コレステロールと、機構■で使用されるフェリシアン化物との電子媒体（Ｏｘ　 Ｉ／Ｒｅｄ　ｔ　）として、その他に、エト硫酸フェナジン、メト硫酸フェナジ ン、テトラメチルベンチジン、ペンゾキノーンの誘導体、ナフトキノーン及びナ フトキノーンの誘導体、アントラキノーン及びアントラキノーンの誘導体、カテ コール、フェニレンジアミン、テトラメチルフェネンジアミン、及びフェニレン ジアミンのその他誘導体が挙げられる。

酸化された形態の電子は、センサー内のコレステロールから電子を受けるが、コ レステロールとフェリシアン化物に対して速やかに反応するのであれば、媒体は 酸化された形態又は還元された形態のどちらでもよい。もし、還元された形態は 十分に安定であるが、酸化された形態はそうでない場合、比較的少量（調べよう とする検体と比較して）の還元剤をセンサー内に入れると、電子の中継を行なう ことができる。しかしながら、この場合は、背景信号（ｂａ、ｃｋｇｒｏｕｎｄ 　ｓｉｇｎａｌ）を考慮せねばならない。

還元剤はまた、別個の試薬層に入れて、センサー内のフェリシアン化物と分離せ ねばならない。

機構■及び■を包含する上記の化学組成物は、薄膜上に乾燥フィルムとして調製 した。これらの薄膜はセンサー内に設けて、コレステロールの定量に使用するこ とができる。機構■に使用される試薬の望ましい組成は次の通りである。

コレステロールエステル　＠４００ユニット／■Ｌフェリシアン化カリウム　０ ．０５モル塩化カリウム　０．５モル ｐＨ６，９の燐酸塩　０．２モル ＣＨＡＰＳＯ３ｇ／ｄＬ ゼラチン　２　ｇ／ｄＬ ヒドロキシーン （分散広がり層又はウィッキング層内）　０．０００１モル濃度は、多孔性支持 体、フィルター紙又は薄膜上にコーティングした溶液の濃度である。これらの濃 度は、薄膜が血清又は全血液試料を吸収するときに回復する（ｒ■５ｔａｂｌｉ ｓｈｅｄ）。コレステロールの定量を行なうためには、グルコースの場合よりも 、フィルター支持体の細孔を大きくする必要がある。これは、血清中のコレステ ロールは、大きなりボタンバク質（キロミクロン、ＬＤＬ、　ＶＬＤＬ。

ＨＤＬ）で存在し、試薬に達するまで、センサーの種々の層の中に侵入しなけれ ばならないからである。大部分の界面活性剤は、これら天然ミセル（ｎａｔｕｒ ａｌ　ｍ１ｃｅｌｌｅｓ）を破壊して、さらに小さなミセルとし、酵素が反応触 媒として作用する全表面積を更に大きくする。ペンゾキノーンは不安定であるた め、蒸気圧が低くてより安定なヒドロキシーンをセンサーの中に少量加えること により、コレステロールとフェリシアン化物との間の電子媒介作用を補助するこ とができる。血清試料をセンサー内に導入すると、ヒドロキシーンは酸化されて ペンゾキノーンになる。ペンゾキノーンは基質から電子を自由にピックアップし 、フェリシアン化物に循環させる。これらの条件下では、コレステロールと、少 量のペンゾキノーンとの反応速度は、大量のフェリシアン化物との反応よりも速 い。

センサーの試薬層として用いられ、機構■に使用される試薬の望ましい組成は次 の通りである。

ストレプトマイシスのコレ ステロールオキシダーゼ　＠２００ユニット／＋ｎＬＣＨＡＰＳＯ３ｇ／ｄＬ ＴＲＩＳ　ｐＨ？、５　０．２モル フェリシアン化カリウム　０．０５モル塩化カリウム　０．５モル ＭｇＣ１５Ｏ，０５モル ゼラチン　２　ｇ／ｄＬ ヒドロキシーン（分散広がり層内）　０．００１モルこの組成物内のマグネシウ ム塩は、燐酸塩を含まない試薬層内のエステラーゼ酵素の安定性を高める作用が ある。リパーゼはりボタンバク質の分散を促進する。これらの乾燥試薬をセンサ ー内に入れ、前述した方法論（ｓｅｔ１８２　２７．２ ３０９　３８．５ これらの結果は、血清のコレステロール値に対するセンサーの量的応答結果を示 している。

機構Ｉを用いた他の望ましい実施例は、次の試薬組成物によってもたらされる。

コレステロールエステラーゼ　＠　４００ユニツト／腫ＬＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ ００１ｇ／ｄＬ ＴＲＩＳ緩衝液　ｐＨ８，６０，１モルフェリシアン化カリウム　０．２モル 塩化カリウム　０．５モル ＭｇＣ１＊　０．０２モル ゼラチン　２　ｇ／ｄＬ 又は コレステロールエステラーゼ　＠２００ユニット／ｍＬデオキシコール酸ナトリ ウム　０．０６モルＴＲｌ５緩衝液　ｐＨ８，６０，１モルフェリシアン化カリ ウム　０．２モル 塩化カリウム　０．５モル ゼラチン　２　ｇ／ｄＬ 本発明の望ましい実施例を詳細に説明したが、本発明に変更又は変形を加えるこ とが可能であることは理解されるべきである。本発明は前述した語句そのもので 限定されるものではなく、必要に応じて、使用条件等に合わせて変形等はなしう ろことができる。従って、そのような変形等は、均等の範囲内で成し得ることが でき、それらは添付の請求の範囲の中に含まれると解すべきである。

前述の説明において使用した語句、表現等は、限定するものではなく、その語句 、表現等と均等なものを排除するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲に 規定されていると認識すべきである。

当該分野の専門家が、本発明と同じものを作り、使用できるように、本発明の作 成及び使用方法について、明瞭かつ正確な語句で記載した。

ＦＩＧ、１ 電流、麟Ａ 区 ↑２寥＝１３１ 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ．第１の電極と第２の電極を有する試料セルの中に分析すべき試料を入 れ、 ｂ．試料を、酸化剤と緩衝剤とともに混合し、ｃ．電極及び試料に電位を加え、 ｄ．電流を測定し、その電流値から試料の中にある所定化合物の濃度を決定する 、 工程からなる体液内にある所定化合物の量を測定する方法
2. （２）化合物は、グルコース、コレステロール、ＴＳＨ、Ｔ４、ホルモン、不整 脈抗剤、癲癇抗剤及び非治療性薬剤からなる群から選択される請求の範囲第１項 に記載の方法。
3. （３）酸化剤は、ベンゾキノーン、フェリシアン化物、フェリシアン化物、ツユ リシニウム、コバルト（ＩＩＩ）、トリスオルトフェナントロレン、及びコバル ト（ＩＩＩ）ジピリジルからなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方 法。
4. （４）試料セルの電極は、標準電極と作用電極を有している請求の範囲第１項に 記載の方法。
5. （５）ａ．貫通する開口を有する第１の非導電性基板と、第２の非導電性基板と 、 ｂ．第２の非導電性基板の上に設けられた、金属化した第１の電極と、 ｃ．第１の電極の上に設けられた、第２の電極、とから構成され、第１の電極は 第２の電極の上に位置し、これら電極を基板の間に介在させた層状体を形成し、 電極に露出する開口が試料入れを構成している、試料セル。
6. （６）第１の電極は標準電極であり、第２の電極は作用電極である請求の範囲第 ５項に記載の試料セル。
7. （７）第１の非導電性基板、第２の非導電性基板、第１の金属化した電極、第２ の金属化した電極から構成され、第１の電極は第２の基板の上に配備され、第２ の電極は、第１の基板と第２の基板との間に非導電性の基板を介在させた非導電 性の基板を含んでおり、第１の基板及び第２の基板を貫く開口によって試料入れ を構成している、試料セル。
8. （８）第１の電極は作用電極、第２の電極は標準電極であり、第２の電極の開口 は、第１の基板の開口よりも小さい請求の範囲第７項に記載の試料セル。
9. （９）第１の電極は標準電極であり、第２の電極は作用電極である請求の範囲第 ７項に記載の試料セル。
10. （１０）第１の非導電性基板、第２の非導電性基板、作用電極及び標準電極から 構成され、標準電極は、第２基板上の金属化層であり、作用電極は、第１及び第 ２の基板の間の非導電性支持層上の金属化層であり、作用電極は、コンポルート 部を備え、該コンポルート部を貫く開口によって試料入れを構成し、作用電極の 開口の位置に揃えて第１の基板を貫く開口を形成している、試料セル。
11. （１１）第１の基板に、一対のノッチ部を形成して作用電極の接触エリアと標準 電極の接触エリアを構成し、作用電極に、第１の基板のノッチ部の下方にノッチ 部を形成して標準電極の接触エリアを構成している請求の範囲第１０項に記載の 試料セル。
12. （１２）ａ．ハウジングと、 ｂ．ハウジング内に配備され、測定すべき試料を含む試料セルの電極と電気的に 接触できるようにした電気接点を有する回路基板と、 ｃ．第１の電極、第２の電極及び分析すべき試料を収容する試料入れを有する試 料セルと、 ｄ．ハウジングに設けられ、試料セルをハウジング内に挿入して電気接点と接触 できるようにするための開口と、 ｅ．電位を電極に加えるための手段と、ｆ．試料を流れる電流を測定するための 手段と、から構成される血液グルコースの測定装置。
13. （１３）試料を流れる電流を測定するための手段は、マイクロプロセッサーを有 している請求の範囲第１２項に記載の装置。
14. （１４）窓部は、試料セルが挿入されると、試料セルに振動を与え、電位を加え る手段を有している請求の範囲第１２項に記載の装置。
15. （１５）試料セルの電極は、標準電極と、作用電極を有している請求の範囲第１ ２項に記載の装置。