JPH04501501A

JPH04501501A - ９５ｋｂ程度の大きさのｄｎａ断片用ｐ１バクテリオフアージクローニング系

Info

Publication number: JPH04501501A
Application number: JP1504972A
Authority: JP
Inventors: スターンバーグ，ナツト・レオン; サウアー，ブライアン・リー
Original assignee: エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテツド
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1992-03-19
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: EP0415958A4; ATE153376T1; DE68928062D1; DK248690D0; AU631360B2; AU3541989A; EP0415958A1; DE68928062T2; EP0415958B1; FI905055A0; WO1989009826A1; JP3019344B2; DK248690A; FI905055A7

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称９５ＫＢ程度の大きさのＤＮＡ断片用ＰＩバタテリオファージクローニング系発明の分野この発明は大きさが９５ＫＢ程度のＤＮＡ断片の増幅を制御するバタテリオファージＰＩクローニング系に関する。

発明の背景組換えＤＮＡ技術は高等真核生物（植物と動物）の染色体からのＤＮＡ断片をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のような細菌の中で増殖することができるベクターを使用してクローン化し、増幅することを可能にした。

ＤＮＡをその取込みを可能にした細菌中に直接導入する場合、ＤＮＡの細胞への取込みの効率はＤＮＡの大きさが２０ＫＢ以上に増加すると劇的に減少するのでＤＮＡは比較的小さく　（２０ＫＢ以下）なければならない。このため、大きなりＮＡを細菌に導入するため別の供給経路が探索された。ウィルス粒子中にバクテリオファージベクターＤＮＡを包み込む技術がこの必要に応するため開発された。それは包み込んだＤＮＡをほとんど単位効率を伴う感染により細胞に供給される利点を持つ。Ｂｒｕｎ　ｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ（１９７８年）７５巻、８５〜１０７ページとＣｏｆｆ１ｎｓ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（１９７８年）７５巻、４２４２−４２４６ページはＳｔｅｒｎｂｅｒｇ等、Ｇｅｎｅ（１９７５年）１巻、２５５〜２８０ページが開発したラムダバクテリオファージのインビトロパッケージ反応を利用してグラスミドとラムダバクテリオファージ頭部Ｓ部位の融合物であるコスミドベクター中でクローン化した大型挿入断片を包み込んだ。ＣＯＳ部位はラムダバクテリオファージ頭部へのＤＮＡパッケージの開始に必要な認識要素を提供する。

インビトロパッケージ反応におけるラムダバクテリオファージの主要な欠点はラムダバクテリオファージ頭部は４９．５ｋｂより大きいＤＮＡを載せないということである。

従って、ＣＯＳベクター自身が約２ｋｂの大きさであることを考慮に入れると、４７ｋｂ以上のクローン化可能なりＮＡをベクターに挿入し、ラムダバクテリオファージ頭部に包み込むことはできない（Ｍｕｒｒａｙ、　Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ　２３６　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　１９８６年）、３９５〜４３２ページ）。

従って、５０ｋｂより大きい遺伝子のクローニングは達成することができず、及び大きさが数メガ塩基のＤＮＡの染色体部分の「ウオーキング」又は「ジャンピング」による地図作成は困難であり、このことはラムダバクテリオ７アージ系の制限となっている。研究者はより大きいＤＮＡ断片をクローニングする有能な手段として二つの系、すなわちラムダバクテリオファージより大きい頭部を持つファージ系と酵母クローニングベクターを探究した。

Ｒａｏ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８５年）１８５巻、５６５〜５７８ページはＴ４　ＤＮＡ（約１６５キロ塩基）をインビトロでＴ４バクテリオファージ頭部を包み込むことができることを示した。

この反応の効率は添加したＴ４　ＤＮＡマイクロダラム当りｌＯ′〜１０１′プラーク形成単位（ＰＦＵ）であった。しかしながら、Ｂｌａｃｋ、　Ｇｅｎｅ　（１９８６年）４６巻、９７〜１０１ページは種々なベクターＤＮＡを１４頭部に包み込み、適当な細菌に注入後前記ＤＮＡを回収する努力を重ねたが、添加ＤＮＡのマイクロダラム当り１０２〜ｌ　０３ＰＦＵを上回る効率は得られなかった。Ｂｌａｃｋの結果は哺乳動物細胞のそれのような複雑なゲノムの１５０ｋｂ挿入断片の完全なライブラリー（すなわち、１５０ｋｂ挿入断片の約２０　、０００個相当）を生成させることはＴ４パッケージ系の使用を以てしては極めて困難であることを示唆する。第二の恐らくより困難な問題は、大きなりＮＡ断片をクローン化し増幅するためＴ４パッケージ能力を利用できるクローニング用ベクターが存在しないことである。実際、Ｔ４パッケージの開始に必要なＴ４配列に関してはほとんど何も知られていないので、そのようなベクターを組み立てることは困難であろう。

Ｂｕｒｋｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）２３６巻、８０６〜８１２ページは哺乳動物ＤＮＡの大セグメントをミニ染色体として酵母中でクローン化することができた。挿入するＤＮＡは酵母復製要素、酵母分裂要素又はセントロメア、及び酵母テロメアを含むベクター中にクローン化し、生成するキメラＤＮＡを直接ＤＮＡ形質転換により酵母に導入する。１００ｋｂより大きいＤＮＡの挿入断片を持つミニ染色体を確認した。

この系には二つの問題がある。第一にＤＮＡの挿入断片を持つ酵母クローンの生成は極めて非効率であり、記述した実験においては約３００クローンが挿入ＤＮＡのマイクロダラム当り生成した。第二に一旦ＤＮＡの挿入断片を持つクローンが得られると、挿入ＤＮＡを探り当てて回収することは困難である。形質転換した酵母細胞において、ミニ染色体は細胞の全ＤＮＡの１：１０００以下に相当し、従ってＤＮＡハイブリダイゼーシｄン法によってのみ検出することができる。

その上、各々の形質転換した細胞内で挿入断片は増幅することができず、それらは細菌中へのプラスミド救援によってのみ一部分を回収することができる。

他の問題の系はＧａ１ｔａｎａｉｅｓ等、Ｇｅｎｅ　（１９８６年）４６巻、１ −１１ページに記述されている。ＤＮＡを注入することができ、次いでそれを細胞内に注入することができるラムダベクターが記述されている。注入したＤＮＡは宿主染色体中に細胞当りｌコピー、又は染色体外に細胞当り多数コピー組み込まれて細胞内に維持される。このベクターは３０ｋｂ以下のＤＮＡを載せることができるが、組み込まれたグロ７アージのＤＮＡ量はその挿入断片が組み込まれたプロファージにおけるそれと重複する第二の感染ラムダキメラと相同組換えすることにより著しく増加することができる。この方法で任意のプロファージにおける相接するＤＮＡのセグメントを１００ｋｂ以上に増加し、その後ベクターの染色体外状態を誘導することにより増幅することができる。しかしながら、これを達成するには少なくとも数個の相接し重複するＤＮＡのより小さいセグメントをクローン化し、それらを組換えにより共に配列する困難な方法を実行することが必要である。その上、大きなりＮＡ挿入断片は一旦組み立てられると回収することが困難であり、何となればそれはラムダウィルス粒子中に包み込むには大きすぎるからである。染色体外状態にあるＤＮＡの直接単離もそれが大きいことから困難である可能性がある。

発明の要約この発明は次の配列、すなわちＰＩ　１ｏｘＰ部位−アンビシリン耐性遺伝子− ｐＢＲ３２２ｏｒｉ−ｐａｃ−ＰＩ　１ｏｘＰ部位−ポリリンカークローニング部位−カナマイシン耐性遺伝子−Ｐｉプラスミドレプリフンからなる９５ｋｂ程度の大きさのＤＮＡ断片のクローニング用ベクターに関し、前記配列はＰＩプラスミドプリフンが第一のＰＩ　１ｏｘＰ部位に付漕して配列が反時計方向に読まれるように環化している。このベクターの好ましい具体化は上に列挙したすべての要素並びにポリリンカークローニング部位とカナマイシン耐性遺伝子の間に挿入された１ａｃＺプロモーターの制御下にあるＰｉ溶菌レプリコンを持つ。

９５ｋｂ程度の大きさのＤＮＡ断片のクローニング及び増幅を制御する方法は（ａ）外因性ＤＮＡをＰｉ溶菌レプリコンを含むベクターのポリリンカークローニング部位に挿入し、（ｂ）段階（ａ）の生成物をｐａｃ−開裂プロフイシェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接触させ、（Ｃ）Ｃｒｅ“、１ａｃｌｑレプレツサーを持つグラム陰性菌を段階（ｂ）の生成物に感染させ、段階（ｃ）の生成物にＩＰＴＧを添加してレプレッサーを脱抑制し、及び（ｅ）クローン化し増幅したＤＮＡを回収する段階からなる。

この発明は溶［Ｎ５２９６２とＮ５２９６１及び浴深から調製したｐａｃ−開裂プロフィシェント及び頭−尾プロフィシェント抽出物からなるインビトロＰＩパッケージ系に関する。

包み込んだＤＮＡはその後Ｅ、　ｃｏｌｉのような種々のグラム陰性細胞に感染させるために使用することができる。

Ｂ５５９１及びＮ５２９７４と称するＣｒｅ＋グラム陰性細菌株を特別に工学処理してこの発明のベクターにより感染し形質転換した。Ｂ５５９１は１ａｅｌｑレプレツサー遺伝子を持たない。

一方Ｎ５２９７４は１ａｃｌｑレプレツサー遺伝子を持ち、従って一旦形質転換するとＩＰＴＧを添加するまで１ａｅＺプロモーターを抑制することができる。

図面の簡単な説明第１図は一般的なＰ１バクテリオファージクローニングと増幅系を示す。

第２図は本発明に関連するＰＩ遺伝子と要素の地図を示す。

第３図は、本発明のベクターの組立てを示す。

第４Ａ図はガンマ”Ｐ−ｄＡＴＰで両端を付票した６００ｂｐデルタ−３ｐａｃ断片を示す。

第４Ｂ図はｐｅｐゝパッケージ抽出物のｐａｃ開裂活性を示す。　・第５Ａ図はＣｒｅリコンビナーゼが作用した場合のｐＮＳ３５８のＤＮＡの分裂を示す。

第５Ｂ図は形質転換したＢ５５９１菌においてＣｒｅが作用したベクターＤＮＡを示す。

第６Ａ図はｐＮＳ３６４の構造を示す。

第６Ｂ図はｋａｎ−Ｒ遺伝子、Ｐｌプラスミドレプリコン、及びＰｉ溶菌レプリコンを含むプラスミドｐＮＳ３６４の増幅を示す。

第７Ａ−７Ｃ図と第８Ａ−８Ｂ図は包み込んだｐＮＳ３５８ＤＮＡとそれを含むＥ、　ｃｏｌｉ挿入断片の回収と確認を示す。

寄託の声明本発明に関する次の細菌とプラスミドはブダペスト條約により、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２４７７６、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ　１２３０１に存在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎに寄託した。

ｐＮＳ２０はＡＴＣＣＡｃｃａｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　６７６６６と命名された。

ｐＮＳ４２はＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　６７６６７と命名された。

Ｂ５５９１はＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　５３７６０と命名された。

Ｎ５２９６１はＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、６７６６５と命名された。

Ｎ５２９６２はＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　６７６６４と命名された。

Ｎ５２９７４はＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、　５３７５９と命名された。

発明の詳細な説明本発明はバタテリオファージＰｉのインビトロパッケージ系と９５ｋｂ程度の大きさの外因性ＤＮＡ挿入断片の導入と増幅制御のための新規なりローニング用ベクターに関する。このクローニング系の組立てに使用される多くの要素は最近詳細に総括されている（Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ　＆Ｓｔｅｒｎｂｓｒｇ、　Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ＰｉｎＣｈａｐｔｅｒ　Ｌ　１９８８．　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

２３３　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｓｔ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）　ｏ　Ｐｉ遺伝子とｌ０ＩＰ　−Ｃｒｅ組換え系、Ｐ１プラスミド七プリコン、Ｐｌ溶薗レプリコン、及びｐａｃ部位を第２図に示す。

ここに記述するクローニング系はラムダコスミドクローニング系で得ることができるＤＮＡ断片の大きさの少なくとも２倍の大きさのそれの単離を可能にする。

この大きさの増加は次の有用性を持つ。すなわち（１）　４５−９５ｋｂの大きさの範囲の遺伝子は直接クローン化でき、及び２５−４５ｋｂの大きさの範囲の遺伝子はより容易にクローン化できる。

（２）染色体「ウオーキング」及び「ジャンピング」技術は少なくとも２倍に速度を上げることができ、共に連結することを要する相接するセグメントの数が減るのでより正確になるであろう。

（３）　ＰＩファージは広範囲の種類のグラム陰性細菌（第１表）にそれらのＤＮＡを注入することができるように見えるので、インビトロＰＩパッケージ系は他の方法では溶液からＤＮＡをよく摂取しない細菌にＤＮＡを効率的に供給する手段として有用であろう。

１ｏｘＰ　−Ｃｒｅ組換え系これは組換えが極めて効率的に起こる３４ｂｐ部位又はＤＮＡ配列（１ｏｘＰ）と、前記部位に接触し組換えを促進するタンパク質酵素（Ｃｒｅ）とからなる部位特異的組換え系である。Ａｂｒｅｍｓｋｉ等、Ｃｅ１ｌ（１９８３年）３２巻、１３０１〜１３１１ページは超コイル、切れ目の入った環状、又は線状ＤＮＡとｌ０ＩＰ部位との間の組換えはＣｒｅの存在下で起こることを示した。Ｐｌ生活環においてＣｒｅは１００ｋｂ離れた１ｏｘＰ部位との間の組換えを促進することができる。Ｃｒｅ遺伝子はラムダベクター中にクローン化され、Ｅ、ｃｏｌｉ染色体中にラムダーＰｉ　：　Ｃｒｅグロファージとして存在する場合Ｃｒｅを発現する。Ｓｔａｒｎｂｅｒｇ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８６年）１８７巻、１９７〜２１２ページはプロ７アージがそれから組み立てられる機能的Ｃｒｅ遺伝子を含むｐＨＲ１０３変異株を記述している。

ＰＩプラスミドレプリコンＰｌプラスミドレプリフンと分配領域は浴深性細胞の集団における単位コピー染色体外要素としてのＰｉプロファージを維持するための責任がある。それはＤＮＡの開始点配列で細胞分裂周期当り１回の複製を開始する作用をするタンパク質をコード化する複製遺伝子（ｒｅｐＰ）を含む。

レプリコンには二つの遺伝子ｐａｒ　Ａとｐａｒ　Ｐも存在し、それらはｐａｒＳ部位で細胞分裂の際、複製の生成物を娘細胞に正確に分配する作用をする。

Ｐ１溶菌レプリコンＰ１増殖型及び溶菌レプリコンはグロ７アージ脱抑制後３０分以内に高いコピー数までＤＮＡを複製することができる。このレプリコンは転写プロモーターＰ５３と下流のｒａｐ　Ｌ遺伝子からなり、その生成物は開始点配列で複製を促進する作用をする。レプリコンはＰ５３に結合するファージｃｌレプレッサーにより負の制御を受け、ｒｅｐＬ遺伝子の転写を妨げる。

プロセラシブ頭部パッケージ、ｐａＣｓ及びｐａＣ認識タンパク質（ＰＲＰ）ウィルス生活環の間のパッケージ反応に使用するＤＮＡ基質は頂部−尾部形式で配列するＰＩ染色体の個々の単位からなるコンカテマーである。パッケージは４段階の過程である。すなわち（１）第１段階では特異的部位、ｐａｃが認識されてＰＰＰタンパク質（一つ又は複数）により切断され、（２）分裂の一方の側のＤＮＡは空のファージ頭部に頭部が完全に充満するまで包み込まれ、（３）第２の分裂（頭部の切断）が起って包み込まれたＤＮＡがコンカテマーの残りから分離され、及び（４）前の頭部の切断で生成した自由末端から２回目のＤＮＡパッケージが始まり、従って用語、グロセッシブ頭部切断が生れる。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂ１０１．（１９８７年）１９４巻、４６９〜４７９ページは十分に機能的なｐａｃ部位を含む１６１ｂｐの配列のクローニングを記述している。又、これらの研究はｐａｃの認識と開裂は７アージの頭部と尾部の不存在下で起こることができ、Ｐｌ遺伝子９（第２図）の変異により機能が失われることを示している。包み込まれたＰＩ　ＤＮＡの末端は包み込まれたラムダＤＮＡのように相補的な一本鎖配列を含まず、従ってＰＩＤＮＡを細菌に注入した後、その環化は鎖のアニーりングによっては起こらず、むしろ分子の末端に存在する相同配列の間の組換えによって起こる。このような状況であることから、Ｐｌパッケージを使用する任意のベクター、又は任意の頭部パッケージを使用するそれは線状の包み込まれたＤＮＡを組換えにより環化する手段を工夫しなければならない。この発明において、環化はベクターにＰＩ　１ｏｘＰ部位を組み込み、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用してＣｒｅ◆、グラム陰性細菌に注入後ＤＮＡを環化する。

ＰＩは二つの大きさの頭部を生産し、大きい頭部は１０５〜１１０ｋｂのＤＮＡを載せることができ、小さい頭部は４０ｋｂ以下のＤＮＡを載せることができる。正常にはＰＬ野性型感染における大願の小頭に対する比率は１０：１であるが、しかしながら、ここで使用する本発明の包み込んだリゼートの調製に使用するＰＩのｃｍ−’ｌ変異株は頭部大きさの比率が１＝１である。もっばら大きいファージ頭部のみにＤＮＡの包み込みを確実にするため、ＤＮＡは小頭部に載せることができるより大きくなければならない。

ＰＬ宿主範囲バクテリオファージＰ１は別な方法ではＤＮＡを有効に摂取することができない種々なグラム陰性細菌に吸着し、及びそのＤＮＡを注入することができる。Ｐ１ピリオンが吸着しＤＮＡを注入することができる細菌株の表を第１表に示す。

第１表円の宿主範囲細　菌　ＰＩ　ＤＮＡ注入　ｐｔファージ生産Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２．Ｃ，Ｂ　＋　＋Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ　＋　＋Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　＋Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　（）＋　＋Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ　＆　ａｂｏｎｙ　＋Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　＋　＋Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ　＋　＋Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　＋　＋５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　＋　（−）＋Ｅｎｔ、ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　＋　＋Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　＆　ｃｌｏａｃａｅ　＋　＋Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ　十　十Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａ　＋　＋Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ　＆　ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　＋　＋Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　＋　（−）＋Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ　（−）　＋　＋Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、　Ｍ　６４　＋　−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　＋　−Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　５ｕｂｏｘｉｄａｎｓ　−Ａ１．ｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　＋　−Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　＋　−これらの株においてバクテリオファージを生産するＰｉの能力も表に示されている。インビトロでＰ１ファージにＤＮＡを包み込む能力と共に、任意のこれらの細菌からＤＮＡを直接パッケージ用ベクター中にクローン化し、前記ＤＮＡをＰＩピリオン中に包み込み、次いでこれをＰＩ注入に熟練したこれらの細菌に戻すことも可能である。

このすべてはＥ、　ｃｏｌｉで挿入ＤＮＡを複製することなく実行され、前記細菌中では挿入ＤＮＡがその元の宿主に入った場合それを制限酵素から保護するメチル化パターンの喪失が起こる。

細菌株と培地Ｅ、ｃｏｌｔのＤＨ５デルタ−１ａｃＵ１６９、Ｗ３３５０、Ｎ５４３９、Ｎ９９、ＪＭｌｏｌ、ＪＭ１０９．５９４及びＹＭＣ株、及びその誘導株はプラスミドとファージＰＩの宿主の役割をすることができる。ＤＨ５デルタ−１ａｃＵ１６９はＬｉｔｔｏｎ　ＢｉｏｎｅｔｉｃｓのＤｒ。

Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂｅｒｍａｎから入手したが、この株はＤＨＩの変異株であるＤＨ５の誘導株であって、Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８３年）１６６巻、５５７〜５８０ページに記述されている。

Ｂ５５９１はＣｒｅ遺伝子を含むｐＲＨ１０３から組み立てられるラムダ−１ｍｍ４３４−ＰＩプロファージを伴うＤＨ５デルタ−１ａｃＵ１６９（以後ＤＨ５と呼称する）である。ｐＲＨ１０３変異株はＳｔｅｒｎｂｅｒｇ等によりＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ（１９８６年）１８７巻、１９７〜２１２ヘージに記述されている。Ｂ５５９１は１ａｃＩｑレフレツサー遺伝子を含まない。ＪＭ　１０１．！ｌ：ＪＭ　１０９はＭＡ　０１９１５、Ｂｅｖｅｒｌｙに存在するＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等によりＧｅｎｅ（１９８５年）３３巻、１０２〜１１９ページに記述されている。

Ｎ５２９７４はＪＭ　１０９であり、機能的Ｃｒｅ遺伝子と１ａｃＩＱレプレツサーを含むラムダ−１ｍｍ４３４−Ｐ１プロファージを持つ。、５９４とＷ　３３５０株はＣａｍｂｅ　１１等、Ｃａｒｎｓｇｉｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｗａｓｈ、　Ｙｅａｒｂｏｏｋ（１９８７年）５７巻、３８６ページに記述されており、ＹＭＣはＤｅｎｎｅｒｔ等、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｊｏｌ、（１９６８年）３３巻、３２２〜３２９ページに記述されており、Ｎ９９はＳｈｉｍａｄａ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９７２年）９３巻、４８３〜５０３ページに記述されている。ＮＳ　４３９はｔｒｐ　Ｅ　５Ｑ４７変異を伴うＹＭＣ株である。ＮＳ　３０６７はＮＳ　４３９であり、機能的Ｃｒｅ遺伝子を持つラムダ−１ｍｍ４３４−ＰＩプロファージを持つ。

細菌増殖用培地（すなわちＬブロス及びＬ−ａｍｐ寒天）はＭｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｍｅｔｉｃｓ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ。

１９７２）に記述されている。

ファージ法用語バクテリオファージとファージは互換的に使用される。ファージリゼートの調製、ファージ遺伝酌交雑種の作成、７アージ相補性試験の実施及びファージ溶原化を起こさせるＰ１ファージ（ＰＩバクテリオファージ、　Ｐｉ）操作はＳｔｅｒｎｂｅｒｇ等によりＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８６年）１８７巻、１９７−２１２ページ、及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇ等によりＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

（１９８７年）１９４巻、４５３〜４６８ページに記述されている。

ＤＮＡ調製と操作２０ｋｂより小さいプラスミドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉから（１）Ｈｏｌｍｅｓ　＆　ＱｕｉｇｌｅｙによりＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８１年）１１４＠、１４３〜１９７ページに記述された迅速法（以後迅速プラスミド調製と呼称する）、又は（２）Ｇｏｄｓｏｎ及びＶａｐｎｅｋ、　ＢＭＡ（１９７３年）２８９巻、１５６〜５２２ページに記述された塩化セシウム密度勾配法により調製した。２０ｋｂより大きいプラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９７９年）７巻、１５１３〜１５２３ページの方法により調製した。細胞ＤＮＡはＥ。

ｃｏｌｉからＳｔｅｒｎｂｅｒｇ等、Ｊ−Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８７年）１９４巻、４６９〜４７９ページにより記述されたように単離した。ＤＮＡの大きさを２００ｋｂ以上に維持するため、この単離過程の間延断力を避けるように注意した。パルスフィールドアガロースゲル電気泳動をＣａｒｌｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６年）２３２巻、６５〜６８ページにより記述されたように実行した。

ＤＮＡの制限酵素消化とＴ４　ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡＪ結反応結反光者が明示したように実施し、この場合発売者はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓであった。ＤＮＡを操作するすべての他の方法はＭａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ＢＯ３Ｃ１００，Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　１９ｇ２）により記述されている。

サザン分析ＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロース膜に移シ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９７５年）９８巻、５０３〜５０７ページの方法により特別に付票したＤＮＡ断片又はプラスミドでプローブし、前記方法は以後「サザン分析」と呼称する。

制限分析５００ナノグラムのＤＮＡを２０マイクロリツターの酵素購入先であるＮ１５Ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ　０１９１５）が明示した緩衝液中で、３７℃で２時間１〜２単位の制限酵素で消化した。反応を０．２５％プロムフエノルブルー０．２５％キシレンシアツール、及び４０％（Ｖ／Ｖ）シュクロースの溶液の３マイクロリツターを添加して停止し、次いで反応物を７０℃で５分間加熱した。この試料をＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ緩衝液（０，０８９Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、　０．０８９Ｍホウ酸。

０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ）に浸漬した１％アガロースゲル（１５ｘ１５Ｃａｌ）のみぞに添加した。電気泳動を２０ミリアンペア（３０ポルト）でキシレンシアツールのバンドがゲルの行程の３分の２移動する通常約１２時間室温で実行した。次いでゲルを臭化エチジウムの０．５マイクログラム／ｒａＱの溶液中で３０分間染色し、ゲルの画を透過紫外光源（３２０ｎｍ）とポラロイド型５７フイルムを使用して撮影した。

ＤＮＡのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）による処理前章で記述したようにＤＮＡを制限酵素で消化した後、これを７０℃で５分間加熱した。反応物を３７℃に冷却し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）溶液で１００マイクロリツターにし、次いでウシ腸アルカリホスファターゼの０．０１単位と共に３７℃ で１時間インキュベートした。反応物を等量の７エノールで４回及び等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ）で１回抽出し、次いでＤＮＡをｌ　Ｍ　ＬｉＣ（２ｘ中で２量のエタノールと共に一２０℃で３時間沈澱させた。

断片のベクターへの連結と挿入連結反応を６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，５）　、５　ｍＭ　ＭｇＣα ３．５ＱＩＭジチオスレイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰ、　１００マイクログラム／峠ウシ血清アルブミンを含む２０マイクロリツターの液量中で実施した。適格な細菌中へ形質転換により回収されるグラスミドへの断片の挿入を含む反応のため、１００ｎＨの消化したベクターＤＮＡと１００〜４００ｎｇの挿入断片を使用した。インビトロファージパッケージにより回収されるプラスミドベクターを含む反応のため％　５００ｎＨのベクターＤＮＡと１〜５マイクログラムの挿入断片を使用した。

４００単位のＴ４リガーゼを各反応物に添加し、この反応物を１６°Ｃで２０時間インキュベートした。反応を７０℃で１０分間加熱して停止した。

形質転換体の選択Ｅ、ｃｏｌｉ株を（１）Ｍａｎｄｅｌ及びＨｉｇａ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

（１９７０年）５３巻、１５９〜１６２ページの方法、又は高い効率が要求される場合（２）Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８３年）１６６巻、５５７〜５８０ページの方法により形質転換した。０．１峠の液量中の形質転換した細胞を１　ｍＱのＬ−ブロスで希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。培養のｌＯＯ〜２００マイクロリッターをカナマイシン（２５マイクロリツター／ｒｔｒＱ）又はアンピシリン（１５０マイクログラム／１ｍ＋２）のいずれかを含むし寒天平板上に拡げ、平板を３７°Ｃで１６時間インキュベートした。次いでコロ；、−を計数した。

Ａｍｐ”形質転換体のカナマイシンを添加したＬ寒天平板上の発育を試験し、逆も行った。

形質転換細胞の選択Ｅ、　ｃｏｌｉ株を、（１）Ｍａｎｄｅｌと旧ｇａ　（Ｊ−Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　５Ｌ１５９〜１６２　（１９７０）　）の方法、又は高い効率を要する場合には（２）Ｈａｎａｈａｎ　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６、５５７”５８０（１９８３））の方法に従っ゛Ｃ形質転換した。　０．１ｍＱの容量の形質転換細胞をＬ−ブイヨンでｌ＊Ｑに希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。１００〜２００ミクロリツトルの培養液をカナ？　イシ７　（２５ｕＱ／　ｍＱ’）又はアンピシリン（１５０Ｍｇ／ＩＩＱ）を含有するし寒天平板上に広げて、その平板を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、コロニーを採点した。

Ａｍｐ−Ｒ形質転換細胞を、カナマイシンを含むし一寒天平板上での増殖、及びアンピシリンを含むし一寒天平板上での増殖に関して調べた。

プラスミドベクター、　ｐＮ５３５８−ｔｙｔの構築ベクターの構築における種々の工程を記したフローシートを第３図に示す。開始プラスミドはｐＢＳ６９であった。

それは、同一方向に配向された２つの１ｏｘＰ組み換え部位を含む４　、９ｋｂプラスミドであった。Ｃｒｅ蛋白質の存在下では、これらの部位の間に組み換えが起きて、ＤＮＡの２つの環を生じ、その各々は１つの１ｏｘＰ部位と、ｐＢｓ６９における１ｏｘＰ部位間のＤＮＡの２つの領域のうちの１つとを含有する。

以後、ａｍｐ−Ｒドメインと呼ばれるこれらの環状化領域の一方は、薬剤アンピシリンに対する耐性と、プラスミド、）ＢＲ３２２（以後、ｐＢＲ３２２ｏｒ　ｉと呼ぶ）のＤＮＡ複製系（レプリコン又は複製のオリジン（ｏｒｉ）　）とをコードする遺伝子を含有した。他方のｐＢＳ６９の１ｏｘＰ部位間の環状化領域は、酵母菌１ｅｕ２遺伝子を含有した。

（ａ）ｐＢＳ６９へのＰ１パッケージング部位ｐａｃの挿入ＤＮＡパッケージングの開始に必要なＰｌ配列は、ＤＮＡの１６１ｂｐセグメント（ｐａｃ部位）に局在した。　ＤＮＡのこのセグメントは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９４．４６９〜４７９（１９８１）　）によって記載された二重欠失突然変異体（デルタ−３−デルタ−２０）に残存するＰｉ配列を示した。

デルタ−３−デルタ−２０ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及び５ａｌＩで消化し、１６１　ｂｐ　ｐａｃ部位を含有する４３７ｂｐ断片を単離して、ｐＢＳ６９ＤＮＡのａｍｐ−Ｒドメイン内の独特のＸｈｏ　Ｉ部位に結紮した。その結果上じたｐＢＳ６９−ｐａｃズラスミドは、第３図に示されているように、パッケージングが反時計回りに起こるように配向されたｐａｃを含有した。ｐａｃに加えて、４３７ｂｐ挿入体は、ｐＢＲ３２２マツプ座標の３７５及び６５１の間に位置するテトラサイクリン遺伝子配列を含有した。さらに、４３７ｂｐ　ＤＮＡ断片中に存在し、またｐａｃとグラスミドＤＮＡ内のｐＢＲ３２２配列との間に位置するＢａａ旧部位を欠失した。Ｂａｍ旧部位の除去により、ｐＢＳ６９−ｐａｃプラスミドが単−ｐＢＳ６９　ＢａｍＨ１部位しか有していないことが確証された。

（ｂ）　ｐＮＳ　２０を生成するためのＴｎ９０３カナマイシン耐性遺Ｔｎ９０３カナマイシン耐性（ｋａｎ−Ｒ）遺伝子を、１．３ｋｂＡｃｃ　！断片として、ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌｓ　（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入したプラスミドｐｕｃ４Ｋから単離した。ｐＢＳ６９−ｐａｃ　ＤＮＡを制限酵素Ｃ１ａ　Ｉで消化したが、これはそのＤＮＡを酵母菌１ａｕ２遺伝子内で１回切断した。等量（１００ｎｇ）のその消化プラスミドＤＮＡ及びｋａｎ− Ｒ遺伝子断片を２０μｇ中に混合し、１６℃で一晩結紮させた。結紮混合物を用いてＤＨ５株細菌を形質転換し、ｋａｎ−Ｒ，ａｍｐ−Ｒ形質転換細胞を選択した。これらの形質転換細胞から作製される迅速プラスミド調製物の分析により、それらは全てｐＢＳ６９−ｐａｃのＣ１ａ−Ｉ部位でｋａｎ−Ｒ遺伝子を含有することが示された。その後の全手技のために選択され、以後ｐＮＳ２０と呼ばれるプラスミドは、ｋａｎ転写の方向が反時計回りであるように配向されたｋａｎ −Ｒ断片を含有した（第３図）。このｋａｎ−Ｒ遺伝子を含むＩｏｘＰ部位と側面を接する領域は、以後、ｋａｎ−Ｒドメインと呼ぶ。

Ｐｉマツプの座標５９及び６６（第２図）の間に位置するＤＮＡの７ｋｂＫｐｎＩ断片を、ＰｌファージからのＤＮＡをＫｐｎ　Ｉで消化した後、単離した。それをｐＮｓ２０の特独のＫｐｎ　Ｉ部位に結紮し、プラスミド中のその存在を、迅速プラスミド調製物の制限酵素消化物を分析することによって確証した。

その後の手技のために選択された特定の構築物はｐＮｓ１５０と呼ばれ、プラスミド中で反時計回りに配向されたマツプ座標５９から６６までのＰＩ　ＤＮＡを含有した。７ｋｂ　ＰＩ挿入体はプラスミド複製系だけでなく、その分配系をも含有した（Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、ｉｎ″Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｊｅｓ”、　Ｃｈａｐｔｅｒ９　＋　１９８８）。

相補的配列を有する２つの３１塩基オリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホラミダイト法によって合成した。

１００μＱ（１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液、　ｐＨ８，０，ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）の容量中のｌＯμ９の各オリゴヌクレオチドを、７０℃で１０分間、相互にアニーリングした。

その結果生じた２本鎖断片を以下に示す：ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＡＸｂａ　Ｉ　Ｎｏｔ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉ　５ｎａＢ　ｌＤＮＡのこの断片は、左から右へ、次の制限エンドヌクレアーゼ部位：Ｘ　ｂａ　Ｉ　（Ｘ）−ＡＧＡＴＣＴ　；　Ｎｏｔ　Ｉ　（Ｎ）−ＣＧＣＣＧＧＣＧ　；Ｓａｌ　Ｉ　（Ｓａ）−ＣＡＧＣＴＧ　；　５ｎａＢ　Ｉ　（Ｓｎ）− ＡＴＧＣＡＴを含有する。これらの部位は何れも、ｐＮｓ１５０のＤＮＡ中には存在しなかった。本断片はまた、Ｂａａ＋Ｈ１消化によって生成される末端と相補的な１末鎖ＧＡＴＣ末端を含有する。

本断片のＧＡＴＣ末端に対するヌクレオチド３′が異なるために、この断片のＢａｍＨを有するＤＮＡへの結紮は、挿入体の一方の側においてはＢａｍＨＩを再生したが、他方においては再生しなかった。本断片をＢａｍＨＩ−開裂ｐＮｓ１５０　ＤＮＡに結紮し、挿入体の存在を、５つの制限酵素ＢａｍＨ、ＸｂａｌｓＮｏｔＩ、５ａｌＩ及び５ｎａＢ１の各々によって１回だけ開裂されるプラスミドの能力によって確証した。その後の手技のために選択された特定の構築物はｐＮ５３５８と呼ばれ、プラスミド上で反時計回りに配向されたＢａｍＨから５ｎａＢ　Ｉまでのポリリンカーを有した（第３図）。

Ｐ１溶原性レプリコンを、正常Ｐ５３プロモータがｌａｃ　Ｚプロモータに置換されたＪ、、９ｋｂのＡｓｕ　ＩＩ断片（ＰＬマツプ座標５３〜５５）としてクローン化した。したがって、Ｐｌ溶菌レプリコンは、１ａｃＺプロモータの制御下に置かれた。１ａｃ２プロモータは、次に、Ｉａｃｌｑリプレッサーによって制御される。ＩＰＴＧ　（イソプロピル−ベーターローガラクトシド）の存在下では、１ａｃｌｑリプレツサーは抑制解除され、レプリコンが機能的になる。ｌａｃ　Ｚプロモーター調節ＰＩ溶菌しグリコンをプラスミドｐＮＳ４２からＰｙｕ　ＩＩ　−Ｈｐａ　Ｉ断片として単離し、５ｎａＢ　！消化ｐＮＳ３５８　ＤＮＡに結紮して、ｐＮＳ３５８−１７ｔプラスミドを生成した。レプリコン（ＰＩマツプ座標５３〜５５）は、プラスミド内で反時計回りに配向した。

ＰＩパッケージング抽出物を生成する際に用いるファージ及び溶厚菌の構築及び特性ＰＩパッケージング抽出物の調製のための浴深性細菌（浴深菌）を構築するために用いるファージは、４倍体突然変異株Ｐｌｒｍ−ｃｍ−２ｃ１．１００９．１６又はＰｌｒｍ−ｃｍ−２ｃ１．１００１０、ｌであった。個々の突然変異株の特性、及び最終ファージにおけるその組み込みの理由を以下で考察する。

（ａ）　ｃｌ、１００゜Ｒｏｓｎｅｒ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　４８．６７９−６８９（１９７２））によって最初に記載されたこの突然変異は、ファージｃｌリプレッサーを温度感受性にする。したがって、このＰＩプロファージを含有する浴深菌は一般に３３℃以下の温度で増殖するが、しかし溶菌周期に入るよう導入されて、より高い温度でファージを産生ずる。例えば、培養液の温度が３３℃から４０℃に上昇した場合には培養液はその温度に保たれて、細胞溶解が切換えてから５０分以内に起り始め、約１００７アージ／細胞が放出される。

（ｂ）　ｒｍ’−０Ｇｌｏｖｅｒ等（Ｇｅｎｅｔ−Ｒｅ５−、４．４８０〜４８２（１９６３））によって最初に記載されたこの突然変異は、ウィルスの制限及び修飾系を不活性にする。それは、Ｐ１＃厚菌から作成される抽出物が、パッケージされる前に付加されたＤＮＡを破壊し得る制限エンドヌクレアーゼ活性を含有しないようにここで用いられるファージに組み込んだ。

（ｃ）　ｃｍ−２゜この突然変異はｌ１ｄａとＡｒｂｅｒ　（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、　１５３．２５９〜２６９（１９７７）　）によって記載されていて、そのクロラムフェニコール耐性（ｃｍ−Ｒ）遺伝子を伴うＴｎ９トランスポゾンがＰ１マツプ座標２４で挿入され、マツプ座標２４と３３の間のＰＩ　ＤＮＡの１Ｏｋｂ部分を欠失した大量゛染色体転位である。本突然変異は、浴深菌の導入後に、細菌を別の方法でできるよりも遅い時間に採集可能であるようにファージを部分的に溶菌欠陥性にする。この突然変異体の別の特性は、それが野生型Ｐ１よりも多くの小頭型ファージ変異株を産生ずることである。

（ｄ）　ａ＋ｎ　９．１６及びａｏｔ　１０−１゜ＰＪアンバー（ａｍ）突然変異株１０．１は、ＰＬ遺伝子１０中にナンセンス突然変異を含有しく第２図参照）、全“後期″７アージ蛋白質合成に欠陥がある。それは、正常量のｐａｃ−開裂活性を産生ずる。

Ｐ１アンバー突然変異株９．１６は、Ｐｌ遺伝子９中にナンセンス突然変異を含み、ｐａｃ−開裂活性の産生に欠陥がある。

それは、正常では、ファージの頭部及び尾部を含めたファージ形態形成蛋白質を産生ずる。これらの突然変異株の何れか１つから調製される抽出物がｉｎ　ｖｉｔｒｏでＤＮＡをパッケージングできるとは期待しないが、しかし再抽出物はともに、パッケージに必要な成分を全て有するべきである。

２工程法で、４倍体ファージ変異株を構築した。先ず、７ア一ジＰ１ｃｍ−２と、ＰＩ　ｃｌ、１００９．１６又はＰＩ　ｃｌ、１００１０．１とを交叉させて、３つの突然変異、Ｐｌｃｍ−２ｃｌ、１００９．１６又はＰｌｃｍ−２ｃｌ、１００１０．１を含有する組み換えファージを選択した。この交叉によって産生された７アージを用いて、ＹＭＣ株の細菌芝土にプラークを生成し、個々のプラークを次の３つの特性＝　（１）ａｍ−Ｒである浴深菌を産生ずる能力；（２）温度感受性；及び（３）細菌のＮ９９株上ではなく　ＹＭＣ株上にプラークを作る能力；に関してスクリーニングした。ＹＭＣ株はアンバーサプレッサーを含有したが、他方Ｎ９９株は含有しなかった。アンバー変異組み換え株が正しいアンバー変異を含有することを確証するために、コントロール９．１６及び１０．ｌファージを用いた相補性試験を実施した。同−遺伝子内のアンバー変異株はファージ産生に関しては互いに相補的でないが、遺伝子９及びｌＯのように異なる遺伝子におけるものは、相補的である。

相補性試験によって、３倍体変異株におけるアンバー変異はそれらの変異株を生成するために用いるファージに基づいて予期されることが確証された。３倍体変異株を次にＰｌｒｍ−と交叉して、４倍体変異株が３倍体変異株の全特性に加えて、任意のＥ、ｃｏｌｉ株中にグロファージとして存在する場合は、ラムダファージの増殖を制限することができない特性を有することが確証された。

４缶体Ｐｌ変異株を用いてＮ９９株を溶原化し、９．１６及び１０．１変異株に対してそれぞれＮ５２９６１及びＮ５２９６２と呼ばれるその浴深菌を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏバッキング反応のためのＰＩ抽出物を調製した。さらに、これらのＰＩ変異株はまた、それらの取込みに熟達した任意の細菌株を溶原化するのに用い得る。

Ｐ１パッケージング抽出物の調製１リツトルのし一ブイヨンにＮ５２９６２株、細菌のコロニーを植え込み、その培養を３２℃で０．８の００６５０に増殖させた。つぎに培地の温度を９０℃の水浴中でそれを渦巻き状に掻き混ぜて４２℃に急速に上げ、激しく曝気しながら４２℃で１５分間増殖を継続した。つぎに培地の温度を、３８℃の水浴中に入れて低下させ、激しく曝気しながらさらに１６５分間増殖を継続した。次いで、細菌懸濁液を氷スラリー中で４℃に急冷し、５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ５Ａｌ：Ｆ−ター内で４℃で１０分間、６０００　Ｘ　９で遠心分離して小球状にした。細胞小球を、２０ｍＭ　トｊｊ　ス−塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５ＱｍＭＮ　ａ　Ｃ（ｌ　ｓ及び１ａ＋Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）から成る２ｒａＱの緩衝液中に再懸濁した。再懸濁細胞を、４０秒間隔で５回、５にセツティングしたＢｒａｎｓｏｎ音波処理装置の中等度出力で氷上で音波処理した。各音波処理バーストの間は、試料を６０秒間氷上に置いた。つぎに音波処理抽出物を３４．０００Ｘ９で３０分間遠心分離し、その後上清をｌＯμ ｇアリコートに分けて、−８０’Ｃで凍結保存した。これらの抽出物は、通常、数回の凍結−及び−解氷に対して安定であった。

Ｐｃｐ”パッケージング抽出物のｐａｃ−開裂活性ｐａｃ開裂を測定するために、６００ｂｐデルタ−３ｐａｃ断片を用いたが、これはその右末端にｐａｃ部位を含有してぃた（第４Ａ図；　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｂｙ、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１９４、４６９〜４７９（１９８７）　’）。その断片を両末端で、ポリヌクレオゲートキナーゼを用いることによってガンマ３！ｐ−ｄＡＴＰで標識し、つぎにｐｃｐ＋抽出物の種々のアリコートを用いてインキュベートした。反応は、１０１１１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　Ｎａｆｊ２．１０ｍＭ　ＭｇＣＱ、、１　ｍＭ　ＤＴＴ、１　ｍＭ　ＡＴＰ。

ｌＩｌαの標識化ｐａｃ断片（１２μｇ／ｌ１ＩＱ）を伴う１０μこの音波処理仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及び抽出物を含まないか又は０．０１〜ｌｐＱノｐＣｐ”抽出物（３，４１１１ｇ蛋白質／ｍ（＋）から成る溶液１５ｕｉ２中で実施した。

反応混合液を３０℃で１５分間インキュベートし、そして０．２％の濃度までＳＤＳを加えてその混合液を７０℃で５分間加熱することによって反応を停止した。その反応の生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。試料を垂直の５％ゲルのスロットに入れ、１５０ボルトで４時間電気泳動処理した。

つぎにゲルを乾燥してＫｏｄａｋ　ＸＲＰフィルムに一晩露出した。第４Ｂ図に示されている結果は、ｌμａの抽出物（レーン２）は約２０％の断片を切断し、付加抽出物（レーンｌ）なしではそのレーンでは観察されない２つの新規断片を生成することを明示している。その抽出物の１０倍希釈（レーン３）は辺縁部のみ切断断片の量を低減したが、しかし、さらにその抽出物を１０倍に希釈すると（レーン４）、切断効能が約５％に低減した。

上記（ａ）に記載のように１リツトルのしブイヨンにＮ５２９６１株細菌のコロニーを植えつけ、培養を増殖、導入した。温度を４２℃に切り換えてその温度で１５分間培養をインキュベート後、温度を３８℃に戻し、その後４５分間インキュベートした。培養を半分に分けて、細胞を（ａ）に上記のように小球化した。

培養の半分からの細菌細胞を、２０ｍＭ　）リス−塩酸、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　ＮａＣＱ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５μａＭ　ＭｇＣＱ、、１　ｍＭ　ＰＭＳＦ、及び５ｍＭベーターメルヵズトエタノールを含有するＬｒａ（：ｌの緩衝液中に再懸濁し、（ａ）に上記のように音波処理した。１００μＱのアリコートを直接−８０℃に凍結した。培養の他の半分からの細胞は、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４、及び１０％シ３糖の溶液１１中に再懸濁し、つぎに２回、凍結及び解氷した。凍結は液体窒素中で寅施し、凍結細胞は室温で解氷した。次いで、卵白リゾチームの８　ｕｍｏｌｅｓ溶液（１０ｍ１／　＋１１２）を解氷細胞に加え、４℃で１５分後、音波処理ｈｉｐ＋抽出物のために用いる２００μ Ｑの緩衝液を加えた。全ての成分を４°Ｃで５分間、徐々に混合した後、抽出物の１００μａアリコートを一８０℃に凍結した。

細胞を採集する前に、Ｎ５２９６１株の場合よりも長期間、細菌Ｎ５２９６２株を導入したことに留意すべきである。これは、Ｎ５２９６２株における１０．１アンバー変異が、両細胞株に認められるｃｍ−２変異の場合よりもさらに劇的に細胞溶解を阻害するためであった。したがって、導入されたＮ５２９６２溶原菌は導入後４時間は溶解しなかったが、一方導入されたＮ５２９６１溶原菌は導入後約８０〜１００分で溶解を開始した。実際上、遠心分離工程中に細胞を溶解しないよう、遠心分離によって小球化される前に導入されたＮ３２９６１細胞を急冷するよう注意すべきである。

本明細書で構築されるベクターが、Ｃｒｅリコンビナーゼを含有する細胞中に導入される場合に予期されるようにプロセッシングされるということを立証するために、ｐＮｓ２０及びりＮ５３５８をＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５株及びＢ５５９１株中に導入した。ＤＨ５は機能的ｃｒｅ遺伝子を含有しなかったが、一方Ｂ５５９１は機能Ｃｒｅ遺伝子を含有した。Ａｍｐ−Ｒ及びｋａｎ−Ｒに形質転換した結果を表２に示すが、これは、Ｃｒｅが細胞中のこれらの両プラスミドの２つのドメインを効率よく解離し、そして各ドメインは、回収さるべきものである場合にはレプリコンを含有しなければならない、ということを示している（第５Ａ図参照）。

ｐＮｓ２０　なし　１．４　０．００２　１．２　１．０ｐＮ３３５８　ＰＩプラスミド　（Ｌ６　０．５　０．４　０．５ＢＳ５９１株ヲ、ａｍｐ−Ｒドメイン中にのみレプリコンを保有するｐＮｓ２０で形質転換しＩ；場合、ａｍｐ−Ｒ形質転換の効率はｋａｎ−Ｒ形質転換の効率よりも約１０００倍高かった。ＤＨ５株の形質転換の結果は、これが１ｏｘＰ部位間のＣｒｅ仲介組み換えによる２つのドメインの分離によるものである、という結論を支持する。この場合、ｐＮｓ２０によるａｍｐ−Ｒ形質転換とｋａｎ−Ｒ形質転換の効率は同じであった。

ｋａｎ−Ｒドメインが、プラスミドｐＮＳ３５８の場合と同様にレプリコンを保有する場合には、ｋａｎ−Ｒ及びａｍｐ−Ｒ遺伝子はともに、Ｂ５５９１株の形質転換細胞の間に等しく表現される。さらに、Ｂ５５９１のｋａｎ−Ｒ形質転換細胞の約２０〜３０％がアンピシリン感受性であり、同様のａｍｐ−Ｒ形質転換細胞がカナマイシン感受性であった。予期される通り、ｐＮ３３５Ｂ　ＤＮＡによるＤＨ５（Ｃｒａ−）の形質転換細胞はすべて、ａｍｐ−Ｒ且つｋａｎ−ＲであっＩ；。これらの実験における形質転換の１単位は、使用したＤＮＡ　ｌμｑ当たり１０轟個の形質転換細胞を表わすことを意味した。

Ｂ５５９Ｉ中のｐＮＳ３５８のＤＮＡの解離に関する物理的証拠（第５Ｂ図）は、Ｂ５５９１及びＤＨ５の形質転換細胞に由来するＤＮＡの迅速プラスミド試料の制限分析から得られた。全ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで消化し、その結果上じた断片数をアガロースゲル電気泳動法及びサザーンハイプリダイゼーションによって測定した。ＤＨ５のａｍｐ−Ｒ，ｋａｎ−Ｒ形質転換細胞（レーンｌ）に由来するプラスミドＤＮＡは、オリジナルｐＮＳ３５８プラスミドと区別できなかった。それらはともに、予期される３つのＸｈｏ　Ｉ断片を含有した。これに対してＢ５５９１のａｍｐ−Ｒ，ｋａｎ−５形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡは、単−Ｘｈｏ　Ｉ部位のみを伴うＤＮＡを含有したが（レーン２）、一方Ｂ５５９１のｋａｎ−Ｒ，ａｍｐ−３形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡは２つのＸｈｏ！断片を含有した（レーン３）。

Ｂ５５９１のａｍｐ−Ｒ，ｋａｎ−Ｒ形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡ（レーン４）は、３種類のＤ　Ｎ　Ａ、、即ちｐＮＳ３５８と同様のＤＮＡ、。

単−Ｘｈｏ　１部位を有するａｍｐ−ＲドメインプラスミドＤＮＡ。

２つのＸｈｏ　Ｉ部位を有するｋａｎ−ＲドメインプラスミドＤＮＡを全て含有した。予測の通り、ｐＮＳ３５８のまさにｋａｎ−Ｒドメインを有するプラスミドＤＮＡは、ｐＮＳ３５８　ＤＮＡ又はａｍｐ−ＲプラスミドＤＮＡの場合よりも非常に少量で（即ち、ＤＮＡバンドは非常に薄い）回収された。ｋａｎ−Ｒドメイン中のＰ１プラスミドレプリコンは、　ａｍｐ−Ｒドメイン中のｐＢＲ３２２レプリコンよりも非常に少量のコピー数にＤＮＡを複製した。

Ｐｃｐ＋及びｈｔｐ＋抽出物によるＤＮＡパッケージングの立証結紮ベクター（ｐＮ５３５８）　ＤＮＡのパッケージング５μこのＢａｖａ旧消化ｐＮＳ３５ｇ　ＤＮＡ（１００＃／１１２）を−晩結紮して、　５０ｋｂ〜１５０ｋｂの大きさのコンカテマーを生成した。

３０ｎｇのこのＤＮＡを、インキュベージタン時間が１５分ではなく６０分であったことを険いては、前章に記載された通りに、０．２μａのｐｃｐ＋抽出物でインキュベートした。インキュベーション終了時に、６ｍＭ）リス−塩酸、　ｐＨ７，４，１５ｍＭ　ＡＴＰ、　ｌ６ｍＭ　ＭｇＣＱ、、６０ｍＭスペルミジン、６０ｎ＋Ｍプトレシン、及び３０ａ＋Ｍベーターメルカプトエタノールを含む２Ｍｇの緩衝液を、８μｇの凍結−解氷ｈｔｐ＋抽出物とともに反応に加えた。

その結果上じた混合液をさらに６０分間、３０℃でインキュベートした。この時間の終了時に、ＴＭＧ（１０ｍＭトリス−劃￥１．　ｐＨ７，５、ｌｏｍＭ　Ｍｇ５ＯイＯ−１％ゼラチン）でその反応液を１５０μｇに希釈し、ＤＮａｓｅｌをｌＯμｇ／ｗｒＱの濃度まで加えて未パッケージング化ＤＮＡを全て破壊した。

５μａの上記パッケージング反応液をＢ５５９１の１０８個の細菌細胞に加え、その結果上じた混合液を３０℃で１０分間インキュベートして、７ア一ジ吸着を起こさせた。その結果上じた感染細胞をＬブイヨンで２ｒｎＱに希釈して、３７ ℃で１時間増殖させ、遠心分離によって小球化し、次いでＬ−ａｍｐ寒天寒天上板上げた。−晩インキュベート後、平板は２２０８のコロニーを含有した。これは％２Ｘ１０−パッケージング化ＤＮＡ分子／付加ベクターＤＮＡ（Ｍｇ）のパッケージング効率に相当した。パッケージ化ベクターを査定するために用いた細菌株がＤＨ５（Ｃｒｅつであった場合には、検出されるａｍｐ−１’２コロニーの数は約４０倍低減したが、これは、ｆａｘ　Ｐ部位間のＣｒｅ仲介組み換えが、注入された線状ＤＮＡを環状化するＩ；めには必要であることを示している。

２つの抽出物のいずれかがパッケージング反応から除外された場合には、ａｍｐ −Ｒコロニーは検出されなかったが、これは再抽出物がパッケージングには必要であることを示している。凍結−解氷ｈｔｐ＋の代わりに音波処理ｈｔｐ＋抽出物を用いた場合、パッケージング効率は変わらなかった。しかしながら、音波処理抽出物が凍結−解氷抽出物よりも安定度が低いことが立証されたので、その後の実験は全て、凍結−解氷抽出物を用いた。最後に、ａｍｐ−Ｒコロニーの分析から５０％（２８へ。）がｋａｎ−１１ｉ！でもあったことが示されたが、これは、頻繁に、ｐＮＳ３５８の両抗生物質耐性ドメインがパッケージングされたことを示している。

ベクターによる細菌の感染一晩培養したｌＯＯμＱの細菌（２〜３ＸｌＯ’細胞／＋＊Ｑ）をファージ溶解物のアリコート、又はｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング反応液で、３０℃で１０分間インキュベートした。７アージを査定する場合は、３．ＯｍＱの溶解り最上寒天（０，７％寒天）を５５℃で感染細胞に加え、その混合液をＬ−寒天平板上に広げた。最上寒天を室温で５分間固化させた後、平板を３７℃で１６時間インキュベートし、プラークを採点した。抗生物質耐性細胞を査定する場合は、感染細胞を抗生物質含有り一寒天平板の上に広げ、これらの平板を３７°Ｃで１６時間インキュベートした。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング及びＣｒｅ”細胞の形質転換後ｐＮ３３５８　ＤＮＡにクローン化された外生ＤＮＡ断片の回収Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡのクローン化挿入体を有するプラスミドを２つの方法で回収した：（１）プラスミドＤＮＡを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等（：Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．　１５１３〜１５２３（１９７９）　）のアルカリ性溶解プロトコールにより、そして塩化セシウム臭化エチジウム平衡遠心分離〔これはＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｂｏｘ　１００．　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８２）が記載した〕によって、−晩増殖させて２〜３Ｘ１０＠細胞／ｒａＱになった細胞ＩＱから単離した。

ＤＮＡを勾配液から除去した後、それを塩化セシウム−飽和インプロパツールで４回抽出し、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８，０、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液ｉｆｆに対して４°Ｏｆ５時間透析し、フェノールで２回抽出して、つぎにＩ　Ｍ　ＬｉＣＱ、に溶解した２容積のエタノールで沈澱させた。（２）クローン化挿入体ＤＮＡを有するプラスミドを、細胞をＰ１７アージで感染させることによってファージ粒子の形で形質転換細胞から回収した。感染中のＰＩ　ＤＮＡは、Ｃｒｅ仲介組み換え工程によって細胞中の残留プラスミドと組み換えを生じ、両ＤＮＡ上にＩｏｘＰ部位を生じた。この出来事により、クローン化挿入体−プラスミドに隣接したＰＩ　ｐａｃ部位が突きとめられ、それによってそれをファージ粒子中にパッケージングすることができた。−晩培養した１００μＱの形質転換細胞（約２Ｘ１０”細胞）を６　ｘ　１０”Ｐｌファージとともに３０°Ｃで１０分間インキュベートし、次いでＬ−ブイヨンで５＋ｍＱに希釈した。感染細胞を、細胞溶解が観察されるまで（約９０分間）、３７°Ｃで激しく振盪した。ｐＮＳ３５８のｋａｎ−Ｒドメインとともにクローン化断片を含有する７アージの数を、Ｂ５５９１を溶解物のアリコートで感染させることによって査定し、つぎに産生されたｋａｎ−Ｒ細胞の数を測定した。溶解物中のプラーク形成中のファージを、前記のように測定した。通常、これらの溶解物中のｋａｎ−Ｒファージ対プラーク形成ファージの比は約０．１〜１％であった。

ｋａｎ−Ｒ遺伝子、ＰＩプラスミドレプリコン、及びＰＩ溶解し７Ｐ　！Ｊ　コア　、　ｐＮＳ３６４を含有するプラスミドの増幅このプラスミドの構造を第６Ａ図に示す。われわれは、本明細書においてはこれを、１ａｃＺ遺伝子プロモータによって調節されるクローン化ＰＩ溶解レプリコンが細胞中のプラスミドコピーの数を容易に増幅するために使用し得ることを示すために用いた。ＪＭ１０９株（ｌａｃｌｑ）をｐＮＳ３６４ＤＮＡで形質転換して、その形質転換細胞をＬ −ブイヨン中で増殖させた。これらの条件下では、プラスミドはｌコピー／細胞染色体でプラスミドレプリフンによって保持されると予測された。ＩＰＴＧをその培地に加えた場合は、１ａＣＩＱリプレツサーが不活化され、したがって、ｌａｃ　Ｚプロモーター及びＰＩ溶解レプリコンを活性化する。ハ目０９（ｐＮＳ３６４）の培養６０ｍＱをＬ−ブイヨン中で３７℃で５Ｘ１０’細胞／ｍＱの密度に増殖させ、つぎに各々５ｍＱの８つのアリコートに分けた。１つのアリフートをＬ−ブイヨン中で３７℃でさらに３時間増殖させ、−万能の７つのアリコートは各々、■Ｏμｍｏｌｅｓ”　ｌ　ｍＭの濃度範囲のＩＰＴＧを用いて３時間、Ｌ−ブイヨン中で増殖させた。全ての細胞ＤＮＡを各培養から単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ（これはｐＮＳ３６４を２つの断片に切断した）で消化して、サザーンハイプリダイゼーションによって分析した。その結果（第６Ｂ図）は、培地中のＩＰＴＧ濃度が増大するとプラスミドのコピー数も増大することを示した。

１ｍＭ　ＩＰＴＧでは、プラスミドのコピー数は、ＩＰＴＧを欠いた培地中のグラスミドのコピー数よりも３０〜４０多かった（レーンｌと８を比較）。

−で形質転換し、形質転換細菌を選択して、挿入ＤＮＡ断片を回収する２μｇのｐＮＳ３５８　ＤＮＡをＢａｍＨ又はＮｏｔＩ制限酵素で消化した。これらの酵素は各々、ベクターＤＮＡをポリリンカークローニング部位で１回切断した。つぎに開裂ＤＮＡをアルカリ性ホスファターゼで処理して、その後の結紮反応における開裂末端の再結紮を防止した。挿入ＤＮＡの供給源はＥ、ｃｏｌｉ　Ｗ　３３５０株であって、単離ＤＮＡはそのサイズが２００ｋｂより大きかった。ベクターにおける任意のＤＮＡの挿入に先立って、それを、Ｓａｕ　３ａ＋で平均サイズ２０〜５０ｋｂに消化するか、あるいは制限酵素Ｎｏｔｌで完全に消化した。はぼ等量（２００ｎｇ）のベクターＤＮＡとＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ５（Ｓａｕ３ａＩ−消化１：、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡを有するＢａｍＨＩ−消化ベクター又はＮｏｔ−消化ベクター、及びＮｏｔＩ−消化Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ）を２０μＱの溶液中で混合し、−晩結紮した。この結紮混合液１μｇを「抽出物ｐｃｐ＋及びｈ　ｔ、　ｐ　”のパッケージングによるＤＮＡのパッケージングの立証」という表題の章に記載されているようにパッケージし、これを用いて、「細菌のベクターによる感染」の章に記載されているように感染によって、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ５５９１株を形質転換した。その結果生じた細菌を、表３に示すようにｋａｎ−Ｒコロニーとして検ｐＮＳ３５８−Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングｐＮＳ３５８−ＢａｍＨＩ　＜　１０’ｐＮＳ３５８−ＢａｍＨｌ＋リガーゼ　２　Ｘ　１０’　２．４Ｘ　１０’ｐＮＳ３５８ −ＢａｍＨＩ−ＡＰ＋リガーゼ　２ＸＩＯ’ｐＮＳ３５８−Ｎｏｔ　Ｉ　＜　１０番ｐＮＳ３５８−Ｎｏｔ　ｒ＋リガーゼ　２　Ｘ　１０’　４．２Ｘ　ｔｏ’ ｐＮＳ３５８−Ｎｏｔ　Ｉ−ＡＰ士ソリガーゼ　ｌＸｌ０’ＡＰ−アルカリ性ホスファターゼ処理ＤＮＡ断片。

アルカリ性ホスファターゼで処理されていないＢａｍＨＩ−又はＮｏｔＩ−消化ベクターＤＮＡをバッキングする効率は、約２ＸｌＯ＠パツケージング化ＤＮＡ分子／付加ベクターＤＮＡ（μｇ）であった。ベクターＤＮＡをアルカリ性ホスファターゼで処理すると、バッキング後のＤＮＡの回収率は約１００〜２００倍低減したが、しかし５ａｕ３ａＩ−又はＮｏｔｌ−消化Ｅ。

ｃｏｌｔ　ＤＮＡを結紮反応液に加えて部分的にその喪失を回復してもよい。これらの結果を解釈すると、ホスファターゼ処理ベクターＤＮＡは大型フンカテマーと結紮できず、したがって効率よくパッケージング化され得ないということであった。Ｅ、　Ｃ０１ｉ　ＤＮＡ挿入体をベクターＤＮＡに加えると、パッケージング化され得る大きさに達することができた。特定のパッケージング反応によって、５０〜９０％のｋａｎ−Ｒコロニーがａｍｐ−Ｓであったが、これは、それらがｐＮＳ３５８のａｍｐ−Ｒドメインを欠いていたことを示している。

（ａ）　Ｓａｕ　３ａＩクローンｐＮＳ３５８に挿入された５ａｕ３ａＩ−消化Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡをパッケージングすることによって生成された１０個の別々のコロニーから増殖させた各培養中のグラスミドＤＮＡを、Ｂｉｒｎｂｉｍ等（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３〜１５２３　（１９７９）　）のアルカリ性手法によって単離し、制限酵素消化によって分析した。プラスミドのうちの２つのＤＮＡはｐＮＳ３５８ＤＮＡのｋａｎ−Ｒドメインと同一であったが、しかし残りは、多数の新規制限断片を含めて、ベクター中に存在するよりも実質的に多くのＤＮＡを含有した。ベクター（レーン３）、及びベクター−５ａｕ３ａＩキメラのうちの５つ（レーン４〜８）の、制限酵素Ｂｑｌ　ｎ　、Ｘｈｏ　ｉ　、Ｐｖｕ　ＩＩ及びＥｃｏ　Ｖによる消化物を第７Ａ図に示す。レーン４〜８で観察される新規ＤＮＡ断片は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｓａｕ　３ａ＋断片の挿入によるものであると思われる。第７Ａ図のレーン１及び２は、ＤＮＡサイズマーカーを含有した。単離された最大のプラスミドは、３８〜４０ｋｂであった。パルス野ゲル分析から、それは２２ｋｂと１７ｋｂの２つのＮｏｔＩ断片を含有することが示されｔ；（第７Ｂ図、レーン３）。レーンｌはパッケージング化ベクターＤＮＡを含有し、レーン２はＮｏｔ　Ｉで消化された２分のＩ　Ｓａｕ　３ａＩ−キメラを含有した。これらの結果は、５ａｕ３ａＩ挿入体が小頭ｕ（ＰＩＳ）粒子に全てがパッケージングされたわけではない場合は、その容量は４０ｋｂ以下であることを示唆している。

（ｂ）ＮｏｔＩクローンＳｏ＋ｉｔｈ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６．１４４８〜１４５３（１９８７）　）が記載したｌ：、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡの最新のＮｏｔＩ制限マツプには、Ｅ、　ｃｏｌｉＤＮＡのＮｏｔＩ消化によって５つのＤＮＡ断片が生じることが示されている。これらの断片は、本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＰＩバッキング系によってバッキングされ得る。これらの断片は、大きさが２０ｋｂ、　４０ｋｂ、　４３ｋｂ　（このサイズの断片が２つ）、及び９５ｋｂである。Ｎｏｔ　Ｉ断片をｐＮＳ３５８　ＤＮＡに挿入し、Ｓａｕ　３ａＩ挿入体に関して記載したと同様にＢ５５９１細菌内でそれらをクローニングした後、５つのクローンからのプラスミドＤＮＡを調べた。クローン化プラスミドのうち２つのもののＤＮＡは、ｐＮＳ３５８のｋａｎ−Ｒドメインのみを含有した。他の３つのクローン化プラスミドからのＤＮＡをＮｏｔＩで消化した場合、それらがベクターのｋａｎ−Ｒドメインに加えて、３０ｋｂ以上の大きさのＮｏｔｌ断片を保有することが示された。これらのＤＮＡ中のＮｏｔＩ挿入体の大きさは、パルスゲル電気泳動によってより正確に測定した。

プラスミドの１つ（第７Ｂ図、レーン１１）は、ゲル中で４゜ｋｂママ−−を伴って転位するＮｏｔ　Ｉ挿入体を含有したが、−万能の２つ（第７Ｂ図、レーン９及び１０）は、わずかに大きい４２．５ｋｂマーカーを転位する挿入体を含有した。３つのクローンはすべて、ベクターのｋａｎ−Ｒドメインに対応する１２ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ断片を含有した。４３ｋｂ挿人体を含有するクローンの１つのＤＮＡは（レーン１０）　、６ｋｂ　ＮｏｔＩ断片を含有したが、この起源はＥ、ｃｏｉ２ｉ断片の場合のようには明らかでなかっＩ；。レーン１０に示されているプラスミドＤＮＡの、ＮｏｔＩによってではなくＢｇｌＩ［及びＸｈｏ　Ｉによる消化は、全体の大きさが６０ｋｂを上回る断片族を産生したが、これはその大きさがＮｏｔＩ消化物に基づく概算値であることを確証している（第７Ｃ図、レーン２）。それらの大きさに基づいて、ＮｏｔＩ挿入体を有する３つのプラスミドは、大きなＰＩ（ＰＩＢ）頭部にパッケージングされていなければならなかった。

Ｅ、ｃｏｌｉ）リプトファン生合成オペロンの遺伝子は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡの９５ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ断片上に存在するが、その大きさの断片がｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＩ頭にパッケージングされ得ることを示すために使用した。Ｎｏｔ　Ｉ−消化Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡを用いてパッケージング反応に起因する７アージは、ラムダ−Ｐｌ　：　ｃｒｅプロファージを含有するＥ、　ｃｏｌｉのＮ５３０６７株（ｔｒｐつを感染するために用いた。その結果生じたｋａｎ−Ｒ細菌を単離し、それらがトリプトファンを欠いた最小寒天培地上で増殖し得るか否かを調べる試験をした。試験した５０のうち２つが増殖した。そのプラスミドＤＮＡを陽性クローンの１つから単離し、臭化エチジウム染色（第８Ａ図、レーン３〜４）によって、又はパルス野ゲルのサザーン分析（第８Ａ図、レーン５〜６）によって、Ｅ、　ｃｏｌｉｔｒｐ遺伝子グローブに対してハイブリッド化される９５ｋｂＥ、ｃｏｌｉ　Ｎｏｔ　Ｉ断片を含有することを示した。レーン３及び５はＮｏｔｆによって消化されたプラスミドＤＮＡを含有し、レーン４及び６はＮｏｔ　Ｉによって消化されたＥ、　ｃｏｌｔＤＮＡを含有した。パルス野ゲルをｋａｎ−Ｒ遺伝子ＤＮＡでグローブした場合、１２ｋｂ　ＤＮＡ断片はｔｒｐプラスミドＤＮＡを含有するレーン（レーン７）には現われたが、しかしＥ、　ｃｏｌｉＤＮＡを含有するレーン（レーン８）には現われなかった。

その断片は、ｐＮＳ３５８　ＤＮＡのｋａｎ−Ｒドメインに対応した。

種々（７）制限酵素（ＢｇｌｌＩ−ＸｈｏＩ　、　レーア　１及び２゜ＨｉｎｄｌｌＩ、レーン３及び４．ＳｍａＩ、レーン５及び６）でｔｒｐプラスミド及びＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡを消化し、その後プローブとしてｔｒｐプラスミドＤＮＡを用いてサザーン分析した結果、プラスミドＤＮＡは、真正Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ断片と大きさが同じである多数の断片を含有することが示された。レーン１，３及び５はＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡを含有し、レーン２．４及び６はｔｒｐプラスミドＤＮＡを含有した。断片がＥ、ｃｏｌｉレーン中に存在し、プラスミドレーンには存在しなかった場合、もしくはこの逆の場合は、それらがベクター由来のものであったか又はそれらがベクターとＥ、ｃｏｌｔＤＮＡとの間の接合を表わしていたことを示す。総じて、これらの結果は、Ｐ１パッケージング系が１０７ｋｂの大きさのＤＮＡ　（９５ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ挿入体＋！２ｋｂプラスミドｋａｎ−Ｒドメイン）を収容し得るということ、そしてベクターが染色体外プラスミドとしてそのＤＮＡを忠実に複製したということを示した。

２ｔｌｅのｐＮＳ３５８−１ｙｔ　ＤＮＡをＢａｍ旧又はＮｏｔＩで消化し、それを用いて、実施例１に記載されているように、それぞれＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡの５ａｕ３ａＩ及びＮｏｔＩ断片をクローン化する。実施例１におけると同様に、５ａｕ３ａＩ又はＮｏｔＩ断片挿入体でベクターＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングした後、そのパッケージング化キメラＤＮＡをＮ５２９７４株に注入し、ｋａｎ−Ｒ形質転換細胞を選択する。個々のｋａｎ−Ｒ形質転換細胞のＤＮＡを実施例１と、ｒｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング及びＣｒｅ＋細胞の形質転換後のｐＮＳ３５８　ＤＮＡ中にクローン化された外生ＤＮＡ断片の回収（ｐｐ、２７〜２８）」の章とに記載されている通りに単離し、制限酵素消化及びサザーンハイプリダイゼーション分析によってＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ挿入体を含有することを明示しｔ；。ベクター挿入体ＤＮＡがベクター中で溶菌レプリコンによって増幅され得るか否かを調べるために、キメラプラスミドを含むＮ５２９７４株細菌の培養を半分に分けて、１ｍＶ　ＩＰＴＧを含む場合と含まない場合とで３時間増殖させた。増殖時間終了時に、全ての細胞ＤＮＡを２つの培養の各々から単離し、ｒ　ｋａｎ−Ｒ遺伝子、Ｐ１プラスミドレズリコン及びＰＩ溶菌レプリコン、　ｐＮ５３６４を含有するプラスミドの増幅」という表題の章でプラスミドｐＮＳ３６４に関して記載したように、サザーンハイプリダイゼーションによってプラスミドコピー数を測定した。

ＩＰＴＧを含有して増殖させた培養からのＤＮＡは、ＩＰＴＧを含まずに増殖させた培養から単離されたＤＮＡの場合よりも２０〜３０倍多いベクター挿入体プラスミドＤＮＡを含有する。

この結果は、Ｃ３ＣＱ−臭化エチジウム平衡密度勾配を用いて２つの培養から超らせん環状ＤＮＡを単離することによって確証される。

中口第３図第４図第５図第６図第８図手続補正音（方式）平成４年１月９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の配列：Ｐｌ　ｌｏｘＰ部位−アンピシリン耐性遺伝子−ｐＢＲ３２２ｏｒｉ−ｐａｃ− Ｐｌ　ｌｏｘＰ部位−ポリリンカークローニング部位−カナマイシン耐性遺伝子 −Ｐｌプラスミドレプリコンを包含するＤＮＡ断片をクローニングするためのベクターであって、上記配列が、Ｐｌプラスミドレプリコンが最初のＰｌ　ｌｏｘＰ部位と結合してその配列が反時計回り方向に読まれるように環状化されたベクター。
２．上記ベクターがポリリンカークローニング部位とカナマイシン耐性遺伝子との間に挿入されたｌａｃＺプロモータの制街下でＰｌ溶菌レプリコンを有する請求項１記載のベクター。
３．Ｐｌｒｍ−ｃｍ−２ｃ１．１００　９．１６及びＰｌｒｍ−ｃｍ２ｃ１．１００　１０．１より成る群から選択される４倍体ファージ突然変異体で溶原化された細菌株。
４．ＮＳ２９６１及びＮＳ２９６２と呼ばれる請求項３記載の細菌株。
５．ＢＳ５９１及びＮＳ２９７４と呼ばれるＣｒｅ＋グラム陰性細菌株。
６．９５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の増幅をクローニングし、制御する方法であって：（ａ）外生ＤＮＡ断片を請求項２のベクターのポリリンカークローニング部位に挿入し；（ｂ）工程（ａ）の生成物をｐａｃ−開裂プロフィシェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接触させ；（ｃ）ｌａｃｌｑリプレッサーを有するＣｒｅ＋グラム陰性細菌株を工程（ｂ）の生成物で感染させ；（ｄ）工程（ｃ）の生成物にＩＰＴＧを加えることによってｌａｃｌｑリプレッサーを抑制解除し；（ｅ）クローン化及び増幅化ベクターＤＮＡを回収する；工程から成る方法。
７．Ｃｒｅ＋グラム陰性細菌株がＮＳ２９７４と呼ばれる細菌株である請求項６記載の方法。
８．上記ｐａｃ−開裂プロフィシェント抽出物がＮＳ２９６２と呼ばれる溶原性細菌株から調製される請求項６記載の方法。
９．上記頭−尾プロフィシェント抽出物がＮＳ２９６１と呼ばれる溶原性細菌株から調製される請求項６記載の工程。
１０．そこに挿入された外生ＤＮＡ断片を有する請求項１又は２記載のベクターのＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐｌバクテリオファージパッケージングのための工程であって、断片含有ベクターのＤＮＡをｐａｃ−開裂プロフィシェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接触させることを包含し、この場合上記断片の大きさが９５ｋｂ又はそれ以下である工程。
１１．上記ｐａｃ−開裂プロフィシェント抽出物がＮＳ２９６２と呼ばれる溶原性細菌株から調製される請求項１０記載の工程。
１２．上記頭−尾プロフィシェント抽出物がＮＳ２９６１と呼ばれる溶原性細菌株から調製される請求項１０記載の工程。
１３．９５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片のクローニング方法であって：（ａ）外生ＤＮＡ断片を請求項１のベクターのポリリンカークローニング部位に挿入し；（ｂ）工程（ａ）の生成物をｐａｃ−開裂プロフィシェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接触させ；（ｃ）Ｃｒｅ＋グラム陰性細菌株を工程（ｂ）の生成物で感染させ；そして（ｄ）クローン化ベクターＤＮＡを回収する；工程から成る方法。
１４．Ｃｒｅ＋陽性株がＢＳ５９１と呼ばれる細菌株である請求項１３記載の方法。