JPH04501362A - 多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたｄｎａ塩基配列決定法 - Google Patents

多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたｄｎａ塩基配列決定法

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JPH04501362A
JPH04501362A JP2500627A JP50062789A JPH04501362A JP H04501362 A JPH04501362 A JP H04501362A JP 2500627 A JP2500627 A JP 2500627A JP 50062789 A JP50062789 A JP 50062789A JP H04501362 A JPH04501362 A JP H04501362A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡＤＮＡ塩基配列を決定し 得ることは、遺伝子の機能やその制御を理解し、分子生物学の基本的技術の多（ を応用していく上で極めて重要である。天然のＤＮＡは、２つの線状ポリマーす なわちヌクレオチド鎖から成る。各々の鎖は、ホスホジエステル結合によって連 結されたヌクレオシド鎖である。２本の鎖は、当該２本の鎖のヌクレオチドの相 補的な塩基の間での水素結合により互に逆平行方向に固定されている：デオキシ アデノシン（Ａ）はチミジン（Ｔ）と、また、デオキシグアノシン（Ｇ）はデオ キシシチジン（Ｃ）と対をつくる。
現在、ＤＮＡ塩基配列決定には２つの基本的な方法が存在するニジデオキシチェ ーンターミネーション法、例えば、Ｓａｎｇｅｒ　（サンガー）ら、な匹、旦８ 配封、虱、　Ｖｏｌ、７４．　ｐｇｓ、５４６３−５４６７（１９７７）および 化学的切断法、例えばＭａｘａｍ　（マクサム）ら、江匹、胆■、閃回、ジシェ 、　Ｖｏｌ、７４．　ｐｇｓ、５６０−５６４（１９７７）である。チェーンタ ーミネーション法は、幾つかの点で改良され、そして現在使用できる自動ＤＮＡ 塩基配列決定機械の全ての基礎となっている、例えばＳａｎｇｅｒ　（サンガー ）ら、Ｌ町すエ　旦（１９８５）；　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｔ、Ｎａｔｕｒｅ、 　Ｖｏｌ、　３２１．　ｐｇｓ、　６７４−６７９　（１９８７）；　Ｐｒｏｂ ｅｒ（プロパー）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３Ｂ。
Ｖｏｌ、　１５５．ｐｇｓ、　５１−３３４　（１９８７）、およびＣｈｕｒｃ ｈ（チャーチ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２４０．　ｐｇＳ、１８５− １８８　（１９８８）。
チェーンターミネーション法及び化学的切断法の両者とも、−組またはそれ以上 の標識されたＤＮＡ断片を作成し、その際それぞれの断片は共通の起源を有しか つ既知の塩基で終結するということが必要である。次いで一組またはそれ以上の ＤＮＡ断片は塩基配列の情報を得るために大きさに従って分離されなければなら ない。両方法とも、ＤＮＡ断片は高分解能のゲル電気泳動によって分離される。
残念ながらこのステップにより、−回の操作で配列を決定できるＤＮＡ鎖の大き さが著しい制約を受ける。非自動の塩基配列決定法では最適条件下で約５００塩 基までのＤＮＡ鎖を、そして自動塩基配列決定法では最適条件下で約３００塩基 までのＤＮＡ鎖を決定すこの制約は、ヒト染色体ゲノムの全てまたは大部分の塩 基配列を決定するといった植物または動物のゲノムの大規模な領域の分子構造解 析を目的とした医学的、科学的そして企業的な多くの重要なプロジェクトを遂行 する。ｌｏｇｙ　（上文にて引用）。
ＤＮＡ塩基配列決定に加えて核酸ハイブリダイゼーションもまた分子生物学的に おける多くの技術の中の極めて重要な要素である、例えばＨａｉｅｓ（ヘイムス ）ら＋　ｅｄｓ。
、“核酸ハイブリダイゼーション：実際のアプローチ”（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ ｈ）　（ＩＲＬブレス、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、１９８５）。
特に、ハイブリダイゼーションの技法は、巨大なライブラリーから頻度の低いｃ ＤＮＡやゲノミッククローンを、混合オリゴヌクレオチドプローブ、例えばＷａ ｌｌａｃｅ（ワラス）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　Ｖｏｌ、６．　ｐｇｓ。
３５４３−３５５７　（１９７９）を用いて、または異種間のプローブ、例えば Ｇｒａｙ　（プレイ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、 　Ｖ。
１．８０．　ｐｇｓ、５８４２−５８４６　（１９８３）を用いて選択するのに 用いられてきた。核酸ハイブリダイゼーションはまた、塩基配列間の相同性の程 度を決定するために、例えば、Ｋａｆａｔｏｓ（カフ７トス）ら、　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖ。
１、７．　ｐｇｓ、　１５４１−１５５２　（１９７９）　、およびコンセンサ ス塩基配列を同定するために、例えば、０１ｉｐｈａｎｔ（オリファン）ら、　 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　Ｖｏｌ、１５５．　ｐｇｓ、　５６８−５８ ２　（１９８７）、同様に用いられてきた。これらの応用の全てにおいて暗に示 されていることは、既知のプローブの塩基配列は未知の標的配列についての情報 を含有しているという考えである。この考えを標的の核酸の詳細な塩基配列情報 を得るために利用することは明らかに今まで行なわれなかった。現在のＤＮＡ塩 基配列決定法の制約を考慮すると、（１）似た大きさのＤＮＡ断片をゲル電気泳 動で分離する必要のなく、（２）−回の操作で非常に長いＤＮＡ＊の塩基配列を 決定することが可能であり、そして（３）自動化が可能である、別の塩基配列決 定法が開発されれば学会あるいは産業界にとって有利であろう。
発明の開示 本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡ分子の塩基配列を、複数の混合オリゴヌクレオチ ドプローブを用いて決定する方法を開発することを目的とする。塩基配列の情報 は、一連のハイブリダイゼーションを行い、塩基配列を決定するべきＲＮＡまた はＤＮＡ中にプローブの配列の相補鎖が各プローブについて何回現れるかを決定 することによって得られる。ＲＮＡあるいはＤＮＡの塩基配列はこの情報とプロ ーブの塩基配列の知識から再構築される。
塩基配列を決定すべき核酸を本明細書において標的配列と呼称する。
本発明に用いられる混合オリゴヌクレオチドプローブは、そのメンバーの塩基配 列が標的配列中のあらかじめ配列決定された長さのサブ塩基配列に相補的な全て の可能な塩基配列を包含するセットから選ばれる。セットから選ばれた一つまた は複数のプローブが既知の量の標的配列と結合するように、例えばニトロセルロ ースフィルターあるいは類似した物質上で、実質的に、完全に相補的なプローブ のみが標的配列とハイブリダイゼーションできる条件下で一連の各々のハイブリ ダイゼーションを個別に行う。対をつくらない塩基を含むプローブは実質的に例 えば洗浄により取除かれ、そして標的配列にハイブリダイゼーションしたまま残 った完全に相補的なプローブの量を決定する。
本発明の一実施態様において、１セツトのプローブは４つのサブセットを含む。
４つのサブセットのそれぞれは、プローブの大きさくあらかじめ決定されている ）に関して、４つの塩基のうちの一つについての全ての可能な配列に相当するプ ローブを含む。例えば、第一のサブセットはＧを含む全ての可能な配列に相当す るプローブを含みうる；第二のサブセットはＴを含む全ての可能な配列に相当す るプローブを含みうる：そしてＣおよびＡについても同様である。もし、プロー ブがそれぞれ８塩基の長さを持つならば、アデノシンサブセットに含まれるプロ ーブの一つは次のように表わされ得る：のうちのどれが占めてもよいことを意味 する。故に上記のプローブはｌＸｌＸ３Ｘ３ＸＩＸ３Ｘ３Ｘ１＝８１の重複度、 又は縮退度を持つことになる。どのサブセットが考慮されているのかが状況から 明らかなときには上記の記述をＡＡＯＯＡＯＯＡ、ここでＡはデオキシアデノシ ンを表しモして０はデオキシアデノシンが不在であることを表す、と単純化する 。
好ましくは、塩基対合の特性からプローブの複数性が減少させられるように塩基 類縁体をオリゴヌクレオチドプローブに用いる。例えば式■に示されたプローブ では、デオキシイノシン（Ｉ）はＡおよびＣとはほぼ同じくらい強い塩基対を形 成するが、ＧあるいはＴとは弱いまたは不安定な塩基対を形成するのみであるた め、デオキシイノシンはプローブ中のＧとＴに置き換えることかで同等であるが ずっと低い重複度（すなわち、たった１６）を持つプローブが次のように書き表 され得る；一般に、４つの天然の塩基のうち２つまたは３つと強い塩基対（すな わち結合エネルギーにおいてもとの塩基対とほぼ同等の）を形成しそして決った 塩基（下文中で定義される）の相補塩基と弱いまたは不安定な塩基対を組む塩基 類縁体が好まれる。このような塩基類縁体は本明細書中で重複度減少類縁体と呼 ぶ。
全てのプローブが同じ長さであることは必須ではないが、その長さは既知であり そしてその塩基配列はあらかじめ決定されていることが重要である。一般に、プ ローブはあらかじめ決められた数の位置で既知の塩基（必ずしも同じ種類である 必要はない）で、例えば式ＩのＡと固定され、そして残りの位置はあらかじめ決 められたセット、例えば式ｌにおけるようにＴＳＧ、およびＣ１または式■にお けるように！およびＣから任意に選ばれた塩基によって各々占められるであろう 。プローブ中の塩基対が縮退していない位置、すなわち一つの天然の塩基のみを 持つ位置を本明細書中では固定位置と呼ぶ。固定位置を占めている塩基を本明細 書中では固定塩基と呼ぶ。例えば、式１及び■のプローブにおける固定塩基は、 プローブ３′端から位置１．　２．　５および８のデオキシアデノシンである。
一般に本発明におけるセットおよび／またはサブセットは、それぞれ、プローブ の長さより短いまたはに等しい長さの複数の固定および非固定の位置の各々の順 列の配列と同等の固定および非固定の位置の配列を持つ少なくとも１つのプロー ブを含む。すなわち、本発明の重要な点は、固定および非固定の位置の複数の組 合せの各々の固定および非固定の位置の全ての可能な順列に対応したサブ塩基配 列（これはプローブ全体の長さまでにおよぶ）を集合的に含むということであり 、その際、その複数の組合せは、ゼロからすべての固定位置を含む組合せを包含 する。例えば、本発明におけるプローブのサブセットの一つを考えてみよう。こ のサブセットは８量体のプローブからなり、その固定位置はデオキシアデノシン のみを含みかつその最初の（すなわち最も３′側の）位置が固定されている。式 ■および■のプローブはそのようなサブセットの一員である。そのようなサブセ ットの中には、固定位置を有さない（そのような順列は１つ＝ＡＯＯＯＯＯＯＯ ）、固定位置１つ（そのような順列は７つ、例えばＡＯＯＯＡＯ００）　、固定 位置２つ（そのような順列は２１個、例えばＡＯ０ＡＡＯ００）　、固定位置３ つ（そのような順列は３５個、例えばＡＯＯＯＯＡＡＡ）　、固定位置４つ（そ のような順列は３５個、例えばＡＯＡＡＡＡＯＯ）　、固定位置５つ（そのよう な順列は２１個、例えばＡＡＡｏｏＡＡＡ）　、固定位置６つ（そのような順列 は７つ、例えばＡＡＡＡＯＡＡＡ）、および固定位置７つ（そのような順列は１ つ：ＡＡＡＡＡＡＡＡ）を有するサブ塩基配列に対して固定及び非固定位置の可 能な全ての順列の各々に相当する位置２から８が固定及び非固定位置となってい るサブ塩基配列を持つ少なくとも一つのプローブが存在する。故にこのサブセッ トは少なくとも１＋７＋２１＋３５＋３５＋２１　＋７＋１＝１２８個の要素を 持つ。
標的塩基配列中に一つあるいは複数のあらかじめ決められた既知の塩基配列の領 域が存在すると、標的塩基配列の再構築が容易になる。従って、望ましい実施態 様においては、標的塩基配列はひとつあるいは複数の既知の塩基配列の領域を含 み、その際、これらの領域を本明細書において、既知配列領域と呼ぶ。更に望ま しくは、標的配列が第１と第２の既知配列領域を含み、その際第−および第二の 既知配列領域は未知の塩基配列を含む標的配列の領域の両端に位置する。この未 知の塩基配列を本明細書において、未知配列領域と呼ぶ。もつとも望ましくは、 第１と第２の既知配列領域は、少な（とも最長のプローブ配列の長さである。
■、プローブの合成と標識 本発明に用いる混合オリゴヌクレオチドプローブは自動ＤＮＡ合成機、例えば、 アプライドバイオシステム（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔＹ、ＣＡ）　３８１　Ａまた は３８０Ｂ型、またはその類似の機器を用いて合成するのが望ましい。例えば、 Ｗａｌｌａｃｅ　（ワラス）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ。
Ｖｏｌ、６．　ｐｇｓ、　３５４３−３５５７　（１，９７９）、および０１ｉ ｐｈａｎｔ　（オリファン）ら、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎａｚｙｍｏｌ、、　Ｖｏｌ 、１５５．　ｐｇＳ　５６８−５８２（１９８７）によって開示されているよう に、非固定位置で適当なヌクレオチド前駆体の混合物を、伸長中のオリゴヌクレ オチド鎖と反応させてその位置に異なった塩基を有する複数のオリゴヌクレオチ ドを同時に合成する。プローブは現在使われているどの化学、例えばフォスファ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　Ｖｏｌ、　２２．ｐｇｓ、１８５９−１８ ６２　（１９８１）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（カルセアス）ら、アメリカ合衆国特 許第４，４１５、７２３号、同第４．４５８．０６６号および同第４．５００． ７０７号：ホスホトリエステル法、　Ｉｔａｋｕｒａ（イタクラ）、アメリカ合 衆国特許第４．４０１．７９６号；またはヒドロテンホスホネート法、例えばＦ ｒｏｅｈｌｅｒ　（フロエラー）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１４．　Ｉ）ｇｓ、　５３９９−５４０７　（１９８６ ）　；あるいはそれらの類似の方法を経ても合成され得る。いったん合成された ら、オリゴヌクレオチドはよく知られている技法、通常ＨＰＬＣあるいはゲル電 気泳動により標識のために精製される、例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｕｓｅｒｓ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、　ｌ ５ｓｕｅＮｏ、１３−Ｒｅｖｉｓｅｄ　（Ａｐｒｉｌ　１．１９８７）。
プローブの長さの選択はこの発明の重要な一面である。（１）標的配列に完全に 相補的なプローブを優先的にハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション 条件を操作できるその容易さ、（２）標的配列にハイブリダイズした完全に相補 的なプローブのおおよその総量を区別することができること（例えばプローブが 比較的長くて標的に完全に相補的なプローブ配列が現われる確率が低いならば、 標的に１．　２または３コピーのプローブが存在することを推定するために（例 えば）１０．２０゜３０ピコモルといった範囲のプローブの量を区別する必要が ある；もし、プローブが比較的短くて標的配列に完全に相補的なプローブ配列が 現われる頻度が高いならば、標的上に１１．１２．あるいは１３コピーのプロー ブが存在するかどうかを推定するために（例えば）１１０．１２０、あるいは１ ３０ピコモルの範囲内のプローブの量を区別する必要がある；後者の量の全体に 占める比の間の差は小さいため、推定されるコピー数に対する信頼度は低いかも しれない”）；　（３）プローブの重複度は有意なコツト値でのハイブリダイゼ ーションを可能にしているかどうか（より長いプローブはより短いものより重複 度が高く、ハイブリダイゼーションのためのコツト値も高くなる。より短いプロ ーブについてはその逆が成立つ’）；　（４）各タイプのプローブを用いて別々 にハイブリダイゼーションを行うことの実用性（上述のようにより長いプローブ はより大きなプローブのセットを生むことになる）；そして（５）塩基配列の再 構築の問題に取り組めること（より短いプローブを用いるとこの様な傾向がでる のであるが、標的配列上に存在するそれぞれのプローブタイプのコピー数が増え るほど再構築の問題はより困難になる）を含むいくつかの因子が、与えられた適 用例において長さの選択に影響を与える。７から１１塩基の範囲のプローブの大 きさが望ましい。更に望ましくはプローブの大きさは８〜１ｏ塩基までの範囲に あり、そして最も望ましくはプローブの大きさは８から９塩基の範囲にある。
プローブの多重度あるいは縮退を減少するために縮退減少類縁体をプローブの非 固定位置に使用するのが望ましい。この目的のために多くの合成あるいは天然ヌ クレオシドおよびヌクレオチドの類縁体が手に入る、例えば５ｃｈｅｉｔ　（シ ャイト）、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ａｎａｌｏｇｓ　（ｒヌクレオチド類縁体Ｊ 　）　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ ０）。例えば、縮退減少類縁体には、非固定位置でＧおよびＴを置換するために シトシンまたはアデノシンプローブにおいて使用するためのデオキシイノシン、 非固定位置でＡおよびＴを置換するためにシトシンまたはグアノシンプローブに おいて使用するための２−アミノプリン、およびＴおよびＣを置換するためにア デノシンまたはグアノシンプローブにおいて使用するためのＮ４−メトキシデオ キシシチジン、Ｎ４−アミノデオキシシチジン、または５−フルオロデオキシシ ラリジンが含まれる。
オリゴヌクレオチドプローブ中でのデオキシイノシンの使用は、Ｍａｒｔｉｎ　 （７−チン）ら（上皇にて引用）　；５ｅｅｌａ（セータ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１４．　ｐｇｓ、　１８２５ −１８４４　（１９８６）；　Ｋａｗａｓｅ　（カヮセ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１４．　ｐｇｓ、７７２７−７７ ３７　（１９８６）；０ｈｔｓｕｋａ　（オオッカ）ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、２６０゜ｐｇｓ、　２６０５−２６０８　（１９８５）； およびＴａｋａｈａｓｈｉ（タカハシ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８２．　ｐｇｓ、　１９３１−１９３５（１９８ ５）によって開示されている。自動ＤＮＡ合成のためのデオキシイノシンホスホ ラミダイトの前駆体は例えばアプライドバイオシステム（フォスターシティ、カ リフォルニア）から購入することができる。Ｎ４−メトキシシチジンの合成とそ のオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、Ａｎａｎｄ（アナンド）ら、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１５．　ｐｇｓ、　８ １６７−８１７６　（１９８７）によって開示されている。２−アミノプリンの 合成とそのオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、Ｅｒ１ｔｊａ　（エリトヤ ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１４． 　ｐｇｓ、　５８６９−５８８４（１９８６）によって開示されている。５−フ ルオロデオキシウリジンの合成とそのオリゴヌクレオチドプローブへの導入は、 Ｈａｂｅｎｅｒ（ハベナー）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、、　Ｖｏｌ、８５．　ｐｇＳ、　１７３５−１７３９　（１９８８）によっ て開示されている。そしてＮ４−アミノデオキシシチジンの調製は、Ｎｅｇｉｓ ｈｉ（ネギシ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｏｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
Ｖｏｌ、　１１．　ｐｇｓ、　５２２３−５２３３　（１９８３）によって開示 されている。
本発明においては、ヌクレオシド類縁体もまた、種々の相補的塩基間の結合エネ ルギーの差を減少させるために用いらる。特に２−アミノアデニンは、プローブ または標的配列中のチミンを置き換えてＡ−Ｔヌクレオシド対とＧ−Ｔヌクレオ シド対の間の結合エネルギーの差を縮めることができる、例えばＫｉｒｎｏｓ　 （キルノス）ら（主文中にて引用）、　Ｃｈｏｌｌｅｔ　（コレット）ら（主文 中にて引アデニンを含むオリゴヌクレオチドの合成方法は、Ｃｈｏｌｌｅｔ（コ レット）ら（主文中にて引用）　；Ｇａｆｆｎｅｙ（ガフニー）ら、　Ｔｅｔｒ ａｈ封匹ムＶｏ１．４０．　ｐｇｓ、　３−１３　（１９８４）、およびＣｈｏ ｌｌｅｔ（：）レット）ら、Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｃｒｉｐｔａ、Ｖｏｌ、２６、 　ｐｇｓ、　３７−４０　（１９８６）によって開示されている。同様にして、 ２−アミノ−２゛−デオキシアデノシンは、Ａ−Ｔ塩基対が生じる位置での結合 エネルギーを増加させるためにデオキシアデノシンを置き換えることができる、 いくつかの実施態様においては、縮過度のより高いプローブを、標的配列につい て、全体として同じ情報を得ることのできるいくつかの縮退度のより少ないプロ ーブで置き換えるのが望ましいかもしれない。例えば、９量体プローブＡＯＯＯ ＯＯＯＯＯを考えてみる。このプローブは重複度のより少ない３つのプローブＡ ０００００００Ｃ，ＡＯＯＯＯＯＯＯＧおよびＡＯ００００００Ｔで置き換えら れ得る。故に、２回余分にハイブリダイゼーションを行うことによってセット中 の最も重複度の高いプローブの重複度を２５６から１２８に減少できる（非固定 位置にはデオキシイノシンを使用すると仮定して）。
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、プローブを形成するために、直接あるい は間接に放射性物質、蛍光性物質、高電子密度の物質あるいはその類縁体を付加 するという方法を包含する種々の方法で標識され得る。プローブの中のそれぞれ の配列が同様の強度のシグナルを産生ずることができ、その結果プローブ数の定 量が可能であることのみが重要である。反応性の高い反応基でオリゴヌクレオチ ドをその誘導体に変化させ標識を付加する幾つかの方法が摘要可能である、例え ば、Ｃｏｎｏｌｌｙ（コノ１３１−３１３９　（１９８７）；　Ｇｉｂｓｏｎ（ ギブジン）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１５、　ｐｇＳ。４８３７−４８４８　（ １９８７）；およびＭａｔｈｅｗｓ（マクュース）ら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ９．　Ｖｏｌ、１６９．　ｐｇｓ、１−２５　（１９８８））。
ひとつの望ましい実施態様について、本発明におけるオリゴヌクレオチドは標準 的な方法、例えばＭａｘｉｍ　（マクサム）およびＧｉ　１ｂｅｒｔ（ギルバー ト）、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。
、　Ｖｏｌ、　６５．　ｐｇＳ、　４９９−５６０　（１９８０）ニよッテ、ｓ ｔＰで放射線で標識される。望ましくは０Ｐで標識された本発明におけるプロー ブは、約１〜１０ｎｇ／ｍ１．更に望ましくは約１〜５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で ニトロセルロース、ナイロン、あるいはその類縁体に結合した標的ＤＮＡに適用 される。プローブの比活性は約１〜５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍｌの範囲内にあること が望ましい。
■、ハイブリダイゼーション プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは、不一致のプローブ配列およ び非特異的に結合したプローブ配列をプローブ配列と標的配列の間に完全に相補 対を作って形成される２本鎖から分離させることが出来るような方法で行われる 。通常、この分離は洗浄の段階で行われる。望ましくはハイブリダイゼーション の第１ステツプは洗浄やその他の処理中に標的配列が失われる可能性を最小にす るために標的配列を固定する。標的配列を固定する方法は、標的の長さ、標的の 複製をつくるのに用いられた方法、およびそれに類することなどいくつかの因子 に依存して選ばれる。望ましくは、標的配列はそれをニトロセルロース、ナイロ ン−６６、またはその類縁体、あるいはミクロスフェア−誘導体のような基質ま たは固相支持体に連結することによって固定される、例既知量の一本鎖あるいは 二本鎖の標的配列の複製が基質あるいは固相支持体に固定される。本明細書で用 いられる「既知量」とはそれを基にして完全な対を形成するプローブの全体量を 決定し得る量のことを意味する。いくつかの実施態様においてはこれは標的配列 の既知のグラム数またはモル数を意味する。別の実施態様においては、プローブ の全体量に相当するシグナルが複数個の支持体からのシグナルを比較することに より、あるいは特別に供給された標準のシグナルを比較することにより識別でき るように複数個の固相支持体にのせられた同量の標的配列のことを意味すること もある。好ましくは、固定手段は、標的配列により最大許容量まで荷重され、そ の結果ハイブリダイゼーション後に最大のシグナルが得られる。標的配列は２本 鎖の形で合成され、変性され、続いて、望ましくはニトロセルロース、ジンスク リーン、あるいはその類縁体である固相支持体である固体手段に適用されること ができる。標的配列が２本鎖の形で調製される場合には、好ましくは、そのクロ ーニングベクターから平滑末端を生じる、ひとつまたは複数のエンドヌクレアー ゼ、例えばＥｃｏＲＶ、Ａｌｕ　１．Ｂａ　Ｉ　Ｉ切り出される。この場合には 、コーディングすなわちセンスおよび非コーディングすなわちアンチセンスの両 鏡が同時に配列決定される。塩基配列の相補性のために、再構築の問題は一本の 鎖の場合より難しいということはない。
二本鎖の標的配列を調製するのに適したベクターはｐＵＣ系のベクターである、 例えばＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　（ヤニッシューペロン）ら、　Ｇｅｎｅ 、　Ｖｏｌ、　３３．　ｐｇｓ、　１０３−１１９　（１９８５）。これらのベ クターはポリリンカーの領域に特異的な制限酵素切断部位を加えることにより容 易に改変される。新しい特異的な制限酵素切断の部位は、切断の後、平滑末端を 残す制限酵素の中から選ばれる。例えば、そのような部位を含んだ化学合成した 断片をｐＵｃ１８あるいはｐＵｃ１９のＨｉｎｄｌＩ［とＥｃｏＲＩ切断部位の 間に挿入することができる。これらのベクターにおいて列の前駆体（すなわち未 知配列領域）はすでに存在するポリリンカ一部位、例えばＢａｍＨＩ切断部位に 挿入され得る：ベクターを増幅し、単離することができる；そして標的配列は平 滑末端を生じる制限酵素により切り出され得る。そして未知配列領域と共に切り 出されたポリリンカー領域の断片は、標的配列の既知配列領域となるＤＮＡをニ トロセルロースフィルターに固定するのに好んで用いられる方法は、本質的には 、Ｋａｆａｔｏｓ（カファトス）らによって記述されたものである（下車中にて 引用）。１ミリメーター四方のフィルターあたり約１μｇまでの標的配列がのせ られる。添加に先立ってＤＮＡは望ましくは０．３から０．４Ｎの水酸化ナトリ ウム中で約１０分間変性され、その後、同容量の冷水で、または随意には冷却し た２Ｍ酢酸アンモニウムで冷やされ、約１６μｇ／ｍｌの濃度にされる。既知量 の変性した標的を、析出した液体の容量を注意深く調節しながらフィルター上に スポットする。全てのサンプルがスポットされた後（約１．５分）、フィルター を場合により約ｏ、０２〜０．２Ｎ水酸化ナトリウムを含む１Ｍ酢酸アンモニウ ム、ｐＨ７，８〜９゜０を一滴垂らして、洗浄することも可能である。フィルタ ーを例えば約２００ｍ１の４ＸＳＳＣ（下車中で定義する）で洗浄することもで きる。フィルターを風乾し、２×デンハルト溶液中（下車中で定義する）で少な くとも１時間浸とうし、水を切りそして再び風乾し、そして真空中８０℃で約２ 時間ベークする。
プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは通常三段階二ブレハイブリダ イゼーション処理、プローブの添加、および洗浄を含む。プレハイブリダイゼー ション処理の目的は、プローブの、固定手段および非標的の核酸への非特異的な 結合を減少させることである。これは通常、可能な非特異的な結合部位を、たん ばく質、例えば血清アルブミン（デンハルト溶液の主要な内容物）のような阻害 物質でブロックすることにより達成される。ニトロセルロースあるいはナイロン −６６（例えばジンスクリーン、ナイトラン、あるいはその類縁体）に固定され た標的配列の場合、プレハイブリダイゼーション処理は、５〜ＩＯＸデンハルト 溶液で、弱い界面活性剤、例えば０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 好ましくは含む２〜６ＸＳＳＣで、約２５℃から６０”Ｃの範囲内の温度で１５ 分から１時間処理することを含み得る。Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ ｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｖｏｌ、２３．　ｐｇＳ、　６４１−６４５　（１９６ ６）に開示されているデンハルト溶液は、ｌＯＸの濃度で０．２％のウシ血清ア ルブミン、０゜２％のポリビニルピロリドン、および０．２％のフィルコールか らなる。もう一つの、ハイブリダイゼーションの技術には標準的な溶液であるＳ ＳＣは、ｌ×の濃度で、ｐＨ７，０で０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１５ Ｍのクエン酸ナトリウムからなる。望ましい処理の時間、温度、そして組成はそ れぞれの態様によって異なるプローブは、固定されたＤＮＡに対して、プレハイ ブリダイゼーション溶液、例えば５〜ＩＯＸデンハルト溶液と実質的に同等の溶 液中、２〜６ＸＳＳＣおよび穏やかな界面活性剤、例えば０．　５％ＳＤＳで、 約１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲で適用されるのが望ましい。更に望ましくは 、プローブの濃度は約１〜５ｎｇ／ｍｌの範囲にある。ハイブリダイゼーション はプローブと標的の間の期待される５０％解離温度、Ｔ、より１０〜２０℃低い 温度でなされるのが望ましい。すなわち、全ての完全に相補的なプローブの高い 割合、例えば８０〜９０％以上が安定な二本鎖を形成する温度が選ばれる。８量 体のプローブでは望ましいハイブリダイゼーションの温度は約１０〜１８℃の範 囲内にある。ハイブリダイゼーションの時間は望ましくは約３〜１６時間の範囲 内である。高度に縮退しているプローブ、例えばＯＡＯＯＯＯ００内の特定の配 列の有効濃度は、縮退層の低いプローブ、例えばＡＡＡＯＡＡＡＡよりかなり低 いため、縮退層の異なるプローブには異なるハイブリダイゼーションの時間が選 ばれ得る。このように、縮退層のより高いプローブが完全に相補的な配列の充分 な結合を達成するためには、より高いＣｏｔ値（これは通常より長いハイブリダ イゼーションの時間を意味する）が要求され得る。
望ましくは、全てのプローブに対して、単一のハイブリダイゼーションの時間が 選択され、これはもっとも縮退しているプローブのハイブリダイゼーションのキ ネティクスによって定められる。オートラジオグラフィーの後、相対的なシグナ ルを比較するとき、プローブの縮退層か重要となる。より高い縮退層を持つプロ ーブはより低い縮退層を持つプローブより低いシグナルを与えるだろう。故に、 相対的なシグナルは、同等の縮退層を持つプローブに由来するオートラジオグラ フの間でのみ比較するべきである。それぞれのプローブのための、または少なく ともそれぞれの縮退層のクラスのためのポジティブおよびネガティブコントロー ルを同時に実施することにより、１回の比較が援助される。
非特異的に結合したり、誤って対を形成しているプローブ配列を洗浄によって取 除くことは本発明の重要な側面である。温度および洗浄の時間は、最大量の非特 異的に結合したプローブ配列、および誤って対を形成したプローブ配列を除去し 、一方、同時に標的と完全な相補二本鎖を形成しているプローブ配列の最大数を 維持するように選ばれる。プローブの長さと塩基組成は、適当な洗浄温度を決定 するにあたって２つの重要な因子である。
望ましい範囲内である、７〜１１塩基の長さのプローブにおいては、完全に対を 形成しているプローブ配列と誤った対を形成しているプルーブ配列の間の２本鎖 の安定性の違いは極めて大きく、それぞれのＴ、はおそらく１０℃かまたはそれ 以上も異なっている。故に、洗浄温度を調節することにより誤って対を形成した ものを選択的に除去することは困難ではない。一方、組成の違い、例えばＧ−Ｃ 含量対Ａ−Ｔ含量はプローブのＴ、に広い巾を与えることになり、洗浄温度を低 くすると非特異的に結合したプローブを除去する能力が減少する。従って、洗浄 温度は非特異結合プローブを除去するために最高でなければならないが、比較的 高いＡ−Ｔ含量を持つ完全に対を作ったプローブまでも選択的に除去してしまう ほど高くはできない。
プローブ結合の配列に特異的な差異を最小にするため、種々の塩基対の結合エネ ルギーの差を最小にするようにハイブリダイゼーションの条件および／またはヌ クレオチド類縁体を選択するのが望ましい。そのような最小化は、完全相補対を 形成するプローブを検出し得る感度を増加させるため、望ましい。このような最 小化は、温度が上昇していく際プローブ／標的二本鎖から一末鎖ブロープおよび 一本鎖標的への転移をずっと鋭くするため、感度が増加する、すなわち、プロー ブ／標的のＴ、の巾がより狭い。例えばハイブリダイゼーションがテトラアルキ ルアンモニウム塩の存在下で起こると、Ｇ−Ｃ対とＡ−Ｔ対の間の結合エネルギ ーの差が減少する、例えばＷｏｏｄ　（ウッド）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８２、　ｐｇｓ、１５８５−１５８８　 （ｉ９８５）。同様に、α−アノメリックヌクレオシド類縁体を使用すると結合 エネルギーが増大ニンの代りに２−アミノアデニンを使用すると結合がよって、 ８Ｍ体のプローブの洗浄の望ましい手順は、フィルターを０．５％ＳＤＳを含む ６ＸＳＳＣ中で約１５分間、約ｌθ〜１２℃の温度範囲で３回洗浄し、続いて３ ．０ＭのＭｅ４ＮＣＩ、５０ｍＭのＴｒｆｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、０．５ ％ＳＤＳで約１０−１２℃の温度範囲で１〜２回洗浄し、さらに続いて３．０Ｍ のＭｅ４ＮＣＩ、５０ｍＭのＴｒｆｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、０．５％ＳＤ Ｓ中で、温度範囲約２４〜２８℃で１．５〜２．５分間洗浄することを含む。９ Ｍ体のプローブの場合、手順は実質的には同じであるが最後の洗浄の温度は約２ ６〜３０℃の範囲内であることが望ましい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄 の後、標準的な技法を用いて結合したプローブの定量的な測定がなされ、例えば 放射性標識されたプローブの場合、オートラジオグラフィーまたはシンチレーシ ョン計測を使用し得る。
■　塩基配列の再構築 再構築の問題の一般的な性質が第１図の例に示されており、この例では４Ｍ体プ ローブの４つのサブセットが、２１量体の塩基配列、ＣＧＡＡＴＧＧＡＡＣＴＡ ＣＣＧＴＡＡＣＣＴを解析するために用いられている。第１図の左側には、固定 塩基と非固定塩基の次の組合せ：ｌ固定と３非固定、２固定と２非固定、３固定 と１非固定、４固定とＯ非固定に対して、デオキシアデノシン、デオキシシトシ ン、デオキシグアノシン、およびチミジンのそれぞれに関して固定及び非固定位 置の全ての可能な順列を持つ４Ｍ体プローブのリストが挙げである。すなわち、 リストは、八と非固定位置、Ｃと非固定位置、Ｇと非固定位置、そしてＴと非固 定位置のそれぞれの全ての可能な順列と同等であるＡ、Ｃ，ＧおよびＴに関して 固定及び非固定の位置の配列を持つ少なくとも１つのプローブを含む。図におい ては、未知配列の長さに等しい、この例では２１の列を持つ２次元のます目の各 行にプローブがひとつある。
６０個のプローブを２１量体に別々にハイブリダイゼーションを行なって得られ たデータが「完全相補対」と書かれた列の下に挙げられている。データは、２１ 量体の４塩基サブ配列と完全な相補性を持っている各プローブタイプの数を示す 。２１量体の配列それ自身の下に完全相補対が現われる塩基配列に沿ってプロー ブが位置付けられている。再構築アルゴリズムの目的は、充分な数のプローブの 位置を決定し標的配列が再構築され得るようにすることである。
再構築の問題は多くの方法で取り組むことが出来る。
この問題はある意味で最適である目的物の順列を発見するということを含むとい う点において旅行するセールスマンの問題に似ている。その様な組み合わせの問 題については、ある特殊な態様への最良のアプローチを組み立てる上で指針を提 供する広範な文献が存在する、例えば、ＬａＷａｌｅｒ（ラワラー）ら、　ｅｄ ｓ、、“旅行するセールスマ・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ ｏｎｓ）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５））；　Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ（ キルクパトリック）、Ｊ、５ｔａｔ、　Ｐｈｙｓ、、Ｖｏｌ、　３４．　ｐｇ８ ．９７５−９８６　（１９８４）；　Ｈｅ１ｄ　（ベルト）およびＫａｒｐ　（ カーブ）、Ｊ、Ｓｏｃ、Ｉｎｄｕｓｔ、　Ａｐｐｌ、　Ｍａｔｈｌ、　Ｖｏｌ、 １０．　ｐｇｓ、　１９６−２１０　（１９６２）；およびＬｉｎ（リン）およ びＫｅｒｎｉｇｈａｎ（カーニンガム）、０ｐｅｒ、　Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ　２ １゜ｐｇｓ、　４９８−５１６（１９７３）、再構築の問題に対スル望マシイア プローチは、標的配列がひとつかそれ以上の既知配列領域を含むことを要求する 。特に、最初の既知配列領域は標的配列の一端に存在しそして２番目の既知配列 領域は標的配列の他端に存在する。２つの既知配列領域の存在により、簡単でか つ効率のよい再構築アルゴリズムの構築が可能となる。おおざっばに言えば、再 構築の問題は標的配列に相当する互いに重複するプローブ配列の順序を見出す問 題である。既知配列領域は再構築における開始と終点のプローブ配列を定義する 。間に存在する未知配列領域は、残されたプローブ配列からその各々の連続して 選択されるプローブがその前に選ばれたプローブ配列と正しく重複していること を満たすことにより再構築され得る。第２図はその様なアルゴリズムの流れ図で ある。これは交互に行われる２つの部分からなり、ハイブリダイゼーションのデ ータ：（１）既知配列領域のひとつから出発して、正しく重複した固定開始位置 および固定終末位置を持つプローブから候補配列を構築することおよび（２）他 の既知配列領域から出発して、正しく重複した固定終末位置および固定開始位置 を持つプローブから候補配列を構築することより決定された同じセット（本明細 書中ではデータセットと呼ぶ）からプローブを引き出す。「正しく重複した」と いう言葉はこのセクションの始めに述べられ、そして第１図に記載されている意 味で、重複していることを単に意味している。故に、このアルゴリズムでは固定 開始位置（３°）または固定終末位置（５’）、あるいはその両者を持つプロー ブのみが再構築に使用される。これらの２つの種類のブローブは本明細書中でＦ ＩＰプローブおよびＦＦＰプローブと呼ぶ。
アルゴリズムのために、一番目および２番目の既知配列領域のヌクレオチド配列 によって２種の数のセット（あるいは実行状態に依存した論理変数）が定義され る。
これらのセットはそれぞれ開始左方レジスターおよび開始右方レジスター２と呼 ぶ。レジスターの大きさは、用いられるプローブの長さに依存する。通常、レジ スターはＬ−１個の要素、またはエントリー、ここでＬはプローブの長さである 、を持つ。開始右方レジスターから出発して、アルゴリズムは標的配列と完全相 補対を形成する全てのＦＦＰおよびＦＩＰプローブとレジスターのエントリーを 比較する、４゜比較は、選択されたプローブの２番目からＬ番目の塩基と、右方 レジスターのナンバー（あるいはエントリー）ｌからＬ−１との間である。
すなわち位置２の塩基は右方レジスターの位置Ｉのエントリーと比較され、位置 ３の塩基は右方レジスターの位置２のエントリーを比較され、そして以下同様で ある。
まず、上述のように、レジスターのエントリーは１番目と２番目の既知配列領域 の塩基によって決定される。もし、比較の結果、Ｌ−１（ｍｌの位置がそれぞれ 正しく重複するならば、その時レジスターの現在の内容は新しい右方レジスター に入力されそして続いて新しい右方レジスターのエントリーはひとつ右側の位置 に移される。すなわち、新しい右方レジスターのエントリー１は位置２に移され 、エントリー２が位置３へ、そして以下同様である。エントリーＬ−１は消去さ れ、そしてプローブの開始位置に存在する固定塩基（またはそのある代表）が１ 番目に入力される。次に、新しい右方レジスターと選択されたプローブが次の比 較のために維持されるために、レジスターおよび、選択されたＦＩＰプローブの 開始固定塩基と正しく重複するＦＦＰプローブが見出されなければならない（も ちろんＦＩＰプローブが同時にＦＦＰプローブでなければ）８゜その様な選択が なされると（すなわち４と８）、選択されたプローブはデータセットから除去さ れる。新しい右方レジスターは、その選択が現在のレジスターに導いた、正しく 重複しているＦＩＰプローブの関連したセット、および正しく重複しているＦＦ Ｐプローブの関連したセットとともに保存される。
それぞれの新しい右方レジスターが形成された後、ＦＦＰプローブがまず最初に 選択されそしてＦＦＰプローブの位置１−Ｌが左方レジスターのエントリー！− Ｌと比較されること以外、実質的に右方レジスターと同じ方法で既に存在する左 方レジスターを延長することにより、ひとつあるいは複数の左方レジスターが形 成される１６および１８゜ＦＩＰ及びＦＦＰプローブは、データセットに残って いるプローブから選択される。すなわち、以前に右方あるいは左方レジスターを “延長”するのに選択されたいかなるプローブをも選択することができない。こ のことは、第一の後の連続的な繰り返しにおいて形成される右方レジスターにつ いても保持される。これらの比較の結果、対をなす右方及び左方レジスターが形 成され、そしてそれぞれの対には４セツトのプローブが関連している、２０：（ ｉ）右方レジスターを延長するために選択されたＦＩＰプローブのセット、（ｉ ｉ）右方レジスターとＦＩＰプローブに正しく重複するように選択されたＦＦＰ プローブのセット、（ｉ　ｉ　ｉ）左方レジスターを延長するために選択された ＦＦＰプローブのセット、および（ｆｖ）左方レジスターとＦＦＰプローブに正 しく重複するように選択されたＦＩＰプローブのセット。それぞれのステップｉ 　（第２図参照）において、Ｍ１＋１個のそのような対とそれに関連したセット が形成される。
プローブとレジスターの位置の間の比較は以下のようになされる。レジスターの エントリーは常に塩基ＡＳＣ１Ｇ、またはＴ（あるいはそれらを代表するもの） である。プローブの位置は常にある塩基によって、またはある塩基のないことに よって占められる。上述より、プローブは例えばＡＯＡＡＯ００Ａという記号で 表わされ得ることを思い出してほしい。０はこの場合Ｃ，Ｇ、Ｔ、またはそれら の縮過度減少類縁体を表わす。別の言葉で言えば、０は「Ａでない」ことを示す 。比較は（レジスターからの）塩基と（比較されているプローブからの）ある塩 基あるいはその塩基以外のものの真実の値を決定することを必要とする。例えば 、レジスターエントリーがＡでかつプローブエントリーが「Ｔではない」ならば 、その時「ＡでありＴではない」の論理的操作は論理的に真である。故に、正し い重複が存在する。他方、プローブエントリーが「Ａでない」ならば、その時「 ＡでありＡではない」の論理的操作は論理的に偽りである。従って、重複は正し くなくそしてプローブは拒否される。
連続的なステップにおいて、レジスターのｍｌ対のそれぞれがそれぞれのデータ セットのプローブと比較され、その際次々に、Ｍ、や、対のレジスターのセット が生じる。それぞれのステップで、データセットの大きさは２つあるいはそれ以 上のプローブずつ減少され、そしてそれぞれの候補配列は各々ｌ塩基ずつその大 きさを増加される。レジスターが、関連するデータセット内の残っているプロー ブのそれぞれと比較され、そして正しく重複するプローブが見出されないときは 、レジスターとその関連するセットは消去される６−１４゜データセットの全て のプローブが使われると、アルゴリズムは停止する（すなわち、４つの関連する セットのひとつに分類される）。ひとつより多い候補配列が形成された場合、あ るいはデータの統一性を検討することが望まれた場合には、最初の左方レジスタ ーと固定終末位置及び標的配列と完全な相補性を持つプローブセットで出発して 一連の繰返しの比較の同じ工程が遂行され得る１０−１６゜この場合、開始左方 レジスターのエントリー１からＬ−１までがプローブの位置ｌからＬ−１までの それぞれと比較され、そしてｊ回目の比較の後のひと続きのレジスターＲ８が現 在のエントリーを左に移動し、そして正しく重複しているプローブの終末固定塩 基を新しいレジスターの位置Ｌ−１に入れることによって形成される。上述され たのと同様方法で：次々と候補配列が形成され、そして以前に形成された配列と 比較される。両方のセットに現われる配列だけが保存される１８゜全ての残され た非固定終末および非固定開始位置プローブが各候補のなかで正しく重複してい る位置を見出すことを要求することによって更に消去することが可能である２０ ゜好ましくは、アルゴリズムは平行処理能力を有するコンピューターに入力され る。例えば、付録Ｉのアルゴリズムは、パイパーキューブ平行プロセッサ、例え ば１０２４ノードＮＣＵＢＥ／ｌｅｎ：７ンビユーター（エヌキューブ社（Ｎｃ ｕｂｅ　Ｃｏｒｐ、）、　Ｂｅａｖｅｒｌｏｎ、Ｏｒｅｇｏｎ　）のそれぞれの ノードに入力され得る。
上述のアルゴリズムは必ずしも全ての場合に唯一の解答を与えるとは限らない。
一般に実質的にプローブよりも長い高頻度の繰返しの領域（例えばＡＣＡＣＡＣ ＡＣ・・・、ＧＴＣＧＴＣＧＴＣ・・・またはそれに類するもの）あるいは一定 の領域（例えばＡＡＡＡＡＡＡ・・・、またはそれに類するもの）は唯一ではな い解答を与える。例えば、（上のアルゴリズムを用いて）異なるタイプの数塩基 が集って現われるひとつの塩基タイプの長いひと続きの配列を含む標的配列を唯 一に再構築するのは不可能である。故に、もしＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡという配列を含む配列を再 構築するのに４量体プローブか用いられた場合、このＡの配列の中のＧＣＡＴの 位置を疑いなく決定することはできない。ある場合には、異なる解答が見出され るならば、標的配列の一通りに決定されなかった部位を、標準的な方法で配列決 定することにより、正しい配列が識別され得る。
１、３３．　ｐｇｓ、　１０３−１１９　（１９８５）により記載され、そして 広く商業的に入手可能、例えばベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（Ｇａｉｔｈ二本 鎖ＤＮＡが得られる。ｐＵｃ１９の大規模分離は、例工ばＭａｎｉａｔｉｓ　（ マニアテス）ら、“分子クローニング・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９８２ ）により開示されている標準的な方法により行われ得る（すなわちアルカリ溶解 に引続き塩化セシウム−エチジウムプロミド勾配中での平衡遠心を行う）。ある いは、精製されたｐＵｃ１９は、必要とされる時、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商業的に購入される。
１ｍｇのｐＵｃ１９のＤＮＡを９５％エタノールで沈衝液（例えば、５０　ｍＭ 　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）、　１０　ｍＭ　Ｍ ｇＣ１＊　、　１０　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１１００ｕウシ血清ア ルブミン）中で、３７℃で約２．０時間再度懸濁する。０．５ＭのＥＤＴＡ　（ ｐＨ７，５）を添加することにより反応を停止した後、制限酵素緩衝液をキシレ ンシアツールと混合しそして８％ポリアクリルアミドゲルに乗せ電気泳動する。
１１９塩基対の断片を含むバンドを切り出し、そしてＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ 　（マニアテス）らによって１７８ページに（主文中にて引用）記載されている ように溶出する。
断片は、ｌｎｇｌｏ、２ＮのＮａＯＨ１００μｌで、１０分間再度懸濁され、冷 却され、そして同容積の１ＯＸＳＳＣ（１，５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１５ Ｍクエン酸ナトリウム）と混合される。この断片溶液の１００μｍサンプルをス ロットプロット機器、例えば１１個の７２ウエルのミニフォールド■微量サンプ ルろ過マニホールド（シュレイヒャア・アンド・ジュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　ａｎｄ　５ｃｈｅｕｌｌ）、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨから入手可能）のウェル にピペットで注入し、その際それぞれの機器は前にＩ　Ｘ５ＳＣ中に１５〜２０ 分浸されたＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ膜を保持している。２時間後、溶液は穏やかに 膜を通して吸引され、２ｘｓｓｃで洗浄され、そして乾燥される。乾燥後、膜は ８０°Ｃで２〜４時間ベークされる。プローブを添加する前に膜はプレハイブリ ダイゼーション混合物で処理される（０．５％ＳＤＳを有する１０×デンハルト 、６０℃で１時間、続いて２ＸＳＳＣで洗浄）。
ハイブリダイゼーション用のプローブはアプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）　３８０　Ａ型ＤＮＡ合成機によ りホスホラミダイト化学により合成される。４　Ｘ　１９６＝７８４の混合オリ ゴヌクレオチドプルーブが用いられ、その際、８量体配列のそれぞれの種類のプ ローブは、固定開始位置あるいは固定終末位置のどちらかを有する（付録■参照 ）。プローブのシトシン及びアデノシンサブセットの非固定位置はそれぞれデオ キシアデノシンおよびデオキシイノシンならびにデオキシシトシンおよびデオキ シイノシンによって満たされる。プローブはＭａｘｕｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ ｔのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼプロトコール（Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、　Ｖｏｌ、　６５．　ｐｇＳ、　４９７−５６０　（１９８０））に従ってＳ ″Ｐで標識されマニホールドウェルに５×デンハルト、５ＸＳＳＰＥおよび０゜ ５％ＳＳＤからなる５００μｌのハイブリダイゼーション混合物中１ｎｇ／ｍｌ の濃度で１８℃で１６時間適用される。ハイブリダイゼーションの後、膜は１２ ℃で０．５％ＳＤＳを含む６ＸＳＳＣで３回洗浄され、続いて１２°Ｃで３．０ ＭのＭｅ、ＮＣ１，５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、０．５％ ＳＤＳで２回洗浄し、そして最後に２６〜２７℃で３．０ＭＭｅ、ＮＣ１，５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、０．５％ＳＤＳ中で２分洗浄する。洗 浄の後、乾燥された膜はＸＡＲ−５フイルム（またはそれと同等なもの）上で２ 〜４日間オートラジオグラフされる。現像されたフィルム上の「スロット」は、 ＬＫＢウルトロスキャンＸＬ（エッグスェル）レーザーデンシトメーターまたは それに類似した機器で分析される。
完全に相補性のあるプローブの数は同じ程度の縮退度を持つプローブの相対的な シグナル強度と比較して決定される。また２本鎖の標的配列が使用されているた め、再構築アルゴリズムに使用されるプローブ数の値は（固定塩基に関して）各 プローブタイプとその相補鎖に対するシグナルの平均である。塩基配列はプログ ラムＲＣＯＮ８によりプローブ数のデータから再構築され、そのコード源は付録 に列挙されている。ＲＣＯＮ８は、標的配列のそれぞれの末端の８塩基の配列は 既知配列領域であることを仮定している。プログラムは左から右へ３′−５°の 方向で記載された非翻訳の配列を返送する。
実施例Ｉ［、９量体プローブを用いたｐＵＣｌ　９の３２３塩基対のＰｖｕＩＩ 断片の塩基配列決定３２３塩基対２本鎖ＤＮＡはｐＵｃ１９のｐｖｕＩＩ切断に より得られる２つの断片のひとつである。３２３塩基対のＰｖｕｌＩ断片の調製 、その変性、そしてそのジンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）支持体への固 定のため、実施例Ｉに記載されたものと同じ方法に従う。プレハイブリダイゼー ション、ハイブリダイゼーションそして洗浄のプロトコールは最後の高温洗浄が ２８〜２９°Ｃで行われること以外同じである。
プローブは実施例工に示されたように合成され、そして標識される。１５５６個 のプローブが使われる。開始あるいは終末の位置に固定塩基を持つ９量体配列の それぞれについてプローブが調製される（すなわちＡ、Ｃ。
Ｇ１及びＴプローブについてそれぞれ３８９個）。実施例工のように、１ｏｏｏ ｏｏｏｏｏとｏｏｏｏｏｏｏ。
ｌ型のプローブは異なった型の固定塩基を持った３つのプローブで置き換えられ 、例えば０ＯＯＯＯＯＯＯＴはＡＯＯＯＯＯＯＯＴ、Ｃ００ＯＯＯＯＯＴ及びＧ ＯＯＯｏ　０００Ｔで置き換えられる。
Ｐｖｕ断片の配列は、特に９量体のプローブデータを適応させる改変された版の 付録Ｉのプログラムを用いて再構築される。８量体版と同様に、プログラムは標 的配列の両端の９塩基配列は既知配列領域であることを仮定第１図は２１量体の 塩基配列が４量体プローブの４つのサブセットによってどのように再構築され得 るかを示すことによって塩基配列再構築の一般的問題について例示している。
第２図は望ましい再構築アルゴリズムを図式的に説明したフローチャートである 。
２　１ｒｅｇ２．ｐｓｅｔ、ｐｓｅｑ８１１（１，１）冨Ｏ ｄｒｌｎｕｍ（ｌｌ＋＋＋０ ｃｉｌｌｎｕｍ（１）−０ １０００１ｉ＝ｉｉ＋１ ｉｆ（ｔａｂ（ｒｒｅｇｌ（ｆｒｘ−１１ｒｐｎｕｍｌｉｌ（ｐｓｅｔ（ｊｊｌ ；！Ｌ１９５０　ｃａｎｔ工ｎｕｓ ｅｌｓｅ ｄｏ　１９００　ｘ−Ｌ８ １９００　ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｅｎｄ工ｆ ｋｓａｖｅｗｋｋ １ｓｅ ｄｏ　２３００　ｋ＝ｗｏ＋ｌ、ｗ ｎｄｉｆ ｓｋｉｐａｍｌ 特表千４−５０１３６２　（１２） ｌｓａ ｗＱ■Ｗ ｃａｌｌ　１ｅｆｔ（ｉｉ、ｗｌＬｊｓａｖｅ、ｋｓａｖｅ）ｄｏ　２８００ｉ ＝１，６ ２７００　ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｉｆ＋ｉｉ、ｅｑ、１）ｔｈｅｎ ｄｏ　６０００　ｋＷｗｏ＋ｌ、ｗ ６０００　ｒ２（ｋ、１）＝ｋｋ １ｓｅ ｄｏ　６１００　ｋ禦ｗｏ＋ｌ、ｗ ｄｏ　６２００　ｘｍｌ、１ｉ−１ ６２００ｒ２（ｋ、ｘ）”ｒｌ（ｆ、ｘ）６１００　ｒ２（ｋ＊１ｉ）−ｋｋ ｎｄｉｆ １２００　ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｌｌｏｏ　ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｒｌ（ｋ、ｍ）ｘｒ２（ｋ、＋ｎ） ７１００　１１、（ｋ、ｍ）＝１２（ｋ、ｍ）ｄｏ　７２００　ｍ＝１，７ ７３００　ｄｒｌ（ｋ、ｍ１＝ｄｒ２（ｋ、ｍ）ｄｏ　７４００　ｍ−１，ｄ１ ２ｎｕｍ（ｋｌ）４００　ｄｌｌ（ｋ、ｍｌ−ｄ１２（ｋ、ｍ）ｄｒｌｎｕｍ（ ｋ）ｍｄｒ２ｎｕｍ（ｋ）ｄｌｌｎｕｍ（ｋ）＝ｄ１２ｎｕｍ（ｋｌ７０００　 ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｉｆ　（ｉｉ、ｌｔ、ｈａｌｔｌ　ｇｏ七ｏ　１０００３０００　ｃｏｎｔｉｎ ｕｅ ５０００　ｅｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｄｗ２（ｘｘ、１２０１ｒｄｌｌ（ｘｘｔ１２０）＊ｄ１ ２（ｘｘ、１２０）、ｄｒｌｎｕｍ（ｘｘｌａｏ　１１００　ｍｍｘＬｉｉ−１ ｄｏ　１５００　ｎｕｎ−１，ｄｌｌｎｕｍ（ｆ）１７００　ｃａｎｔ工ｎｕｅ ｎｄｉｆ ｓｋｉｐａｍｌ ｓｋｉｐｂ＝１ ｗｗｗ＋１ ｄ１２ｎｕｍ（ｗｌ＝ｄｌｌｎｕｍ（ｆ）＋１ｄ１２（ｗｌｄ１２ｎｕｍ（ｗｌ ）ｍｒｒ１４００　ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｄ１２ｎｕｍ（ｗ１ｍｄｌｌｎｕｍ＋ｆ）１２（ｗ＋１ｉ）−ｈｈ １０００　ｃｏｎｔｉｎｕｅ プローブ　標的配列　完全相補対 ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧＵＲＥ２　第１部 国際調査報告

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. １．核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、段階： プローブのセットを提供し、その際、そのセットの中の端プローブは前もって定 められた長さを持ちかつセットの中の各プローブは固定および非固定位置のあら かじめ決定された配列を持ち、この固定位置はひとつあるいはそれ以上のあらか じめ定められた種類のヌクレオチドを含むこと； 核酸にセットのプローブをハイブリダイゼーションすること； 核酸と完全に相補対を形成するセットの中の各プローブのコピー数を決定するこ と；そして核酸と完全に相補対を形成するプローブの前もって決定された配列か ら核酸のヌクレオチド配列を再構築すること を包含する方法。
  2. ２．上記のセットがプローブの長さに等しいまたはより短い複数の固定および非 固定の位置の各順列の配列と等価の、固定及び非固定の位置の配列を含む少なく ともひとつのプローブを含む、請求項１記載の方法。
  3. ３．さらに以下の段階： 複数の固相支持体の各々に既知の量の上記核酸を固定すること；そして 上記核酸と完全に相補対形成していない全ての上記プローブが実質上固相支持体 から除去され、そして上記核酸と完全に相補対を形成している上記プローブの全 てが実質上固相支持体上に残るように上記プローブをハイブリダイゼーションし た後固相支持体の各々を洗浄すること を包含する、請求項２記載の方法。
  4. ４．上記のハイブリダイゼーションの段階が、複数の固相支持体の異なる固相支 持体上の上記核酸に上記セットの各プローブを別々にハイブリダイゼーションさ せることを包含する、請求項３記載の方法。
  5. ５．上記のプローブの上記のあらかじめ決定された長さが７から１１ヌクレオチ ドの範囲にある、請求項４記載の方法。
  6. ６．上記プローブの上記非固定の位置が少なくとも１つの縮退度減少類縁体によ って占められる、請求項５記載の方法。
  7. ７．核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、段階： プローブの第一のセットを提供し、その際、第一のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは７から１０ヌクレオチドであり、そして第一のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシアデノシンでありそして非固定の塩基はデオキシシトシン、 デオキシグアノシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第一のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも１つのプローブ を含むようにすること； プローブの第二のセットを提供し、その際、第二のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは７から１０ヌクレオチドであり、そして第二のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシシトシンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン、 デオキシグアノシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第二のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも１つのプローブ を含むようにすること； プローブの第三のセットを提供し、その際、第三のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは７から１０ヌクレオチドであり、そして第三のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はデオキシグアノシンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン 、デオキシシトシン、チミジンまたはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロー ブの長さより短いまたはに等しい固定および非固定の塩基の各順列について当該 第三のセットが、このような順列と同等の配列を持つ少なくとも１つのプローブ を含むようにすること； プローブの第四のセットを提供し、その際、第四のセット中の各プローブは同一 の長さを有し、その長さは７から１０ヌクレオチドであり、そして第四のセット 中の各プローブは固定および非固定の塩基のあらかじめ決定された配列を有し、 固定塩基はチミジンでありそして非固定の塩基はデオキシアデノシン、デオキシ シトシン、デオキシグアノシン、またはこれらの縮退度減少類縁体を含み、プロ ーブの長さ固定および非固定の塩基の各順列について当該第四のセットが、この ような順列と同等の配列を持つ少なくとも１つのプローブを含むようにすること ： 複数の固相支持体のそれぞれに既知の量の核酸を固定すること： 第一、第二、第三および第四のセットの各プローブを固相支持体に固定した核酸 に個別にハイブリダイゼーションすること； 核酸と完全相補対二量体を形成していない全ての上記プローブは実質上固相支持 体から除去されそして核酸と完全相補対を形成した全ての上記プローブは実質上 固相支持体に残るように、上記プローブをハイブリダイゼーションさせた後、各 固相支持体を洗浄すること；各セット中で核酸と完全相補対と形成する各プロー ブのコピー数を決定すること：そして 核酸の塩基配列を核酸と完全相補対を形成するプローブのあらかじめ決定された 配列から再構築することを包含する方法。
  8. ８．上記核酸が少なくとも１つの既知配列領域を含む請求項７記載の方法。
  9. ９．上記第一のセットの上記プローブが８から９ヌクレオチドの長さを有し、上 記第二のセットの上記プローブが８から９ヌクレオチドの長さを有し、上記第三 のセットの上記プローブが８から９ヌクレオチドの長さを有し、そして上記第四 のセットの上記プローブが８から９ヌクレオチドの長さを有する請求項８記載の 方法。
  10. １０．上記第一のセットの上記縮退度減少類縁体がデオキシイノシン、５−フル オロデオキシウリジン、およびＮ４−メトキシシトシンを含み、上記第二のセッ トの上記縮退度減少類縁体がデオキシイノシンおよび２−アミノブリンを含み、 そして上記第三のセットの上記縮退度減少類縁体が２−アミノブリンおよびＮ４ −メトキシシトシンを含む請求項９記載の方法。
  11. １１．上記洗浄の段階が、上記固相支持体を約２から４モル毎リットルの濃度の 塩化テトラメチルアンモニウムにさらすことを含む、請求項１０記載の方法。
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