JPH04501352A - ナチュラルキラー細胞および非特異的細胞障害性細胞レセプターに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 舒亘請 ナチュラルキラー細胞および非特異的細胞障害性細胞レセプターに対する抗体 米国政府は、米国農務省の補助金を受けている本発明に対し、特定の権利を有し ている。 本発明は、一般的には、免疫学およびタンパク学の分野に属し、特に、ナチュラ ルキラー細胞上のレセプタータンパクの分野に属する。 又囲旦！景 １９７０年第初期までに、マウス、ラットおよびヒトを包含する様々な種におい て、抗原特異的細胞溶解性１９７３球活性と全（異なったナチュラルキラー（Ｎ Ｋ）　ｉｌｌｌｌ性が、いくつかの研究所により報告されている。これらの報告 は＋　Ｒ，Ｋ、　ＯｌｄｍａｎＪ、　Ｂｉｏｌ、−力す且、量Ｉ４１，２１７　 （１９８２）に概説されている。多くの点においてＮＫ細胞と類似している。非 特異的細胞障害性細胞（ＮＣＣ）もまた、より下等なを椎動物種において同定さ れている（Ｇｒａｖｅｓら、　Ｄｅｖ、　Ｃｏ＋＊　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、８＋ ２９３　（１９８４）；Ｅｖａｎｓら、　Ｄｅｖ、　Ｃｏｗ　、Ｉｍｍｕ　ｏｆ 、８＋３０３　（１９８４）；　Ｅｖａｎｓら＊　ガニ。如ｌしＩｓｍｕｎｏｌ 、、８．５９９　（１９８４；　Ｅｖａｎｓら、Ｄｅｖ、Ｃｏｗ　、Ｉ＋ｕ＋ｕ ｎｏｌ　Ｂ、８２３（１９８４）。 ＮＫ細胞は２表現型および機能に関して、免疫細胞の不均一な集団であることが 知られており８例えば、　Ｌａｎ１ｅｒら、　Ｉｍ＋＊ｕｎｏｌ。 ｎ釦り、　７．１３２　（１９８６）において考察されている。しかし、他の免 疫細胞とのＮに細胞系の関連および、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＮ）細胞 および異常キラー（ＡＫ）ＩＩＩ胞のような他のエフェクター細胞との関連につ いては、まだ議論の余地がある。 これらの相違点は、　ＮＫ活性（それは機能面から定義されている）を示し得る 細胞型に本来備わっている不均一性を反映しているか、あるいは、　ＮＫ細胞を 研究するために使用される様々な測定システムによるためと考えられる。 ＮＫ細胞は、免疫系を包含する様々な活性に関連づけられている。上記免疫系は 動物モデルおよびヒトの両方における免疫障害を包含している。動物モデルでの 結果では、インビボにおいて、ある型の腫瘍細胞の増殖および転移に対し、ＮＫ Ｎ胞が有効であることも示されている。これに関し、インビトロで培養したＮＫ 細胞をヒト癌患者に投与すると、ある型の悪性腫瘍の治療および症候の緩解に有 望であることが示された。 さらに、　ＮＫ細胞は、ａ＋菌およびウィルスの両微生物による感染に対する宿 主抵抗性と関連づけられている。最後に、　ＮＫ細胞は、免疫グロブリン産生お よび造血により、宿主免疫系の正常な調節において重要な役割を果たしていると 考えられる。 これらの一連の事実は、　ＮＫ系がかなりの機能的多様性を持っており１分化し た抗原（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　）を包含する正常 な膜構造における変化を認識することにより働き得ＬａｕｚｏｎおよびＲｏｄｅ ｒ、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｏ＋ｍｕｎｏ１．９４．８５（１９８５）；　Ｒｏｄｅｒ　 ら。 Ｌ−陰■−ＩＩ工１５０，４７１　（１９７９）により考察されている。 ＮＫ細胞は数十年にわたり研究されているにもかかわらず。 今日、　ＮＫ生物学において残されている２つの大きな疑問は。 標的細胞を認識するためにＮに細胞の表面上にどのような分子が含まれているか ということ、および標的細胞上のどのような分子がＮＫ細胞により認識されてい るかということである。 最近の１０年間の初期においては、Ｔ細胞が、標的細胞上に発現した主要組織適 合抗原複合体（ＭＨＣ）の産物を認識することが見いだされた。この発見は、　 ＭＭＣの産物の分子に対するモノクローナル抗体（■Ａｂ）が入手可能となった ために促進された。該モノクローナル抗体はＴ細胞による認識を抑制する。 ＮＫ生物学において、　ｇ＊Ａｂによる機能あるいは認識の阻害（補体非存在下 ）は９文献においては、あまり頻繁に見出されない、ｌｌ論の余地があるが、ト ランスフェリンレセプターとＩｇＧのＦｃの受容体とがＮＫ細胞の認識構造とし て関連づけて示されているＣＶｏｄｉｎｅｌｉｃｈら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０Ｊ３５（１９８３）ＨＤｏｋｈｅｌａｒ　 ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４．３４０　（１９８４）。 最近では、ラミニン／ラミニン受容体複合体もある種の細胞のＮＫ認識の手段と して働くと関連づけられている。このことは第４回ＮＫ細胞国際ワークショップ 、オンタリオ州キックストン、　１９８６．で報告された。最後に、Ｉ！と糖と の相互作用がＮＫ／標的細胞の認識の手段として、　Ｄｅｃｌｅｒら、　（１９ ８１）；　Ｍｕｃｈｍｏｒｅら、　Ｉｍｍｕｎｏｌｂｉｏｌ、　１５８，１９Ｈ １９８１）；　Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒら、　Ｃｅ１ｌ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌ。 ８０．１７２　（１９８３）により関連づけて示されている。これらの結果を合 わせると、　ＮＫ細胞は、クローン的に制定されたレセプターを発現しないこと 、Ｎに細胞は、その表面に１つ以上のレセプターを発現し得ること、およびＮＫ 細胞は、１つまたはそれ以上の標的細胞の表面にある複数の抗原を認識し得るこ とこれらの決定基を検出し得る。　ＮＫ細胞膜抗原および−Ａｂを表１に示す、 典型的なＮＫ活性は、一般的には、　Ｌｅｕ４−　（ＣＤ３−）。 Ｌｅｕｌｌ”　（ＣＤ１６”）およびＬｅｕ１９’表面表現型を持つ細胞を介し て認められるが、典型的なＴ細胞、特に抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ） が、　Ｋ５６２のようなある種の腫瘍細胞について測定したところによれば、　 ＮＫ様細胞障害性を媒介し得るという注目すべき事実があり、この事実は、　Ｂ ｒｏｏｋｓら、　Ｉｍ＋ｍｕｎｏｌ。 Ｒｅｖ、７２．４３　（１９８３）およびその他に記載されている。これらのＣ ＴＬは、　ＣＴＬ（ＮＫ）あるいはＭＨＣ非制限ＣＴＬと言う、真のＮＫ細胞は 、典型的なＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＰ）のｍＲＮＡを転写したりＴＣＲをＮ Ｋ細胞の表面に発現したりしないため（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、　Ｊ、　Ｅｘ　、 　Ｍｅｄ、　１５０，４７１　（１９８５）；　Ｌａｎ１ｅｒ　ら、　ム」９． 　Ｍｅｄ。 １６３．２０９　（１９８６）ＨＴｕｔｔら、Ｊ、ＩＲＩＩＩＬＩｎｏｌ、１３ ７．２９９８（１９８６））　、−ＮＫ細胞は、この方法で抗原を認識しないこ と、および？ＩＨＣ分子を認識しないことが、一般的に認められている。　ＣＴ Ｌ（ＮＫ）は典型的ＴＣＰを発現するが、この分子がＮＫ様死減作用をもたらす のに利用されているかどうか、あるいは、何らかの通常ではない様式によりこれ らのエフェクター細胞がＭＨＣ抗原を認識するかどうかについては知られていな い、最近ＣＤ３分子およびＴ／δＴＣＲが、　ＭＨＣ非制限的細胞障害性を示す このタイプに含まれ得ることを示唆する事実があるＣＦａｒｒｉｎｉ　ら。 Ｌ」」蹟騰虹１６６．２７７　（１９Ｂ？）ｓ　Ａｌａｒｃｏｎら、　Ｐｒｏｃ 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．３８６１　（１９８７）；　Ａｎｇら、　Ｊ、　Ｅｘ 　、　Ｍｅｄ、　１６５．１４５３（１９Ｂ？）　；Ｄａｖｉｄら、　Ｊ、　ｌ ｍ５ｕｎｏ１．１３８．２８３１　（１９８７）　：Ｖａｎ　ｄｅＧｒｉｅｎら 、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８．１６２７　（１９８７）　、他の研究に おいて、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８　＊Ａｂは、このようなＣＴＬクローンによる 抗原特異的溶解を抑制するが、これらのエフェクター細胞によるＮＫ様溶解を抑 制しないことが示されている（Ｍｏｒｅｔｔａら、　Ｂｕｒ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１４．１２１　（１９８４）：　Ｂｒｏｏｋｓおよびｔｌｏｌｓｃｈｅ ｒ＋Ｊ、　Ｉｖｗｕｎｏｌ、　６，５９４　（１９８７）；　Ｒｏｂｅｒｔｓお よびＭｏｏｒｅ、Ｅｕｒ、　Ｊ。 Ｉｖｉｕｎｏｌ、　１５，４４８　（１９８５））　−魚類におけるリンパ性網 様細胞の同定に関しては、はとんどのことが知られていない、以前の研究では、 この種において、Ｂリンパ球細胞亜集団が試験的に同定されている。しかし、硬 骨魚の細胞障害性細胞を同定するために試みられた研究はご（わずかである、し かし哺乳類では、リンパ球の不均一性に関し多くの事が知られており、細胞障害 性活性を抑制するｓ＋Ａｂが得られている０例えば、抗０ＫＴ３冒Ａｂは、はと んどのヒトＴ細胞上に見いだされる決定基を確認する。この抗原に特異的なモノ クローナル抗体は、エプスタイン−バーウィルスに感染した細胞のＣＴＬ細胞死 減作用を抑制する。０ＫＴＩＯ決定基は、他の細胞と同様にヒトナチュラルキラ ー細胞上に存在し、抗０ＫＴ１０＋ｗＡｂは、　Ｋ６５２．　？１ＯＬＴ−４お よび０８Ｍ腫瘍標的のＮＫ溶解を抑制する。すべてのヒト末梢血Ｔリンパ球上に 存在する抗原である糖タンパクＴ−２００に対するモノクローナル抗体は、寒冷 標的阻害アッセイにおいて、　Ｋ５６２細胞の能力をブロックし、その結果、　 ＭＯＬＴ−４細胞に対するＮＫ細胞死減作用が阻害される。　ｓＡｂ　ＮＫ−８ は、　ＬＧＬにより媒介されるに５６２紺胞に対する細胞障害性を５０〜６０％ 抑制する。免疫学的に同種のヒト細胞障害性リンパ球に対する２種の−Ａｂ　（ ＲＨ７，２および１７．２）は、　Ｃａ”パルス相（Ｃａ”ｐｕｌｓｅ　ｐｈａ ｓｅ　）において添加された場合に、　ＮＫ細胞溶解を抑制する。 このように、　ＮＫ細胞細胞認識のプロセスを理解するためには、魚類などの下 等なを椎動物および哺乳類を包含する様々な種について、　ＮＫ標的抗原および レセプターの例を同定し特徴づけることが必須である。 ＮＫ抗原レセプターについての知識により、どのようにレセプター／リガンド複 合体が機能するかという分析が可能となる。さらに、　ＮＫ抗原レセプターの単 離により他のレセプターとの比較が可能となり、そしておそら（抗原特異性およ び／または抗原レセプターの型に基づき、他のＮＫ抗原レセプターあるいはＮＫ 細胞のサブクラスを同定することが可能となる。 このことにより、　ＮＫ、　ＬＡＫ、およびＣＴＬ　（ＮＫ）細胞集団、および 単球、マクロファージおよび他の型のＴ細胞のような免疫細胞間の相関関係がよ り一層の理解され得る。魚類、マウスおおよびＮＫ細胞集団が免疫機能、悪性疾 患および免疫障害において果たす役割についての洞察が得られる。 ＮＫ標的抗原についての知識により、　ＭＨＣ分子のようなエフェクター細胞に より認識される他の既知のりガントとの比較が可能となり、そして、正常な宿主 の防御、腫瘍生物学およびＮに細胞調節において類似している他の標的抗原の同 定が可能となり得る。さらに、　ＮＫ細胞レセプターでは真実であるが。 ＮＫ標的抗原を同定することにより、　ＮＫＩＩＩ胞、「抗原特異性」に基づい て異なる細胞並集団に分類することが可能となり得る。なぜなら、ある標的抗原 を優先的に認識するＮＫ１１ｌ胞亜集団が存在し得るためである。これらの分子 の知識は、他のタイプの非特異的エフェクター細胞上に存在する抗原レセプター のタイプに関する重要な意味を付与し得る。生化学レベルでの標的抗原の分析に より、どのタイプの分子がＮＫ細胞認識に重要であるかということ、および免疫 系におけるこれらの細胞の役割について、よりよい理解がなされ得る。魚類、マ ウスおよびヒトにおける標的抗原の生物学的、生化学的および分子レベルでの比 較により、免疫系におけるＮＫ細胞集団の進化におけるある程度の洞察が得られ 、そしてこの戦うために進化した免疫系に、どのようなものにより攻撃が行なわ れたかに関しても洞察が得られる可能性がある。即ち、これらの標的抗原がすべ ての分析レベルにおいて非常に保存されているなら、このことは、宿主に重要な 調節構造が存在すること、および、それゆえこれらの分子を認識する方法を維持 するために、　ＮＫ系にかかる強い進化による圧力が存在することを示し得る。 抗標的細胞ｍＡｂはインビボに関連するのものであり得る。なぜならＮＫ細胞が 、悪性疾患に対する防御において重要である場合には、この抗原の認識および調 節についての理解は、悪性疾患および免疫障害のスクリーニングによって癌を発 見し治療することに有用であり得、そして、　ＮＫ細胞あるいはｍＡｂを腫瘍に 対して標的化するために有用である得る。 従って９本発明の目的は、　ＮＫＩＩＩ胞およびＮＫ細胞により溶解する細胞の 表面に存在する抗原を特異的に認識し、そして結合する抗体を提供することであ る。 本発明の他の目的は、　ＮＫ細胞による標的細胞の溶解を抑制し得る。そのよう な抗体を提供することにある。 本発明のさらに他の目的は、抗原レセプターおよびそれにより認識された分子に より定義されたＮＫ細胞集団、およびその抗原本体の単離および特徴付けに有用 な抗体を提供することにある。 光浬Ｒと４１ 本発明は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の表面に存在するレセプター分子 （二量体）、およびレセプターにより認識された抗原を有する標的細胞の非特異 的溶解を含む非特異的細胞障害性細胞（ＮＣＣ）　；ナチュラルキラー細胞によ り認識されて溶解し、細胞表面に一般的に存在する抗原；レセプターおよび抗原 分子に結合し、それらの同定および精製に有用なモノクローナルおよび非対応抗 体；およびＮＫ細胞による標的細胞の溶解作用を変化させる方法を包含する。 本発明のモノクローナル抗体（ｓ＋Ａｂ）は、ナマズ由来の非特異的細胞障害性 細胞（ＮＣＣ）　（抗レセプター抗体）あるいはＮＫ１１１胞により溶解しやす いＮＣ−３７ヒトリンパ芽球性Ｂｉｂ胞で免疫されたマウス肺臓細胞と、ミエロ ーマ細胞とを細胞融合して調製した。８種の異なるｍＡｂのうち、４種はＮＫ／ ＮＣＣ細胞レセプターに対する抗体であり、そして４種はＮＫ／ＮＣＣ認識標的 細胞抗原に対する抗体であることが特徴づけられた。本発明で用いられるｒＮＫ 細胞」は、特に指示のない限り、＠乳類由来のナチュラルキラー細胞および魚類 由来の非特異的細胞障害性細胞を包含して用いられる。レセプターに対する２種 の−ＡｂおよびＮＫ細胞抗原に対する２種のｍＡｂは、低ｓ＋Ａｂ濃度において ＮＫ溶解を有意に抑制し得る。これは、細胞に媒介される細胞障害性アッセイの 抑制により評価された。レセプターに対する２種のｍＡｂおよびＮＫ細胞抗原に 対する２種のｍＡｂは。 タンパクに結合するが、細胞溶解を抑制しない。 （以下余白） ２１ｂλ囚隼ヌＩ【叫 第１図は　％　ｌＣｒでラベルされたＮＣ−３７標的細胞をＮＣＣにより細胞溶 解する場合のｍＡｂ　５Ｃ６，１０，４と６Ｄ３．４．４の抑制効果を比較して いる。エフェクター細胞は、　ｍＡｂ　１０μｇを加えて４時間インキュベート した後、２回洗浄し、エフェクター二標的細胞の比が２０：　１．４０：　１． ８ｏ：　１．または１６０：　１となるように標的細胞と混合した。 第２図では、２７℃、４時間のアッセイでＮＣＣによる前腎細胞の溶解における 。　ＮＣＣに対する１０μｇの閤Ａｂ　５Ｃ６，１０，４および２Ｂ２．４．９ の抑制効果を比較している。このアッセイでは、選別されたエフェクター細胞が 流動血球計測によりエフェクター：標的細胞の比が２０：　１，４０：　１．ｓ ｏ：　１．および１６０：１となるように濃縮される。 第３図は、内因性ＮＫまたは活性化されたＮＫ細胞とともにインキュベートした 場合の５ＩＣｒ−ラベルのに５６２標的細胞（ウェルあたり１０．０００標的細 胞）の溶解割合（％）を比較している。 細胞は、コントロールとして培地とともに、あるいは１ウエルあたり２μｇ、５ μｇ、または１０μｇ　ｍＡｂとともに、あらかじめ培地中で４°Ｃで１時間イ ンキュベートした後、エフェクター二標的細胞比が１：１，３：１．および１０ ：１で、３７°Ｃ２３時間アッセイされた。 光旦ｊ」す■ｖ礼所 本発明は、ヒト、マウス、ラット、および魚類を含む様々な種において、ナチュ ラルキラー細胞および非特異的細胞障害性細胞（以後特に記載のない限り合わせ てｒ　ＮＫＩＩＩ胞」とする）の表面に見い出されるレセプタータンパク；真核 生物細胞の表面に存在するときにレセプターにより認識されるタンパク（このタ ンパクはタンパクを有する細胞の溶解の結果生じる）−並びに当該タンパクレセ プターおよび標的タンパクの両方に対するモノクローナル抗体およびヘテロクロ ーナル（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）抗体に関するものである０本発明は、さら に。 それらの単離、特徴付け、および種々の条件下における使用非特異的細胞障害性 細胞（ＮＣＣ）とは、ナマズ（ｎ旦旦旦…）の「ナチュラル」細胞性免疫を媒介 する細胞集団を示し、哺乳類のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に類似している。 　ＮＣＣは。 様々に形質転換されたげっ歯頚およびヒトのＢ細胞；Ｔ細胞；および骨髄の標的 細胞に結合し、溶解させる。ＮＫ細胞と同様にＮＣＣは、溶解の第１段階を開始 するために細胞−細胞接触を必要とする。　ＮＣＣは、プラスチックおよびナイ ロンウールに非粘着性である（３）　ｉ　ＮＣＣは、細胞死減作用を増強するた めに、標的細胞を加える前にブレインキュベーション期間を必要とする；さらに ＮＫ細胞のように、　ＮＣＣは、結合および死滅作用それぞれに対して、類似の Ｍｇ＋″およびＣａ″＋を必要とする。 さらに、ミカエリスメンテンの速度論およびラインウィーヴアークの形質転換試 験を用いて、　ＮＣＣ細胞とＮＫ細胞とを比較した０個々の標的細胞を殺すのに 、　ＮＣＣ細胞は、ＮＫ細胞の約５倍必要であり、３時間の細胞死滅アッセイ中 にＮＣＣは再生しない、しかし、比較において、速やかな死滅作用速度論。 非常に広い至適温度および多数の標的細胞表現型特異性を示す比較結果かられか るように、　ＮＣＣは哺乳類ＮＫ細胞と比べると、より分化可能で１機能的に未 分化であると考えられる。 ＮＣＣは、標的細胞を速やかに（９０分以内に全溶解の９０％）溶解し、　ＮＣ Ｃは、広範な異なる型の標的細胞と結合し、溶解させる。これらの標的細胞は、 　ＹＡＣ−１，Ｐ８１５．　ＮＣ−３７，ＤＡＵＤＩ、　Ｐ３ＨＲ−１，ＭＯＬ Ｔ−４，Ｋ５６２．０９３７．およびＨＬ−６０細胞を包含する。 この標的細胞死減作用の非常に広い範囲は、認識が完全に抗原非特異的であるこ と、もしくはＮＣＣによる標的細胞の認識と溶解に対して２つの異なる決定基が 必要であることを示している。寒冷（Ｃｏｌｄ）標的阻害では、　ＮＣＣが、抗 原特異細胞の多くの異なる細胞並集団を含有し、そのペテロ型寒冷標的細胞では なく、ホモ型が溶解を阻害することを示している。 さらに、溶解に感受性を有する特定のＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ形質転換Ｂ細胞 （ＮＣ−３７，Ｐ３ＨＲ−１，ＤＡＵＤＩ）等と類似の性質を示す細胞は、逆に 、寒冷標的細胞として、　ＮＣＣによる細胞溶解作用を抑制し得る。これらのデ ータは、多くの異なる標的細胞が。 ＮＣＣの異なるサブセットにより認識され得ること、およびクローン型様のＮＣ Ｃ機能が、特異的抗原レセプターによって媒介され得ることを示唆する。 退煎員胞工鳳至・するーＡｂの　および　・しＮＣＣによる細胞溶解作用は、　 ＭＢＣ非制限性であるという特徴があので、　ＮＣＣは、　ＮＣ−３７（ヒトリ ンパ芽球Ｂ細胞系）　、　ＤＡＵＤＩ（ヒトリンパ芽球Ｂ細胞系）およびＰ３Ｈ Ｒ−１（ＤＡＵＤＩに同じ）を含む種々のヒト形質転換細胞；並びに自然発生す る魚の寄生虫］１すＩＤ旦ｕ−■旦ハｒＷ１ｓ＋　を溶解することができ、同様 に、　ＹＡＣ−１（モロニー白血病ウィルスによるマウスリンパ腫）等数種のげ っ歯頚細胞系をも溶解することができる。また寄生虫標的細胞が、細胞障害性ア ッセイにおいて、この腫瘍細胞系と寒冷競合を示すことから、ある種のヒトおよ びげっ歯頚形質転換細胞系が、魚のＮＣＣにより認識される魚の寄生虫といくつ かの共通の抗原決定基を共有していることが考えられた。このような理由により 、　ｍＡｂ生産における抗原提供細胞として、　ＮＣ−３７ｉｔ胞系を用いるこ とをした。 ＮＣ−３７を接種したＢａ１ｂ／ｃマウスの肺臓細胞をＰ３−Ｘ６３−Ａｇ　８ ．６５３ミエローマ細胞と融合させた。得られたｍＡｂは、　ＥＬＩＳＡにおい てＴｅｔｒａ上戸旦凹−■ｕハ■ｎとＮＣ−３７細胞系との両方に反応するｍＡ ｂについてスクリーニングした。４種の独立した。 陽性の結合している園Ａｂを、展開とクローニングのために限界希釈を繰り返す ことによって選び出した。これらのｍＡｂは、　ＩＢ７゜１８Ｃ２，８，３，Ｌ Ｄ４．７Ｃ６，５，４，であった、標的抗原に結合するＩｇＭｍＡｂを産生し、 　ＮＫによる細胞溶解を抑制する１８Ｃ２，８，３；および標的抗原に結合する ＩｇＭ　ｍＡｂを産生するが、　ＮＫによる細胞溶解を抑制しない７Ｃ６，５， ４，は、　１９８７年１０月１６日、　Ａｓ＋ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、に寄託されて 、それぞれＡＴＣＣ阻ＨＢ９５７１およびＨＢ９５７４と命名された。すべての ｍＡｂを腹水中で増殖させ、試験の前に、セファロースープロテインＡ　（Ｉｇ Ｍ　）あるいはセファロース−ＣｏｎＡ（ＩｇＭ）クロマトグラフィーにより腹 水から精製した。 以下の試験により、　ＮＣ−３７に対して誘導されたモノクローナル抗体が、魚 における標的細胞のＮＣＣ溶解作用を特異的に抑制することが示される。　ｍＡ ｂ　１８Ｃ２，８，３，およびＩＦ５による細胞障害性阻害作用は、用量依存的 な、標的細胞レベルで局在する阻害作用である。すべての被検標的細胞系は、ヒ トあるいはマウス由来に関係なく、これらのａ＋Ａｂを前投与することによりＮ ＣＣ細胞溶解から保護される。他の＋＊Ａｂ　（７Ｃ６，５，４゜およびＩＤ４ ）は、標的細胞に結合はするが、溶解を抑制しない。 これらのデータは、　ｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３，およびＩＦ５により認識され る決定基が同じ（もしくは、少なくとも一部分が同じ抗原の複合体である）であ り、この溶解作用の抑制はおそら（立体障害によるものではないと考えられるこ とを示す。 このｍＡｂの特異性は、吸着実験により検討された。このｍＡｂがあらかじめ種 々の異なる標的細胞系に吸着する場合、　ＮＣＣによるＮＣ−３７標的細胞の溶 解に対するａ＋Ａｂの抑制能が消失することを示した。この反応は、　ｍＡｂに より認識された抗原決定基が、　ＮＣ−３７標的細胞上で見いだされた抗原決定 基と、吸着細胞上で同一であり、この抗原決定基が細胞膜表面に存在することを 示した。 さらにこれらの＋ａＡｂを特定する抗原決定基の広範な細胞内分布が、　＋ＩＩ Ａｂ　ＩＦ５によると旦ｍ阻坦肚亘旦已江の溶解抑制を示す実験により明らかと なった。加えて、　ＮＣ−３７標的細胞に対する溶解アッセイによりテストされ ると、異なる数の寄生虫への抑制性ｍＡｂの吸着が、　ｍＡｂの抑制活性を選択 的に消失させた。この結果は、＃乳類および原生動物標的細胞の両方に対し、ｍ Ａｂが同一の抗原決定基を認識していることを示した。 ｍＡｂ　５Ｃ６および６Ｄ３．２の抑制メカニズムを、抑制が起こる溶解サイク ルの段階を決定することにより検討した。抑制ｇｌＡｂでエフェクター細胞を前 処理すると、　ＮＣ−３７および魚のＮＣＣとの間での接合体形成が著しく減少 した。これらのデータは。 レセプターｍＡｂが標的細胞と細胞障害性細胞との間での認識構造に結合するこ とを示している。 ＦＩＴＣラベルしたａ＋Ａｂによるこの細胞系の流動血球計測分析では、最も高 い結合能が、抑制性ｍＡｂと非抑制性ｍＡｂ　１０４との両方に対してみられ、 　ｍＡｂ　７Ｃ６，５，４，との結合能のレベルは低かった。これらの結果は、 　ＮＣ−３７でコートしたＥＬＩＳＡプレートで得られたデータと一致する。　 ｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３，１Ｂ７．７Ｃ６，５，４゜およびＩＤ４がこの細胞 系への結合能が異なることを示したにもかかわらず、４種すべてのｍＡｂは被検 標的細胞にある程度結合した。 （以下余白） ＮＣ−３７モノクロ−ル　によるＮＣＣの且皿作貝　標識Ｓ　ｌＣｒ−放出アッ セイで、各標的細胞−ＮＣＣ混合液を、各精製−Ａｂの異なる希釈率の希釈液と 共にインキュベートした。一連の標的細胞のＮＣＣによる細胞溶解を抑制する能 力を、４種のｍＡｂについて試験した。この標的細胞には。 ＮＣ−３７（この細胞系はＥＢＶ遺伝子配列を有するがｇＢｖ　ｆｉ！抗原は発 現されない）　、　ＤＡ［ＩＤＩ　、　ＭＯＬＴ−４（ヒト白血病子細胞）。 髄球性（ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌｏｉｄ）白血病細胞）　、　０９３７　（ヒト組 織球性白血病細胞）　、　Ｐ８１５　（マウス肥満細胞腫細胞）、およびＹＡＣ −１が包含される。精製■Ａｂ　１８Ｃ２，８，３およびＩＥｌ　（１ｇＭイソ タイプ）は、以下の標的細胞のＮＣＣ死減作用を抑制した二すなわち、　Ｕ９３ ７．　ＭＯＬＴ−４，Ｋ５６２．　ＨＬ−６０、ＤＡＵＤＩ　、　ＮＣ−３７， Ｐ８１５゜およびＹＡＣ−１である。５０μｇ／ウェル濃度において、用量に依 存する抑制活性は、非抑制性のｍＡｂ　７Ｃ６，５，４およびＩＤ４（ＩｇＧイ ソタイプ）に比較して、５０％から７０％の範囲であった。 同様にｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３は、鵬Ａｂ　７Ｃ６，５，４と比較して、魚の 寄生虫ｎ江蛯ル弘Ｌ　肛社匂」ｎをＮＣＣによる細胞溶解から保護した。吸収試 験では、　ＮＣＣによるＮＣ−３７細胞溶解に対する抑制作用は、他の標的細胞 系のいずれか１種とともにｍＡｂ　ＩＦ５をインキュベートすることによって１ 滴定可能な様式で除くことができた。　ｍＡｂ　ＩＦ５および１８Ｃ２，８，３ の抑制活性は、エフェクター細胞（ＮＫ／ＮＣＣ）とＮＣ−３７標的細胞との間 の接合体形成を抑制することによることが示された。 ｍＡｂ　ＩＦ５および１８Ｃ２，８，３はＮＣＣの細胞溶解作用を用量に依存し て抑制するが、　＋ｍＡｂ　１０４　、７Ｃ６，５，４は細胞毒性を抑制しない 。抑制性ｍＡｂとして、同じＩｇｌ’ｌイソタイプの、無関係のｍＡｂ　゛（６ Ｄ３．４．４とする）も、細胞毒性に対する効果がなかった。 同様に、ラベルした標的細胞としてｋぶ困１阻匣　肛杜技胆旦を用いた場合、　 ＋＊Ａｂ　１８Ｃ２，８，３（ｅｍＡｂ　７Ｃ６，５，４ではない）は。 ＮＣＣによる死滅作用の約７０％をブロックした。標的細胞を。 プレインキュベートした後洗浄することによって、細胞溶解作用が抑制される場 合、抑制作用は標的細胞に特異的である。 さらに、　ＮＣＣエフェクター細胞をｍＡｂと共にインキュベートし、その後洗 浄しても、溶解作用を抑制しない、これらのデータは、　ｍＡｂ　ＩＦ５および １８Ｃ２，８，３により認識される決定基が魚ＮＣＣエフェクター細胞により認 識される抗原決定基と同一であるか、あるいはきわめて類似していることを示し ている。 非抑制性−Ａｂ　（１０４および７Ｃ６，５，４）の両方が標的細胞に結合する ことから、抑制作用は立体障害作用によるとは考えられない。 さらに、　ＮＣＣによる寄生虫とぶ司１阻封の溶解がｍＡｂ　７Ｃ６，５，４で はなく　、　ｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３で抑制されることから、これらの抗原決 定基の広範な分布が明示された。 これらｍＡｂを特定する。標的細胞上の決定基の相対的レベルは、　ＦＩＴＣ標 識したｍＡｂを用いて蛍光流動血球計測分析（ＦＣＭ）により測定された。これ らの実験は、４種のｓ＋Ａｂすべてが被検細胞表面に結合することを示した。ウ ェスタンプロットおよび免疫沈降法による生化学的分析により、　−Ａｂ　１８ Ｃ２，８，３およびＩＦ５がＮＣ−３７溶解産物中の２抗原を認識することが示 された：すなわち、大きい方のタンパクは、約８０．０００　Ｄで、小さい方は ４２．０００　Ｄである。　ｍＡｂ　ＩＦ５により認識される抗原は。 すべての標的細胞で高度に発現される。さらに、ｖＩ的細胞でのこれらの決定基 の濃度が、細胞溶解作用に対する標的細胞の感受性に比例すると考えられた。即 ち、　ＮＣ−３７細胞（溶解に対する感受性が最も高い）は、この抗原を非常に 高いレベルで発現するが、　Ｐ８１５細胞（溶解に対する感受性はより低い）は 、この決定基が低濃度である。 標的細胞分子の広範な系統発生的分布に起因して、他の無関係な種であるヒトの ＮＫ活性に対する。このｍＡｂの効果も試験された。末梢血を採集し、比重分離 によりリンパ球を精製した。これらのエフェクター細胞によるＮＫ細胞溶解作用 を抑制する能力を、　ｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３について試験した。６頭中４頭 において、このｍＡｂにより用量依存的に抑制されるＮＫ活性が示され、この５ ｅＡｂが、大部分のヒト由来のヒトＮＫ細胞により認識される抗原決定基を認識 することが確められた。 ヒ）ＮＫ活性の試験で通常使用されるいくつかのヒト細胞系についても、　ｍＡ ｂ　ＩＦ５．１８Ｃ２，８，３および７Ｃ６，５，４で特定される分子の発現を 試験した。この決定基は、　Ｋ５６２．　ＮＣ−３７，？ｌ０ＬＴ−４゜ＤＡＵ ＤＩおよびＳＢ細胞で発現された。興味深いことに、この抗原は、　ＮＫの溶解 作用に最も感受性の高い細胞系（Ｋ５６２．　ＮＣ−３７゜およびＭＯＬＴ−４ ）で高濃度に存在した。３時間の細胞毒性アノセ４ｉ”ｍＡｂを試験すると、Ｉ Ｆ５および１８Ｃ２，８，３ｗＡｂは、用量に依存して、４種の異なる標的細胞 のＮＫ溶解作用を、著しく抑制することが見いだされた。無のＮＣＣ系で見られ たのと同様に、　ｓＡｂ　１０４および７Ｃ６，５，４は標的細胞に結合するに もがかわらず、標的細胞のヒ）ＮＫ細胞溶解作用を抑制しながった。 他のヒトエフェクター細胞集団のＮＫ細胞溶解作用を抑制するこれらのｍＡｂの 能力についても検討した。活性化ＮＫ細胞（ＩＦ２と共に２４時間インキュベー トした）と５Ｄリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ　）細胞との細胞溶解活性を 、この−Ａｂが抑制し得ることが認められた。これらのエフェクター細胞集団を 最大限に抑制する効果を得るには、新鮮なＮＫ細胞で見られたよりも高濃度の− Ａｂが必要であることは注目すべきであり。 標的細胞へのより高い親和性を有するエフェクター細胞を表わしているかもしれ ない、これらの結果は、新鮮なＮＫ細胞。 活性化ＮＫ細胞、およびＬＡＮエフェクター細胞が、特定の標的細胞上の、同一 な抗原決定基を、少なくとも部分的に認識することを示している。 最後に、これらの−Ａｂが、抗原特異的ＣＴＬの、　ＮＫ様の細胞溶解作用を抑 制する能力について試験した。　ｍＡｂ　ＩＦ５および１８Ｃ２，８，３は、こ れらＣＴＬによって発現された抗原特異的溶解作用に対して効果を示さなかった が、　ＷＢ／３２　ｍＡｂ　（抗−肛Ａ）はこれに関して有効であった。しかし 、これらのｍＡｂは、これらのＣＴＬによるに５６２の標的細胞の溶解作用を、 非常に効果的に抑制したが、　Ｗ６／３２　ｓＡｂは効果がなかった。 これらの結果は、抗原特異的ＣＴＬが、　ＭＨＣ分子とは異なる特定の標的細胞 上の決定基を認識し得、その決定基が１通常のＮＫ細胞により認識される決定基 と同一であると考えられることを示している。この知見から、このようなＣＴＬ が、その表面に１つ以上の抗原受容体を有することが考えられ、１つは特異的抗 原に対する抗原受容体で（典型的ＴＣＲに媒介されるＭｌ（Ｃ認識）および、　 ＮＫ抗原決定基に対する抗原受容体であり（この−Ａｂにより特定され、受容体 「Ｘ」で媒介される抗原の認識）２両者は相互に独立している。溶解作用の抑制 のレベルが固体によって異なることは注目すべきことであり。 このことから、異なる個体中に、この決定基を認識する異なるＮにの細胞並集団 の存在を示していると考えられる。これらの結果は、これら腫瘍細胞系に他の標 的抗原が存在することも示している。 異なる標的細胞上の、　ｍＡｂを特定する決定基の発現についてさらに検討する ために、吸収実験を実施した。各＋＋＋Ａｂを。 異なる３種の濃度の、指示された標的細胞に吸収させた。この吸収されたｍＡｂ を２次に　５ＩＣｒで標識されたＮＣ−３７標的細胞に加え、魚ＮＣＣとともに ４時間の溶解アッセイでインキュベートした。用量依存的な抑制反応が認められ 、このことは。 ｍＡｂにより認識された吸着細胞上の抗原決定基が、標識されたＮＣ−３７標的 細胞上のそれと同一であることを示している。 ハに的ｇ虹を用いたｍＡｂ　ＩＦ５の吸収は、　ＮＣＣによって認識される同じ 決定基が、この原生動物表面およびＮＣ−３７ＩＩＩ胞上に存在することを示し た。 接合体形成の抑制が起こっているかどうかを調べるために。 次に、標的細胞を各ｍＡｂで処理した。　ＮＣ−３７細胞（１，５Ｘ　１０’細 胞）を、７５または１５０μｇの各−Ａｂで処理し、洗浄後、魚のＮＣＣ（１： ２　ＥＡＴ比）に加えた。　ＸＭＳ処理と比較して、　ｍＡｂ　１８Ｃ２，８， ３およびＩＦ５で処理したサンプルにおいて、顕著な用量依存性の接合体形成の 抑制作用が見られた。非抑制性ａ＋Ａｂである７Ｃ６，５，４および１０４は、 接合体形成に対し有意な効果を持たなかった。 同様に、前処理した５ＩＣｒ標識標的細胞を用いて実施した細胞毒性実験から、 　ｓ＋Ａｂ　１８Ｃ２，８，３およびＩＦ５によりＮＣ−３７の細胞溶解作用は 抑制されるが、　７Ｃ６，５゜４および１０４では抑制されないことも示された 。 麟Ａｂ　ＩＦ７　、１８Ｃ２，８，３，７Ｃ６，５，４、および１０４によって 認識される各決定基の相対的膜レベルを測定するために、単色流動血球計測分析 を行なった。抑制性のｓ＋Ａｂ　１８Ｃ２，８，３およびＩＦ５の標的細胞への 結合の蛍光ヒストグラムでは、細胞の約４０〜７５％の高い結合レベルが、被検 細胞系すべてにみられた。同様に１両ａ＋Ａｂ　（１８Ｃ２，８，３およびＩＦ ５）は、マウス標的細胞の約７０％に結合した。一般的に抑制性ｍＡｂより低濃 度ではあるが、非抑制性ｓ＋Ａｂ　７Ｃ６，５，４および１０４では、ヒトおよ びマウス標的細胞の間で異なる結合レベルが認められた。　ｍＡｂ　７Ｃ６，５ ，４および１０４の結合レベルは、被検ヒト標的細胞の２〜１０％であった。ｍ Ａｂ　７Ｃ６（５，４）および１０４に対する最も高い結合性は。 ＹＡＣ−１１１１胞で認められた（それぞれ２５および２９％）。 標的細胞抗原の単離および特徴付は 標的細胞に特異的なｍＡｂに認識される抗原の生化学的分析は、ウェスタンプロ ット法と免疫沈降試験により実施した。 両試験で、各抑制性ｍＡｂが２つのタンパクに結合することが示唆された。ウェ スタンプロット分析を用いて、１つの分子は４２．００００で、第２の分子は、 用いられたｍＡｂにより、　７８．００００または８６．００００であった（そ れぞれｍＡｂ　ＩＦ７または１８Ｃ２，８，３）。 ウェスタンプロット分析と同様、　ｍＡｂ　ＩＢ？または１８Ｃ２，８，３を用 いた免疫沈降試験でも４２．００００抗原が示唆された。しかし。 ウェスタンプロット分析と異なり、沈降した第２のより大きな分子は、　８０． ００００であった。この７８に口、８０に口、および８６に口分子という見かけ の分子量の違いは、潜在的に、グリコジル化による変動あるいは５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅ分析中のゲル−ゲル変動によると考えられる。約８０ｋＤのより大きなタンパ クは、　４２，０００Ｂの抗原の二量体である可能性がある。異なる還元条件下 では（β−メルカプトエタノール濃度およびインキュベーション時間／温度を変 化させる）　、　４２．００００に単一のバンドは得られなかった。モノクロー ナル抗体７Ｃ６，５，４は、　６７．００００のタンパクを認識した。１０４は ニトロセルロース膜に結合しなかったが、流動血球計測データでは、　ＮＣ−３ ７細胞に結合することが示される。１０４で認識されたペプチドは、我々の方法 では溶解しない可能性が考えられる。あるいは、ＩＤ４は、結合親和性が低いの で、ニトロセルロースに一度固定されると。 相同な抗原には結合できないと考えられる。 この結果は、これらのａ＋Ａｂで認識された標的細胞抗原は。 魚ＮＣＣによる標的細胞溶解に必要な認識工程に包含され、宿主防御、腫瘍生物 学、および細胞障害性細胞の認識工程の研究にも重要な関係を有することを示し ている。 さらに、標的細胞抗原の特徴付けは、　ＮＣ−３７細胞溶解産物から５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥを用いて得られたタンパクの分離およびウェスタンプロット分析による同 定により達成された。ｍＡｂ　ＩＦ５は。 ７８、０００および４２．００００の分子量の２つのタンパクと反応し。 ＠Ａｂ　１８Ｃ１８−３は、　４２，０００口抗原および８６．００００タンパ クを認識した。ｍＡｂ　７Ｃ６，５，４は９分子量６４．００００の抗原に結合 し。 １０４はウェスタンプロット分析で結合は見られなかった。４種のａ＋Ａｂのす べての配合物をニトロセルロース片とともにインキュベートし、その結果、各抗 体に認められたバンド数の総和が得られた。ゲルが還元条件（５％β−メルカプ トエタノール）または非還元条件下で用いられた場合、差異はなかった。負の対 照として正常マウス血清を用いたが１反応性はなかった。 ５５Ｓ−メチオニン標識したＮＣ−３７細胞溶解産物を、プロティンＡビーズに 結合したｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３およびＩＦ５を用いて沈降させ、溶出後、１ １％５ＯＳ−ＰＡＧＥ上の電気泳動により分離した。 分子量４２．００００および８０．００００の２つの大きな抗原が免疫複合体か ら溶出された。 これらの所見は、これらのｍＡｂとＮＣ−３７腫瘍細胞を用いた免疫沈降実験で 見られた第１の分子と一致し、二量体複合体であることが考えられる。結合デー タに基づくと、このｍＡｂは、ＦＣ７レセプター、トランスフェリンレセプター 、ラミニンレセプターまたはラミニン、免疫グロブリン、　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ ａｒｒウィルス抗原、あるいはＭＨＣ抗原を認識しないようである。 実際、構造が非常に保存されている。　ＭＨＣ分子に対する抗体は、このような 異なる種を超えて９　このような分子を認識しない。従って、このｍＡｂは、　 ＮＫ細胞溶解過程においてＮＫ標的抗原として作用する。新規で、単一の、保存 された分子を特定すると考えられる。この分子は、おそらく、免疫系進化の初期 において、免疫系発達の調節に機能するために進化したと考えられる。事実、未 だよくわかっていないが、この分子は、いくつかの生理学的役割を有するであろ う。 標的細胞分子が、　ＮＫ標的抗原の定義と一致するためには。 ＮＫ細胞溶解に感受性のある標的細胞上でのみ発現されるか。 もしくは、この分子の場合に見られたように、感受性のある標的細胞とない標的 細胞とで、この分子の発現が量的に異なる必要がある。ＭＨＣ抗原でそうである ように、標的抗原が。 多形性分子である場合は、これらの条件に合致する必要がない。しかし、Ｎに細 胞の標的細胞認識は、Ｔ細胞のそれと同じ形式でないと考えられているため、　 ＮＫ標的抗原は多形性でないと考えられる。ＭＨＣ抗原等の特定分子は９体内に 広く分布している。Ｔｈｙ　１抗原などの他の分子は、Ｔ細胞および脳等の限ら れた細胞群および脳で見出されている。特定のＴ細胞サブ細胞群にのみ見出され ているＣＤ８決定基等のさらに他の分子は、非常に狭い範囲にしか分布していな い。これらの分子の発現は機能を定義づけたり、特定の免疫障害を分類するうえ で有用である。従って、マウスおよびヒトにおける標的細胞分子の分布を確立す ることは、ＮＫ細胞に認識され、かつ／または調節されている細胞を特定する上 で、さらに免疫形におけるＮＫ細胞の役割において有用である。 流動血球計測（ＦＣＭ）技術は、標的細胞抗原を発現する細胞および組織の範囲 を測定するのに利用されている。間接免疫螢光法が単色ＦＣＭのために用いられ 、一方、二色ＰＣＭは標的細胞抗原および他の興味ある抗原の発現を同時に評価 するため用いられる。二色分析については、市販で入手可能な技術を用いて、こ のｍＡｂを直接ＦＩＴＣまたはフィコエリトリンのいずれかに接合させる。次に 、形質転換したＴ細胞、Ｂ細胞。 マクロファージ、およびその他の細胞系（例えば、肉腫および種々の胚細胞系） などのインビトロでの培養細胞系の拡大パネルと：種々の膜抗原のレベル、Ｂ細 胞成熟期、およびＮに細胞溶解に対する感受性が十分に特徴付けられているＢ細 胞系のパネルとについて、こられのＢ細胞系のＮＫ細胞溶解に対し感受性を有す る標的細胞抗原の発現レベルに応じた。この分子の発現を検討する。これらの細 胞系のＮＫ細胞溶解に対する感受性がこれらの細胞で発現されるＭＨＣ抗原のレ ベルに影響されることが示されたので、こられの抗原、すなわちＨＬＡ−Ａ、　 Ｂ、　Ｃを調べ、溶解に対するＢ細胞の感受性へのこれら２抗原の影響を測定し た。正常組織、単離された。新鮮な末梢血細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファー ジ）とともに、膵臓。 胸腺、骨髄、および非造血性組織由来のサンプルについても。 この分子の発現を調べることができる。 ＮＫ細胞に関するいくつかの機能のうちの１つであるＮＫ細胞溶解に対する。こ のｓＡｂの抑制能のみを調べたが、抗ＴＣＲ複合体−ＡｂがＴ細胞機能を増強も 抑制もできることと同様に。 これらの−Ａｂは、標的細胞抗原に刺激された増殖およびリンホカイン産生など の活性を抑制し得、さらにＮＫ細胞を増強し得ると考えられる。 抗標的細胞ｍＡｂのＮＫ細胞溶解抑制能を測定するために、標準３時間のＳ　ｌ Ｃｒ−放出微小細胞障害性アッセイを行う。このアッセイは、　ｍＡｂを除去し て、あるいは除去せずに、さらにｍＡｂ濃度の用量反応性を測定するために濃度 を変化させて。 行う。 抑制メカニズムは、　ＮＫ細胞溶解過程のどの段階にｍＡｂが作用するのかを分 析することによって検討される。このｍＡｂがＮＫ標的抗原を特定すると考えら れるので、まず、　ｍＡｂが標的細胞の認識を妨害しているかどうかを検討する ために接合アッセイを行う。これらのアッセイは、懸濁液中で、標的細胞と精製 エフェクター細胞（種々のｍＡｂで前処理したものと処理していないもののいず れか）を、２３℃１５分間混合し、光学顕微鏡下で接合体をカウントして実施さ れる。溶解した接合体は、混合液を３７℃３０分間インキュベートした後トリバ ンブルー染料を添加し、生存および死亡接合体をカウントすることにより決定さ れる。これらの比較的単純で９便宜的な接合アッセイを、アガロース中の標準接 合アッセイで確認する。 溶解過程の結合後の段階の効果も＋１ｇ”＋を含有し　（ａ　２　＋を含有しな い緩衝液中に、　Ｃａ”＋を添加する前後の種々の時点でｍＡｂを加えて細胞障 害性アッセイを行うことによって決定され得る。 このｍＡｂの、　ＮＫ機能の他の局面への抑制能も、短期間の抗原刺激増殖アッ セイを用いて検討することができる。ＮＫ細胞は、９６ウエルのマイクロタイタ ープレートに、照射標識されたフィーダー細胞、刺激剤（ＩＬ２．　腫瘍細胞、 およびレクチンの混合物）、およびＩＬ２の存在および非存在下においてプレー ト化される。アッセイ開始後１〜５日間、６時間毎に３Ｈ−チミジンを加え、増 殖に対するａ＋Ａｂの作用を調べる。検討され得る。抗原に刺激される。他のＮ Ｋ機能には、　ｓＡｂのリンホカイン産生（例えばＩＰＮ−γ）抑制能が包含さ れる。リンホカイン産生アッセイは、開始後２４時間で上清を採集し、　ＩＮＦ −Ｔ含量を分析することを除けば、増殖アッセイと同様に行うことができる。 このｓＡｂにより影響を受けるＮＫ細胞群は何であるのか調べるためには、　Ｎ Ｋ増殖およびリンホカイン産生に対するーＡｂの作用を、限界希釈分析（ＬＤＡ ）を用いて評価する。ＬＤＡは９段階的な精製ＮＫ細胞数（０，５〜１００　ｘ ｌＯ’細胞／ウェル）を用いることを除くと、上記アッセイと同様に行われる。 これらのｍＡｂにより抑制されるＮＫ細胞の割合を知ることが、すべてのＮＫ細 胞が同等に影響を受けているのか、感受性のあるＮＫ細胞集団とないＮに細胞集 団が存在するのか、そして、標的細胞に対して異なる抗原を認識する。　ＮＫ細 胞の異なるサブ細胞群が存在するのかが決定され得る。 抗原分子の活性および生化学は、標的細胞の表面においても変化を受け得る。そ こで、変化した標的細胞を１種々のＮＫ細胞群により認識され、溶解される可能 性について試験することができる。これは、特定の標的細胞（例えばに５６２細 胞）が１つ以上のＮＫ細標的抗原を発現するかどうかを調べるために用いること ができる。変化は、　ｍＡｂを加え９次に２番目の抗マウスＩｇ抗体を加え、細 胞を３７℃で一晩インキユベートすることによって行われる。細胞を洗浄後、　 ＦＣＭにより分子の発現を評価する。ＦＣＭは、他の標的細胞表面分子のいずれ かが、他の分子間結合を介してともに変化をうけているかどうかを評価するため に用いることができる。 上記方法と同様にして、　ｍＡｂで変化を受けた標的細胞の。 寒冷標的細胞ＮＫ溶解抑制能も分析する。まず、標的細胞分子の発現レベル（Ｆ （：Ｍを介した）と変化を受けていない標的細胞の、寒冷標的細胞ＮＫ溶解抑制 能とを、　ＮＫ標的細胞とＮＫエフェクター細胞のパネルを用いて対比する。次 に、　ｍＡｂの変化を受けた標的細胞（変化はＦＣＭで評価する）を、未処理の 標的細胞の寒冷標的細胞ＮＫ溶解抑劃側について分析する。これにより、これら の標的細胞上に１つ以上の標的抗原が存在するか、　ＮＫ細胞、特にＮＫクロー ンが、１つ以上のＮＫ標的抗原を認識するかがわかる。 抗原認識、腫瘍細胞の溶解、ふよび、抗原に刺激される増殖とリンホカイン産生 などのすべてのＮＫ機能が抑制されることが予想される。ＩＬ２で誘発される増 殖は影響を受けないと予想される。 ＮＫ細胞レセプターに対するｍＡｂの単離および特徴付は標的細胞抗原に関して 記載された前記方法と同様の方法を用いて、Ｎに細胞レセプターに対するｌ１ｌ Ａｂを調製した。ｍＡｂは。 流動血球計測により精製した魚（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ　ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）非 特異的細胞障害性細胞（ＮＣＣ）に対して誘導された。４種のｏ＋Ａｂがクロー ニングされ、特徴付けがされた。ｍＡｂ　５Ｃ，１０，４および６Ｄ　３．２． １０は、未分画ＮＣＣによるＮＣ−３７標的細胞（ヒトリンパ芽球性細胞系）の 溶解を６０〜６５％抑制する。ｍＡｂ　２Ｂ２．４．９および６Ｄ３．４．４． は、細胞障害性を抑制しない。すべての−Ａｂは、同じイソタイプ（ＪｇＭ）で あり、限界希釈（２回）によりクローニングする。標的細胞のみに処理した場合 、　ｍＡｂがＮＣＣ細胞障害性に対し作用しないことから、抑制活性がエフェク ター細胞に特異的である。ＮＣＣとともにｍＡｂをブレインキュベートしても、 ブレインキュベートしなくても、抑制作用は起こり得る。抑制作用は可逆性では ない。抑制性ｍＡｂを用いて流動血球計測（ＰＣＭ）で精製されたＮＣ（１’を 処理すると、約１００％の抑制が起こる。標的細胞をｍＡｂ　５Ｃ６，１０−４ （抑制性ａ＋Ａｂ　）ｍＡｂ　６Ｄ３．４゜４　（非抑制性ｍＡｂ　）と共にブ レインキュベートし。 エフェクター細胞を加える前にｍＡｂを取り除くと、細胞溶解を抑制しなかった ことから、細胞障害性の抑制作用は、標的細胞ではなく、エフェクター細胞に特 異的であった。両抑制性醜Ａｂは、エフェクター細胞とＮＣ−３７標的細胞の間 の接合体成形を著しく抑制する。 ＮＫ細胞レセプターに対するｍＡｂのうち２種５Ｃ６−１０，４および６Ｄ３． ４．４を、　１９８７年１０月１６日にアメリカンタイプカルチャーコＬ／クシ ョンに寄託し、それぞれＡＴＣＣＮ（Ｌ　ＨＢ９５７２および８８９５７３と命 名された。 種々のエフェクター細胞群に結合しているｍＡｂを検討するために、流動血球計 測を用いる。抑制性および非抑制性＠Ａｂは、魚前腎細胞の約２５％（５Ｃ６， １０，４）および３９％（６０３，４，４）　；魚＊ａ細胞ノ４２％（５［：６ ．１０．４）　＃よび５４％（６０３−４，４）　；魚末梢血の２．５％（５Ｄ ６．１０．４および６Ｄ：１４．４）に結合する。 ＮＣＣ細胞溶解を最大限に抑制するのに必要な必要条件を検討するために、各ｍ ＡｂをまずＣｏｎ−Ａセファロースで精製した。 次に、このｍＡｂを、エフェクター細胞と共に４時間ブレインキュベート（その 後２回洗浄）するか、あるいは、ブレインキュベートせずに、細胞障害性アラ七 イ開始時に添加した。 両方のインキュベーションプロトコルが、　ＮＣＣ細胞溶解の抑制において同様 に効果的であり、７４％（５Ｃ６）および６８％（６０３，２）の抑制を示した 。第４図参照。第１図は抑制性ｍＡｂ　５Ｃ６゜ｌ００４および６Ｄ３．２．１ ０によるＮＣＣ活性の抑制を示す。ｎ＋Ａｂは。 まずＣａｎ−Ａセファロースを用いて精製され、各エフェクター細胞の標的細胞 混合液（Ｅ：Ｔ比は１６０：１）に１０μｇずつ加えられた。値は、３回測定値 の平均±ｓＤである。アステリスクは、対照からの有意差（Ｐ　＝　０．００５ ）を示す。ｍＡｂによる抑制作用は可逆的ではなかった。ｍＡｂで処理されたエ フェクター細胞をよく洗浄しても、抑制作用は除かれなかった。 次に、非特異的細胞障害性細胞を、　ＦＡＬＳおよびＬ９０’　ＬＳパラメータ ーを用いて、流動血球計測により選別した。選別された細胞を、　ｍＡｂ　５Ｃ ６，１０，４または２Ｂ２−４−９と共にインキユベートシ、溶解活性を試験し た（第２図）。第２図は、　Ｃａｎ−Ａ精製−Ａｂの添加によるＮＣＣ細胞障害 性の抑制を示す。選別されなかった細胞は、未分画前腎細胞であり９選別された エフェクター細胞は流動血球計測により蓄積された。アッセイは。 ２７℃４時間で行った。より高ＢＡＴ比で必要な、蓄積されたエフェクター細胞 の数を得ることはできなかった。データは。 各Ｅ：Ｔ比における３回測定の平均とＳＤである。アステリスクは９選別対照か らの有意差（Ｐ＝０．００１）を示す。各反応混合液中には、　ＩＩＡｂを１０ μｇずつ加えた。１０μｇの精製ａ＋Ａｂ存在下、　２０：　Ｉ　ＢＡＴ比と同 様、　４０：　Ｉ　ＥＡＴ比テ、　ＮＣ−３７標的差溶解が著しく抑制された。 次に、接合体形成の抑制が起こっているかどうかを調べるために、エフェクター ＮＣＣを各ｍＡｂで処理した。透水精製したＮＣＣ（１，５Ｘ１０’細胞）を各 ｎ＋Ａｂ　（７）７５μｇまたは１５０　μｇ　Ｔ！処理し、細胞を洗浄後、　 ＮＣ−３７標的細胞を加えた（［Ｅ：Ｔ比１：２）。 ＮＭＳ　（陰性対照）と比較し１両抑制性ｍＡｂにより接合体形成が著しく抑制 されたが、非抑制性ｍＡｂでは抑制されなかった。 ｍＡｂの接合体形成のａ＋Ａｂによる抑制作用の、用量依存性も観察された。非 抑制性ｍＡｂは、接合体形成割合に対し有意の効果を持たなかった。細胞障害性 実験では、　５（”６．１０．４および６０３゜２．０の画濃度により、標的細 胞溶解も抑制されることが示された（表■）。 第３図は、新鮮なＮＫ細胞および活性化ＮＫ細胞の、抗ＮＣＣモノクローナル抗 体による細胞溶解抑制作用を示す。内因性Ｎに細胞およびＩＬ２活性化ＮＫ細胞 を精製した。各エフェクター細胞集団は、　Ｋ５６２標的細胞を加える前に、指 示された用量のｍＡｂと共に４℃１時間インキュベート（その後２回洗浄）する ことによってブレインキュベートした。細胞障害性アッセイを。 ３時間実施した。特異的溶解％のデータは、　Ｌｌｌ、。に変換し。 各白線に記号を挿入して示した。他の２つの独立した実験においても、同様の結 果が得られた。 次に、すべてのｍＡｂにつきて、前腎細胞および膵臓組織−の結合を調べた。前 腎細胞に結合しているｍＡｂ　５Ｃ６−１０，４および６０３．．１１０の螢光 ヒストグラムでは、２つの結合している細胞集団が見られ２その細胞集団は、　 ｍＡｂ　５Ｃ６−１０，４の濃度が。 ａ＋Ａｂ　６Ｄ３．２．１０ので着色された細胞より約１０倍高い。同じ５Ａｂ ５Ｃ６，１０，４が、２つの異なる組ｍ（膵臓および腹側腎）由来の細胞に結合 する。これら両組織由来の細胞に結合したａ＋ＡｂＯ量は、はとんど同じであっ た。前腎、膵臓、末梢血への各ｍＡｂの特異的結合の割合は、細胞型およびｍＡ ｂによって異なった。 他のｍＡｂより、より高い濃度の６０３．４．４が各組織山奥の細胞に結合した 。さらに、前腎および末梢血と比べ、膵臓細胞は。 より高濃度の各ａｇＡｂと結合した。末梢血は、どのｍＡｂとも有意な量で結合 しなかった。 エフェクター細胞として、非選別魚前腎細胞を用いたアッセイでは、　ｍＡｂ　 ５Ｃ６，）、０．４は、　ＮＣＣ細胞溶解活性を６３％抑制した（第２図）。Ｎ ＣＣをｍＡｂとともにブレインキュベートした場合、あるいはブレインキュベー ションなしでｍＡｂを細胞障害性アッセイに加えた場合のいずれも、同等の抑制 レベルが見られた。抗ＮＣＣｍＡｂと同じ性質を有する抑制性ｍＡｂを同定する ために、＠乳類ＮＫ細胞を用いて他の試験を行った。エフェクター細胞および標 的細胞とともに同時に加えた場合、Ｎに抑制性ａ＋Ａｂは有効であった。晴乳類 ＮＫ活性は、アッセイの前にエフェクター細胞のみをｍＡｂで前処理することに よって。 同様に抑制され得る。 抑制を行うためのＩＩＩＡ）Ｉの必要条件をよりよく理解するために、他のアッ セイ条件を調べた。精製した抗ＮＣＣａ＋Ａｂを１０μｇで、細胞障害性の９６ ％が抑制される。マウスにけおる同様の試験で、　Ｃｏｒ＋−ＡによるＴ細胞増 殖を抑制するａ＋Ａｂが２１■／ｄという低濃度でＴ細胞を介する細胞障害性も 、６７％抑制した。 ＮＣＣの−Ａｂ抑制メカニズムは、抑制の起こった溶解サイクルの段階を件とす ることにより調べた。精製ｍＡｂでＮＣＣを前処理すると、　ＮＣＣとＮＣ−３ ７標的細胞との間の接合体形成が著しく減少した。非抑制性ｍＡｂとエフェクタ ー細胞の間で結合が起こるにもかかわらず、接合体形成は著しく減少しなかった 。他の試験においては、０口４５　（７２００類縁体）とＣＭＲＦ−１１゜ＣＭ ＲＦ−１２と、　ＣＭＲＦ−２６に特異的なｍＡｂはすべて、結合後の段階でＮ Ｋ活性を抑制することが示されている。これらの結果とは異なり９本発明のａ＋ Ａｂは、　ＮＣＣ上でレセプターに結合している抗原に対して反応性であること が示された。このことは。 標的細胞溶解を起こす連続したいくつかの段階のうち、最初の段階（接合体形成 ）を抑制するｍＡｂの能力を明らかに証明した。 ＮＣＣ上に見出された膜決定基の相対的濃度を評価するため。 さらに魚のリンパ性網内組織におけるレセプターを持つ細胞の分布を調べるため に、　ＰＣＭ分析を行った。抑制性および非抑制性ｍＡｂの両者が、前腎および 膵臓細胞に結合した。しかし、末梢血中ではＰＣＭ分析によりＮＣＣを検出でき なかった。 ＮＣ−３７ｍ的細胞存在下、前腎細胞中に接合体を形成しているＮＣＣが１６〜 １８％であることが見出されている。ＰＣＭ分析によると、前腎細胞の２５％（ ５Ｃ６，１，０，４）から３９％（６０３，４，４）が。 これらのｍＡｂに認識される決定基を含有する。アガロース技術による単一細胞 とＰＣＭ分析によるデータとの間にみられるこれらの違いは、明らかに、　ＮＣ Ｃを検出するためのこれらのプロトコールの感度を反映している。 ＮＫ細胞レセプターの単離と特徴付け ＮＣＣをＦＣＭによって選別し、界面活性剤で可溶化したこれらの細胞の抽出物 をａ＋Ａｂを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｇｅｌ　１５ ）で精製した。同じ二量体を抑制性ｍＡｂ（６０１２，１０）または非抑制性ａ ＋Ａｂ（６０３，４，４）のどちらかを用いて精製した。精製タンパクはＳＯ３ 分析で２本のバンドを有する。抑制性および非抑制性ｏ＋Ａｂは、ともに２つの タンパクを沈降させた。１つは分子量約４１．００００であり、もう１つは約３ ８．００００　テア、　タ。、：、（７）？１合体ＬＪ、　４１．００００オヨ ヒ３８．００００分子からなり、これらは非還元剤または還元剤の有無に関係な く２本の別々の鎖として共に移動する。この特性をもつ分子は、“非特異的”細 胞障害性（例、　ＮＫ、異常キラー、　無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）キラ ー、　ＬＡＫ、　ＣＴＬ−ＮＫ等）のどんなタイプのエフェクター細胞について も以前報告されていない。 同様の結果をｍＡｂ　５（：６．１０．４による免疫沈降実験から得、還元条件 下５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。沈降した４３．０００口および３８．０００口 の分子はアフィニティークロマトグラフィーで観察されたものと類似していた。 本発明のタンパクと抗体は、さらに、それらの起源や機能に関する情報を提供す るために使用される。それらは、関連タンパクまたは代替タンパクをスクリーニ ングするためのアッセイに使用できる。それらは、癌および自己免疫疾患などの 疾患状態の治療に対して、単独でまたは生物学的に活性な化合物と組み合わせて 使用され得る。そのような使用法は。 本発明の範囲内に入る。さらに本発明のタンパクである。抗原とレセプターの両 方は、その分子上の炭水化物の程度や機能、細胞表面での回転率９等電点、二量 体サブユニット間の関係や相同性、および生物学的機能に関するそれらの修飾効 果などの研究によって特徴付けられ得る。化学的なタンパク修飾および変異体産 生が後者を実施するために使用できる。 この情報を得る方法は、当業者に利用可能であり、ここで詳細に記述される。 ５ＯＳ−ＰＡＧＥで測定された通り、タンパクは均質に精製されているので、そ の配列を既知分子と比較するために分子の配列を決定することができ、ζ、の分 子をコードする配列に対してライブラリーをスクリーニングするためのヌクレオ チドプローブを調製することもできる。そのプローブは、どのレベル（すなわち 、　ｍＲＮＡ産生またはタンパク合成）で変化が起こるかを決定するために１種 々の低発現細胞と、高発現細胞系および変異体中の＠ＲＮＡ含量を測定する際に も役立つ。あるいは。 クローンは上述のｍＡｂ　、または精製タンパクに対して生じた異種抗血清を用 いてスクリーニングされ得る。多くの細胞系由来のｃＤＮＡライブラリーが利用 できる。必要に応じてエフェクター細胞あるいは標的細胞系から単離したポリ（ Ａ）　ＲＮＡを用いたλｇｔｌｌのような発現ベクターを使ってそれらを調製す ることができる。陽性のクローンを低密度で均質性にってスクリーニングし、制 限酵素地図の作成やサザンプロット分析によって相互に比較すると同一クローン または重複クローンを同定することができる。同定したクローンからの配列デー タを使って、レセプターか抗原のいずれかの遺伝子を同定するための別の援助と 手段、および関連分子を同定する際の助けを提供することができる。さらにこれ らの配列やプローブは、し七ブタ−または抗原によって免疫細胞と標的細胞を特 徴付けるためのアッセイに使用することができる。重要なことは、配列およびそ れらの機能の同定や特徴付けによってインビボでの相関関係を変える方法が得ら れる。すなわち、その方法は、標的細胞、または通常、ナチュラルキラー細胞の 標的として作用しない細胞に対してさえナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性を 増加させるか抑制するかどちらかである。配列を使用することによって、染色体 上でこれらタンパクに対する遺伝子の位置をマツピングすることもでき、それに よって免疫応答における潜在的欠損（すなわち、先天的に。 あるいは疾患または環境によって誘発される）に対してスクリーニングできる。 これら分子をコードする遺伝子の知識によって、まただこれらタンパクの発現と 機能の調節に関する情報が得られる。ただし、この情報は、このように広い進化 分岐の非常に多くの異なった種に共通している免疫系内のどんな分子に対しても 今のところ利用できるわけではない。タンパクと配列またはこれらタンパクをコ ードする配列のためのプローブがいったんわかるとこれら末端を完成する方法は 。 現在当業者に利用可能である。ゆえに、配列、プローブ、使用法は９本発明の範 囲内に入る。 （以下余白） 材料及び方法： 動物　異系交配させた河床ナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ　ｐｕｎｃａｔｕｓ）の 雌雄で体重１０〜２５ｇ９年齢は約６カ月〜１年および１年半のものを、地元の 人工養殖場から得た。魚を、１６〜１９℃の温度範囲で５７０１のファイバーグ ラス流水中に維持した。規定食はペレット状の魚餌（Ｐｕｒｉｎａ　Ｃａｔｆｉ ｓｈ　５ｔａｒｔｅｎａ、　Ｒａ１ｓｔｏｎ−Ｐｕｒｊｎａ　Ｃｏ、）からなっ ていた。Ｂａ１ｂ／ｃ７ウスをｍＡｂ生産に使用するために、　）ｌａｒｌａｎ 　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）から 購入した。 培地　マイクロオスメット（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｌａ　Ｊ ｏｌｌａ。 ＣＡ）を用いて２５０　ミＩＪオスモル／ｋｇＨ，０の容量オスモル濃度に調製 したＲＰＭＩ−１６４０（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、　Ｍｏ）中で細胞培養を続けた。 細胞懸濁液の調製　水中でアミノ安息香酸エチル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を用いて魚に軽く麻酔することにより 、魚を殺した。前腎、末梢血、膵臓細胞を取り出し、単細胞懸濁液を調製した。 この方法は、　Ｓ、Ｓ、　Ｇｒａｖｅｓら。 ｎｅｗ、Ｃａｍｐ、Ｉｗｍｕｎｏｌ、８．２９３　（１９８４年）に示された通 りであり、その教示をここに取り入れる。細胞を２回洗浄（２００Ｘｇ、１０分 間）Ｌ、、ト！Ｊパンブルーで染色した後、血球計でカウントした。流動血球分 析用試料を２Ｘ１０’総細胞／ｄに調製した。赤血球は、リン酸塩緩衝食塩水（ ２５０ミＩＪオスモル／ｋｇ　Ｈ，０）とパーコール”　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、。 Ｕｐｐｓａｌａ　、スウェーデン）との溶液を調製することによって取り出した 。調製した溶液を１５献のプラスチック管に２ｄ容積で加えた。前腎、末梢血、 またはＲａ細胞の懸濁液（３×１０”細胞／献）を、パーコール５溶液上に１ｍ ｌ容積の層にした。この管を遠心分離（３００ｘｇ、　１０分間）した後、白血 球を界面から回収し、洗浄（２回）した。エフェクター細胞をブレインキュベー ションする為に細胞をＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＢＳ）中に２Ｘ１０’細胞 ／献で懸濁した後、２６℃、５％Ｃロ、圧で４時間２４ウェル組織培養プレート （Ｌｉｎｂｒｏ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、ＰｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｍ ｃＬｅａｎ、　ＶＡ）中でインキュベートした。 ミエローマ細胞系Ｐ、−Ｘ６３−Ａｇ”　（Ｐ、）は、１０％熱不活性化ＦＢＳ を含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。膵臓は、　ＦＣＭで選別した ＮＣＣを用いて予め免疫化したマウスから無菌的に取り出した。これは、　Ｄ、 Ｌ、Ｅｖａｉｓら、　Ｄｅｖ、Ｃｏｍｐ、Ｉｍｍｕｎｏ、１１．９５　（１９８ ７年）に示された通りに行ない、その教示を標的細胞に関して下記の様にここで 取り入れる。その後、　ＲＰＭｉ１６４０　（血清なし）中で洗浄（２回）した 。膵臓細胞懸濁液をＰ３細胞（対数増殖期）と混合した。細胞を洗浄（３回）し て、カウントした後、　５−ＯＸＩＯ’　Ｉｌｌ臓細胞／１．ＯｘｌＯ”、ＸＵ 　−７細胞の割合で混合した。細胞融合はポリエチレングリコール（圓Ｂ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　）　１．０　ｍｌ を用いて実施した。融合段階後、細胞を遠心分離（２２０ｘｇ、　１０分間）シ 。 その上清を除去した後、細胞を完全ＲＰＭＩ　（１５％ＦＢＳ）　４０ｗＬｌ中 で再懸濁した。細胞懸濁液を４８ウエルプレートのウェル中に等しく分け（２， ５ｘｌＯ’細胞／ｄ）、３７℃、５％Ｃ０２圧で一晩中インキコベートした。そ の後、培地を１５％ＦＢＳおよび０−１＠關ヒボキサンチン、４．０Ｘ１０−’ Ｍアミノプテリンおよび１．６×１０−５Ｍチミジンを補給した完全ＲＰＭＩ− １６４０（）ＩＡＴ培地）に変えた。融合後７日目にＨＡＴ培地を補充（容積で ５０％置換）した。ｌＯ０日目ＨＡＴ培地を０．１ｍＭヒボキサンチンおよび１ ．６Ｘ　１０−’Ｍチミジンで補給した完全ＲＰＭＩ培地（ＢＴ培地）に取り替 えた。その後、培養培地は必要に応じて補充した。それから増殖中のハイブリド ーマを有する上清をＥＬＩＳＡ法によってスクリーニングした。 標的細胞上の抗原に対するモノクローナル抗体の生産抗標的細胞抗原ａ＋Ａｂ生 産の為に用いられる細胞はＮＣ−３７ヒトリンパ芽球Ｂ細胞であった。この細胞 系はＥＢＶ遺伝子配列を有しているが、ＥＢＶ膜抗原を発現しない。次に示す細 胞系もまた細胞障害性アッセイの際に使用した。即ち、　ＤＡＵＤＩ　（ヒトリ ンパ芽球Ｂ細胞）　、　ＭＯＬＴ−４（ヒト白血病子細胞）ＨＬ−６０（ヒト前 腎髄球白血病細胞）　、　Ｋ５６２　（ヒト赤血球骨髄球性白血病）　、　［９ ３７（ヒト組織法白血病）　、　Ｐ８１５　（マウス肥絆細胞腫）。 ＹＡＣ−１（モｏ＝−白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｙ　Ｌｅｕｋｅａ＋ｉａ　ｖ ｉｒｕｓ）によって誘発されたマウスリンパ腫）である。細胞系は、すべて１０ ％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ−１６４０中３７℃でインビトロで維持した。Ｔｅｔｒ ａｈｙｌＩｌｅｎａ　ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ　（Ｍｉｄｗｅｓｔ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ、　５ｅｒｖｉｃｅ。 Ｔｅｒｒｅ　Ｈａｕｔｅ、　ＩＮ）は５００ｄフラスコ中のエリオツド培地（Ｂ ｌｌｉｏｔｔ’　ｓｍｅｄｉａ−）で培養した。 レセプター単離の為のＮＣＣ可溶化　非特異的細胞障害性細胞をＰＢＳ　（ｐＨ ７，５）中で２回洗浄し、５Ｘ１０”細胞／１ｎ１で再懸濁した後、　ｐＨ７， ５（７）２０ａ＋Ｍ　）　！Ｊ　ｘ塩酸５．　Ｏｒｔｔｌ　（コｔＬＬＪ　１　 ｍＭ７）化フェニルメチルスルフォニルおよび１％ノニデット（Ｎｏｎ　１ｄｅ ｔ）　−４０を含む）を添加することによって可溶化した。（４℃で）２時間お いた後、試料を遠心分離（１００，０００ｘ　ｇ　、　６０分間）シ。 その上清をＰＢＳに対して４８時間（４℃）で透析して、−２０℃で保存した。 各試料の細胞抽出物（７μｇ）を１２．０％　５ＤＳ−ＰＡＧｔ！で電気泳動し た（５時間、　１５ｍＡ）。ゲルを標準硝酸銀法（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、　ＣＡ）で染色した。 抗レセプター抗体の単離　Ｐ３ミエローマ細胞とＰＣＭで精製したＮＣＣで免疫 化したＢａ１ｂ／ｃマウス由来の免疫膵臓細胞とを融合したハイブリドーマを、 　ＢＬＩＳＡ法によってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを、前腎組織 から得たＮＣＣ調製物でコーティングした。このときＮＣＣは４５．５％パーコ ール２上で約５〜６倍に濃縮したものを使用した。ＥＬＩＳＡ法で陽性を示した ハイブリドーマを　Ｓ　ＩＣｒ標識したＮＣ−３７標的細胞の、　ＮＣＣによる 溶解作用の抑制についてテストした。テストに用いたＥＬＩＳＡ法で陽性のａ＋ Ａｂのうち、４つのｍＡｂをさらに研究を進める為に選び出した。この４つのｏ ＋Ａｂを各々、　５Ｃ６，１０，４，６０３，２，ｉｏ。 ６０３．４．４．および２Ｂ２．４．９と命名した。この４つのｍＡｂはすべて ＩｇＭであり、４つとも全て限界希釈によって２度サブクローン化した。 抗−ＮＣ−３７（抗原）モノクローナル抗体の生産　マウスを。 ＲＰＭＩ−１６４０中ノ５　ｘ　１０’　ＷノＮＣ−３７ｍ胞テＢ腔内免疫化り 。 １週間後（ＩＦ）　、同数の細胞で追加免疫（ｂｏｏｓｔ）　した。融合３日前 に再びＮＣ−３７細胞をマウスに追加免疫し、このマウスの膵臓細胞をネズミＰ ｓ−ｘ６３　Ａｇ３−６５３のミエローマ細胞と２＝１の割合で融合させた。そ の際、ポリエチレングリコール（ＭＷ３．３５０　、　Ｓｉｇａ＋ａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を使用した。細胞（ＩＸＩＯ ’）を２４ウエルプレートに播種した後、その上清を、　ＮＣ−３７およびＴｅ ｔｒａｈｙｍｅｎａとの酵素結合免疫吸着検定法（ｔ！Ｌ［５Ａｓ）から成る２ 段階プロトコールを用いてスクリーニングした。ウェルは５　Ｘ　１０”　ＮＣ −３７またはＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ細胞でコーティングし、−７０℃で保存し た。陽性を示したウェルの上清から細胞を２５ＣＩＩＦ組織培養フラスコに移し て増生させた後、限界希釈によって２度サブクローン化した。陽性を示すクロー ンをイソタイプ化し９−７０℃で保存した。精製する為に、クローン化したハイ ブリドーマをブリスタン（ｐｒ　１ｓｔａｎｅ）処理したＢａ１ｂ／ｃマウスに 注射し、マウスの腹水を集めて熱不活性化（５６℃、６０分間）した後、フィル ター滅菌した。５０％硫酸アンモニウムで沈降させたｌ１１Ａｂを、　Ｃａｎ− Ａセファロース（ＩｇＭ　ｍＡｂ　）またはタンパクＡセファ０−ス（ＩｇＧ　 ｍＡｂ　）クロマトグラフィーによってさらに精製した。標的細胞死減作用を抑 制する能力に基づいてｍＡｂを選択した。 融合物はＮＣ−３７とのＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ＥＬｒＳＡｓ法によりスクリ ーニングした。さらに詳しい特徴付けの為に４つの異なる標的細胞反応ｍＡｂを 選び出し、この４つのｍＡｂを、　ＩＦ７．４．７　、１８Ｃ２，１３１Ｄｔ　 ５．８．および７Ｃ６，５，４と称した。このモノクローナル抗体の各々の特異 性についてテストするために、それぞれ、ＢＳＡ、　Ｐ３腹水、　Ｐ３上清、ま たはＮＣ−３７全細胞のいずれかでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添 加する前に行なう。 ｍＡｂ　１８Ｃ２，８，３，１８７、および１０４の結合抑制作用はＮＣ−３７ 細胞を用いたこれらのモノクローナル抗体のブレインキュベーションでのみ観察 されたが、他の処理では対照レベル（未処理）と比べても減少しなかった。ＥＬ ＩＳＡプレートに結合させることによって測定された様に、　ａ＋Ａｂ　７Ｃ６ ，５，４の反応性はいずれの処理によっても変化しなかった。 ＋ｓＡｂのコンカナバリンＡセファロースクロマトグラフィーＩｇＭモノクロー ナル抗体は、　Ｃａｎ−Ａセファロースビーズ（ＡｆｆｉｇｅｌＣａｎ−Ａ、　 ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を利用した４ロ、Ｐ、 　Ｂｏｙｌｅら、　Ｊ、Ｉ＋＋ｎｕｎ−Ｍｅｔｈｏｄｓ３２．５１　（１９８０ 年）の方法によりアフィニティークロマトグラフィーで精製した。コンカナバリ ンＡセファロースゲルは試料適用緩衝液（１０ａ＋Ｍ　）リス［ｐＨ７，２］　 。 １１１ＭＭｇ＋と１５ＭＣａ”＋を含む）の３〜５ベツドボリユームで洗浄した 。ゲル上の過剰緩衝液を除去した後、試料２〜５−を充てんし、非常に穏やかに 混合して、スラリーを形成した。 その後、カラムを充てん用緩衝液で洗浄し、溶出液の０．Ｉｔ　（２８０ｎ■） が充てん用緩衝液と同じになるまで試料をモニターした。 次いで、特異的に結合したＩｇＭ　ｍＡｂを２００ｍＭα−Ｄ−メチルマントピ ラノシドで溶出させた。ゲルを充てん用緩衝液の３〜５ベツドボリユームで洗浄 することによって再生させ、４℃で保存した。 細胞障害性アッセイ　細胞障害性活性は＋　Ｇｒａｖｅｓらによって以前述べら れた（１９８４年）様に　Ｓ　＋　（ｒ放出（ｒｅｌｅａｓｅ　）アッセイを用 いて測定した。ＮＣ〜３７ヒトリンパ芽球Ｂ細胞系を標的として使用した。これ らの細胞を、３７℃、５％Ｃ０２圧でＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＢＳ＞中に 維持した。標的細胞を、　（ｉｒａｖｅｓらによって示されたように３７℃２時 間”ＮａＣｒ０＜　（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃｈｉｃａ ｇｏ、　ｒＬ）　１００　、ｕｃｉを用いて標識した。魚ＮＣＣは、単細胞懸濁 液として調製した頭腎細胞を用いて、アッセイし、２回洗浄した後カウントし、 　１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ−１６４０中２Ｘ１０’細胞／−の濃度で４時間 インキュベートした。 このブレインキュベーション後、ＮＥＣを採取し、遠心分離して、異なるエフェ クター：標的細胞の割合でＳ　ｌ（ｒ標識した標的細胞に添加した。細胞障害性 を評価する為に上清ｌＯＯμｌを各ウェルから採取し、　Ｂｅｃｋｍａ口Ｂｉｏ ｇａｍｍａ　ＩＩガンマカウンターで放射能を測定した。細胞障害性は特異的に 放出した割合（％ＳＲ）で表し９次式で計算した。 流動血球計測分析　細胞サイズ、粒状、および蛍光性の分析には、エビマウスＶ 　”　７５３流動血球計（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ。 ＢＰＩＣＳ　Ｄｉ−ｖｉｓｉｏｎ　、旧ａｌｅａｈ、　ＰＬ）を使用した。生存 細胞試料を２Ｘ１０’細胞／ｄ濃度で調製し前方角度光散乱（ＰＡＬＳ）　。 ＬｏｇＩｏ９０°光散乱（Ｌ９０°ＬＳ）　、または緑色蛍光によって分析した 。計器は、フルブライト（ＧＲｎ）　９．７５μｍ径蛍光ポリスチレン中心体を 用いて毎日標定し、一定のレーザーパワーおよび電子増倍管セットで操作した。 緑色蛍光ＰＭＴは、　４８８ｎｍレーザー遮断物と５２５ｎｍ帯域干渉フィルタ ーを通過後、光を受けた。３００〜４００細胞／秒の流動速度で分析を行なった 。ＰＡＬＳとＬ９０°ＬＳパラメーターを用いて、電気的にゲートし、デブリを 排除して、陰性を示す細胞の分析を可能にした。分析は。 すべて５００ｍＷの一定電力でアルゴンイオンレーザ−（４８８ｎｏ＋発光）を 用いて行なった。 すべての選別に関して９尾鞘緩衝液（通常の生理的食塩水）を２５０ミリオスモ ル／ｋｇ　ＨＪに調製した後、予め確立したＦＡＬＳとＬ９０°ＬＳのパラメー ターに基づいて細胞を選別した。蛍光分析は、　ＦＩＴＣ接合抗マウスＩｇＭ抗 体（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋５ｉｃａｌ、、　Ｓｔ。 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を用いて実施した。細胞を４８８ｎｏ＋で励起した後。 ５９０ｎ＊　（短絡）光二色性鏡および５２５ｎ…帯域干渉フイルターを用いて 蛍光を検出した。２つの異なる電気的ゲート法を使用した：即ち、特異的結合割 合の分析にはＦＡＬＳとＬ９０°ＬＳゲート法を使用した。さらに最適ヒストグ ラムを得る為にＬＯＧ　、。 緑色蛍光シグナルに基づいてゲート法を行なった。 −Ａｂ結合を決定する為に前述の通り前腎と膵臓から細胞を採取し、　ＲＰＭＩ 培地中１〜２Ｘ１０”細胞／ｒｎｌで再懸濁した。テスト予定の各モノクローナ ル抗体を細胞懸濁液０．５−に添加（１００μｇ）　Ｌ、　３０分間（４℃）イ ンキュベートした。正常マウスの血清または関連のない１ｇＭモノクローナルを 対照として使用した。細胞は、冷却した（４℃）　ＲＰＭＩ−１６４０で２〜３ 回洗浄した。イソチオシアン酸フルオレセイン接合抗ＩｇＭまたは抗マウスＩｇ Ｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） （１：２０希釈）を１００μβ中に添加した。その細胞を再び３０分間氷上でイ ンキュベートし、冷（４℃）培地中で２回洗浄した後、流動血球計測分析用に１ 献培地中に再懸濁した。 接合体アッセイ　アッセイ用細胞を調製する為に前腎細胞を単離し、洗浄した後 、４５．５％パーコール１溶液上の層にする（パーコール６−上の細胞３ｍＡり ことによって分画した。 ２ＯＯＸｇで２０分間遠心分離した後、培地−バーコール界面で細胞を集め、洗 浄し、カウントした。その後、　７０Ｘ１０’細胞／Ｗ１１を６時間（２５℃で ）インキュベートした。 接合体アッセイ用にパーコールで精製したＮＣＣを調製する為に７．５Ｘ１０’ 細胞を各管中に分配し、適当な培地、ＸＭＳまたは精製＠Ａｂを添加した（総容 積３７５μｌ）。その細胞を６０分間（２５℃、５％Ｃ０２圧）インキュベート し、遠心分離（２ＯＯＸｇ）した後、３７５μｌのＰＭ１１６４０中に再懸濁し た。 アガロース接合体法における単細胞は、　Ｅｖａｎｓら（１９８４年）による魚 ＮＣＣに対して前述の通り処理した。簡単に言えば。 処理したＮＣＣ（２Ｘ　１０’細胞／ｒｎｌ）　１００μ！ｌとＮＣ−３７細胞 （２Ｘ１０’細胞／ＷＬｌ）　２００μｌを丸底ガラス管中で混合し、　（３０ ℃で）５分間インキュベートした。その後、細胞を５分間遠心分離（２ＯＯＸｇ ）　Ｌ、ペレットを穏やかに前融解させたアガロース５０μβ中に再懸濁した後 、その混合物をアガロースであらかじめコートしたスライド上に注いだ。接合体 の割合を決定する為に、３００のエフェクター細胞をカウントし。 ＮＣ−３７細胞に結合したエフェクター数を決定した。コードした試料をカウン トした（−重盲検分析）。 レセプターのアフィニティークロマトグラフィー　レセプターを精製する為に、 　Ｃａｎ−Ａセファロースで精製したモノクローナル抗体６０３．２と６０３． ４．４を、アフィゲル１０”　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ。 Ｒｉｃｈｓｏｎｄ、　ＣＡ）とカップリングさせた。その際の条件は、１０１ヘ ベス緩衝液（ｐＨ７，５）中で穏やかに振盪させながら４℃で４時間　５■タン パク／ｄゲルの濃度であった。遠心分離によって反応を止めた後、残った活性部 位をブロックする為に０゜１Ｍグリシンエチルエステル（ｐＨ８）中にこのゲル を。 １時間再懸濁した。ＰＢＳ　（ｐＨ７，５）でくり返し洗浄した後。 ゲルを４℃で保存した。可溶化したＮＣＣ溶解物を、穏やかに振盪しながら４℃ で一晩中２■タンパク／ｄのビーズ濃度で６０３、２および６Ｄ３．４．４アフ ィニティーゲルと共にインキュベートした。このゲルを２本のカラムに注入し、 溶出したタンパクがＯＤ２．。で検出できなくなるまでＰＢＳ　（ｐＨ７，５０ ＞でよく洗浄した。すべてのタンパクを溶出するまでグリシン／塩酸緩衝液（０ ，２Ｍ塩酸でｐＨ２，５に調整された０、１Ｍ）を用いて特異的エフェクター細 胞（ＮＣＣ）抗原を溶出した。両分を。 １Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８，０）　１００μｌを含有した管中に集めた。 ピーク画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した後、カルボキシメチルセルロー スを用いて濃縮し、−２０℃で保存した。 を、４℃でセルロースＣＬ４Ｂビーズと１２時間インキュベートすることによっ てあらかじめ透明化（ｐｒｅｃｌｅａｒ）　シた。その後。 あらかじめ透明化した溶解物を、４℃で４時間ｍＡｂ　５Ｃ６，１０，４に結合 したタンパクＡセファロース４Ｂと共にインキュベートした。タンパクＡセファ ロース４Ｂ接合体を１％トリトンＸ−１００で洗浄（３回）１−だ。次いで特異 的に結合した分子を２倍の試料緩衝液（２０％グリセロ−ＪＬ／（Ｖ／Ｖ）　、 ４％ＳＤＳ　（Ｗ／Ｖ）　。 および１０％β−メルカプトエタノール（Ｖ／ν）を含む１２５ｍＭ　）リス− 塩酸（ｐＨ６，８）　）　で溶出し、試料を電気泳動（１１％５ＯＳ−ＰＡＧＥ ）　した。そのゲルを銀染色法（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）で染色した。 ｏｎｅ−ｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ、　ＡＮＯＶＡ　 ）から得た。 ３７細胞を、ＰＢＳ　（ｐＨ７，５）で２回洗浄し、５Ｘ１０’細胞／ｄで再懸 濁した後、　２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　（１ｍＭフッ化）、ニルメ チルスルフォニルと１％２ノニデツト（ＮＯ旧ｄｅｔ）　−４０を含む）５．０ −を添加することによ−って可溶化した。２時間後（４℃）、その試料を遠心分 離（１００，０ＯＯＸ　ｇ　、　６０分間）シ。 Ｊ二清をＰＢＳに対して４８時間（４℃）で透析した後、−２０℃で保存した。 すべてのホモジネートを１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル （ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動した。 試料をニトロセルロース紙上にトランスプロットした（４℃。 １００ｍＡｍｐｓで１２時間行なった後、　３２０ｍＡｍｐｓで２時間行なった ）。 総タンパクを決定する為に、標準の分子量を含有するレーンを切断し、アミドブ ラックで染色した。ニトロセルロース膜（転移タンパクを含む）は、ＰＨ７，６ で５０ｍＭ　）リス−塩酸、５％淡紅色無脂肪乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　Ｎ ｏｎｆａｔ　Ｄｒｙ　Ｍｉｌｋ）　、　０．９％ＮａＣｌ。 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ブロッキング緩衝液）中に２時間浸した後。 ｌｅａ細片に切断した。その細片をｍＡｂと共に９０分間インキュベートした後 、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合したヤギ抗マウスＩｇＧ　、　ＩｇＡ　、　 ＩｇＭ　（Ｃａｐｐｅｌ　ＢｉｏＩ［１ｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌｖｅｒｎ、　Ｐ Ａ）と共に６０分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中で洗浄した後、 基質（ＨＲＰ　Ｃｏ１ｅｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　５ｏｌｕｔｉｏｒ＋、　 Ｂｉ。 Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を添加し、 少なくとも１０分冊重水（ｄＨ２０）中に浸すことによって発色現象を止めた。 レセプターの免疫沈降　標識された細胞を２〜４Ｘ１０’細胞／　ｍｅまで緩衝 液中で再懸濁する。これに等容積の溶解緩衝液（１％　ＮＰ４０；１％ＢＳＡ　 ；　１　ｍＭＰＭｓＦ）を添加する。核、デブリ、不溶解細胞を、　３０００Ｘ ｇで１５分間遠心分離することによって除去する。免疫沈降は次の通り行なう。 即ち、標的細胞抽出物を０．０１Ｍ）リス（ｐＨ７，５）　、　ウシ血清アルブ ミン（１００μｇ／μｍ）、および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む緩 衝液中で適当なｓＡｂと混合する。インキュベーションは４℃で３時間行なう。 ブドウ球菌タンパクＡを抗原−抗体混合物に添加（１０％、Ｖ／Ｖ）　Ｌ、　３ ７℃で１時間インキュベートする。この混合物を遠心分離（２００Ｍｇ、２分間 、４℃）シ、そのペレットを、５０μｌのＳＯＳ緩衝液（３％Ｓ口Ｓ／２％メル カプトエタノール（ＬＯ５）リス、　ｐＨ６，８１５％グリセロール）を添加し た後。 １０分間沸騰し２遠心分離することによって処理する。代わりにブドウ球菌タン パクＡ抗原−・抗体混合物を８Ｍ尿素中４％ＳＯＳ　（０，０５Ｍトリス（ｐＨ ８，４）を含む）に懸濁し、３分間沸騰させた後、遠心分離（２０００Ｘ　ｇ　 、６分間）する。各々の免疫沈降において、標識抗原は常に過剰にある。 ＮＣ−３７標的抗原の免疫沈降と５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析　ＮＣ−３７を、１００ μｃｉ／１０＠細胞／ｗｄ１．”Ｓ−メチオニン＜Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ。 Ｈｏ５ｔｏｎ、　ＭＡ）と共に６時間インキュベートした。標的細胞を遠心分離 し、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，１％Ｎａロ ロＣ，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１０ｍＭ）リス　（ｐＨ７，４＞　、１ ｍｇ／ｄ　ＢＳＡ、　０．０２％ＮａＮ５．０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を用いて溶 解させた。遠心分離によって核を除去し、その上清をセファロースＣＬ４Ｂビー ズで（４℃）あらかじめ透明化した（１２時間）。その後。 あらかじめ透明化した溶解物をｍＡｂ　１８ｃ２．８．３またはＩＥ７に結合し たタンパクＡセファロース４Ｂと共にインキュベートした。次にタンパクＡセフ ァロース４Ｂ接合体を遠心分離し。 上記の緩衝液で洗浄（３回）した。その後、　ｍＡｂで精製した標的細胞抗原を ２倍の試料緩衝液（２０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）　。 ４％ＳＯＳ　（ＩＩＩ／Ｖ）　、および１０％β−メルカプ）　ｘ　９　／　− ル（Ｖ／Ｖ）を含む１．２５５Ｍ　）リス−塩酸（ｐ）Ｉ　６．．８）　）で溶 出し、試料を電気泳動（１１％５ＯＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。ゲルを乾燥させた 後、室温で５日間Ｘ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、に０口ＡＫ、　Ｒｏｃｈｅｓｔ ｅｒ、　ＮＹ）に曝した。Ｎに細胞抗原の免疫沈降はレセプターの場合と同様に 行なった。 （以下余白） フィコエリトリンーＢ接合 チオール化したフィコエリトリンは、　１２５ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ６ ，８）中３．６ａａｇ／ｍｌのフィコエリトリン−８１，２ｄに１５．５ｍｇ／ 　Ｗ１１！、の塩酸イミノチオレン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、） 　６００μＩｔを添加することによって調製する。室温で９０分後に反応混合物 を５０−Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）に対して４℃で一晩中透析した後 、　ｐＨ７，５！衝液に対して２日間透析する（これによって平均８−ＳＨ基／ 分子が得られる）。 エタノール中１．１ｍｇ／ｍｊ２のＮ−スクシニミジル３−り２−ビリジルヂオ ーブロボーシ３ネート）（ＳＰＤＰ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ。 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）　３０μｍを４−２ｍｇ／ｍ１．の免疫グロブ リン〔５０１リン酸ナトリウム　（ｐＨ７、５）中〕７００μ！に添加する。１ ｇに対する５ＰＤＰのモル比は５．３である。反応は室温で２．５時間続行さす る。チオール化したフィコエリトリノ（同緩衝液中１．７畦／ｄの４００μｇ） を反応混合物５００μｌに添加する。チオール化したフィコエリトリンーＢに対 する活性比のモル比は４．７である。室温で１２時間後、　８０ｍＭヨード酢酸 ナトリウム１００μ！を残存するすべ′Ｃのスルフヒドリル基をブロックするた めにホルボール−１２−ミリステート−１３−アセデート（ＰＭＡ）およびその 類似体４−α−ホルボール−１，２，１３−ジデカノート　（４−αＰ１１１０ ）　（ＰＭＡの不活性類似体）をＮＣＣ／Ｎに溶解活性に対するホルボールエス テルの影響を決定するために使用する。ＮＣ（’およびＮＫ細胞は、　ＰＭＡ（ １０−’Ｍ）あるいは４αＰＤＤ　（１０−’Ｍ）で処理する。 エフェクター細胞活性およびエフェクター細胞レセプターの膜表現に対するこれ ら物質の影響を決定するために細胞を１〜４０時間処理する。モノクローナル反 応決定基の発現が増加したことはＦＣＭによっておよび感受性標的細胞の増加し た（あるいは減少した）溶解によって決定する。 表面炭水化物の放射能標識 糖タンパクのシアル酸残基を、酸化された炭水化物のトリチウム標識水素化ホウ 素ナトリウム（Ｎａｐ３ＨＪ還元によって標識する。シアル酸残基上にアルデヒ ド基を形成するためにＰＢＳｌｉ中１〜２Ｘ１０’　リンパ球を１ａ＋Ｍ過ヨウ 素酸ナトリウムと共に０℃で１０分間インキコベートする。２５ｍＭの最終濃度 までグリセロールを添加することによって反応を止め、細胞はＰＢＳで２回洗浄 する。ベレット状細胞をダルベツコの平衡化塩類溶液（１）ＢＳＳ）　０．５− 中に再懸濁し、　ＮａＢｓ）Ｉｓ　１　ｍｃｉを添加してアルデヒド基をそれら の対応するアルコールにまで還元する。 混合物を室温で３０分間インキュベートし、　ＤＢＳＳで２回洗浄する。 ヒトＮＫ細胞 ヘパリン化した末梢血は、　ＮＫ細胞源として正常給血者（年齢１８−３０才） から得られる。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、　Ｂｏｙｕｍ。 ５ｃａｎ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　２１　（ＳｕＰＰ、 　９７）　９　（１９６８）によって教示されたようにＰｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ ｑｕｅ　（フィコール−ハイバック）勾配で遠心分離し、単核細胞（ＭＮＣ）を 得る。ＭＮＣは。 次に示す方法の１つあるいは組合せによってＮＫ活性を高められる：　（ａ）　 ＭＮＣをプラスチックペトリ皿上で３７℃で１時間の２サイクルプレートする。 そして非粘着細胞を注意深く集める（ＰＮＡｄ）；これはＦｉｓｃｈｅｒら、　 Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５８，４２６　（１９８１）による：（ハ）ＰＮ Ａｄをナイロンウールカラムを通し、　Ｊｕｌｉｕｓら。 ３９．５４７　（１９８６）の方法に従ってパーコール勾配で遠心分離する：お よび（ｄ）　ＰＮＡｄをａ＋Ａｂ　ＰＫＴ３でコートしたベトリ皿上で選別し、 そして非粘着細胞を集める。細胞の生存はトリバンブルー染料排除法によって評 価する。種々のＮＫ集団は流動血球計測によってＮにマーカーＬｅｕ１１．　Ｌ ｅｕ７．　Ｌｅｕ１９に対して表現型で表される。 ＮＫ細胞の培養とクローニング 上述の方法で単離したＮＫ細胞はバルク培養（ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅ）およ びクローニングのための細胞源である。バルク培養では２５ｍ１１２フラスコ中 で増殖が行われ、培養増殖は、レクチン。 ＩＬ２．　照射された腫瘍細胞のどれかを用いた刺激あるいはこれらの刺激の組 合せによって開始される。照射されたフィーダー細胞もまた加える。１１２だけ を毎週添加することによって培養を維持する。単に培養物の増殖が減衰する場合 にのみ。 初期刺激とフィーダー細胞を再添加する。照射されたＢ細胞系はヒ）ＮＫ培養に 対するフィーダー細胞として働くことがわかっている。培養物を表現型について 毎週スクリーニングし。 典型的ＮＫ培養物だけを維持する。Ｖａｎ　ｄｅ　Ｇｒｉｅｎｄ、ら、　Ｊ、　 １ｍｍ細胞は９６ウエルマイクロタイタープレート中０．２５細胞／ウエルの限 界希釈によってクローン化される。そのクローンを２５ａｓ”フラスコに必要に 応じて広げ、それらの表現型について定期的にスクリーニングする。このプロト コルによりクローン当り１ｏｏｘｉｏ“細胞まで得られる。 リンフ才力イン生産に対するＮＫ刺激 １〜２Ｘ１０＠ＮＫ細胞／ウェルを２４ウェルコスタ−プレート中完全培地ｉ、 ｏｙにプレートする。適当な刺激を加え、その反応を３７℃で２４時間インキュ ベートする。その後、ウェルの内容物を集め遠心分離（１１００ｘｇ、　ｉＯ分 間）で細胞を除去する。上清をろ過（０，２μ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によっ て減菌し９分析まで４℃で保存する。次に示す刺激が利用される：　ＩＬ−２（ ３０ｕｎｉｔｓ／　ｗｌｌ）、Ｃｏｎ−Ａ（５ＪＪ　ｌ／　ｄ）、　ＰＨＡ（ｌ μｇ／　ｍ）、および抗原腫瘍細胞、この抗原腫瘍細胞は、腫瘍細胞に対するＮ Ｋ比は１：１であり、ポリ−１−リジンによってウェルに付着され、　０．０２ ５％グルタルアルデヒドを用いて２３℃で５分間で固定される。完全培地が単独 で自然発生的なリンフ才力イン分泌に対する対照として働く。 細胞ＤＮＡ含量および分布の流動血球計測分析実験操作後、　ＮＫ細胞のＤＮＡ 含量と分布の分析が行われる。 ＤＮＡ結合結合性染料スキスト３３３４２０μｇ／ｍｌよび０．１％Ｎｏｎ　１ ｄｅｔＰ−４０界面活性剤を含む、洗浄再懸濁したＮＫ細胞（ＰＢＳ中１×１０ ６細胞／ｄ）は、螢光活性細胞ソーター（ＦＡＣ３）を使用して分析される。こ のために、　３５１ｔ＋ｍ　Ｊ６よび３６ａｓｍで５０１を発光するようにレー ザーを調整する。螢光は、介在するいかなる光学フィルターも使用せずに検出さ れる。挟角の前方光散乱が生存細胞を同定するために使用される。Ｇｏ／、、　 Ｓ、およびＧ２＋　Ｍ集団を螢光強度に基づいて同定する。半定量的方法が細胞 周期の異なる時期における相対的細胞数を見積もるために使用される（Ｈａｒｒ ｉｓおよび５ｅｋａｌｙ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３３（１）。 ４０（１９８４）。Ｇｏ／、右よびＧ、＋−期の集団は正規分布していると考え られ、平均螢光強度をＤＮＡ分布から直接決定する。標準偏差（ＳＯ）は、各ピ ークの半値全幅を２．３５で割ることによって計算する。Ｇｏ／、集団は、Ｇｏ ／、ピークの平均螢光強度より上と下の２ＳＤ範囲内のＤＮＡ分布領域として定 義される。 Ｇ　２十Ｍ集団も同様にＧ２＋Ｍピークの２ＳＤ内の分布領域と考えられる。８ 期細胞は、Ｇｏ／　ＩとＧ２＋Ｍ領域間に分布した螢光強度を持つと定義される 。 ＮＫ放射性同位体ａ識および実験プロトコルＮＫ細胞刺激後、リン脂質代謝にお ける変化を次のように決定する。ＮＫ細胞を集め、調製した後、標識緩衝液（１ ３７ｍＭ　ＮａＣ１゜２．７ａ＋Ｍ　ＫＣＩ、　１−０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１． 、ＯｍＭ　ＣａＣｌ２．２０ｍＭ　ＨＥＰＢＳ、　２５ｍＭグルコース、１■／ ｄウシ血清アルブミン、　ｐＨ７，４）で１回洗浄する。次いで、これを標識緩 衝液中２０Ｘ１０’細胞／ｒｎｉ、で再懸濁し、　５０．！ｊｃｉ／ｉｆ　３２ Ｐ−オルトフォスフェート（Ａｍｅｒｓｈａｍ。 ２００ｓＣｉ／　ｍＭｏ１）を用い３７℃で１〜２時間前標識（ｐｒｅｌａｂｅ ｌ）して、細胞ＡＴＰブールを平衡化させる。同時に９種々のイノシトール脂質 種を同定するためのトレーサーとして２０μＣｉ／ｄ　”Ｉｆ−ミオ−イノシト ール（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　１５＋ｎＣｉ　／ｍＭｏ１）を用いて細胞をあらか じめ標識する。あらかじめ標識する時間の最後に、細胞を次の２方法のどちらか 一方で処理する。即ち、標識緩衝液で２回洗浄した後、同緩衝液中に６Ｘ１０’ 細胞／献で再懸濁させる（短期アッセイ用）か、あるいは　！２ｐ標識ＡＴＰや 追跡標識イノシトールプールの枯渇を防ぐために。 追加放射性同位体（３２Ｐおよび３Ｈ−イノシトール）を含む標識緩衝液で６Ｘ １０’細胞／ｍｊｌ！にただちに希釈する（長期アッセイ用）。反応はすべて３ ７℃、　０．５　ｍｌ（１，５ＸＩＯ’のＮＫ総量）中で実行する。短期反応は ３７℃の水浴を用いてポリプロピレン管で行う。長期反応は抗原刺激以外はポリ プロピレン管内で行う。抗原刺激においては、腫瘍細胞を１２ウェルコスタ−プ レートのポリ−１−リジン処理ウェルに付着させ、湿った３７℃Ｃ０２インキユ ベーター中でＮＫ細胞を添加する前にグルタルアルデヒドで固定させる。すべて の刺激は氷上でＮＫ全全体与えられる。反応は、短期抗原性刺激以外は、　ＮＫ 細胞を３７℃に置くことによって開始するが、短期抗原性刺激においては。 ３７℃に置く直前に接合体形成を開始させるため、　ＮＫ細胞と腫瘍細胞を、と もに４℃、　１１０００ｒｐで２分間遠心分離する。■、９５献のクロロホルム ／メタノール／ａ塩酸（１００：２００：１．　ｖ／ｖ）を添加し、ただちに試 料をポルテックスで混合することによって反応を終結させる。 ｋＤＡＧ生成を分析するために、１μＣｉ／ｍｌ’Ｈ−アラキドン酸（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ、　１３０〜２００ａ＋Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を用いて、２４時間細胞を 標識する。リン脂質分析について上述した通りに、Ｎに細胞を調製し９反応を開 始させ、終結させる。 ＩＰ分析のために、　ＮＫ細胞（２０Ｘ１０’　／ｒｄ）を１０μＣｉ／−の濃 度で１−ミオ−イノシトール（１４〜２０Ｃｉ／　ｍｍｏ　１）を含む標識緩衝 液中３７℃で４〜５時間インキュベートする。その後。 ＮＫ細胞を標識緩衝液で２回洗浄し、塩化リチウム（１抛闘）を含有する同緩衝 液（４℃）に最終濃度６０〜８０Ｘ　１０’ＮＫ細胞／ｄになるように再懸濁す る。上述のように反応を開始させ。 トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の１１．２５％溶液１−を４℃で添加することによっ て反応を終結させる。その試料はポルテックスで混合した後、４℃で２０分間保 ち、−７０℃で保存する。 （以下余白） ＮＫ脂質代謝の分析 ＮＫ脂質は、クロロホルム／メタノールで反応を終結させた反応混合物に０−６ ５１Ｒ１クロロホルムと０．６５ｄ　０−ＩＮ　ＨＣＬとをさらに添加すること によって抽出される。反応試料をポルテックスで混合した後、遠心分ｉｌｌ　（ ２０００７Ｐ１１．１０分間、４℃）シ。 有機層を集める。次に、試料を１．Ｏｄのクロロホルムで再抽出し、２つの有機 層を合併し９分析を行うまで一７０℃で保存する。その試料を窒素下３７℃で蒸 発乾固し、薄層クロマトグラフ４−　（ＴＬＣ）を行う。ＴＬＣ分析は２０ｒｍ Ｘ２０ａｉ、　０．２　ｔｔのシリカプレート　（シリカゲル６０．　Ｍｅｒｃ ｋ）を用いて行う。上記シリカプレートは使用直前に１１０°で１〜２時間あら かじめ活性化しておく。乾燥試料をクロロホルム１０μβ中に溶解させた後、　 ＴＬＣプレートに付与する。次に、各試料についてこの方法をくり返す。■試料 当り総放射能の９０％もしくは以上がＴＬＣプレートに移行する。次に、プレー トを１１０℃で１０分間再加熱した後、展開する。 次に示す１次元系の各々において脂質をＴＬＣの上昇によって分析する。系■は クロロホルム／メタノール／石油／エーテル／氷酢酸／ホウ酸（４８：　２４　 ：　３６　：　１２　：　２゜１６．　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）でなり、上昇順で 次の脂質類（ＴＬＣの上昇の順序で示す）を分離する：リゾホスファチジルコリ ン（ＬＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、 ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスフ ァチジルエタノールアミン（ＰＲ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、遊離脂肪酸類 （ＰＰＡ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）。系■は、クロロホルム／アセトン ／メタノール／氷酢酸／水（容量比４０：１５：１３：１２　：　８）でなり、 １％シュウ酸二カリウム〔メタノール／水（２：３）中〕処理したＴＬＣプレー トを利用する。系■は次の脂質類（ＴＬＣの上昇の順序で示す）を分離する：ホ スファチジルイノシトールー４．５−ビホスフエート（ＰＩＦ、）、ホスファチ ジルイノシトール−４−モノホスフェート（ＰＩＦ）、　ＰＩ＋ＳＭ、　ｐｓ＋ ｐｃ。 ＰＥおよびＰＡ、系■は、ヘキサン／ジエチルエーテル／ギ酸（９０：　６０　 ：　１２．　ｖ／ｖ／ｖ）でなり、主に次の化合物（これもＴＬＣの上昇順序で 示す）を分離するニリン脂質（起源）、モノグリセリド（ＭＧ）や　１．２−Ｄ ＡＣ，１，３−ロＡＧ、　ＦＦＡ、　ＴＧ、およびコレステロールエステル。系 ■および■については、　５０００〜５０．０００ｃｐｍ／試料（実験に依存す る）が分析のためにスポットされる。この系１よび■は、３２Ｐ標識リン脂質を 分離するために使われる（３Ｈ−イノシトールの放射能が脂質類の交差汚染（ｃ ｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を評価するために使用する）。系■は 口ＡＧ分析に使われ、そして、　’Ｈ−ＡＡ標識脂質の５　ｘ　１０’　〜Ｉ　 Ｘ　１０’ｃｐｏ＋／試料がスポットされる。脂質は、ヨウ素蒸気にさらすこと によって視覚化し２個々の脂質をこすり取り、シンチレーションバイアル中に入 れる。ポルテックスにより激しく攪拌しながら、チューブ１本あたり１０ｍ１の Ａｇｕａｓｓｕｒｅ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を添加するこ とによって、シリカから脂質を抽出する。次に、クエンチングについて補正を行 いながらシンチレーション計数によって放射能を測定する。 処理されたＣＴＬのＣｐａ＋を対照（未刺激のＣＴＬ）のＣｐｎ＋と比較するこ とによって、リン脂質分析を行う。対照の測定は各時点について行われ、データ は変化：対照として示すことができる。ＤＡＣは総脂質の％として計算され、そ して、データは。 各条件や各時点における対照に対する刺激ＣＴＬ（未刺激のＣＴＬ）の比率とし て示される。 ＮＫイノシトールホスフェートの分析 ＣＴＡ希釈された試料（分析まで一７０℃で保存する）は、４℃を超えない温度 で溶かした後、ポルテックスで混合し３０００ｒｐｔａで１０分間遠心分離する （４℃）。 コトミオイノシトールとそのリン酸化誘導体（グリセロールホスフォリルイノシ トール、　ＩＰ、　ＩＰ２．　およびＩＰ、）とを含む水性の上澄をベレットか ら分離し、ジエチルエーテル２．４献で５回抽出する。６．２５ｍＭテトラホウ 酸ナトリウムでｐＨ７，０に中和した後、その上澄をＤｏｗｅｘｌ−８，１００ 〜２００メツシユ　（ギ酸塩形、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ　Ｃｏ、 ）　１．２　献でなる陰イオン交換（１９８５）に述べられているように逐次的 に溶出する。イノシトールとグリセロールホスフォリルイノシトールとを一緒に 溶出した後、ＩＰ、　ＩＰ２およびＩＰ３を逐次的に溶出する。 タンパクリン酸化の分析 新規（ｄｅ　ｎｏｖａ）タンパクリン酸化に関するＮＫ細胞刺激の影響を次の方 法で分析する。ＮＫ細胞を示された通り調製し。 １　ｍｇ／　ＲＩ！ＢＳＡを含有する緩衝液Ｂ中で２回洗浄した後、同緩衝液中 に２０Ｘ１０”細胞／献の割合で再懸濁する。３２ｐ−オルトホスフェートを５ ０−１００μＣｉ／ｄとなるように加え、３７℃で３０〜６０分間ＮＫ細胞をあ らかじめ標識し、細胞ＡＴＰプールを平衡にする。この時間の終わりにＮＫ細胞 を処理する。短時間アッセイ（０〜３０分）の場合には、　ＮＫ細胞を２回洗浄 した後、緩衝液中に２Ｘ１０’細胞／ＩＩ！７！の割合で再懸濁する。長時間ア ッセイ（３０分〜２４時間）の場合には、洗浄することなく、緩衝液ＢでＮＫ細 胞が２Ｘ１０’細胞／ｄとなるように希釈し、追加の放射性同位体を、細胞ＡＴ Ｐプールの枯渇防止のために添加する。反応はすべてＮＫ細胞を３７℃に置くこ とによって開始する。 反応はすべて１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．ＩＭ　ＮａＦ、　０．１ｍＭ　ＰＭＳ Ｆを含有する氷冷ＰＢＳ：Ｍを添加することによって終結する。細胞をその様な 形式で２回洗浄し、細胞ペレットをＯ，ＩＭ　Ｎａｐ、　０．１　ｗＭ　ＰＭＳ Ｆ。 ５　Ｘ　１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノール、１％トリトンＸ−１００を含 有する緩衝液Ｂ１００μβ中に再懸濁する。この反応液を氷上で３０分間インキ コベートした後　４℃で１０分間２４００Ｘｇで遠心分離し、不溶性の核ペレッ トを除去する。その上澄は。 界面活性剤可溶の血漿膜／細胞質タンパクの起源として使用する。核ベレットと 会合したタンパクを４００ｍＭ　ＮａＣ１，５Ｘｌ０−５Ｍ２−メルカプトエタ ノール、２ｍＭ　ｕｇｃｌ、、　０．１Ｍ　ＰＭＳＦ、　Ｏ−ＩＭＮａｐ、　２ ｂＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５を用いて氷上で３０分間処理することによって 抽出する。そのペレットを再び遠心分離し、上澄を集めて分析する。 Ａｃｃｏｌｌａ、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５７．１０５３　（１９８３）に よって述べらエフェクター細胞免疫沈降物由来）を乾燥５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルか ら切り取り、　ＰＯＳ中の０．１％ＳＯＳの中で溶出する。溶出物質を２抛關ジ チオトレイトールで６０分間還元し、そして６（ｂｏＭ：？　−）’アセトアミ ドで３０分間アルキル化する。ペプシンを用いてギ酸／酢酸／水（１：　４　： 　４５（ｖ／ｖ））　１００μＩｔ中でペプシン消化を行う。このペプシン消化 は、３７℃で１６時間、ウシ血清アルブミンキャリア（１：５０；酵素／タンパ ク比）存在下で行われる。シリカゲルプレート上で２次元ペプチドマツピングを 行う。第１の次元で電気泳動を行い１次いで第２の次元（直角方向）でクロマト グラフィーを行う。その際の溶媒はｎ−ブタノール／酢酸／水／ピリジン７５　 ：　１５　：　４０　：　５０（ｖ／ｖ）である。 細胞（ｍ的またはエフェクター細胞）の変異誘発はＫａｖａｔｈａｓら、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｊＵＳＡ　７７．４２５１　（１９８０ ）によって示されたように行う。５Ｘ１０’細胞を２０〜３００ラドで照射し。 洗浄後、完全培地中ｌＸｌ０’細胞／−で培養する。１週間後。 抗標的細胞および抗エフェクター細胞ｍＡｂのいずれか、および補体の飽和投与 量を添加することによって免疫的な選択が行われる。ｍＡｂと補体との添加を１ 力月間毎週くり返す。免疫的選択により生き残った細胞（細胞損失変異体）を必 要に応じて限界希釈法によりクローン化する。 表１．ナチュラルキラー細胞膜抗原およびこれらの決定基を検出し得るｍＡｂ ＣＤ２　（Ｌｅｕ−５ｂ）　Ｔ細胞、　ＮＫ細胞ＣＤ７　（Ｌｅｕ−９）　Ｔ細 胞、　ＮＫ細胞ＣＤ８　（Ｌｅｕ−２）　Ｔ細胞、　ＮＫ細胞ＣＤＩＩ　（Ｌｅ ｕ−１５）　Ｔ細胞、　ＮＫ細胞、単球およびマクロファージ上のＣ３ｂ　ｉレ セプターＣＤ１６　（１，ｅｕ−１１ａ）　ＮＫ細胞およびＰＭＮ’　Ｓ上のＦ Ｃ（Ｔ）レセプター Ｌｅｕ７　ＬＧＬ’Ｓ　Ｊ３よびＮＫ細胞上のＨＮＫ−１Ｌｅｕ１９　ＮＫ細胞 およびＴ細胞上のＨＮＫ−１決定基（２２０ｋＤ） “ｌ　０ＫＴ８　Ｔ細胞障害性／サプレッサー細胞およびＬＧＬ ＯにＴＩＯＬＧＬ、初期胸腺抗原 ３ＡＩ　Ｔ細胞およびＬＧＬ ５Ａ１２　Ｔ細胞およびＬＧＬ Ｌｙｔ３　Ｔ細胞およびＬＧＬ ＯＫＴ５　Ｔ細胞障害性／サプレッサーおよびＬＧＬＩａ　活性化Ｔ細胞 ”０ＫＴ８．０にＴ５およびＩａを表現する細胞は非溶解性ＬＧＬ’　ｓである 。 表２．　ＮＣ−３７標的細胞を用いたＮＣＣ接合体形成における１ｌｌＡｂ処理 の影響 モノクローナル　％　抑　制 培地′″　０　Ｏ ＮＭＳ　’　（１：２００）　０　０ ５Ｃ６，１０，４７５μｇｍ　４７．２８”　５２．８７”５Ｃ６，１０，４１ ５０μｇｍ　８２．４０”　８４．１８”６０３．２．１０　７５ｕ　ｇｍ　４ ６．２０”　４８．５０”６０３−２．１０　１５０μｇｍ　８０．２２”　８ １．１５”２Ｂ２．４．９　７５ａｇｔｒｒ　２０．８７　１１．８０２Ｂ２． ４．９　１５０μｇｍ　８．８０　５．７３６０３．４．４　７５μｇｍ　３． ２７　７．１０６Ｄ３．４．４　１５０μｇ＋＋　２３．１０　２２．２０５Ｃ ６，１０，４’　１５０．ｕ　ｇａ＋　７８．０５”　８１．８２”ａ培地対照 には、カウントされた３００非標的細胞のうちＮＣ−３７標的に結合した３４． ６細胞が含まれていた。８０：ｌの比率において、対照培地は　５１（’、遊離 アッセイによれば３８％の細胞障害性を有していた。 ｂ　ＮＭＳの１：２００の希釈により、カウントされた３００非標的細胞のうち のＮＣ−３７接合体当り３０．３細胞が生産された。８ＭＳ対照は８０：ｌのＥ ：Ｔ比において、２９．７％細胞障害性を有していた。 ＣすべでのｍＡｂは、材料および方法の節で述べたように免疫アフィニティーク ロマトグラフィーで精製した。接合体アッセイの間に−Ａｂが存在した。モノク ローナル抗体は、７５μｇ／ｌ、５Ｘ１０″細胞または１５０　μｇ／ｌ、５　 ｘｌＯ’細胞のいずれか一方で使用した。 ｄ陽性の対照は硫酸アンモニウム精製されてｍＡｂからなっていた（たとえば、 免疫アフィニティークロマトグラフィーにかけられていない）。 本発明の次のものの修飾および改変は、前述の本発明の詳細な説明から当業者に 自明である。つまり、標的細胞を認めて機能する哺乳類および魚類起源のナチュ ラルキラー細胞の表面に共通の二量体タンパク、ナチュラルキラーレセプターに よって認められる細胞表面上の抗原、レセプターおよび標的細胞タンパクに対す るｍＡｂ　、およびナチュラルキラー細胞および標的細胞間の相互作用を変化さ せる方法の修飾および改変は上述の説明から当業者に自明である。そのような修 飾および改変は、添付の請求の範囲内に包含される。 ＦＩＧＵＲＥ　７ エ７Ｔ−７７−多田＆ｖ　ｎｈ’ｔｋｎｕ巳のしらＦＩＧＵＲＥ３ エフｃ７７−キｑすｚ：　１らり癲屹形手続補正書（自発） 平成２年４月１６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類および魚類起源のナチュラルキラー細胞の表面に，分子量が約３８， ０００〜４３，０００の二量体として見出される，レセプター抗原に対する抗体 。 ２．請求項１に記載の抗体であって，前記レセプターは，ナチュラルキラー細胞 によって溶解しやすい標的細胞の表面の抗原を認識する。 ３．請求項２に記載の抗体であって，前記抗体は，ミエローマ細胞と，魚類の非 特異的細胞障害性細胞で免疫化された動物由来の脾臓細胞とを融合させることに よって生産されたハイブリドーマ由来の抗体である。 ４．請求項３に記載の抗体であって，該抗体は，５Ｃ６．１０．４，６Ｄ３．２ ．１０，２Ｂ２．４．９，および６Ｄ３．４．４でなる群から選択されるハイブ リドーマによって産生される。 ５．請求項４に記載の抗体であって，該抗体は，ＡＴＣＣに，ＡＴＣＣＮＱＨＢ ９５７２として寄託されているハイブリドーマにより生産される。 ６．請求項４に記載の抗体であって，該抗体は，ＡＴＣＣに，ＡＴＣＣＮＱＨＢ ９５７３として寄託されているハイブリドーマにより産生される。 ７．請求項１に記載の抗体であって，該抗体は，ミエローマ細胞と，魚類の非特 異的細胞障害性細胞で免疫化した動物由来の脾臓細胞とを融合させることによっ て生産されたハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いて，抗原抗体法で 単離した精製抗原で動物を免疫化することにより産生される。 ８．ナチュラルキラー細胞によって溶解しやすく，哺乳類もしくは魚類起源の細 胞の表面に見い出される抗原に対する，抗体であって；該抗原は，分子量が約３ ８，０００〜４３，０００の二量体である。 ９．請求項８に記載の抗体であって，前記抗原は，ナチュラルキラー細胞表面の レセプター分子によって認識される。 １０．請求項８に記載の抗体であって，該抗体は，ミエローマ細胞と，ヒトＢリ ンパ腫細胞系ＮＣ−３７により免疫化された動物由来の脾臓細胞とを融合させる ことによって生産されたハイブリドーマ由来である。 １１１．請求項１０に記載の抗体であって，該抗体は，１８Ｃ２．８．３，１Ｅ ７，７Ｃ６．５．４および１Ｄ４でなる群から選択されるハイブリドーマにより 産生される。 １２．請求項１１に記載の抗体であって，該抗体は，ＡＴＣＣに，ＡＴＣＣＮＱ ＨＢ９５７１の受託番号で寄託されているハイブリドーマにより産生される。 １３．請求項１１に記載の抗体であって，該抗体は，ＡＴＣＣに，ＡＴＣＣＮＱ ＨＢ９５７４の受託番号で寄託されているハイブリドーマにより産生される。 １４．請求項８に記載の抗体であって，該抗体は，ミエローマ細胞と，ヒトＢリ ンパ腫細胞系ＮＣ−３７で免疫化された動物由来の脾臓細胞とを融合することに よって生産されたハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いて，抗原抗体 法で単離された精製抗原により動物を免疫化することによって産生される。 １５．哺乳類または魚類起源のナチュラルキラー細胞により標的細胞の溶解を変 化させる方法であって，該方法は，哺乳類および魚類起源のナチュラルキラー細 胞の表面に分子量が約３８，０００〜４３，０００の二量体として見出される抗 原に対する抗体を提供することを包含する。 １６．請求項１５に記載の方法であって，該抗体は，ナチュラルキラー細胞によ り溶解しやすい標的細胞表面の抗原を認識するレセプターに対する抗体である。 １７．請求項１５に記載の方法であって，該前記抗体は，ミエローマ細胞と，魚 類の非特異的細胞障害性細胞で免疫化された動物由来の脾臓細胞とを融合させる ことによって生産されたハイブリドーマ由来の抗体である。 １８．請求項１７に記載の方法であって，５Ｃ６．１０．４，６Ｄ３．２．１０ ，２Ｂ２，４．９，および６Ｄ３．４．４でなる群から選択されるハイブリドー マによって産生される。 １９．請求項１４に記載の方法であって，前記溶解は抗体の添加によって阻害さ れる。 ２０．哺乳類，もしくは魚類起源のナチュラルキラー細胞による標的細胞の溶解 を変化させる方法であって，該方法は，ナチュラルキラー細胞によって溶解しや すい哺乳類もしくは魚類起源の細胞表面に見い出される抗原に対する抗体を提供 することを包含し，該抗原は，分子量が約３８，０００〜４３，０００の二量体 である。 ２１．請求項２０に記載の方法であって，前記抗体は，ナチュラルキラー細胞の 表面上のレセプター分子によって認識される抗原に対する抗体である。 ２２．請求項２０に記載の方法であって，前記抗体は，ミエローマ細胞と，ヒト Ｂリンパ腫細胞系ＨＣ−３７により免疫化された動物由来の脾臓細胞とを融合さ せることによって生産されたハイブリドーマ由来である。 ２３．請求項２２に記載の方法であって，前記抗体は，１８Ｃ２．８．３，１Ｅ ７，７Ｃ６．５．４および１Ｄ４でなる群から選択されるハイブリドーマにより 産生する。 ２４．請求項２０に記載の方法であって，前記標的細胞の溶解は，抗体の添加に よって促進される。 ２５．請求項２０の方法であって，前記標的細胞の溶解は，抗体の添加によって 阻害される。 ２６．哺乳類もしくは魚類起源のナチュラルキラー細胞によって溶解した標的細 胞のアッセイ方法であって，該方法は，ナチュラルキラー細胞によって溶解しや すい哺乳類もしくは魚類起源の細胞表面に見い出される抗原に対する抗体を提供 することを包含し，該抗原は，分子量が約３８，０００〜４３，０００の二量体 である。 ２７．ナチュラルキラー細胞又は非特異的細胞障害性細胞のアッセイ方法であっ て，該方法は，哺乳類および魚類起源のナチュラルキラー細胞の表面に分子量が 約３８，０００〜４３，０００の二量体として見出される抗原に対する抗体を提 供することを包含する。 ２８．ナチュラルキラー細胞もしくは非特異的細胞障害性細胞に生物学的に活性 な試薬を送達する方法であって；該方法は，哺乳類および魚類起源のナチュラル キラー細胞の表面に約３８，０００〜４３，０００の分子量を有する二量体とし て見い出される抗原に対する抗体を，生物学的に活性な試薬と組合わせて与える こと，および該ナチュラルキラー細胞もしくは非特異的細胞障害性細胞を，該抗 体にさらすことを包含する。 ２９．ナチュラルキラー細胞および非特異的細胞障害性細胞によって認識される 細胞に，生物学的に活性な試薬を送達する方法であって；該方法は，ナチュラル キラー細胞によって７７８溶解しやすい哺乳類もしくは魚類起源の細胞表面に見 い出される抗原に対する抗体を提供することを包含し，該抗原は，分子量が約３ ８，０００〜４３，０００の二量体である。