JPH04501353A - Ｒｎａ及びｄｎａ増幅法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ＲＮＡ及びＤＮＡ増幅法 １、光盟少分野 本発明は、ＲＮＡ及び一本一又は二本−ＭＤＮＡ断片の増幅方法に関する。

２、豊考文献 カサラ（Ｃａｔｈａｌａ）、　Ｇ、、等、旦Ｎ人（１９８３）２（４）　：３２ ９゜ジャクソン、　Ｄ、Ａ、、等＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ １９７２）６２　：　２９０４゜ ロバン（Ｌｏｂｂａｎ）、　Ｐ、Ｅ、を等、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９７３ ）７８　：４５３゜ トスプリングハーバ−研究所（１９８２）。

第２８０頁。

ネルソン、Ｔ１等、醒素学凶方法、アカデミツクプレス、　ＮＹ（１９７９）６ ８　：　４１−５０゜ロイコウドフリー（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）、　Ｒ， Ｅ、＋等。

挟敢」競（１９７６）　３　：　１０１゜トンプソン、Ｊ、９等、八ｎａｌ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ（１９８７）３０３：３３４゜３、発■９宜量 ＲＮＡ又はＤＮＡ断片を、適当なりローニングベクターに組込むＲＮＡ及びＤＮ Ａクローニング法は、特定のクローン化された配列の同定に及びクローン化され た断片の発現に広く使用されている。典型的なりローユング法でＲＮＡ全体を選 択起源、たとえば体液、細胞、又は組織起源から抽出し、次いで主にメツセンジ ャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を示すポリＡＲＮＡ分画をコピーして、二本鎖ｃＤＮ Ａ断片を産出する０次いでｃＤＮＡ断片を、制限部位リンカ−で連結し、クロー ニングための制限一部位末端を適するクローニングベクター中の選択部位に供給 する。

その断片から作成された断片ライブラリーを、特定のプローブへのハイブリダゼ ーションに、及び／又は特定の暗号化されたたん白又はペプチドの製造に使用で きる。

上記方法は多くの印象的な成功を生じたが、にもかかわらすい（つかの限界を有 する。第一に、原料の量が極めて小さい、たとえば１０３−１０’　ＩＩＩ胞で あるので、抽出ＲＮＡ及び結果として生じるｃ　ＤＮＡは、適当な、すなわち典 型的な数のクローン化配列を有するライブラリーを生じるには小さすぎる。第二 に、二重断片は、夫々の末端で同一リンカ−を有するので、クローニングベクタ ー中での指向性クローニングを妨げる。最後に大きいパーセンテージのＲＮＡ種 は部分的にしかコピーされず、したがって多くのライブラリークローンは５“− 末端コード領域を欠落する。

他の生化学遺伝子法があり、これは入手できる核酸材料の量によっても限定され る。たとえばしばし特表千４−５０１３５３　（３） ば２つの関連する起源によって産生されたＲＮＡ種を比較し、ある起源又は他の 起源に特有である種の同定を行うことが重要である。特有な種が、全材料の極め て小さい分画としてしか存在しないので、出発材料の比較的多量は、重要な特有 の配列を単離する必要がとする。

同様に、特有の材料が、極めて低い濃度で重要な疾病試剤を含有すると疑わしい 場合、重要な配列の存在を、通常のクローニング又はプローブハイブリダイゼー ション法によって検出することができない。

最近、反復鎖−複製による二重ＤＮＡ断片の増幅法は、記載されている（米国特 許第４．６８３．１９４号及び第４，６８３．２０２号明細書）、一般にポリメ ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法として示されるこの方法は、２つの異なる一配列域に 相同する２つのプライマーを用いて、２つの断片鎖中に異なる公知の配列を含有 する断片を選択的に増幅する。当然、上記ＰＣＲ法は、２つの異なる配列−特定 プローブが存在する特定断片を増幅するのに適する。しかし、記載された方法は 、異なる配列を含有する断片混合物中で断片を非特異的に増幅するということを 問題にする意図もないし、問題として取り上げることができない。

４、光皿（２）！約 したがって本発明の全体的な目的は、核酸増幅法を提供することであり、その方 法は上述の様な生化学的遺伝子法で低量の材料と関係がある多くの問題及び限界 を克服することである。

１つの重要な目的は、非−特異的に、すなわち断片配列に関係なくＲＮＡ又はＤ ＮＡ断片を非−特異的に増幅する、簡単な、敏速な方法を提供することである。

本発明のより一層特別な目的は、ＲＮＡ、たとえば１０３細胞だけから得られた ＲＮＡの少量から満足すべきライブラリークローン作成をさせる様な方法を提供 することである。

本発明は、ＲＮＡ又はＤＮＡ断片の混合物を非−特異的に増幅しようとするもの である。断片を使用して、共通の５゛−末端配列、主としてホモポリマー配列を 有する意味のない鎖を作成し、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ Ｔ　ｄ　Ｔ）及び選択されたデオキシヌクレオジドトリホスファート（ｄＮＴＰ ）で処理し、ホモポリマー配列を３′意味のない鎖断片末端に加える。意味のな い鎖を、鎖中で３°−末端に相同するホモポリマー結合配列を有するホモポリマ ープライマー、５゛−末端共通−配列の補体に相同する共通〜配列プライマー、 ＤＮＡポリメラーゼ及びすべての４つのｄＮＴＰｓと混合する。

断片を変性し、断片へのプライマー組込みの条件下に再生し、次いで前もって情 報が与えられた断片（Ｐｒｉｚｅｄ）を二本−鎖断片に変える条件下で反応させ る。変性、再生、及び反応工程を、断片増幅の所望の度合が達成されるまで反復 する。

１つの一般的観点から、この方法は、選択された細胞又は組織源から得られた遺 伝子性断片の様な二重ＤＮＡ断片を、増幅するのに使用される。増幅される断片 は比較的短い、すなわち約３−８キロ塩基より小さい場合、ＴｄＴによる処理は 、同一のホモポリマー配列を意味のある−及び意味のない鎖両方の３゛−末端に 加える。５′−共通−配列末端を、３′ホモポリマー配列に相同する相補的ホモ ポリマーを連結することによって作成する。添加されたホモポリマーは、ホモポ リマー及び共通−配列プライマーとして役立つことができ、すなわち増幅を、１ つのホモポリマープライマーによって実施することができる。

増幅される二重ＤＮＡ断片が約３−８キロ塩基より大きい場合、“意味のない” 鎖を（ａ）二重ＤＮＡ断片を変性し、（ｂ）（ｉ）意味のある鎖の相補的配列に 結合するのに有効な３′ランダム配列、及び（ｉｆ）共通５゛配列を有するラン ダムプライマーを加え、次いで（Ｃ，）ブライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）状態で 、前もって情報が与えられた鎖とＤＮＡポリメラーゼ及びすべて４つのｄＮＴＰ ｓを、意味のある鎖のコピーを生じる条件下に反応させることによって製造する 。

もう１つの基体的観点から、増幅された意味のない鎖は、ＲＮＡ種の混合物の逆 転写によっし生じる第−鎖ｃＤＮＡ断片である。ポリＡ　ＲＮＡ種の場合、意味 のないｃＤＮＡ鎖を、（ａ）オリゴｄＴプライマーをポリＡ　ＲＮＡ種に加え、 次いで（ｂ）ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー、逆転写酵素、及びすべて４つのｄ ＮＴＰｓの存在下に転写することによって作成する。共通ポリｄＴ配列をその５ °末端で有する、生じるｃＤＮＡ断片を、ターミナルデオキシヌクレオチドトラ ンスフェラーゼで処理し、同−又は異なるホモポリマー域を３’ｃＤＮＡ末端に 組込む。

ＲＮＡ増幅法は、長さが約３−８キロ塩基より大きいＲＮＡ種から導かれるｃＤ ＮＡ二重断片にも適切である。この際意味のない鎖は、（ａ）ＲＮＡ種を単離し 、（ｂ）　（ｉ）　ＲＮ　Ａ種の相補的配列に結合するのに有効な３゛ランダム 配、及び（ｉｆ）共通５゛配列を有するランダムプライマーを加え、次いで（Ｃ ）、プライミング状態で、前もって情報が与えられたＲＮＡ種とポリメラーゼ及 びすべて４つのｄＮＴＰｓとを、第−鎖ｃＤＮＡ合成を生じる条件下に反応させ ることによって製造する。

生じるｃＤＮＡ断片を、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼで 処理し、所望のホモポリマーを３’ｃＤＮＡ末端に組込む、上述の様に、意味の ない鎖は、同−又は異なるホモポリマー域を特表平４−５０１３５３　（４） その反対の末端に有する。

この方法は、ｃＤＮＡ断片組込みをクローニングベクター中で指向的に配向する ｃＤＮＡライブラリーを作成するのに使用する。この際ホモポリマー及び共通− 配列プライマーは、異なる５゛−末端配列を選択された指向性クローニング部位 に対応してベクター中に有する。増幅された断片を対応する制限エンドヌクレア ーゼで分解し、標準法によってベクター中に組込む。

断片の３′−末端しか末端プライミング配列を備えない二重ＤＮＡ断片に関する 変形増幅法も記載する。

本発明のこれらの及び他の目的及び様相は、次の本発明の詳細な説明を添付の図 面と併せて読んだ場合に、より一層十分に分る。

凹皿■円車久脱咀 第１図（Ｆｉｇ、１）は、ポリＡ　ＲＮＡのオリゴｄＴブライミングによって生 じるｃＤＮＡを増幅する方法のフローシートである； 第２図（Ｆｉｇ、２）は、断片増幅が同一配列プライマーを用いて実施される第 １図の方法の変法を示す；第３図（Ｆｉｇ、３）は、ポリＡ　ＲＮＡのランダム プライミングによって生じるｃＤＮＡを増幅する方法のフローシートである； 第４図（Ｆｉｇ、４）は、第３図中に示した方法に似た方法のフローシートであ るが、そこでは第−鎖ｃＤＮＡはランダムプライマーによって前もって情報が与 えられる； 第５Ａ図（Ｆｉｇ、５Ａ）は、本発明の１つの実施態様に従って二重ＤＮＡ断片 を増幅する方法のフローシートである； 第５Ｂ図（Ｐｉｇ、５Ｂ）は、第５Ｂ図の方法の変法である； 第６図（Ｆｉｇ、６）は、本発明のもう１つの実施態様に従って二重ＤＮＡ断片 を増幅する方法のフローラ・−トである； 第７図（Ｐｉｇ、７）は、１０３（レーン２）、１０４（レーン３）及び、及び １０Ｓ（レーン４）細胞から本来得られる材料の量に対応する、臭化エチジウム −染色され、増殖された二重断片のゲルを示す； 第８図（Ｆｉｇ、８）は、ヒト−インターロイキン−２遺伝子から作成された放 射標識されたプローブでハイブリダイズされた、第７図からのゲルレーン２−４ 中の二重断片サザン・プロットを示す；第９　図（Ｆｉｇ、９）は、１つのプラ イマー末端増幅法によって増幅されたｐｈｉχ１７４二重ＤＮＡ断片のオートラ ジオグラフである；及び 第１０図（Ｆｉｇ、１０）は、２つの細胞源のうちの１つに特有のＲＮＡ種を同 定する、本発明の方法の適用法を示す。

見所□□□庄桓久脱曹 ■・凪旦Ｎへ種血壇損 本発明の方法は、一本一鎖ＲＮＡ種、主としてメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮ Ａ）種、を増幅するのに有用である０組織、細胞又は体−液体サンプルからｍＲ ＮＡ種を単離する方法はよく知られている。

１つの方法はバナジル−ＲＮＡ錯体の作成、クロロホルム／フェノールでたん白 質の抽出、及び冷エタノールでの沈殿を伴う、第二の方法で、ＲＮＡをグアニジ ウムイソチオシアナート混合物からフェノールで抽出し、次いでクロロホルム： イソアミルアルコールで抽出し、次いで水性相から冷エタノールでＲＮＡを沈殿 させる。マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、第１８８−１９８頁に及びそこに詳 細に引用された文献を参照されたい。１つの好ましいＲＮＡ単離法はカサラ（Ｃ ａｔｈａｌａ）に記載されている。

はとんどの真核ｍＲＮＡ５は、３°タ一ミナルポリＡ配列によって特徴づけられ る。この配列は固形担体に結合されたオリゴｄＴを用いてアフィニティクロマト グラフィーによって単離される。更に、あるいは単離されたＤＮＡ全体を、密度 勾配遠心分離、又はアガロースゲル電気泳動によってより一層分画することがで き、ＲＮＡ種の所望のサイズ分画が得この方法の実施態様で、ポリＡ　ｍＲＮＡ 種を使用し、オリゴｄＴ５’−末端共通配列及びホモポリマー３゛−末端配列を 有する第−鎖意味のないｃ　ＤＮＡ鎖を生じる。この方法は、３゛ポリＡ域を有 する、及び好ましくは約３−８キロ塩基より小さいサイズを有するＲＮＡ種を増 幅するのに適する。一方の実施態様で、断片増幅反応を異なる一配列プライマー の存在下で実施し、指向性クローニング末端を有する増幅された断片を製造させ る。もう一方の実施態様で、増幅は同一配列プライマー、すなわち唯一のプライ マーを使用する。

１、　なる−配ダ１プライミング 方法の第一段階として、ポリＡ−含有ＲＮＡ　（ポリＡ　ＲＮＡ）種を逆転写に よってコピーし、対応する第−鎖意味のないｃＤＮＡＩを作成する。第一コピー 合成を、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素及び４つのデオキシヌクレオ シドトリホスファターゼ（ｄＮＴＰｓ）の存在下に実施するのが好都合である。

第１図で明らかな様に、作成された意味のないｃＤＮＡ鎖は、５゛−末端ポリｄ Ｔ域を有する。二重断片混合物を処理し、オリゴｄＴプライマー及びｄＮＴＰｓ を、たとえば１又は数種のフェノール又は酢酸アンモニウム沈殿工程、及びゲル 濾過によって除去する。

プライマー及びｄＮＴＰＳの除去の後、ＲＮＡＩの分解の前又はその後のどちら かに生じるｃＤＮＡ特表平４−５０１３５３　（５） 断片をターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｔ　ｄ　Ｔ）と選 択されたｄＮＴＰの存在下に３°ｃＤＮＡ末端でホモポリマー域を作成する。第 １図に示された実施態様中で、指向性クローニング増幅に関して、ホモポリマー はポリｄＧ又はポリｄＣが好ましく、そしてホモポリマーティリング反応は、Ｒ ＮＡ／ｃＤＮＡ二重断片で行われる。ホモポリマーティリングに関する方法は、 報告されている（ジャクソン；ロブパン；ネルソン）、ＲＮＡ鎖が存在する場合 、反応の効率を５゛エキソヌクレアーゼで最初の分解によって３゛断片末端をさ らすか又は反応をコバルトイオンの存在下に実施することによって増加すること ができる（ロイコウドフリー（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）　＊ 反応を、少なくとも約１０及び好ましくは１５又はそれ以上の塩基が３゛断片末 端にある条件下で実施する。

ポリｄＧティリングを生じる、例１に記載された反応は、典型的なものである。

ティリング反応を、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ断片を用いて行う場合、次に二重断片をＲ Ｎａｓｅで分解し、意味のある一層ＲＮＡを除去し、ポリＡプライマーから導か れた５゛−末端オリゴｄＴ域、及びホモポリマーチイル、たとえばｄＧを含有す る一本鎖意味のない鎖ｃＤＮＡｓを３゜断片末端に生じる。ＲＮａｓｅ　、Ｔｄ Ｔ及び選択されたｄＮＴＰを、たとえばｃＤＮＡ断片沈殿によって除去する。

ＴｄＴによるホモポリマーティリングは、−末鎖及び二本鎖材料両方によって有 効であるので、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重断片中のＲＮＡ鎖を、ホモポリマーティリ ングの前にＲＮａｓｅ分解によって除去することができる。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ 断片に適用されるホモポリマーティリングの１の利点は、ティリング法が完全な コピーｃＤＮＡ断片を選択することである。二重断片とのターミナルトランスフ ェラーゼ反応は、ｃＤＮＡの３゛−末端が実質上隣接するか又はＲＮＡ鎖の５“ 末端よりも長いことを要求するためである。かくして、部分的にコピーされたｃ ＤＮＡは、ＲＮＡ１ｉを下方に取付け、そして効率的に尾をつけない。結果とし て鎖は増幅されない。

増幅に関して、上述の意味のないｃＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３１−末端ホモポリ マーチイルと相同するホモポリマープライマーと混合する。ここで使用される様 に、　“相同”なる言葉は、プライマーが使用される再生条件下で塩基一対の特 定な組込みによって、ＤＮＡ鎖の３′ホモポリマー域に前もって情報を与えるの に有効であることを意味する。概して、配列一致での変化は特により一層長いプ ライマー配列に関して可能であるが、プライマー配列はプライマー鎖環の正確な 補体である。第１図中に示された実施態様で、そこではホモポリマーはポリｄＧ であるが、ホモポリマープライマーは、好ましくは−続きの少なくとも約１５− ２０　ｄＣ塩基を含有する相同ポリｄＧ域を有する０図中のホモポリマー域は、 一般に実際に示されているよりも大きいホモポリマーサブユニットを含有するこ とが注目される。

増幅がクローニングに対する断片を生じる場合、ホモポリマープライマーは、好 ましくはその５゛末端で第１図中でＲＥ−１として示される、選択された制限エ ンドヌクレアーゼ部位の配列を含む。この部位は、付加的な５゛−末端塩基、た とえばｄＧ塩基の対によって保護される。

ホモポリマープライマーを用いる意味のない鎖の最初の複製は、相補的意味のあ る鎖を生じ、その３゛末端で、作成された共通配列の補体であることが分る。第 １図中、たとえば共通配列がポリｄＴである場合、この域に対する補体は、意味 のある断片の３゛末端でポリｄＡである。更に、増幅混合物は、共通−配列域に 対する補体に相同する配列を有する共通−配列プライマーを含む。共通−配列プ ライマーは、第１図の例に於てポリｄＴ域を含む、プライマーを、指向性クロー ニングに使用する場合、このプライマーはまたＲＥ−１と異なる、第二の選択さ れた制限部位ＲＥ−２に相当する５−末端配列を含む、上述の様に、このＲＥ− ２配列は、添加された５゛末端たとえばｄＧｓ対によって保護されるのが好まし い。

選択された配列を有する、合成−末鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、市場で入 手できる、オートメーション製造されたオリゴヌクレオチド合成剤を用いて製造 することができる。すなわちオーダーメイドの合成オリゴヌクレオチドを、たと えばジンテチフク　ジエネチソクス社（サン　ジエゴ、カルフォルニア）から購 入することができる。

５°Ｘｂａ　Ｉ部位を有する典型的なホモポリマープライマー及び５”Ｘｈｏ　 １部位を有する共通−配列プライマーを、夫々以下にＡ及びＢで示す： 上述の意味のないｃＤＮＡ鎖を、次の工程に従って反復断片複製によって増幅す る。先ず、断片を、好ましくは加熱によって変性し、次いでモル過剰の、上記ホ モポリマープライマー及び共通−配列プライマーと混合する。上述の様に、プラ イマー配列及び長さは、意味のある及び意味のない鎖の３′−末端ホモポリマー 域へのプライマー組込みを可能にするほどであり、ＤＮＡポリメラーゼプライミ ングに十分である。他の要求は、プライマーが変性断片鎖のす特表千４−５０１ ３５３　（６） ンカー域に組込まれる場合、プライマーはポリメラーゼ−触媒された鎖複製をプ ライミングすることができる；すなわちプライマーの内部末端は遊離の３′−Ｏ Ｈを与えることである。

次いで変性断片を、好ましくは、たとえば約３７−６０℃の間に冷却して再生し 、意味のないｃＤＮＡ断片へのホモポリマープライマー組込を可能にする。

第二鎖情報が与えられた複製を触媒することができる４つのｄＮＴＰｓ及びＤＮ Ａポリメラーゼを加え、反応混合物を酵素による鎖複製に適する温度となす。

下記の例１に示される方法で、ｄＮＴＰｓ及びＤＮＡポリメラーゼを、断片変性 前に添加する、加熱変性の後に、混合物を５０℃で２時間再生し、次いで前もっ て情報が与えられた、第二鎖複製のために５−１２分間７２℃となす。使用され るＤＮＡポリメラーゼは、サームスアクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ　ｕａｔ ｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ）であり、こ れは短時間で９５℃まで比較的に熱−安定である。

上述から、及び第１図から、ホモポリマー及び共通−配列プライマーは、夫々の ＤＮＡ鎖中で３゛−末端ホモポリマー域に前もって情報を与えるのに有効であり 、そしてかくして断片数の倍加は、夫々の複製で生じることが分る。断片変性、 第二鎖−プライマー錯体を作成するためのプライマー組込みをさせる再生、及び ＤＮＡポリメラーゼの存在下にその錯体の第二鎖複製を伴う、上記複製処理は、 断片の所望の濃度が得られるまでくり返す。熱−安定なＺｌポリメラーゼを使用 する上記例に於て、複製段階を、断片混合物を変性温度（断片のＴ＋ｍ以上）に 加熱し、しばらく冷して、断片／プライマー錯体を作成させ、次いで第二鎖合成 に十分な時間培養することによって実施する０重合のための培養時間をより長い 断片、たとえば長さ８キロ塩基までの断片のために約１時間半まで延ばすことが できる。

断片の濃度は、複製の夫々のラウンドで倍加するので、１０３倍の増幅は約１０ ラウンドの複製で、そして１０６倍の増幅は約２０ラウンドの複製で達成するこ とができる。かくてＲＮＡ種の最初のピコグラム量は、約２０ラウンドの複製の 後にマイクログラム量の断片材料を生じる。

ＤＮＡ増幅処理に続いて、断片をポリメラーゼ及びポリヌクレオチド成分から、 主としてフェノール抽出によって分離する。

例１は、ヒト末梢血液子細胞から単離されたボエＡ　ＲＮＡ種の混合物に増幅法 の適用を示す。第７図中にゲル模様で表わした様に、この方法は１０”−１０’ 細胞だけから単離されたＲＮＡから二重ＤＮＡの検知量を生じるのに有効である 。

第１図の下方の部分は、いかに増幅された断片が適するクローニングベクターに 、指向的にクローン化されるかを示す。その処理を例１中に記載する。

例１中に示されるＲＥ−１及びＲＥ−２は、夫々まれな断片−末端制限部位Ｘｂ ａｌ及びＸｈｏｌである。増幅の後、断片を、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで分解し、 特有のＸｂａｌ及びＸｈｏＩ部位を有するブルースクプトベクターに組込む。連 結及び満足のいく組換えの選択は好都合である。

指向性クローニングに対する好ましいベクターは、増幅されたＲＮＡの５”末端 に相当する組込み部位の近くにＲＮＡポリメラーゼプロモータ一部位を有する。

このベクターを、プロモーターと逆の断片組込み末端の制限部位で切断し、次い ですべて４つのｄＮＴＰｓの存在下にＲＮＡポリメラーゼで処理した場合、この 系はたん白質製造に関する宿主によって使用することができるＲＮＡ鎖を転写す る。増幅法でのプライマー制限配列を、ベクターへの組込みがポリメラーゼプロ モーターの近くの二重ｃ　ＤＮＡ中で意味のない鎖の５′末端にある様に選択し なければならないことが分る。すなわち、クローニングベクターが、２つの組込 み部位でポリメラーゼプロモーターによって提供され、意味のある一鎖転写を生 じる断片末端で組換えベクターを切断することによって意味のある一鎖転写が認 められる。

２−　−　ｅｆ、　＋１’ｙ４　ａ　７７’第２図中に示した他の一般的な実施 態様で、オリゴｄＴブライミングによって作成された意味のないｃＤＮＡ鎖を、 ３゛−末端ボリｄ、Ａホモポリマー配列を含むために処理する。最初の鎖ＣＤＮ Ａ合成のたのオリゴｄＴブライミングを含んだ第一段階は、第１図中に示した方 法に従う、逆転写酵素及び４つのｄＮＴＰｓの除去後、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ断片を 上記条件下でＴｄＴとｄＡＴＰで処理して、示した様にポリｄＡホモポリマーチ イルをｃＤＮＡ３”末端に組込む。

ＲＮＡ鎖の分解、及びターミナルティリング成分の除去後、ｃＤＮＡ鎖を３゛オ リゴｄＴ配及び好ましくは選択された制限エンドヌクレアーゼ部位、たとえばλ α口に相当する５゛配列を含有するホモポリマープライマーと混合する。１つの 典型的プライマーは、次の配列を有するニ プライマーは、断片濃度に関して大モル過剰で存在し、そしてこれは断片環か又 はコンカテマーかを作成する相補的断片末端の間でハイブリダゼーションを最小 にするために、濃度の点で算出された分子内鎖末端濃度に匹敵するか又はより大 きい。主とし特表平４−５０１３５３　（７） でプライマーモル濃度は、ｃＤＮＡ断片濃度よりも少なくとも約１０３高く、そ して約１μＭ又はその以上である。付加的なプライマーを重合反応混合の間に加 え、増幅反応の間に使用されるプライマーを補給することも必要である。

最初に、新たに作成された意味のある鎖はその３゜末端に共通ポリｄＡの配列を 有し、そしてこの配列はホモポリマーオリゴｄＴプライマーに相同もすることが 分る。かくて加熱して２つの鎖を変性し、次いで冷却してプライマーを再び再生 しながら、双方の鎖はその時その３′末端に前もって情報が与えられる。したが ってポリｄＴプライマーは、意味のない一鎖ｃＤＮＡｓをブライミングするため にホモポリマープライマーとして、そして意味のある一鎖ｃ　ＤＮＡ　ｓをプラ イミングするために共通−配列プライマーとして役立つ、増幅をプライマー再生 、重合、及び変性を上述及び例１に示す様にくり返しながら上述の様に実施する 。

示した様に、ホモポリマープライマーが、選択された制限部位配列ＲＥ−１を有 する場合、増幅された断片はこの制限部位をその反対の末端に有する。断片を、 対応する制限酵素で分解し、分解された断片をベクター中の相客−末端部位に組 込むことによって、断片を適するクローニングベクター中でクローン化する。

Ｂ、ラン゛ム　が　え゛れたＣＤＮＡ３の　弧方法のこの実施態様で、ｍＲＮＡ 種を使用して、ランダムプライマーによって寄与された５゛−末端共通配列、及 びホモポリマーの３°−末端配列を有する第−鎖意味のないｃＤＮＡ鎖を作成す る。この方法は、ＲＮＡ種の５°−末端域を増幅するのが所望される場合、３” ポリＡ域を有さない、及び／又はサイズが約８キロ塩基よりも大きいＲＮＡ種を 増幅するのに適用する。上述の様に断片増幅反応を、異なるー配列プライマーの 存在下に実施し、指向性クローニング末端を有する増幅された断片を、又は選択 的にシングルプライマーを用いて製造が認められる。

１、異なる一配列ブライミング この方法に於ける第一段階として、ＲＮＡ種を逆転写によってコピーし、対応す る第−鎖意味のないｃＤＮＡ鎖を作成する、第一一コピー合成を、主として約４ −８塩基の３゛ランダム配、及び主として約１５−２０塩基の共通配列の５゛域 を有するランダムプライマーを用いて実施するのが好都合である。第３図に示さ れたランダムプライマーは、Ｎで示された６ランダム一配列塩基及び共通 ＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧ−ＲＥ−２５“配列を有する。

そこでＲＥ−２配列は主として４−８塩基及び末端保護塩基対を上述の様に含む 、ランダムプライマーを、夫々Ｎ、たとえば最初の６つの３゛部分に対して夫々 ４つの塩基、及び次の部分の夫々に対して選択された塩基を選択して合成するの が好都合である。かくて６つのＮの場合、プライマー混合物は理論上４６プライ マー配列を含む。

ランダムプライマーの添加後、第−鎖のｃＤＮＡ合成を、上述の様にすべて４つ のｄＮＴＰｓの存在下に逆転写酵素の添加によって実施する。明らかな様に生じ る、意味のないｃＤＮＡ鎖すべては、５゛−域共通プライマー配列をその５゛末 端で含有する。ランダムプライマーは、ＲＮＡ種に任意の場所でＲＮＡ５”末端 に関して前もって情報を与えるので、ｃ　ＤＮＡ断片は、５゛−末端配列の変化 しうる長さを有する。

ｄＮＴＰｓ及び逆転写酵素を除去後、 ＲＮＡ／ｃＤＮＡ断片を、上述の様にＴｄＴ及び選択されたデオキシヌクレオチ ドで処理し、ホモポリマーチイルを３°ｃＤＮＡ末端を組込む、上述の様に、ホ モポリマーティリング操作は、ｃＤＮＡ断片を選択し、それはｔ’ＲＮＡ配列と 隣接する、すなわちＲＮＡ種の５゛末端コード域を含む。

意味のない断片をその時上述の様に意味のないｃＤＮＡの３′末端をプライミン グするためにポリメラーゼ、４つのｄＮＴＰｓ、ホモポリマープライマーを添加 し、次いで逆のｃＤＮＡ意味のある鎖の３゜域をブライミングするために共通− 配列プライマーを添加して増幅する。上述の様にこの方法が指向性断片クローニ ングを行う場合、夫々のプライマーは選択されたエンドヌクレアーゼ部位に相当 する５°配列を含む。

プライマー変性、再生、及び重合の反復サイクルの後に、増幅断片を上述の様に 反応成分から分離する。断片クローニングのために、断片を断片−末端エンドヌ クレアーゼで分解し、次いで上述の様に適する２つの部位クローニングベクター に連結する。

２、同−一配列ブライミング 方法のこの実施態様は、第−鎖ｃＤＮＡ合成が５°−域ホモポリマー共通配列を 含有するランダムプライマーによって前もって情報を与えれる以外、上記第１Ａ 、２項で議論したランダムプライマー法に従う。

この方法を、第４図中に示す０図の上部は、ポリＡＲＮＡからランダム配列プラ イマーを用いて第−鎖ｃＤＮＡの合成を示す。示されている様に、プライマーは 、Ｎで表わされる６つの任意の塩基を含み、次いでホモポリマー配列、たとえば ポリｄｃを含み、次いで選択された制限エンドヌクレアーゼ、たとえばＸｈｏＩ の配列で終止する。上述の様に、制限一部位配列は、２又は数種の付加塩基によ って保護される。　ＲＮＡ種がポリＡ　ＲＮＡ５を含む場合、プライマーホモポ リマー域はオリゴｄＴであってはならない、というのはポリＡ域へのプライマー 結合は、プライミング反応を妨害する。ある典型的プライマー特表千４−５０１ ３５３　（８） は、次の配列を有する： ｄ　（５’　−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣ＋５ＮＮＮＮＮＮ　３’）Ｘム！■ 第−鎖ｃＤＮＡ合成の後、逆転写酵素反応成分を除去し、次いでＲＮＡ／ｃＤＮ Ａ二重断片をプライマーホモポリマー配列の補体であるＴｄＴ及びｄＮＴＰと反 応させる。かくてプライマーホモポリマー配列は、第４図中に示されている様に ポリｄｃである場合、ホモポリマーティリングヌクレオチドはｄＧＴＰである。

かくて、生じる意味のない鎖ｃＤＮＡｓは、５°ポリｄＣ共通−配列域及び３′ ポリｄＧホモポリマー域を含有する。

ＲＮＡ鎖の分解及び非−断片反応成分の除去後、ｃＤＮＡ断片を大モル過剰のホ モポリマープライマー、たとえば好ましくは選択された制限部位の配列も含有す るポリｄＣプライマーと混合する。断片増幅を、上述の様にＤＮＡポリメラーゼ 、すなわちすべて４つのｄＮＴＰｓの存在下にプライマー変性、再生、及び重合 のサイクルを反復して実施する。第４図中に示された特定方法中で、ホモポリマ ーティリングは、３゛末端ポリｄＧ域を加える場合、新たに作成された意味のあ る鎖は、共通ポリｄＧ配列をその３′末端に有する。かくてポリｄＣプライマー は、意味のない鎖ｃＤＮＡｓのプライミングにホモポリマープライマーとして、 及び意味のある鎖ｃＤＮＡｓのブライミングに共通−配列プライマーとして役立 つ。

クローニングに関して、成分を末端一部位リンドヌクレアーゼで分解し、次いで 上述の様に適するクローニングベクターの単一部位に組込む。

■、二重ＤＮＡ断片の増幅 一本一及び二本−鎖ＤＮＡ断片は、また断片混合か精製された処理かで本発明に 従って増幅するのに適する。選択された細胞源からのゲノムＤＮＡを、標準操作 で単離することができる。これは主としてエタノール沈殿を伴う相次ぐフェノー ル及びフェノール／クロロホルム抽出を含む、単離されたＤＮＡが、重要な単離 されたクロモシーム又はクロモシーマル域から得られる。二重ＤＮＡを、好まし くは１又は数主の選択された制限エンドヌクレアーゼで部分的に又は完全に分解 して断片化する。しかし機械的剪断を使用することができる。断片化されたゲノ ムピースを、サイズ分画するか又は更に処理して反復ＤＮＡを除去する。二本− 鎖ＤＮＡ断片の他の起源は、染色体外材料、たとえばミトコンドリアＤＮＡ、二 本−鎖ＤＮＡウィルス、又はそのライフサイクルの一部として二本−鎖中量体、 たとえばレトロウィルスを有するウィルスを含むことができる。

ｃＤＮＡ断片の製造に使用されるゲノムＤＮＡ断片又はＲＮＡ転写の細胞の起源 は、培養された細胞系、又は単離された細胞又は組織（又は全器官又は全生物） から得られる細胞タイプを含む、細胞起源は、種々の減数技術で重要であり、そ れでは特異な２つの関連する細胞起源の１つである特別なＲＮＡ転写又は遺伝子 材料を同定するか又は単離することが望まれる。ＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡ転写 の体−液源が第一に重要である。というのは液体が公知であるか又はウィルス剤 又は重要な他の微生物を含有すると疑われているからである。

線形化された又は断片化された又は断片化されたプラスミドＤＮＡ、又は断片化 されたファージＤＮＡは、ある力が増幅に望まれるＤＮＡ断片の他の起源である 。ベクターＤＮＡは、通常の技術による、精製されたプラスミド又はファージＤ ＮＡから得られ、そして選択された制限されたエンドヌクレアーゼでの分解によ って線形化及び／又は断片化される。

Ａ、逆−末端ホモポリマーティリング 第５Ａ図中に示された方法のこの実施態様は、長さが約３−８キロ塩基より小さ い二重ＤＮＡ断片を増幅するのに適合する。断片、たとえば図中の最初の二重断 片を、ＴｄＴと選択されたｄＮＴＰ、たとえばｄＧＴＰの存在下に反応させ、示 した様に断片の反対の３″末端にホモポリマーチイルを組込む。反応条件を、約 ２０−４０塩基を夫々３°断片鎖で加えて調整するのが好ましい。

テイル化断片を、反応成分から、たとえばフェノール抽出及びゲル濾過によって 抽出し、次いでホモポリマーチイルに相補する大モル過剰のホモポリマーと混合 する。たとえばホモポリマーティリングは、ポリｄＧテイルを加えた場合、ホモ ポリマーはポリｄＣである。ホモポリマーは、長さが少なくとも約１５−２０塩 基であるのが好ましい。二重断片を、上述の様に加熱変性し、次いで３゛ホモポ リマー断片末端にホモポリマーハイブリダゼーションさせる条件下に再生する。

次いで再生された断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＨｇＺ−及びＡＴＰの存在下に 標準条件（マニアチス、第１４６頁）下で処理して、ホモポリマーを断片の５゛ 鎖末端で連結する。かくて生じる断片は、３゛−末端ホモポリマー配列及び５゛ 共通配列を断片鎖中に作成する５゛末末端相補的列を有する。

反応成分を除去するために断片を精製した後、断片を、好ましくは選択された制 限エンドヌクレアーゼ部位の配列を含有するホモポリマープライマーと混合する 。オリゴｄＧティリングと共に使用する、及びターミナルＸｈｏ１部位を供給す る、ある典型的プライマーは、次の配列を有する： 特表千４−５０１３５３　（９） ｄ　（５’　−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣｚｏ−３゜Ｘ工！■ 増幅反応を、上述の様に変性、再生、重合、及び変性のサイクルを（り返して実 施する。上記第１項に記載されたシングル−プライマー法を用いた場合、ホモポ リマープライマーは、意味のない鎖の３′末末端列に対するホモポリマープライ マーとしても、意味のある鎖の３゛末端で共通ホモポリマー配列に対する共通配 列プライマーとしても役立つ。

第５Ｂ図は、まさに記載された二重ＤＮＡ増幅の修飾を示す。この方法は、二重 断片を処理し、ホモポリマーティリングを生じる第５Ａ図法と異なるが、次いで 相補的ホモポリマーで連結し、５゛−末端相補的配列を加えない、かくてここに 記載された基本法と対照的に、本変法は、５”−末端共通配列を有する意味のな い鎖を作成する段階を含まない。

ホモポリマーチイル断片の精製の後に、断片を、断片ホモポリマー域、ＤＮＡポ リメラーゼ、及びすべての４つのｄＮＴＰｓに相同するホモポリマープライマー と混合する。増幅を、上述の様に変性、再生及びポリメラーゼとの反応をくり返 して実施する。

前もって情報が与えられた一鎖複製は、３°ホモポリマー末端を生じることが予 期されないので、新たに合成された断片は、次の複製のための鋳型を供給しては ならず、複製の夫々のラウンドは、ホモポリマーティリングを有するオリジナル 二重断片の線状増加しか生じないはずである。

かくて２５ランドの複製は、断片数で約２５倍の増加しか生じないはずである。

驚くべきことに、本発明に基づいて導かれた及び例２中に記載された実験は、断 片濃度で少なくとも約２００倍の増加が、２５ラウンドの複製で達成される。

第５Ｂ図法なかで観察された増幅は（ポリｄＣプライマーによって供給される） ５′−末端ポリｄＣ配列を有する、新たに合成された鎖を含む全体−鎖ハイプリ ダゼーションによる。図から、この様な全体−鎖ハイブリダゼーシッンは２つの 鎖の相反する５′末端でポリｄＣ配列を有する二重断片を生じる。順次にポリｄ Ｃ突出する配列は、ポリｄＣ配列形成のための鋳型を、相補的鎖の隣接する３゛ 末端で、反応混合物中ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＧＴＰの存在下に供給する。か くて生じる断片は、第５Ａ部中の実施態様と同一のポリｄＣ３”末端及びポリｃ ｌｃ５’末端を有し、夫々の複製サイクマで断片を倍加する。

観察された増幅の実際量は、実質上理論上の増幅よりも少ないという事実は、恐 らく増幅反応で再生段階の間に相互にハイブリット化されうる、比較的小さいパ ーセンテージの新たに作成された断片をもたらす。この限界は、増幅反応の早期 の段階でより一層大きいハイブリダゼーション時間を許可することによって、少 なくとも部分的に克服することができる。

２、ランダム−配列ブライミング 第６図は、二重ＤＮＡ増幅に、特に断片が約３−８キロ塩基よりも長い場合、及 び５′域断片配列を増幅するのが望ましい場合の使用に関連する方法を示す。

使用されるランダムプライマーは、上述の様に３”−末端配列を主として長さ約 ４−８塩基の間にホモポリマー域又は他の共通−配列域、選択された制限部位の 配列及び第３図法で使用されるプライマーに類似する保護塩基を含む。

方法を実施するのに、二重断片を先ず処理し、二重断片の３”−末端ＯＨ基をブ ロックする。これは、ホモポリマーティリングが、新たに（ランダムプライミン グで）合成されたＤＮＡ鎖の３°−末端でしか生じないことを示す、３゛二重末 端のブロックを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びコルディセピントリホスファート （３゛−デオキシＡＴＰ）を用いて、マニアチス（第１１８−１１９頁）中に記 載された、３″ＤＮＡ鎖の修復のための条件に類似する条件下に実施する。

次いで断片を、加熱によって変性し、次いでモル過剰のランダムプライマーと混 合する。プライマー化された断片を、ＤＮＡポリメラーゼ及びすべて４つのｄＮ ＴＰｓでコピーし、ランダムプライマー共通配列をその５゛末端に有する新しい ＤＮＡ鎖を生じる。この新しい鎖も、この場合第一１ｉｃＤＮＡ合成と同様に意 味のない鎖と呼ばれる。

ポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰｓを除去した後、断片をＴｄＴ及び選択された ｄＮＴＰで処理し、図中に示されている様に、ホモポリマーティリングを二重断 片中に新たに合成された鎖で生じる。示された方法で、第−鎖プライマーがホモ ポリマーを結合する領域、たとえばポリｄＣを含む場合、ホモポリマーチイルは プライマー配列、たとえばポリｄＧに相補的であり、シングルプライマーで、こ の場合はポリｄＣプライマーで増幅される。

二重断片を、ティリング成分から分離し、ＤＮＡポリメラーゼ、上記ホモポリマ ープライマー（そこで意味のない鎖は、相補的ホモポリマー末端域を第６図に於 ける様に有する）及びすべて４つのｄＮＴＰｓを含む増幅反応混合物に加える。

プライマー再生、重合及び変性の反復サイクルを、増幅の所望の度合いが得られ るまで上述の様に実施する。

どのように方法が異なる一配列プライマーを用いる増幅に関して変化されるかが 分る。

■、利用 本発明の増幅方法は、限定された料の断片材料が特表平４−５０１３５３　（１ ０） 入手可能である場合、ＲＮＡ及びＤＮＡ断片増幅に、及びｃＤＮＡ断片の指向性 クローニングに有用である。たとえば、細胞又は組織材料の比較的小さｖｖｉ４ は、ＲＮＡ源として入手できる場合、この方法はｃＤＮＡクローニングのために 急速な増幅に可能である。第７図に示され、かつ例１に記載された結果は、１０ ３細胞だけから成るｍＲＮＡを増幅後に検出することを示す。第８図中に示され 、かつまた例１に示された結果は、特定の遺伝子配列、たとえばヒ）７１１１胞 から成るインターロイキン−２に関して、この方法はＲＮＡ−誘導された断片の 急速増幅を提供することを証明する。

上記の２つのプライマー接近を用いて、増幅された断片を、異なる制限部位末端 を有する指向性クローニングに対して製造することができる。ＲＮＡ増幅法は、 また全体−コピー配列に関して選択する。

というのはホモポリマーティリングは、不完全なｃＤＮＡコピーであまり有効で はないからである。

ＤＮＡ増幅に関するランダムプライマー法は、比較的長い断片の場合、５゛−末 端配列増幅を可能にする。

２つの関係する細胞起源のうちの１に特有であるＲＮＡ種の同定に、ＲＮＡ増幅 法を適用することは第１０図中に示される。２つの細胞起源は、たとえば感染及 び非感染細胞、又は正常及び悪性細胞、又は活性化及び非活性化細胞を示し、そ こでは細胞感染又はえくせい又は活性化細胞状態に特異的に関係するＲＮＡ種を 同定することが望まれる。２つの細胞起源からのＲＮＡを単離し、次いで上述の 様にシングル−又はジュアループライマー法によって増幅する。第一起源からの 増幅された断片の混合物を適するクローニングベクター中でクローン化し、クロ ーニング断片ライブラリーを作成し、このライブラリーは多くの形質転換された 宿主細胞を有するプレートによって図中の最下部に示される。第二起源からの増 幅細胞は、たとえばニックトランスレーション又はその類似法によってライブラ リークローンに対するプローブとして使用するために放射標識される。

クローニングベクターライブラリーの複製プレート上でのブロープハイプリダゼ ーションを、サザンブロッティングによって行うのが有利である。ノ１イブソト 化プレートのオートラジオグラフは第二起源断片にも共通するこれらのライブラ リークローンを同定するためのオリジナルライブラリープレートと比較する０次 いで図中Ｘで表わされる第一起源に特有である種を同定する。

この方法を、精製され、強化され又はサブ分画されたＤＮＡ断片に、次の処理、 たとえば次の強化で入手できる断片量を増加するために適用することができる。

たとえば、特有の配列を同定する上記方法で、クローン化された特有の配列断片 を単離し、付加的な増幅及び選択によって更に強化する。他の例として、ゲル電 気泳動によって得られるＤＮＡサブフラクションを増幅することができる。ここ で分画前に断片混合物は末端リンカ−を備え、そして選択された断片バンドをそ の場でゲル内でか、又は選択的に溶離後に、プライマー、ポリメラーゼ及びヌク レオチドの添加によって複製段階をくり返しながら単離する。

次の例は、上記断片増幅及び断片単離の方法を示すが、この方法又はその使用の 範囲を限定するものではない。

材料及び方法 ブルースクリブビ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ’）　Ｍ１３　＋　／−は、ストラタ 遺伝子から得る（ラ　ヨラ、ＣＡ）；及び大腸菌株ＤＨ５及び太Ｕ株ＪＭＩ　０ １は、ベテスダリサーチラブス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｓ）　（ベテスダ、ＭＤ）から得られる。

ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（仔ウシ胸腺）、アルカリ ンホスファターゼ（仔つシ腸）ポリヌクレオチドキナーゼ、ｆｆ１ＤＮＡポリメ ラーゼＩ　（クレー断片）、及びＳ１ヌクレアーゼが、ベーリンガーマンハイム バイオケミカルス（インディアナポリス、ＩＮ）から得られる：Ｘｂａｌ、Ｘｈ ｏＬ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼが、ニューイングラン ドバイオラプス（ベベリイ、ＭＡ）；及びストレブタビジンアガロースがベセス ダリサーチラブス（ベセスダ、ＭＤ）から得られる。低い一ゲル化温度アガロー ス（ジ−プラーク）がＦＭＣ（ロクランド、ＭＥ）から得られる。ニトロセルロ ースフィルターが、シュライヒヤー及びシュエル（ナチク、Ｍ、Ａ、）から得ら れる。

合成オリゴヌクレオチドリンカー及びプライマーを、市場で入手できるオートメ ーション化されたオリゴヌクレオチド合成剤を用いて製造する。換言すれば、慣 用の合成オリゴヌクレオチドを、たとえばジンテチックジェネチックス（サンジ エゴ；ＣＡ）から購入することができる＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成キット及びラン ダムブライミング標識キットが、ベーリンガーマンハイムバイオケミカル（ＢＭ Ｂ、インディアナポリス、ＩＮ）から得られる。

再生の前の又は標識化のための一本鎖のリン酸化を、１　ｒｕｗｏ１基質に対し て過剰の、たとえば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５０ＩＩ ＩＭトリス、ｐＨ７，６，１０＋Ｍ　ＭｇＣ１１，５ｍＭジチオスレイトール、 １−２ｎ＋Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐ　：　１．７ｐｍｏｌｅガンマ−”Ｐ−Ａ　Ｔ　Ｐ　 （２，９ｍｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、Ｏ，ｂｎＭスペルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴ Ａの存在下に達成する。

部位特異的ＤＮＡ開裂を、一般に技術的に理解された条件下でかつその条件の特 色は、これらの市場特表千４−５０１３５３　（１１） で入手できる制限酵素の製造によって特定化される条件下で適する制限酵素（又 は酵素）で処理することによって行われる。たとえばニューイングランドバイオ ラプス、プロダクトカタログ参照。一般に、プラスミド又はＤＮＡ配列の約１μ ｇを、３７℃で１時間分解後１単位の酵素で約２０μｌの緩衝溶液中で開裂する ；たとえばこの際主として過剰の制限酵素を、ＤＮＡ基質の完全な消化を保証す るために使用する。

約３７℃で約１時間ないし２時間の培養時間は、変化を用意に許容できるが実行 可能である。夫々の培養後、たん白質をフェノール／クロロホルムで抽出して除 去し、次いでエーテル抽出を行い、核酸を水性分画からエタール（７０％）で沈 殿させて回収する。

所望の場合、切断された断片のサイズ分離を、ポリアクリルアミドゲル又はアガ ロースゲル電気泳動によって標準技術をもって行う、サイズ分離の一般の記載は 、！方？ＥＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗｏｌｏｇｙ）（１９８０）匹 ：　４９９−５６０中に見い出される。

制限切断断片を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！（クレノー試剤）で４つのデオキ シヌクレオチドトリホスファート（ｄＮＴＰｓ）の存在下に、約１５ないし２５ 分の培養時間を用いて２０’ないし２５℃で５０ｍＭトリスｐＨ７，６，５０ｍ Ｍ　ＮａＣ１，６ｎＭ　ＭｇＣ１ｚ　、６ｍＭ　ＤＴＴ及びｄＮＴＰｓ中で処理 して、平滑末端化する。クレノー断片は、５°一本一鎖突出部で４つのヌクレオ チドの存在下にふさぐ。所望ならば選択的修復を、突出部の性質によって指示さ れる制限内でｄＮＴＰＳ又は選択されたｄＮＴＰｓの１つのみを供給することに よって行うことができる。クレノー試剤で処理後、混合物をフェノール／クロロ ホルムで抽出し、次いでエタノールを沈殿させる。Ｓ１ヌクレアーゼを用いる適 切な条件下での処理は、ＤＮＡのすべての一本一鎖部分の加水分解を生じる。特 にｃ　ＤＮＡの合成で作成される５゛ヘアーピンのニック化が達成される。

ＤＮＡの３”末端のブロックを、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ及びコルディセピン トリホスファート（３′〜ジオキシＡＴＰ）を用いて、ＤＮＡの３′末端の修復 に関するマニアチス（第１１８−１１９　頁）によって記載された条件に類似す る条件で実施する。

連結を、１５−５０μｌ容量中で次の標準条件及び温度下に実施する：たとえば 、２０ｍＭ　）リス−Ｃ１ｐＨ７，５＋ｂ １０＋Ｍ−５０＋ＭＭ　ＮａＣ１、及び４ｈＭ　ＡＴＰ、０．０１−０．０２（ ヴアイス）単位Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１４℃で（“付着端”連結に）又は１ｍＭ ＡＴＰ、０．３−０．６（ヴアイス）単位Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１４℃で（“平 滑末端”連結に）のどちらか。分子内“付着端“連結を、常に３３１００＋ｇ／ ＩＲ１全ＤＮＡ濃度（５−１００ｎＭ全末端濃度）で行われる０分子内平滑末端 連結を、１＋＊Ｍ全末端濃度で実施する。

°ベクター断片”を使用するベクター作成で、ベクター断片を通常、細菌アルカ リホスファターゼ（ＢＡＰ）又は仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で、 ５°ホスフアートを除去及びベクターの自己一連結を防ぐために処理する。分解 を、ｐＨ８で約１０ｍＭ　）リスＨＣＩ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で６０℃で１時 間ＢＡＰｎ＋ｇにつき約１単位又は３７℃で約１時間ベクターｍｇにつきＣＩＰ Ｉ単位を用いて行う。核酸断片を回収するために、調製物をフェノール／クロロ ホルムで抽出し、次いでエタールを沈殿させる。換言すれば、再連結を、付加的 な酵素分解及び望まれない断片の分離によって２回分解されたベクター中で妨害 することができる。

拠よ ｍ口」社ガプライマー豪有Ｉ擾ユ」ｂト」辷生の四３」し１１曝 Ａ、ＣＤＮＡ断片を調製 ヒト末梢血液Ｔ細胞を、正常の個体からＴロゼツトティングによって単離され、 そして全ＲＮＡを標準操作（キャスク）に従って約１０７細胞から単離する。全 ＲＮＡ調製物をオリゴｄＴクロマトグラフィーによって、公知の操作に従っても 分画し、ポリＡｍＲＮＡ調製物を生じる。最終調製物を、約１μｇ／−のＲＮＡ 濃度に希釈する。

１０３細胞（ｍ　ＲＮ　Ａ全体単離の０．０１パーセント）。

１０４細胞（ＲＮＡ全体収量の０．１パーセント）、及び１０’細胞（ｍＲＮＡ 全体収量の１パーセント）の予期された収量にほぼ相当するｍＲＮＡ調製物の一 部を、第−鎖ｃＤＮＡを作成するのに、ベーリンガーマンハイムによって供給さ れたｃＤＮＡキット中に記載された様に使用する。

ＲＮＡ／ＤＮＡ１９体を、フェノール／クロロホルム１容量で、次いでエタノー ル２容量で連続的抽出によって（ｔＲＮＡ５μｇをキャリヤーとして添加する） 　、７．５　Ｍ　ＮＨ４０ＡＣｐＨ７，ｏ　Ｏ，５容量及びエタノール２容量を 用いて沈殿によって精製する。遠心分離（室温でマイクロフユーゲ（Ｍｉｃｒｏ ｆｕｇｅ）中で１０分間：約１４ｋ　ｒｐｓ＋）の後、ペレットを急速減圧で乾 燥し、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を表わす ことで知られているＮＨａＯＡｃの完全な除去を確かめる。

二本−鎖材料の３つの混合物の夫々を、０．２Ｍ　Ｋカコディラート（ｐ）１７ ．２）　、４ｄ　ＭｇＣ１ｚ　、ｌ＋ｏＭ　２−メルカプトエタノールの０．０ ５０　ｄ中に、ｄＧＴＰの最終濃度２５μ門を含有するＢＲＬによって供給され る様に、再懸濁する０反応を開始するために、Ｔ　ｄ　Ｔ１５単位（ＢＲＬによ って供給）を添加し、反応混合物を３０分３７℃で培養する。反応の終了時に、 ＲＮａｓｅＡ特表千４−５０１３５３　（１２） （ベーリンガーマンハイムによって供給）　１０−２０μｇを、反応に加え、３ ７℃で更に３０分間培養する。

ＲＮａｓｅＡ反応の終結で、反応混合物を上述の様にフェノール／クロロホルム で抽出し、ｔＲＮＡ５−１０μｇを、上記の様にエタノール沈殿を実施する前に キャリヤーとして加える。又は、サンプルをキャリヤーなしに沈殿させ、ＲＮａ ｓｅＡでサンプルを再懸濁後に処理する。

Ｂ、ｃＤＮＡ断片を増幅 １．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｇを含有する１０１１Ｍ　）　！Ｊ　スーＣＩ緩衝液、ｐ ｔ１８．３（緩衝液Ａ）１００．ｃｌに、上記ｃＤＮＡ断片混合物１００ｃｒｊ ！、配列ｄ　（５’　−ＧＧＴＣＴＡＧＡＣｚｏ−３’　）を有するプライ？− ２０μＭ、配列５’　−ＧＧＣＴＣＧＡＧＴｚｏ−３’　）を有するブライ？− ２，ｃｒＭ　、ｄＡＴＰ　：　ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（ｌれぞれ２００　ｐ　Ｍ　（最終濃度）及びテルムスア クアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｓ）ＤＮＡポリポリーゼ豆四±ユ ｌ旦二亙）５単位を加える。反応混合物を、９４℃に１分間変性のために加熱し 、５０℃に２分間プライマー再生のために放冷し、次いで７２℃に５−１２分間 加熱して、Ｔａｑポリメラーゼによってプライマー拡張させる。引き続きの加熱 冷却、次いでポリメラーゼ反応を含む、複製反応を、ペリカンエルメルセテユヌ ＤＮＡターミナルサークラーによって付加的に２５回くり返す。

Ｃ０増幅された断片の分離 ３つの混合物の夫々に増幅されたＤＮＡ断片のパーセント分割量を、１．５％賀 ／Ｖアガロースゲルに供給し、次いで電気泳動を標準状態下に行う。ゲルを臭化 エチジウムで染色し、サザンブロッティングのニトロセルロースフィルターに移 行させる。第７図は、増幅されたＤＮＡの臭化エチジウム着色の絵を示す。ゲル 中で３つのサンプルレーン（２，３及び４）は、示されている様に１０’、　１ ０’、及び１０’から成るＲ　Ｎ　／’、に相当するサンプルである。明らかな 様に、増幅されたＤＮＡが、１０３細胞のバンドはぼんやりしているけれども、 すべての３つの細胞混合物に相当するＲＮＡサンプルから得られる。

第７図中レーン１は、ランブダ（ｌａｍｂｄａ）ファージサイズマーカーＤＮＡ 断片、及びレーン５は増幅されたコントロールｃＤＮＡの１０％サンプルを示す 。

３つのサンプルバンドを、ニトロセルロースフィルターに移行させ、Ｔ細胞中に 存在することが知られている。ヒトインターロイキン−２遺伝子に相同する放射 標識されたプローブでハイブリット化する。

したがってこの遺伝子のＲＮＡ転写が、増幅されるべきＴ細胞から得られるＲＮ Ａ中に期待される。観察される放射標識パターンを、第８図中に示す。明らかな 様に、１０４と１ＯＳ（レーン２及び釦細胞の間のＲＮＡに相当するレーンは双 方とも、インターロイキン−２遺伝子に相対するｃＤＮＡの用意に検出できる標 識を含有する。

Ｃ０増幅された断片をクローニング １０’細胞に相当するサンプル混合物からの増幅された断片を、Ｘｂａｌ及びＸ ｈｏＩで分解する。ブルースクリプト“Ｍ１３プラスミドを、同一酵素で処理し 、電気泳動によって分画し、小さいＸｈｏｌ／ＸｂａＩ断片を除去し、次いで上 記又ｂａｌ／Ｘｈｏｌ断片と混合する前にアルカリホスファターゼで処理する。

連結を、シングルプラスミド断片の環化を促進する条件下に行う。環化されたプ ラスミドを、太Ｕ株ＤＨ５で選択し、満足すべき組換えを耐アンピシリン性に関 して選択する。

拠ｌ なる−配置プライマーで　さ−余生ｑ旦にへ璽幅Ｈａｅ　ｌｌｌ−分解ｐｈｉＸ １７４　ＤＮＡ断片がプロメガバイオチックから得られる。ポリｄＧテイルの付 加を、緩衝液中に断料５０ｎｇ、　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ２５μＭ　、Ｔ　ｄ　Ｔ１５ ないし３０単位を含有する５０μ１反応溶液中で３０分間３７℃で実施する。反 応の終結で、サンプルをフェノール／クロロホルムで抽出し、例１に於ける様に 、エタノールで沈殿させる。

ＤＮＡを、ポリｄｃプライマー１μｎ及び例１に記載されたのと同一の成分を含 有する反応混合物にＤＮＡ１ないし１００ｎＨの添加によって増幅する６反応循 環回数は、例１に記載した通りであり、かつ全体で２５サイクルを実施する。

第９図は、臭化エチジウムで染色された非−増幅（レーン１．３及び５）及び対 応する増幅（レーン２．４及び６）断片の２％寒天ゲル電気泳動パターンを示す 。

レーン１，３及び５は、夫々断片材料１ｎｇ、１０ｎｇ及び１１００ｎを表わす 、レーン２．４及び６は、夫々ｌｎｇ、１０ｎｇ及び１１００ｎ断片材料の２つ のプライマー増幅１０％を示す、その結果は、２００倍以上の増幅を示す。

本発明は、特定の実施態様、方法、構成及び使用に関して記載されているが、種 々の変化及び変更を本発明から離れることなく行うことができることは当業者に とって明白である。

特表千４−５０１３５３　（１ａ） プライマー再生、重合及び変性の反復サイクル５”　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡｎ 　３’プライマー再生、重合及び変性の反復サイクル５＠ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ａｎ　３゜ ↓ランダムプライマーを用いて逆転写 ３°　ＧＧＧＧＧＧＧ　ＮＮＮＮＮＮＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧ−Ｒε一部位２−５ ′プライマー再生、重合及び変性の反復サイクル！”　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ｎ　３＠３°　ＧＧＧＧＧＧＧシー一一一シー＼、ＮＮＮＮＮＮＣＣＣＣＣＣＣ Ｃ５”プライマー再生、重合及び変性の反復サイクルフライマー再生、Ｍ合及び 変性の反復サイクルプライマー再生、重合及び変性の反復サイクル符表平４−５ ０１３５３　（１４） ＋２３４５　１２’３Ｐｃ ＦＩＧ、　７　ＦＩＧ、　８ １２３４５６Ｐｃ 細胞−１細胞−２ ライブラリー 国際調査報告 特表平４−５０１３５３　（１５）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．５′−末端共通配列を有する意味のない断片鎖を作成し、ターミナルデオキ シヌクレオチドトランスフエラーゼ及び選択されたデオキシヌクレオシドトリホ スフアートで鎖を処理し、ホモポリマー配列を意味のない鎖の３′末端に加え、 鎖を上記ホモポリマー断片配列に相同するホモポリマープライマー、上記共通配 列の補体に相同する共通−配列、ＤＮＡポリメラーゼ及びすべて４つのデオキシ ヌクレオシドと混合して、二重断片を作成し、断片プライミングさせる条件下で 鎖を再生し、前もって情報が与えられた鎖を二本−鎖断片に変える条件下で混合 物を反応させ、断片を変性し、次いで上記再生、反応及び変性工程を断片増幅の 所望の度合が達成されるまでくり返すことから成る種々の配列ＤＮＡ断片を有す る混合物を増幅する方法。
2. ２．前記処理は、同一ホモポリマー配列を両方の鎖の３′−末端に加えることに 有効であり、前記作成はホモポリマー配列を両方の断片の５′−末端に相補する 相補的プライマーを連結することを含み、そしてその相補的プライマーは、ホモ ポリマー及び共通−配列プライマーとして役立つ、二重ＤＮＡ断片の混合物を増 幅する、請求の範囲１の方法。
3. ３．前記処理は、同一ホモポリマー配列を両方の鎖の３′−末端に加えることに 有効であり、前記作成は上記ホモポリマープライマーの存在下に断片鎖を複製し 、新たに複製された鎖をハイプリダイズさせ、次いでハイブリダイズされた、新 たに複製された二重断片をＤＮＡポリメラーゼ及びこの様なホモポリマー配列を 生じるデオキシヌクレオシドトリホスフアートで処理することを含み、そして前 記ホモポリマープライマーは共通−配列プライマーとしても役立つことができる 、二重ＤＮＡ断片の混合物を増幅する、請求の範囲１の方法。
4. ４．前記意味のない鎖を、（ａ）二重ＤＮＡ断片を変性し、（ｂ）（ｉ）意味の ある鎖の相補的配列に結合するのに有効なランダム３′配列、及び（ｉｉ）前記 ５′−末端共通配列を有するランダムプライマーを加え、次いで（ｃ）プライミ ング状態で意味のある鎖及び組込まれたランダムプライマーとＤＮＡポリメラー ゼ及びすべての４つのデオキシヌクレオシドトリホスフアートとを、意味のある 配列のコピーを生じる条件下に反応させることによって作成する、約３−８キロ 塩基より大きいサイズ範囲で二重ＤＮＡ断片を増幅するのに使用する、請求の範 囲１の方法。
5. ５．前記作成前に二重ＤＮＡ断片の３′−末端を保護して、もとの二重断片のホ モポリマーテイリングを妨げることも含む、請求の範囲４の方法。
6. ６．意味のない鎖は、ＤＮＡ種の混合物の逆転写によって生じる第一鎖ｃＤＮＡ 断片である、請求の範囲１の方法。
7. ７．意味のない鎖を、（ａ）オリゴｄＴプライマーをポリＡＲＮＡ種に加え、次 いで（ｂ）オリゴｄＴプライマー、逆転写酵素、及びすべての４つのデオキシヌ クレオシドトリホスフアターゼの存在下に転写することによって作成し、この際 前記５′−末端共通配列はポリｄＴである、請求の範囲６の方法。
8. ８．前記意味のない鎖を、（ａ）ＲＮＡ種を単離し、（ｂ）（ｉ）ＲＮＡ種の相 補的配列に結合するのに有効なランダム３′−配列、及び（ｉｉ）前記５′−末 端共通配列を有するランダムプライマーを添加し、次いで（ｃ）プライミング状 態で、ＲＮＡ種及び組込まれたランダムプライマーとＤＮＡポリメラーゼ及びす べての４つのデオキシヌクレオシドトリホスフアターゼとを、意味のある鎖のコ ピーを生じる条件下に反応させる、約３−８キロ塩基長いＲＮＡ種から導かれた ｃＤＮＡ二重断片を増幅するのに使用する、請求の範囲６の方法。
9. ９．意味のない鎖のホモポリマー範囲は、前記５′ポリｄＴ共通配列に相補的で あり、前記ホモポリマー及び共通−配列プライマーは、異なって選択された制限 エンドヌクレアーゼ部位の配列に対応して、種々の５′−末端配列を有する、増 幅されたｃＤＮＡ断片の指向性クローニングに使用する、請求の範囲６の方法。
10. １０．ｃＤＮＡ断片組込みを、第一及び第二の異なる断片−組込み制限部位を有 するクローニングベクターに指向的に方向づけ、この制限部位は増幅断片中の２ つの異なる制限部位と選択的に連結することができ、この断片は断片−組込み部 位でベクターに断片を組込むことも含む、ｃＤＮＡライブラリーを作成するのに 使用する、請求の範囲９の方法。
11. １１．ＲＮＡ断片の３′−配列に相同し、得られるＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重断片に 選択された共通５′−末端配列を有する第一鎖ｃＤＮＡ意味のない断片を生じる のに有効であるＲＮＡ−鎖プライマーでＲＮＡ種を転写し、意味のない断片鎖を ターミナルデオキシトランスフエラーゼで選択されたデオキシヌクレオチドの存 在下に処理し、ｃＤＮＡ意味のない鎖の３′−末端でホモポリマー配列を作成し 、意味のない桜の３′−末端ホモポリマー配列に相同し、そして第一断片組込み 制限部位と連結しうる選択された制限エンドヌクレアーゼの配列、結合配列につ いては５′を含む結合配列を有するホモポリマープライマーを加え、第一プライ マーで意味のない鎖を再生し、この混合物をポリメラーゼと反応させて、前もっ て情報から与えられた鎖を二本−鎖ＤＮＡ断片に変え、断片を変性し、同一配列 を意味のないＤＮＡ鎖の選択された共通５′−末端配列として有し、そして第二 断片−組込み制限部位と連結しうる第二の選択された制限エンドヌクレアーゼの 配列、この配列については５′を含み、前記再生を、第一及び第二プライマーを ２つの分離された断片鎖の対応する末端でハイブリダイズする条件下で実施し、 次いで前記反応、変性、及び再生工程、ＤＮＡ断片が所望の度合を増幅するまで くり返すことから成る、第一及び第二の異なる断片−組込み制限部位を有するク ローニングベクター中に指向性クローニングに関する一本鎖ＲＮＡ種の混合物を 製造する方法。
12. １２．前記ＲＮＡ種は、ポリＡＲＮＡｓであり、そして共通−配列プライマーは 、ポリｄＴ配列を含む、請求の範囲１１の方法。
13. １３．前記転写を、サンダムプライマーを用いて実施する、請求の範囲１１の方 法。