JPH04501506A - 百日咳菌の糸状血球凝集素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 百日咳菌の糸状血球凝集素 ゛　に・するクロス・リファレンス この出願は、１９８８年１０月２７日出願の第２６３，６４８号の一部継続出願 であり、その出願は参考として本明細書中に組み込まれる。 庄−醤 鼓」す辷狂 本発明は、百日咳菌（旦、截ハ非１的）の糸状血球凝集素をコードする遺伝子、 タンパク質生産物、並びに遺伝子操作技術によりワクチンを開発するための該遺 伝子および該生産物の利用に関する。 宵−景 百日咳菌［ボルデテラ・パータラシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ＨＬ康一旦鎚） ］は、ヒトにおいてのみ見つかる小さいグラム陰性杆菌である。それは百日咳と しても知られる小児病の病因物質である。感染しやすい個体では、病気が深刻な 発作性期にまで進行し得る。激烈で且つ発作的な咳が発生し、患者は咳の発作に 伴って低酸素および痙彎から二次障害を受ける。二次感染、脳障害および死が起 こり得る。この病気の発作性期における苛酷な作用に関連づけられている別の分 子成分は百日咳毒素（ＰＴＸ）である。ＰＴＸは、リンパ球増加促進因子、ヒス タミン感作因子および島活性化タンパク質といった様々な名称のもとで報告され ている。 別のタンパク質系状血球凝集素（ＦＨＡ）は、トランス作用性犯り座の調節下で 百日咳菌（Ｂ、　凹ｊ！玉国）により発現される表面関連タンパク質である。Ｆ ＨＡは不十分に特徴づけられているが、ヒト感染の過程において主な粘着および 免疫優性抗原として作用すると考えられる。このタンパク質は、ドデシル硫酸ナ トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約６０〜２２０ｋＤａ　（ キロダルトン）に及ぶポリペプチド種の不均質集団として現われる。一般に検出 される小さいタンパク質ゲルバンドのほとんどは、優性の２２０ｋＤａ種の分解 産物であると思われる。このタンパク質の電子顕微鏡検査は、直径２　ｎａ＋　 Ｘ　４０−１００ｎ−を有する糸状構造を明らかにする。 ＦＨＡは、細菌−真核細胞の粘着相互作用を媒介する最も重要な因子の１つであ ると提唱されている。更に、ＦＨＡは臨床的疾患後のヒトにおける免疫応答を刺 激し、そして免疫処置されたマウスのエーロゾルチャレンジを使用するモデル系 において免疫保護抗原として作用する。単独で使用するとＰＴＸよりも効果的で ないが、ＦＴＨとＰＴＸは一緒になって相乗的な免疫保護作用を表わす。 聚迷又猷 百日咳菌（旦、Ｌ浪男１国）の血球凝集素タンパク質の記載は、Ｉｒｏｎｓ　ら 、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｆｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８３）１２９：２７６９−２７７８ ：Ａｒａｉおよび５ａｔｏ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ（１ ９７６）４４４ニア６５−７８２；並びにＺｈａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ ｍｕｎ、（１９８５）４８：４２２−４２７中に見つけることができる。生理学 的性質は、Ｔｕｏｍａｎｅｎおよび−ｅｉｓｓ、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｔｓ、　 （ｉ９８５）　１５２：　１１８−１２５；Ｌｅｎｉｎら、ＦＥＭ針Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ１．Ｌｅｔｔ。 （１９８６）３７：８９−９４；Ｕｒｉｓｕら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ＋＋ｕａｕ ｎ、（１９８６）５２：６９５−７０１ＨＲｅｄｄら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　（１９８８）２６：１３７３−１３７７；Ｏｄａ　ら、ムＩｍｍ ｕｎ、　（１９８３）４０：５２３−５２８；５ａｔｏおよび５ａｔｏ、同文献 （１９Ｂ４）４６：４１５−４２１；並びにＡｄ　Ｈｏｃ　Ｇｒｏｕｐ　ｆｏｒ 　ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ＰｅｒｔｕｓｓｉｓＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｌａｎｃ ｅｔ　１（１９８８）９５５−９６０により記載されている。 糸状血球凝集素構造遺伝子またはその断片のクローニングＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、（１９８６）３６：７３−７７並びに５ｔｉｂｉｔｚ　ら 、ムＢａｃｔｅｒｉｏｌ　、　（１９８８）　１７０：２９０４−２９１３によ り報告されている。 糸状血球凝集素の化学分析は、Ｓａ　ｔｏら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。 （１９８３）４１：３１３−３２０により報告されている。 主班公要り 百日咳菌（Ｂ、　匹Ｂμｍ匡）ｆｈａＢ遺伝子の少な（とも一部分をコードする ＤＮＡ配列、そのような配列を含む遺伝子操作された生成物、およびそのような 遺伝子操作配列を含有する細胞が、百日咳の診断、予防および治療のために提供 される。 の　し　の量己 本発明は、百日咳菌（Ｂ、　Ｌチμ＋　Ｓ　ｔ　ｓ　）の糸状血球凝集素タンパ ク質に関連するヌクレオチド配列並びに百日咳の診断、予防および治療における それらの利用に関する。転写解読枠は、実験の部に記載される配列のように約１ ０ｋｂｐ（詳しくは約１０７８９　ｂｐ）である。それは２３０ｋＤａのＮ先端 断片を含んで成る約３６８　ｋＤａ（約３５９７アミノ酸）のタンパク質をコー ドし、前記Ｎ先端断片は、高アルギニンペプチド配列ＲＲＡＲＲＯ所でのタンパ ク質分解により、それぞれＮ末端断片とＣ末端断片である約９８ｋＤａと約１４ ０ｋＤａの２つのポリペプチド断片に分割される。この高アルギニン配列はタン パク質分解の開裂部位として働くことができる。ポリペプチド全体は塩基性であ り、比較的高い電荷密度、９．６５のｐＫ＋および＋１９の実効電荷を有する。 アラニンとグリシンは全残基の２７％を占め、３％のみが上流に存在する。最後 の３５０アミノ酸はプロリンに富む（１７％）高塩基性領域（電荷＋３２　；　 Ｉ）Ｌ　１１．３）を提供する。アミノ酸１０９７位（左側のＥｃ、ｏ　Ｒ１部 位から２５３ｂｐのところの翻訳開始点により定義される）および２５９９位は トリペプチド配列ＲＧＤである。この配列は、フィブロネクチンや他の真核生物 細胞外基質タンパク質と成る種の真核細胞レセプター、特に哺乳動物細胞レセプ ターとの相互作用のための「細胞認識部位」として知られており、ＦＨＡにより 媒介される細菌粘着と同様な形式で機能することができる。 該遺伝子はｖｉｒ座の近くに位置すると思われる。転写によＶυＢから約２−５ ｋｂ下流に位置し、その後方に同じく調節遺伝子であると思われる遺伝子ｆｈａ ＣがＵυＡの下流方向に位置する。ＯＲＦの始まりは、ｂｎｇ遺伝子垣ＩＡの最 初から約４３０　ｂｐ離れている。該遺伝子はｐＤＲ＋　ＥｃｏＲＩ部位の左か ら２５３位で始まり、そしてＴＡＧコドンを有する１１０４１位で終わる。 ｆｈａＢ遺伝子は、高ＧＣ含量、即ち約６７．５％を有することにより特徴づけ られる。加えて、ヌクレオチド１４６８からヌクレオチド１７４６までの領域中 にパターンＡＢＡＢＡの一連の縦列方向のヌクレオチド繰返しがあり、実験の部 において報告する配列のＧがヌクレオチド１である。稀なもう１つの繰返しくＰ Ｋ）ｓが残基３４７７で始まる。３３１９位の配列ＶＥＶＶＰＲＫＶＥＴが３３ ５０位のところで繰り返される。転写開始はＯＲＦの７０−７５ｂｐ上流で起こ ると思われる。 少なくとも約１５ｂｐ、より普通には少な（とも約５０ｂｐ、通常は約１００ｂ ｐの転写解読枠の断片は、様々な方法において用途を見出すことができる。その ような断片は、診断目的で、百日咳菌（Ｂ、　Ｌ屡四４順）の存在を検出するた めにＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズさせる際のプローブとして等に用いる ことができる。サザン、ノーザン、ドツトプロットまたは他の技術を使用するこ とができる。該断片は少なくとも約９アミノ酸（２７ｂｐ）　、通常は少なくと も約１２アミノ酸のペプチドをコードするのに用いられるだろう。 該断片は、アンチセンス方向においてｆｈａＢ遺伝子の発現産物の量の調節が重 要となり得る場合にそのような調節を行うために用いることができる。生物の表 面上の糸状血球凝集素の存在を減少させることにより、該生物の感染力を調節お よび／または弱化せしめることができる。 ｆｈａＢ遺伝子の着目の断片は、９８ｋＤａタンパク質および２３０ｋＤａタン パク質の発現に関係がある断片を包含する。本出願において提供される配列に示 されるようなナンバリングを使うと、９８ｋＤａタンパク質の断片はヌクレオチ ド３４０２と３５０２の間、通常は３４５１と３４７４の間で終わるだろう、　 ２３０ｋＤａタンパク質は前記範囲内において始まり、そして約ヌクレオチド９ ６２４で終わる。標準法を使って百日咳菌（旦、朋戸凹園国）の液体培養−Ｆ清 からＦＨＡが初めから単離されそして精製される時、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に２３ ０．１４０．１．２５および９８ｋ［ｌａのポリペプチド種を有する３〜４本の バンドがしばしば観察される。貯蔵期間の増加と共に７５ｋＤａと５８ｋＤａの 新規種が現われ、同時に２３０ｋＤａのバンドが薄れそして１２５ｋＤａと９８ ｋＤａのバンドが強まる。 １４０および１２５ｋＤａ断片については同じＮ末端配列が観察される：　Ａ− Ｌ−Ｒ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｑ−Ｇ−Ｎ　 、　コ（７）ペプチドは、提唱されるタンパク質分解開裂部位Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｒ− Ｒのすぐ下流の１０７４位で始まりそして１１３１位で終わる配列によりコード される。更に着目されるのは繰返し配列であり、該配列は少なくとも２回の繰返 し、好ましくは３回の繰返しを有し、そして該断片は転写解読枠の少なくとも約 ６０ヌクレオチド、より普通には約１００ヌクレオチドであり、そして２７８ヌ クレオチドまたはそれより多く、通常は約３００ヌクレオチドを超えないであろ う。該断片は繰返し領域全体を包含する。繰返しは完全な相同性を有さないが高 い保存率を示す。 着目の領域は、アミノ酸配列１２１１〜１２１６（Ｅ−Ａ−Ｒ−に−Ｄ−Ｅ）、 １８７６〜１８８１　（Ｒ−に−Ｄ−ε−Ｈ−Ｒ）および３０７５〜３０８０（ Ｓ−に−Ｑ−Ｄ−Ｅ−Ｒ）、並びにいずれかの方向において１００までのアミノ 酸、好ましくは５０までのアミノ酸に及ぶが特に上述の配列の少なくとも３アミ ノ酸を包含する隣接アミノ酸配列をコードするものであろう。着目のＤＮＡ配列 としては、３４９０−３５９０　、３８４０−３９４０　、５８４０−５９４０ 　、９４４０−９５４０の断片、並びにそれらの少なくとも１５ｂｐ、より普通 には少なくとも２５ｂｐの断片が挙げられる。約５６２５〜５７８０の断片は着 目の特徴を全く有しないと思われるので、上記の断片のうちの１つに連結しない 限り除外されるであろう。 百日咳菌（旦、Ｌｌ某咀江）ＦＩ（Ａタンパク質に対して調製された抗血清は、 パラ百日咳菌（旦、ａｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓ）および気管支敗血症菌（Ｂ、　 虹並的亘並旦９）のポリペプチド種と交差反応する。領域２８３６−３７８６ｎ ｔ、　５２１２−７２９４ｎｔおよび６３９３−８０８０ｎ　ｔの発現産物に結 合する抗血清はバラ百日咳菌りｙ１四−ｒｔｕｓｓｉｓ）のペプチドに結合した が、最初の２つの抗血清のみが気管支敗血症菌（ｂｒｏｃｈｔｓｅ　ｔｉｃａ） のペプチドに結合した。 問題のタンパク質またはそれのいずれかの部分は、任意の便利な宿主、好ましく は原核生物宿主において調製することができる。発現構成物を用いて適当な宿主 を形質転換せしめることにより、宿主は着目のポリペプチドを発現するであろう 。次いでこのペプチドを単離するか、または適当な時には問題のタンパク質また はその部分を含む宿主を単離し、そしてワクチンとして使用することができる。 発現構成物またはカセットは、転写開始領域、発現させようとするポリペプチド の構造遺伝子、および転写終結領域を使用するだろう、転写開始領域はＲＮＡポ リメラーゼ結合部位のみを含んでもよく、あるいは問題のタンパク質もしくはそ の部分の増加された発現または問題のタンパク質もしくはその部分の誘導発現に 備えてエンハンサ−またはオペレーターを含んでもよい。 １または複数の原核生物宿主中で活性である多数の転写開始領域、例えばラムダ 左または右プロモーター、里プロモーター、抛プロモーター、里プロモーター、 ■プロモーター、メタロチオネインプロモーター等が知られている。天然のプロ モーターも使用することができる。特定のプロモーターは、宿主細胞系の選択に 応じて効率的な発現に備えるように選択されるだろう。 大部分は、糸状血球凝集素またはその部分の効率的な発現、発現生産物の完全性 、発現生産物の単離の容易さ、および成る状況では、ワクチンとして形質転換宿 主を使ってタンパク質を単離せずに宿主を利用できる能力に備えて、原核宿主細 胞系が使用されるだろう。問題のタンパク質またはその部分に対するだけでなく 他の病原体に対する免疫応答にも備えることができる種々の生物を使用すること ができ、そのためワクチンは百日咳菌（Ｂ、　Ｌ環非咀圏）生物に対するだけで なく他の病原体により引き起こされる病気に対しても免疫保護をもたらすだろう 。 使用することのできる種々の宿主生物としては、グラム陰性生物、例えば大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｔ）、サルモネラ属（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）、エルジニア属（ Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ボルデテ ラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、例えばアビウム（廊…）、気管支敗血症菌（敗 並並旦肛■組）、パラ百日咳菌（匹すｙｍ迫阻匡）および百日咳菌（Ｌぢ１１匡 ）が挙げられるが、最後の２つが特に好ましい。 前に指摘した問題のタンパク質の配列分析は、従来の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ） クローニング宿主のもの（約５０％）よりも相当高いグアニン＋シトシン含量を 示す。従って、大部分は、宿主はそのゲノムにおいて高いグアニン＋シトシン含 量、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは６５％を有するだろう。 しかしながら、ＧＣ優先を欠く生物において使用するために、グアニンとシトシ ンの割合を減らすために合成部分を使用してもよい。 様々な宿主種において使用される様々な複製系が入手可能である。大部分は、ベ クターは機能的な複製系だけでな（、問題の構造遺伝子またはその部分を含有す る形質転換体を選択するためのマーカーを含むだろう。宿主中で安定であるマル チコピー複製系を有することにより発現の効率を増大させるために、浴深性を伴 わずにベクターとして安定に維持されるプラスミドまたはウィルスのいずれかを 使用することが通常望ましいけれども、これは必要でない。従って、選択用のマ ーカーと共に発現カセットを含んで成る裸のＤＮＡを用いて形質転換を行うこと ができ、ここで該マーカーは発現カセットに連結されていてもよく、または形質 転換媒体中に独立して存在してもよい。成る状況下では、発現宿主に適当な複製 系を有さないベクターが使用されるだろう。こうして、マーカーを含む細胞につ いて選択することにより選択を実施し、組込みが起こったことを保証することが できる。 種々様々なマーカーを使用することができ、マーカーとしては、抗生物質耐性、 重金属耐性、栄養素要求性宿主に原栄養性を付与すること、等が挙げられる。特 定のマーカーの選択は本発明にとって重要でないが、選択効率および問題のタン パク質の生産効率のために選択されるだろう。 形質転換の形式および宿主に依存して、様々な他の機能的能力をベクター中に提 供することができる。例えば、ヘルパープラスミドと共同した接合を考慮して伝 達能力を提供することができ、この場合一度受容体宿主に伝達されれば、該ベク ターはもはや他の宿主に伝達されない。例えば、特にＰ−１不和合性群からの小 配列を使用することができる。加えて、バタテリオファージλからのｃｏｓ部位 を使用してもよい。 着目の他のマーカーとしては、抗生物質耐性株を感受性にする遺伝子を挙げるこ とができる。 終結領域は本発明にとって重要でなく、任意の便利な終結領域を使用することが できる。生来の終結領域を使用してもよ（、または転写開始領域または異なる領 域と通常関連がある終結領域を使用してもよい。実際に多数の転写終結領域が使 用されておりそして一般に入手可能であり、有利に利用できる。 任意の便利な方法により宿主を形質転換せしめることができる。裸のＤＮＡを使 うことにより、リン酸カルシウム沈澱したＤＮＡを形質転換に用いてもよい。あ るいは、ヘルパープラスミドを使った接合を用いてもよく、この場合伝達遺伝子 はベクター中に提供される。成る場合には、バクテリオファージベクターを使用 することが望ましいかもしれない、この場合、宿主細胞は形質導入またはトラン スフェクションされるだろう。問題の遺伝子またはその部分を含んで成る発現カ セットを導入するための方法は本発明にとって重要でなく、様々な別のプロトコ ルが文献中に広く例証されている。 −問題の遺伝子は種々の障害または変異を受けてもよい。例えば、ペプチダーゼ 開裂部位を除去するために配列ＲＲＡＰＲを置換、削除または変更してもよい。 こうしてタンパク質は１、−緒に融合された２つの潜在的断片を有する実質的に 完全状態のまま保持されるだろう。このタンパク質は広範な用途を見つけること ができる。他の変異として、ＲＲＡＲＲ配列の下流にある配列のみを残すような 、該遺伝子の上流部分の除去を挙げることができ、この場合開始コドンが適当な 部位に導入され得る。更に、ＲＧＤ領域の突然変異誘発は、真核生物標的細胞と の相互作用の変更およびおそら（宿主免疫応答の変更を引き起こし得、この両方 が病気の治療または予防に有用であると判明するかもしれない。 突然変異は、試験管内突然変異誘発、プライマー修復、ポリメラーゼチェーン反 応、制限部位失火、挿入等を使って様々な方法で達成することができる。問題の 遺伝子を修飾する特定方法は本発明にとって重要でなく、所望の置換、欠失また は挿入に備えて任意の常用技術を使用することができる。 問題の遺伝子は、プラスミドｐＨＷ２１−２６のＥｃｏＲＩ消化によって得るこ とができる。得られた１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は９３７５ｂｐの転写解読枠を 含む、この断片は様々な方法で５′末端を操作することができる。Ｂａｌ　３１ 消化を使うことにより、配列を切除して開始コドンの５′側の非コード領域の全 部または部分を除去してもよい。あるいは、開始コドンの上流または下流のいず れかで制限消化することができ、開始コドンの下流での制限により除去されたヌ クレオチドを適当なアダプターで置き換えることができる。こうして、問題の配 列を転写開始調節領域の下流のポリリンカー中に挿入し、そしてそのような領域 の転写開始調節下に置くことができる。 問題の組成物であるヌクレオチドもタンパク質も共に、診断と療法の両方に用い ることができる。診断用途については、既に指摘したように、百日咳菌（旦、凹 υ非咀ｉｓ）の存在の指標として問題の配列と重複する核酸配列の存在を検出す るために該配列を用いることができる。あるいは、該タンパク質およびその部分 は、診断アッセイにおいて、血液試料中の糸状血球４Ｅ集素に対する抗体または 血液もしくは組織試料中の糸状匍球凝集素タンパク質の存在を検出するための標 識もしくは未標識試薬として用いることができる。 完全なタンパク質またはその部分は、診断、予防または治療において使用するこ とができる抗体を調製するために用いることができる。抗体はポリクローナルで もモノクローナルでもよく、好ましくはモノクローナルである。望ましくは中和 抗体が得られるだろう、抗体はマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、例えばマウ ス可変領域とヒト定常領域、等であることができる。特に着目されるのは、補体 に結合する定常領域を有するもの、例えばＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプである 。 抗体は受動免疫処置または常法に従った処置に用いることができる。 問題の組成物は、ワクチンとして、タンパク質として、それ自体でまたは他のタ ンパク質、例えば非細胞組成物と組合せて、百日咳菌または非百日咳菌宿主にお ける細胞組成物として、精製または手積製された形態において、等で使用される 。望ましくは、問題の組成物は、もはやＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活 性を有さない修飾された百日咳毒素、特にサブユニットＡと共に使用される。こ れは、Ｂｌａｃｋ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２４０：６５６−６５９に 記載されたｐｔｘ　３２０１を用いることにより達成することができる。糸状血 球凝集素遺伝子の通常の百日咳菌転写調節により調節されない構成性プロモータ ーまたは誘導性プロモーターの転写開始調節支配下に問題の遺伝子を導入するこ とにより、百日咳菌（旦、朋」凹咀旦）の表面上の問題のタンパク質の増大され た存在に備えることができる。こうして、生存または死んだ生物を予防接種する ことに応答して増強された免疫応答を獲得することができる。 問題の組成物を投与する様々な方法のため、投与量は広範囲に異なるだろう。加 えて、ワクチンの量は投与の性質、投投与の形式は、経口、腹腔内、皮下、筋肉 内等であること与の頻度、抗原の存否、抗原の性質等に応じて異なるだろう。 ができる。通常は不活性担体、例えば糖、水、水性エタノール、リン酸塩緩衝化 塩溶液、塩類溶液等が使用される。アジュバントとしては水酸化アルミニウム、 植物油、細菌毒素等が挙げられる。活性成分の量は通常ヒト−回置について約２ ５〜７５ｘ／ｋｇの範囲内であろう。受動ワクチンは以前に使われており、従来 の用法を使用量に対する指針として用いることができる。例えば、ｐ坐に崩Ｐ閂 ｃｔｓ士り駐ヅ毀１ＢｌＬ盈堕１０工堕、−ｚａｔｉｏｎ、前掲を参照のこと。 次の実施例は例示の目的で与えられ、限定の目的ではない。 叉−狡 徂帥 １抹殻よびプラスミド。百日咳菌（影ビぢμ１堕）　ＢＰ５３６株は、ビルレン ト相（１）親株ＢＰ３３８の自然発生ストレプトマイシン耐性変異体である。Ｂ Ｐ５３７はＢＰ５３６の非ビルレント相変異株である。Ｔｎ５変異体ＢＰ３５３ の単離は−ｅｉｓｓら、Ｔｎｆｅｃｔ、　ＩｍｍｕｎＪ１９８３）４２：３３− ４１により以前に記載されており；より最近になってトランスポゾン挿入部位が マツピングされた（Ｓｔｉｂｉｔｚら、１９８８、前掲）　、　ＢＰ３３８　Ｔ ｎ　５−２５は、珈Ｂの２、４　ｋｂ　Ｂａｍ旧セグメント内にｎ５挿入変異を 有する（Ｓｔｉｂｉｔｚら、１９８８、前掲’）　、　ＢＰ−Ｔｏχ６（Ｒ，Ｒ ａｐｐｕｏｌｉから入手可能）は、百日咳毒素オペロンの欠失およびその位置に おけるカナマイシン耐性カセットの置換を有するＢＰ５３６の誘導体である。　 ＢＰ−８５２（Ｍ、Ｍｏｏｉから入手可能）は、ｆｉｍ２および月１３遺伝子を 独立的に不活性化する挿入変異を有するＢＰ５３６誘導体である。 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩおよび５Ｍｌ０株はどこかに記載されてい る団ｅｓｓｉｎｇ、　Ｒｅｃｏｍｂ、ＤＮＡ　Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｌ、　（１９７ ９）２：４３−４８；Ｓｉｍｏｎら、影主ユ赳勧煩且■（１９８３）　１　：　 ７８４−７９１１゜コスミドｐＵＷ２１−２６は、ＢＰ３３Ｂ由来のクローン化 された虫および当座を含む約４５ｋｂ挿入断片を有するｐＨｃ７９　［Ｈａｈｎ およびＣｏ１１ｉｎｓ、Ｇｅｎｅ（１９８０）１１：２９１−２９８１の誘導体 である（Ｓｔｔｂｘｔｚ、１９８８　、前掲）。プラスミドベクターｐＲＴＰ　 １の作製は既に記載されている［Ｓ　ｔ　ｉ　ｂ　ｉ　ｔｚら、Ｇｅｎｅ（１９ ８６）５０：１３３−１４０］　。 ｆｈａＢのクローニングおよびｆｈａＢ゛　の　１糸状血球凝集素（ＦＨＡ）構 造遺伝子ｆｈａＢをコスミドρＬＩＷ２１−２６カラの１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断 片においてベクターｐＲＴＰ　ｌ中にクローニングし、組換えプラスミドｐＤＲ １を作製した。ｐＤＲｌのＢａｍ旧部分消化物のプールを再連結せしめることに より、ｆｈａＢＯフレーム内部分欠失体を作製した。内部の２．４ｋｂＢｆμＩ Ｉ断片の欠損についてプラスミドをスクリーニングした。得られたプラスミドを ｐＤＲｌｏｌと命名した。 Ａおよび・）云　六 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から百日咳菌（影侭チ非１江）へのｐＲＴＰ１誘導体 の接合伝達のための技術は既に記載されている（Ｓｔｉｂｉ−ｔｚら、１９８６ 、前掲）。ｆｈａＢの部分欠失コピーを２段階において百日咳菌ＢＰ５３６中の 野生型対立遺伝子と交換した。第一に、大腸菌供与体５Ｍｌ０　（ｐＤＲｌｏｌ ）を、削除しようとするｆｈａＢ断片内に選択可能マーカーを担持している百日 咳菌受容体ＢＰ５３６　Ｔｎ５−２５と接合せしめた。次いでＳｖａのみを含有 する培地上にＳＩｌ”　Ａｐ”接合完了体を塗布し、そして二次乗換えおよび変 異対立遺伝子の獲得を示すに一耐性の欠損についてスクリーニングした。 ｎ　および配 ｆｈａＢを含む１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をＭ１３ａｏｐ１８とＭ１３ｓｐ１９ ［Ｙａｎｉ−ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１ １９］　、ｐＥＭＢＬｌＢ　と−１９［Ｄｅｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８３）１１：１ｆ２４５−１６５５］　、またはＢｌｕｅ −ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ベクター 中に、３つの別個のＢａｓ＋旧断片としておよび任意の１〜３ｋｂの５ａｕ３＾ 断片としてサブクローニングした。フレノウ断片またはシークエナーゼ（Ｕ、Ｓ 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｒ＋ｄ、 ０ｈｉｏ）のいずれかを使って、ジデオキシチェーンターミネーション法［Ｓａ ｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７７）７４ ：５４６３−５４６７］　により、ＤＮＡ挿入断片を配列決定した。大きなりロ ーン化挿入断片を読み通す配列を拡張するために、合成オリゴヌクレオチドブラ イマーを設計した。ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ 　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ ｌ）のソフトウェアパッケージを使って、ヌクレオチド配列の構築を行った。完 全なヌクレオチドおよび推定されるペプチド配列の更なる分析は、このパッケー ジとＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖ ｉｅｗ＋ＣＡ）の両方を使って実施した。 ２球盃集 ヒツジ赤血球を凝集させる百日咳菌（旦、　朋チ且亙匡）株の能力をポリスチレ ン製マイクロタイタープレー　ト（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）の円錐底型ウェル中でアッセイした。菌株 をＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕプレート上で２〜３日間増殖させ、リン酸塩緩衝 化塩溶液で２回洗浄し、そして１０の００．。。 値（１，７ｘｔＯＩ０細胞／ｄ）に再懸濁した。マイクロタイタープレートの第 一ウェルに１００Ｉｌ！のこの細胞懸濁液を入れ、その後連続的に１１回細菌を 培々希釈した。５０ｍの０．５％ＰＢＳ洗浄済細胞懸濁液としてヒツジ赤血球を 各ウェルに添加した。 プレートを室温で３〜４時間放置し、その期間中に凝集しない赤血球はウェルの 底に落ちて黒っぽいペレットを形成した。 血球凝集（ＨＡ）活性は、有意なペレット形成のない最高希釈度の逆数として表 わした。 月蓮凹咀艮）細胞懸濁液（ＯＤ６゜。＝１０）　２０ｄを用いてドデシル硫酸ナ トリウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニトロセルロー ス膜へのタンパク質の移行は、Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７９）７６：４３５０−４３５４に従った。ＰＢＳと１ ％脱脂粉乳の溶液とのブレインキュベーションにより非特異的結合をブロックし た。ＦＨＡの免疫学的検出は、モノクローナル抗−ＦＨＡ抗体（Ｆ、Ｍｏｏｉか ら入手）の混合物（１−５４，１−１９９，３１Ｅ２．２２Ｆ１０および６８Ａ ６）の１：１０００希釈液に続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウ ス抗血清の１：２５０希釈液とのインキュベージロンにより行った。テトラメチ ルベンジジン含有反応混合物を使ってＨＲＰ活性を検出した。υ遣２とｆｉｍ３ の生産は、同じ方法およびそれら２つのタンパク質に特異的なモノクローナル抗 体（２１Ｅ７と３Ｅ５　；　Ｆ　、　Ｍｏｏ　ｉから入手）を使って検出した。 サザンハイブ１　゛イゼーション 標準技術団ａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ 　：Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ−ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹＩ　に従って、百日咳菌（Ｂ、　匹戸！玉国）の染色体ＤＮＡを単離し、制 限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動により分離した 。ニトロセルロースへの断片の移行はＳｍ１ｔｈおよびＳｕｍｍｅｒｓの方法［ Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−止部、　（１９８０）　１０９：１２３−１２９］　に従っ た。プローブとのハイブリダイゼーシヨンは、５０％ホルムアミドと５ＸＳＳＣ を用いて３７°Ｃで行った。膜を２５℃にて２ｘｓｓｃで２回、２５°Ｃにて０ ．１×ＳＳＣで２回、および６５°Ｃにて０．Ｉ　Ｘ５ＳＣで２回洗浄した。 跋肢宣吉！皿塾Ｉ 百日咳菌（Ｂ、　匹Ｂ凹１国）株を２日間プレート上で増殖させ、次いでリン酸 塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。２００ＩのＭＥＮおよび約５Ｘ１０ ’個のチャイニーズハムスター卵巣細胞が接種されそして一晩増殖されたカバー ガラスを含む組織培養プレートに２０ｍの細菌懸濁液（ＯＤ、。。＝１０）を添 加した。３７°Ｃ１５％ＣＯ□において４時間インキュベートした後、各ウェル をＰＢＳで徹底的に３回洗浄した。残っている細菌およびＣＨＯ細胞をメタノー ルで固定し、次いでギムザ染色した。全ての菌株は二重反復試験において実験し 、全実験は少なくとも２回繰り返した。単−ＣＨＯ細胞への細菌粘着を目視でカ ウントし、そして平均と標準偏差を各棟について決定した。同時９５％信頼区間 は、中心極限定理近似およびＢｏｎｆ−ｅｒｏｎ　ｉ法に基づいて計算した。 箱二、艮 以前の研究は、對工およびｆｈａＤＮＡプローブとハイブリダイズしたコスミド クローンｐＵＷ２１−２６の単離に至った（Ｓｔｉｂｉｔｚら、１９８８、前掲 ）。ＦＨＡコロニーおよびウェスタンイムノプロットを使ったこのニスミド中の Ｔｎ５挿入変異の分析は、ＦＨＡ構造遺伝子ＵυＢが幻工座のすぐ右側の１０ｋ ｂ　ＥｃｏＲＩ断片上に位仕上ることを示唆していた。更に、先端を切り取られ たＦＨＡ生産物のサイズと対応する勤５挿入部位の位置との相関関係に基づくと 、ｆｈａＢの転写は左側のＥｃｏＲＩ部位の付近で始まり、そして左から右に進 行すると思われた。 ｆｈａＢの内部の２．４　ｋｂ　Ｂａ＋ｏＨＩ断片の削除を上述のようにして行 い、変異を百日咳菌染色体に戻してＢＰＩＯＩ株を得た。この株における生じた ｆｈａＢ変異遺伝子座の構造をサザンプロット分析により確かめた。ウェスタン プロット技術により測定すると、ＢＰＩＯＩにより生産される最長のＦＨＡ交差 反応性ポリペプチドは約１５０ｋＤａを有する。この先端を切り取られたＦＨＡ 生産物はもはや血球凝集活性をもたない。 それらのデータは、ＦＨＡの構造遺伝子がｐＤＲｌの１０ｋｂ　Ｅｃ。 Ｒ１挿入断片上に含まれるにちがいないことを確証した。従って、この断片をジ デオキシ−重鎖ＤＮＡ配列決定のためにすｆｈａＢ　ＯＲＦの７部分を各々発現 ベクターｐＥＸ３４中にクローニングした。各場合の結果は、ＭＳ２ファージＲ ＮＡボリメラ−ゼの最初の９８アミノ酸との翻訳融合であった。融合タンパク質 を大腸菌宿主中で発現せしめ、次いで調製用５ＯＳ−ＰＡＧＥを使って精製した 。それらの融合タンパク質の作製の１つの理由は、ＯＲＦの種々の領域中の翻訳 終結コドンの欠損を確かめるためであった。この目的は、測定された融合タンパ ク質の分子量と完全なりローン化ｆｈａＢ挿入断片の翻訳読み通しから理論上予 想されるものとの比較により処理した。表１は、融合タンパク質を各々のｆｈａ Ｂ挿入断片のヌクレオチド座標と共に示す。それらのデータは、全てのｆｈａＢ 断片における終結コドンの不在を確証する。 タンパク質　Ｈ１４５Ｋｄａ　ＢａｍＨＩ−Ｒｓａ！　２８３６−３７８６タン パク質　Ｈ２８５Ｋｄａ　ＢａｍＨＩ−Ｎｒｕｌ　５２１２−７２９４タンパク 質　Ｈ３７７Ｋｄａ　ＰｖｕＩＩ−Ｐｖｕｌｌ　６３９３−８０８５タンパクｔ 　Ｈ４８０Ｋｄａ　ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ　８０８５−９９２２タンパク質　 Ｈ５５５Ｋｄａ　５ｔｕＩ−Ｂａ＋ｏＨＩ　８７５２−９９２２タンパク質　Ｈ ６３２Ｋｄａ　ＥｃｏＲＶ−Ｂａｎ＋ＨＩ　９４６２−９９２２タンパク質　Ｈ ７５６Ｋｄａ　Ｂａａ＋ＨＩ−Ｃ１ａＩ　９９２２−１１６６６ム　ンハク’ヲ 　たウェス　ンイムノブロ・・ト翫 ７つの融合タンパク質の各々に対する抗血清をマウスの腹腔内免疫処置により調 製し、２つの目的：各々のＦＨＡ　５ＤＳ−ＰＡＧＥハンドをｆｈａ　Ｂ　ＯＲ Ｆの領域と互いに関係づけるため、およびＯＲＦによりコードされるポリペプチ ドのどの部分が全ボルデテラ菌種抽出物中に存在するかを決定するために使用し た。表２は、７つの融合タンパク質抗血清の各々を使ったウェスタンイムノプロ ットの結果およびＦＨＡタンパク質のゲルパターンを示す。 それらのデータとＮ末端アミノ酸配列決定の結果との組合せは、異なるＦＨＡポ リペプチド種の起源を示唆する。各々のｆｈａＢ融合タンパク質によるマウスポ リクローナル応答の刺激は、ＦＨＡが多数の免疫原性領域を含むことも主張する 。 ポリクローナル血゛ 抗抗抗抗抗抗抗抗 ＦＨＡ　Ｆ［（Ａ　ＨＩ　Ｈ２１（３Ｈ４Ｈ５Ｈ６Ｈ７５Ｂ−−−−−＋　−− −−−−− ＦＨＡ　゛告゛　−のヌクレオチド西　Ｉ上述の配列決定方法は、１００３６ｂ ｐ長のＥｃｏＲＩ断片のヌクレオチド配列をもたらした。コンビ講−ター分析は 、左側のＥｃｏＲＩ部位から２５３ｂｐめのＡＴＧ翻訳開始コドンにおいて始ま る長さ１０７８９ｂｐの転写解読枠（ＯＲＦ）を同定した。ＯＲＦの始まりから ４５ｂｐと１７４ｂｐ後方に２つの別のフレーム内Ａ　Ｔ　Ｇコドンが置かれて おり；３番目のＡＴＧコドンの位置付近において、百日咳菌にとって強力に優先 されるコドンの使用が始まる〔百日咳菌の百日咳毒素オペロンのコドン用法およ びＬＩＷＧＣＧコドン優先プログラムにより定義されるＨ　Ｇｉｂｓｋｏｖら、 Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）１２：５３９−５４９）　 、　ＯＲＦおよび優先されるコドン用法は左側のＥｃｏＲＴ部位から１１０４１ 　ｂｐ目のＴＡＧ終結コドンで終わる。このＯＲＦはＦＨＡ構造遺伝子ｆｈａＢ を包含する。ＯＲＦの配列を下記に示す。 ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧ ＣＧＧＧＴＴＧＴＣＧＧＣＧＣＡ　５１ＣＧＣＣＴＡＴＡＣＧＴＧＣＣＧＧＡＣ ＡＧＧＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＭＧＡ入ＡＴＴＴＣＣＴＡＣ１０２人 ＡＧＴＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＡＴ ＴＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＡＡ　１５３ＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＣＡＧ ＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧ入丁ττＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＧ　２０ ４ＡｓｎＴｈｒＡｓｎＬｅｕＴｙｒＡｒｇＬｅｕＶａｌＰｈｅＳｅｒＨｉｓＶａ ｌ入ｒｇＧｌｙＭｅｔＬｅｕＶａｌＣＣＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＡＴＴＧＣＡＣ ＣＧＴＣＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧ？　３５７Ｇ ｌｙＧ１ｎ入１ａＡｒｇｓｅｒＧｌｙＡｌａＡｒｇ入工ａＴｈｒＳｅｒＬｅｕＳ ｅｒＶａｌＡｌａＰｒｏＡｓｎＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴ ＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＧＴＴＡＧＴＭＣＧ　４５９Ａｌａ　 Ｌｅ　ｕＡｌａＴｒｐＡｌａＬｅｕＭｅ　ｊＬｅｕＡｌａｃ　ｙ　ｓ　ＴｈｒＧ 　ｌ　ｙ　Ｌｅ　ｕ！？　ｒｏＬｅ　ｕＶａ　ｌ　sｈｒ ＣＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧ ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧ　５１０ＨｉｓＡｌａＧ　ｌｎＧ　ｌｙＬｅｕ ＶａｌＰ　ｒｏＧｌｎＧｌｙＧ　ｌｎＴｈｒＧｌ’ｎＶａｌＬｅｕＧｌｎＧｌｙ Ｇｌ　ｙＡＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣ ＡＡＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧ　５６１Ａｓ　ｎＬｙ　ｓ　Ｖａ　Ｉ Ｐ　ｒｏＶａ　ｌＶａ　ｌＡｓｎ　Ｘ　ｌｅＡｌａＡｓ　ｐＰ　ｒｏＡｓｎＳｅ 　ｒＧ　ｌ　ｙＧｌ　ｙＶａ　撃唐■■ ＣＡＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＣＴ ＧＧＣＧＴＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣ　６１２Ｈ　ｉ　ｓＡｓ　ｎＬｙｓ　Ｐ　ｈｅ ＧｌｎＧ　ｌｎＰ　ｈｅＡｓｎＶａｌＡｌａＡｓ　ｎＰ’　ｒｏＧｌ　ｙＶａ　 ｌＶａ　］．Ｐ　ｈｅ`ｓｎ ＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＧ ＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣ　６６３Ａｓ　ｎＧｌ　ｙＬｅｕＴｈｒＡｓｐ ＧｌｙＶａｌＳｅ　ｒＡｒｇ　工１ｅＧｌｙＧ　１　ｙＡｌａＬｅｕＴｈｒＬｙ ｓＡｓｎＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＴ ＴＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＣＧＧＡＣＡＣＴ　７１４ＰｒｏＡｓｎＬｅｕＴｈｒＡ ｒｇＧｌｎＡ１ａＳｅｒＡｌａ工１ｅＬｅｕＡｌａＧｌｕＶａｌＴｈｒＡｓｐＴ 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全ポリペプチドの計算等電点は６．７９である。 ＦＨＡポリペプチド鎖内の荷電アミノ酸の濃度は２０００〜２７００位で最高で ある。疎水性はＮ末端の３００残基中並びに残基１８００−２０００および２４ ００−２５００付近の特定位置において最高である。残基５２〜６９間に膜貫通 セグメントを有するアミノ酸４４〜６９位に高く予想される膜貫通へリックスが 存在する。 推定アミノ酸ポリペプチドの１つの興味深い特徴は、１０６９位に置かれた配列 ＲＲＡＲＲである。この高アルギニン配列は、おそらくトリプシン様タンパク質 分解の開裂部位であろう。 他の研究者らによる幾つかの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ＦＨＡペプチドバンドのＮ末端 アミノ酸配列決定は、実際に開裂がこの位置で起こることを確証する。生じたＦ ＨＡペプチド配列の２部分の分析は、化学的性質の著しい相違を証明する：Ｎ末 端の９８ｋＤａ断片は正のヒトロバシー値を有する高塩基性であり、一方Ｃ末端 の１４０　ｋＤａ部分はより疎水性の全組成を有する負電荷の酸性ポリペプチド である。それら２つのサイズのポリペプチドは、ＦＨＡウェスタンイムノプロッ ト上で優性の種である。 ■斑閣ム皿泣 アミノ酸１０９７位および２５９９位にトリペプチド配列ＲＧＤが存在する。こ の配列は、フィブロネクチンまたは他の真核生物細胞外基質タンパク質と様々な 真核細胞表面上のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）　レセプター群との相互作 用のための「細胞認識部位」として知られる［Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよ びＲｕｏｓｌａｈｔｉ。 よびＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、５ｃｔｅｎｃｅ（１９８７）２３８：４９１ −４９７］、それら２つのＦｌ（Ａ　ＲＧＤ部位の近接のポリペプチド配列の二 次構造分析は、それらの第一が表面に暴露され、親水性でありそして抗原性であ ると推定されることを示す、このＲＧＤ部位の近隣のＦＨＡペプチド配列とフィ ブロネクチン中のＲＧＤの周辺の配列との比較は、９残基のうち７残基の一致を 示す、　ＲＲＡＲＲプロセシング部位での開裂は、２１４　ｋＤａポリペプチド 生成物のＮ末端に近いこの第−ＲＧＤ配列を残すだろう。 拭駁１古豊凶猫ｌ チャイニーズハムスター卵巣細胞への百日咳菌（ｆｉ、　凹チ！１堕）の粘着を 媒介することにおける幾つかのビルレンス因子の役割を評価した。表３はその知 見を示す。 表−主 ＣＨＯへの　眩　の゛ 上記の部に記載の結果は、百日咳菌（Ｂ、　匹チ刃咀堕）の糸状血球凝集素をコ ードする遺伝子および発現された遺伝子産物が、そのままの形および変更された 形で百日咳の診断、予防および治療における使用のために入手可能であることを 証明する。特に着目されるのは、ワクチンを調製するための８亥遺伝子の使用で あり、この場合、タンパク質はそれ自体で、断片として、該遺伝子の完全発現産 物もしくはそれの生理学的活性断片として、または他の百日咳タンパク質、特に 変更された百日咳毒素と組合せて、または別の病原体のタンパク質と共に、用い ることができる。問題の遺伝子は、生存もしくは死んだ百日咳菌（旦、　匹Ｂ四 咀ｎ）中に存在する糸状血球凝集素の量を増大させるために、または複数の抗原 に対する免疫応答が所望される場合に他の生物における問題のタンパク質の存在 に備えるために、用いることができる。 本明細書中に言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野 の当業者の技術水準を示すものである。 全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が 特定的に且つ個別的に参考として本明細書中に組み込まれたのと同程度に参考と して本明細書中に組み込まれる。 本発明を今まで十分に記載してきたが、添付の請求の範囲の精神および範囲から 逸脱することなく、多数の変更および改良を本発明に成し得ることは当業者にと って明らかであろ国際調査報告 ゛第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ　ｅｌ、’　識別記号　庁内整理番号＠発明　者　ドメニギニ、マ リオ　イ ＠発明者　ラップオリ、リノ　イ ア ０発　明　者　ファルコー、スタンレー　アン ＠出　願　人　スクラボ、ソチェタ　ベル　ア　イツイオニ １７９７国、　５３１００　シエナ、ビア　コロンビニ　９ｆタリア国、　５３ ０３５　モンテリツゴニ、ケルチェグロッサ　３９．ビｒ　カラマンドレイ 【メリカ合衆国、カリフォルニア　９４０２５．ポートラ　バレー、口／ゲスパ ー　８ イタリア国、　５３１００　シエナ、ビア　フイオレンテイナ　１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ｆｈａＢ遺伝子；または（２） 少なくとも約１５ｂｐのその断片；または（３）百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓ ｉｓ）以外のものであり，そしてｆｈａＡ遺伝子を含まず；そして隣接する百日 咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）配列以外のものに連結された配列５６２５〜５ ７８０以外のものである他の核酸配列に連結されたその断片をコードする、約１ ５Ｋｂｐ未満の核酸配列。
2. ２．前記配列が前記ｆｈａＢ遺伝子の５′転写および翻訳調節配列並びに終結領 域の範囲を越えない、請求項１に記載の核酸配列。
3. ３．前記断片が他の核酸を含まないかまたは百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ）以外の核酸配列に直接連結される、請求項２に記載の核酸配列。
4. ４．前記配列が少なくともＲＲＡＲＲをコードする配列あたりに及ぶＮ先端配列 である、請求項１に記載の核酸配列。
5. ５．前記配列が少なくともＲＲＡＲＲをコードする配列あたりに及ぶＣ先端配列 である、請求項１に記載の核酸配列。
6. ６．配列３４９０〜３５９０、３８４０〜３９４０、５８４０〜５９４０もしく は９４４０〜９５４０のうちの少なくとも１つまたは少なくとも１５ｂｐのその 断片を含んで成る、請求項１に記載の配列。
7. ７．前記配列が直接的または間接的に百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）以外 の核酸配列に連結される、請求項６に記載の核酸配列。
8. ８．少なくとも１つの天然配列以外のプロモーターもしくはターミネーター配列 に連結されそして百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）以外の遺伝子を含まない 、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ｆｈａＢ遺伝子または少なくとも２０１ 塩基対の断片をコードするＤＮＡ配列。
9. ９．配列３４９０〜３５９０、３８４０〜３９４０、５８４０〜５９４０または ９４４０〜９５４０のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項８に記載のＤ ＮＡ配列。
10. １０．前記配列が少なくともＲＲＡＲＲをコードする配列あたりに及ぶＮ先端配 列である、請求項８に記載のＤＮＡ配列。
11. １１．前記配列が少なくともＲＲＡＲＲをコードする配列あたりに及ぶＣ先端配 列である、請求項８に記載のＤＮＡ配列。
12. １２．原核生物宿主中で機能的な複製系および請求項８に記載のＤＮＡ配列を含 んで成るベクター。
13. １３．前記ベクターが選択のためのマーカーを含んで成る、請求項１２に記載の ベクター。
14. １４．前記配列が原核生物宿主中での発現のために機能的なプロモーターもしく はターミネーター配列に連結されている、請求項１２に記載のベクター。
15. １５．前記プロモーターが天然のプロモーターである、請求項１４に記載のベク ター。
16. １６．前記プロモーターが天然以外のプロモーターである、請求項１４に記載の ベクター。
17. １７．前駆体原核細胞中へのＤＮＡ配列の試験管内導入の結果として、ｆｈａＡ 遺伝子以外であり且つ配列５６２５〜５７８０以外である配列に連結されたｆｈ ａＢ遺伝子または少なくとも約１５ｂｐの断片を含んで成る前記ＤＮＡ配列を有 する形質転換された原核細胞、および前記形質転換された原核細胞の子孫。
18. １８．前記前駆体原核細胞が百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）である、請求 項１７に記載の形質転換された原核細胞。
19. １９．百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の糸状血球凝集素と交差反応性のペ プチドの生産方法であって、形質転換された原核生物宿主中で発現することがで きるｆｈａＢ発現カセットを含んで成る前記宿主を増殖せしめ、それによって前 記ペプチドが発現される方法。
20. ２０．前記ペプチドが前記糸状血球凝集素の少なくとも９アミノ酸の断片を含ん で成る、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記ペプチドがｆｈａＢ遺伝子のＣ末端部分である、請求項２０に記載の 方法。
22. ２２．百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の糸状血球凝集素と交差反応性のペ プチドを含んで成るワクチンであって、形質転換された原核生物宿主中で発現す ることができるｆｈａＢ発現カセットを含んで成る前記宿主を増殖せしめ、それ によって前記ペプチドが発現される方法によって調製されるワクチン。
23. ２３．百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）内毒素と交差反応性のペプチドを更 に含んで成る、請求項２２に記載のワクチン。
24. ２４．前記ペプチドがＡサブユニットと交差反応性である、請求項２２に記載の ワクチン。