JPH04501606A - センサーユニット及びバイオセンサーシステムにおけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 センサーユニット及びバイオセン サーシステムにおけるその使用。

本発明はバイオセンサーの分野に関し、より詳しくは試料中の多数の生体分子の 濃度を同時に測定する方法、並びに１つの生体分子のいくつかの性質を同時に測 定するためシステムで使用する検出表面を官能化させる方法に関する。更に本発 明はそのような表面を含むセンサーユニット、表面を官能化させるための試薬キ ット、及び生体分子の表面特性決定に関連するその使用に関する。

Ａｉｚａｗａ（１９８３年）によれば、バイオセンサーは分子認識のためのりセ プター例えば固定化抗体を持つ選択層と測定した値を伝達するための変換器との 特異な組合せであると定義される。そのようなバイオセンサーの１つの群はりセ ブターの周辺媒質との相互作用により表面層の光学的特性に生ずる変化を検出す る。そのような方法の中では特に楕円偏光法と表面プラスモン共鳴が挙げられる 。

この種類の方法が実際の実行において十分に働くためにはい（つかの要件が満た されなければならず、その要件とは使用する検出表面はそれが所望のりセプター を含み得るように容易に誘導体化されなければならないこと、及び更に前記表面 はいかなる非特異的結合すなわち意図するそれ以外の成分の結合を生じないこと 、又はそのような結合が生じた場合、測定シグナルに対していかなる有意な寄与 も与えないことである。この分野のいくつかの従来技術の例を下に示す。

欧州特許出願公開第２−２７６９６８号は活性結合剤例えば抗体、抗原、ハプテ ン、タンパク質Ａルクチン、ビオチン及びアビジンの生物学的回折格子設計を持 つポリシリコン又は単結晶シリコン表面からなる光免疫試験に使用するバイオグ レーティング（ｂｉｏｇｒａｔｉｎｇ）を開示している。

欧州特許出願公開第１−２７６１４２号は追加の複合体形成試薬を利用して光学 的表面の光学的厚さを増加させることにより表面プラスモン共鳴に基づく試験の 感度を改善する方法を開示している。

欧州特許出願公開第２−１１２７２１号は測定する物質を結合する能力のある予 め形成された表面例えば格子の光学的性質の変化の観察に基づく試験法を開示し ており、試料は塗付けにより表面に適用される。予め形成された表面例えば輪郭 を画いたプラスチック条片は各々が種々な受容物質で被覆されている多数のゾー ンを持つことができる。

欧州特許出願公開第１−１８４６００号は光シグナルを運び、及び分析する物質 に特異的な反応体の１つ又はそれより多い被覆を持つ光学的導波管を使用して液 体アナライト（ａｎａｌｙｔｅ）に溶解した物質の測定法を開示している。

いくらか簡略化した用語を用いると表面プラスモン共鳴（略語ＳＰＲ，５ｕｒｆ ａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅの頭語から導かれる）の技術は薄 い自由電子金属膜における屈折率の変化はその結果生ずる反射された偏光ビーム の強度における変化により検出する技術であるといえる（例えば、Ｒａｅｔｈｅ ｒ、　Ｈ（１９７７年）が参照される）。

従ってこの場合、検出表面はりセブター又はリガンド（それらを以後このように 呼称する）を持つ金属膜であり、これらは一般に１つ又はそれより多い生体分子 と選択的／特異的に相互作用する分子又は分子構造である。

金属膜は使用する測定法に適した種類の媒質に適用する。ＳＰＨの場合、これは 透明な誘電体物質すなわちガラス板の形態において光速を金属表面に指向させる ために使用することを意味する。

ＳＰＲ法の使用に関しては今までに出版された刊行物の大部分は個別測定用の研 究室設備を記述している。そのような研究室配置は方法の可能性に関する一般的 思想をよく伝えるが、これらのすべては商業的に満足な装置とははなはだしい隔 たりがある。

過去の研究の大部分は特定の生体分子を金属表面に結合させる種々な方法に集中 した。生化学的分析におけるＳＰＲ法の可能性を示す最初の刊行物においてＬｉ ｅｄｂｅｒｇ。

Ｂ等（１９８３年）は最初にＩｇＧの単層を銀表面に吸着させ、次いで前記単層 に抗ＩｇＧの層を吸着させ、次いで共鳴角に起こる変化に関連する影響を調べた 。更にその他では、例えばＣｕ１ｌｅｎ、　ＣＤ等（１９８７／　８８年）は金 被覆回折格子を持つＳＰＲ法を用いてＩｇＧ／抗ＩｇＧ系における免疫複合体形 成を研究する場合生体分子の吸収を直接金属表面に利用した。欧州特許第２５７ ９５５号は金属膜をシリカで被覆し、場合によりシラン化試薬で処理する方法を 記述しており、又欧州特許第２０２０２１号では金属膜を例えば特異抗体に対す る抗原を含み、場合により共有結合により結合している有機層で被覆した。欧州 特許第２５４５７５号によれば、例えばＳＰＲ適用に適当な種類の光学的構造は 金属膜を有機ポリマーの層で所謂「溶媒流延法」により被覆することにより作る ことができる。好ましい具体例では硝酸セルロースが使用され、生選択的リガン ドを層に結合する多（の公知の方法が述べられている。

他の点では、実際の器械設備は極めて短いことばで説明されているに過ぎないが 、光源を含む配置からなり、前記光源から面偏光がその入射面において金属表面 から反射し、次いで検出器によりさえぎられ、検出器の出力シグナルは通常入射 角の関数として記録される。この場合金属膜は概して適当な屈折率を持つ浸漬部 を経てプリズムと光学接触して配置される顕微鏡スライドの形態でプリズム（例 えばＤａｎｉｅｌｓ、　ＰＲ等（１９８８年）が参照される）又はガラス基体に 直接適用される（例えば英国特許第２１９７０６８号参照）。１つの変形が欧州 特許第２５７９５５号にＷｅｂｂ等により記述されており、それによるとガラス 基体は一連の三角突起を備え、それによりレンズ系からの光線は金属表面に結合 し、次いで反射後検出システムの方に出る。いくつかの場合、試料溶液をフロー セル中で検出表面と接触させることが示されているが、いかに実施するかについ て実際的な指示は与えられていない。

しかしながら、商業的に有用なバイオセンサーシステムは少なくとも次の最低要 件を満たさなければならない。

このシステムは誘電体物質の基体例えばガラス基体からなる交換可能なセンサー ユニットを含み、前記基体はその面の１つが１つの検出表面又は好ましくは多数 の検出表面を含む金属膜で被覆されていなければならない。

そのような検出表面は所望の生体分子との選択的相互作用のため官能化されてい なければならない。従って最適な選択を表すもっとも多能な構造は所望のリガン ドと共にその場所で官能化された２つ又はそれより多い検出表面を含む。

このシステムは試薬溶液と試料溶液とを各々の検出表面に送る導管装置を持つブ ロックユニットを含み、液流は並列に小さな流れに分割されるか、又は検出表面 と共に直列に配置されて同じかたまりの液体で交互にフラッシュされなければな らない。

このシステムは入射光束を金属膜上の各々の検出表面に向けさせ、及び検出表面 の各々の１つに相当する種々な金属膜領域からの反射線を検出するために適した 光学装置ユニットを含まなければならない。

検出器シグナルを検量後検出表面上の物質量に比例するパラメーターに変換する 評価ユニットが必要である。

これは会合／解離速度定数、拡散定数、親和力、溶液中分子濃度などに順次比例 することができる。

このようなシステムは［光学的バイオセンサーシステム（Ｏｐｔｉｃａｌ　ｂｉ ｏｓｅｎｓｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ）Ｊという我々の係属中のＰＣＴ出願（スエーデ ン特許願第８８０４０７５−３号に基づく）に極めて詳細に記述されており、こ の開示は参考例としてここに組み入れる。

基本的に、本願の主題を形作るセンサーユニットは第１図に示すような構造物で あり、この図で（１）は誘電体基体及び（２）は金属膜であり、その検出表面は 記号■１で表され、この場合ｎはＯより大きい整数である。第１図の例では帽〜 １３として示す３つのそのような検出表面を示すが、この構造物の思想は検出表 面の数に何等制限を置くものではない。同様にもちろん基体の幾何学的形状は種 々なそれ例えば方形又は円形であり、及び種々な厚さを持つことができる。

このユニットは適当な光学的性質を持つ媒質例えば界面における反射損失を最小 にするような屈折率の浸漬部により光学的ユニットの光学的伝達をもたらすこと を意図している。しかしながら、透明な弾性物質例えば適合した屈折率を持つ適 当なシリコンゴムを使用するのが便利であり、何故ならこれはセンサーユニット を交換する都度拭い去らなければならない油状物を取り扱う必要をな（するから である。両面が透明な弾性物質で被覆されている薄いガラス板からなる「光学的 界面」（前述のＰＣＴ出願参照）例えば方形横断面を持つひもの形状を利用して センサーユニットを光学システムに結合させることが推奨される。この配置で光 学的界面をそれぞれ光学ユニットとセンサーユニットとの接触位置に載せると空 気の包含が避けられる。各々のひもはもちろん相当する検出表面を包含する突出 領域を持つ。好ましくは各々の弾性物質片はその下にある表面全体を覆う被覆を 形成するが、相当する検出表面の各々の位置に厚くなった部分を持つ。

取り扱いを容易にするため、その弾性物質片をその上に持つガラス板は適当に支 持体に載せることができる。

更にセンサーユニットはフローセルの試薬と試料溶液を直列又は並列で検出表面 園。を通過させるように液体を取り扱うためブロックユニットに結合させるべき である。

センサーユニットは単一片で、例えばテクニカルＳＰＲ法で許容される金属好ま しくは金又は銀の薄膜で被覆したガラス板で作られ、この被覆は例えば所謂スパ ッター法で適用される。この金属膜に所望のりガントを結合させるための官能基 を含ませることができる所謂基礎表面を形成する有機ポリマー又はヒドロゲルの 層を付着させることができる。これは「バイオセンサーシステムに使用する選択 的生体分子相互作用の可能な検知表面」という我々の係属中のＰＣＴ出願（スエ ーデン特許願第８８０４０７３−８号に基づ（）により詳しく記述されており、 この開示を参考例としてここに組み入れる。

測定を実行する場合、検出表面は生体分子と相互作用の可能な種々なリガンドで 官能化させなければならない。

そのような表面を作る方法に関してはいくつかの径路を利用することができる。

基礎表面は製造されたすなわち工場で作られた所望の生粋異的リガンドを用いて 作ることができる。しかしながら基礎表面を使用者が関心を持つ特定のリガンド を用いて各々の場合その場所で作れば、より広い用途への適用性を与えるシステ ムが得られる。

センサーユニットの検出表面が液体取り扱いブロックユニットから発する液体の 流路に直列に配置される場合、これらの検出表面はリガンドＬ、−Ｌ、に結合す るそれら自身の特定の官能基ｆｌ−ｆ、を含むべきである。

この場合使用者が使用するリガンドは二官能性又は多官能性である。各々のリガ ンドは対応する検出表面に固定化のため利用される抗ｆ機能及び溶液中の生体分 子と相互作用するための１つ又はそれより多い生選択的機能を含む。

試料溶液の流路に直列の配置される３つの検出表面を持つシステムにおいて、リ ガンドは例えば抗ｆ、−Ｌ、、抗ｆ、−Ｌ、及び抗ｆ、−Ｌ３であることができ る。ｆ、を介して第１のリガンドは第１の表面にｆ、と抗ｆ、との間の相互作用 により結合し、それにより結合リガンドし、は表面に露出するようになる。同様 に第２の表面はり、によりｆ、との結合を介して活性化されるなどである。従つ てこれは一連の試薬、抗ｆｎ−Ｌ、ｌｌを必要とし、ここで抗ｆｎは試薬の固定 化に使用され、及びＬｌｌは表面に露出されて溶液中の生体分子と相互作用する 。

システムが並列の表面を使用する場合、すべての検出表面はシステムに載せられ ると同等であることができ、何故ならすべての試薬溶液は１つの検出表面のみを 通過するようにされるからである。この検出表面は活性化されて問題の特定のり ガントと結合する機能を含む。

一般に本発明の方法に有用な機能は液体クロマトグラフィーで公知のようなそれ である。その例はヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジ ド、カルボニル又はビニル基である。これらの基が種々な種類のリガンドを結合 させるために使用されるとき起こる反応は極めて幅広い文献から公知である。

好ましい具体例においては、ヒドロゲルは金属表面に例えばジスルフィドを介し て結合する。ヒドロゲルは例えば多糖類例えばアガロース、デキストラン、カラ ゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース又はそれらの誘導体例えばカルボキシメ チル誘導体又は水膨潤性有機ポリマー例えばポリビニルアルコール、ポリアクリ ル酸、ポリアクリルアンド及びポリエチレングリコールであることができる。

特にデキストラン型の多糖類は例えばセルロースとは対照的に性質が非結晶性で あり、このような関係においては極めて適当である。デキストランは生体分子を 結合するマトリックスとしてクロマトグラフィー操作で極めて広範囲に使用され てきた。この思想が本来持つ利点の一つは現実にこの全技術が現在バイオセンサ ー適用、すなわち適当なリガンドの固定化を含む最終段階に利用可能なことであ る。

本発明を更に例証しやすくする具体例においてデキストランマトリックスはりガ ントを結合させるため公開技術例えば次の方法の一つにより活性化される。

ヒドラジド機能がアルデヒド基を含むリガンド例えばアルデヒド機能を含むよう に酸化された炭水化物鎖を含む抗体を結合させるためデキストランマトリックス 中に作られる。この場合デキストランマトリックスは最初にヒドラジド基を形成 するように一部分反応を受けたカルボキシメチル基により変性される。この活性 化されたマトリックスにより少なくとも二つの重要な利益が得られる。すなわち １）このマトリックスは未反応のカルボキシル基を含み、これは低いイオン強度 条件下でイオン交換剤として働き、又静電的相互作用により固定化されるべきリ ガンドはデキストランマトリックスに濃縮される。

２）このマトリックスはリガンドのアルデヒド基とマトリックスのヒドラジド機 能とが縮合することにより極めて有効にリガンドを結合させ表面に濃縮する。

他の具体例においては、カルボキシメチル変性デキストランにおけるカルボキシ ル基の一部が反応性エステル機能を生ずるように例えばＮ−ヒドロキシスクシン イミド及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−二チルカルポジイミド 塩酸の水溶液で処理することにより変性される。上述の場合と同じ方法で残留電 荷すなわち未反応カルボキシル基はリガンドの表面への濃縮の遂行に寄与するで あろう。次いでアミノ基を含むリガンド例えばタンパク質とアミノ酸はデキスト ランマトリックスに共有結合により結合させることができる。

別な方法においては、前述の反応性エステルはジスルフィド含有化合物例えば２ −（２−ピリジニルジチオ）エタノールアミンとの反応に利用される。この方法 でジスルフィド基を含むマトリックスが得られ、及びこれらはチオール又はジス ルフィド含有リガンド例えば免疫グロブリンの還元されたＦ　（ａｂ）断片との 結合に使用することができる。

要約すると、それと共に相互作用することにより生体分子の検出に使用すること ができる多数のリガンドが存在する。イオン変換体基、金属キレート化基及び種 々な種類の生体分子用リセブター例えば慣用的な液体クロマトグラフ法で知られ ているようなそれが複雑な測定系においてさえ選別目的に適当な系の構築に使用 し得ることはたやくす明らかであろう。

一つの具体例においては、所謂キメラ分子（二官能性又は多官能性分子）が感知 表面を官能化させるため使用される。キメラ分子は基礎表面例えば前述のデキス トラン被覆検出表面に結合しようとする部分と検出される生体分子に親和力を持 つ他の部分とからなる。本発明に使用する二官能性又は多官能性分子は種々な方 法、例えば適当な分子又は分子断片の化学的結合、二官能性抗体を作るためのハ イブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法により作ることができる。この最後に述べ る方法は生成物中に要求される構造をコードする遺伝子配列の融合を含み、前記 生成物は適当な発現系例えば細菌の培養で発現される。生体分子又はその断片の 化学的結合は生体分子の固定化のために開発された結合法の一つにより実行する ことができる。適当な試薬は例えば５ＰＤＰである（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ 、　Ｓｗｅｄｅｎから入手でき、及び結合法はＣａｒｌｓｓｏｎ等（１９７８年 ）の記述による）。デキストランの場合キメラ分子は生特異的リガンド例えば免 疫グロブリンに結合するデキストランに対する抗体からなることができる。この ようにデキストラン抗体と種々な特異性の基とを含む一連のキメラ分子を用いて 、−装置中に同じ種類のい（つかの検出表面を含む所謂測定用カセットを多数の 生体分子の検出のため容易に併行活性化させることができる。他の方法において は、検出表面はキメラ分子を表面に結合させるため所謂ハプテンで変性させる。

従って例えば上述の反応性エステル表面をテオフィリンアナログで誘導体化し、 次いでキメラ分子を結合させるために使用することができる。この場合キメラ分 子は生特異的リガンドと結合したテオフィリンの抗体からなる。

これらの具体例から本発明の表面を使用する場合、使用者にとって所望のリガン ド（リセブター）を持つ同じ単一の基礎表面を作ることは極めて容易であるから 大きな多能性に到達し得ることは極めて明らかである。タンパク質は生粋異的結 合を反転する傾向のある環境に対してその安定性の点で分子内で変化する。キメ ラ分子の助けにより、ハプテンは調べようとする生特異的ペアより化学的により 安定であることから所望の程度の可逆性を得ることができる。

第２図は官能化剤としてキメラ分子を持つ上述の具体例を略図で示す。図におい て、４つの異なるキメラ分子はそれぞれの検出表面上でそれぞれ４つの異なる官 能基ＡＳＢ、Ｃ及びＤにそれぞれ可逆的結合ａ−ＡＳｂ−Ｂ。

ｃ−Ｃ及びｄ−Ｄにより付着するａ−ｘ％ｂ−ｙ、　ｃ　−ｚ、ｄ−Δで示され る。分析システムが並列で分析を処理する場合、タンパク質結合例えばＡに対す るそれはすべてのチャンネルで使用し、及びＸ　ｓ　Ｖ　ＳＺなどとのキメラ構 築に利用することができる。

キメラ分子の表面結合構造（ａ％ｂ、ｃＳｄ）の例はオーキシン結合タンパク質 （Ｔｅｌｌｗａｎ、　Ｕ等（１９８９年））又は抗体であり、一方アナライト結 合構造（Ｘ％　ＶＳＺｓΔ）は＾ｂ／Ｆａｂ、ストレプトアビジン若しくはタン パク質Ｇ１又はこれら分子のクローン化された部分（ＬｏｒｒｉｃｋＪ、　？、 等（１９８９年）及び１ａｒｄ　Ｅ、　Ｓ、等（１９８９年）ニヨリ例示するこ とができる。

官能基Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄはここでは好ましくは表面に共有結合する比較的小さい分 子であり、又安定であり、例えばこれらの分子とそれぞれのキメラ分子との間の 生粋異的結合は例えばＨＣＩ、　ＮａＯＨ又は添加物例えば混和性有機溶媒によ り壊されるが分子Ａ−Ｄは破壊されることはなく、それにより表面の再生が可能 となる。そのような小分子の例としてテオフィリン、ステロイドホルモン及びチ ロキシンを挙げることができ、これらは水酸化ナトリウムと添加物により再生さ せることができる。多（のタンパク質が極端な条件に耐えることができるが、通 常はタンパク質はあまり安定でない。いくつかの抗体は高い結合強さにも拘らず 反転されることもある。

上述のようにこのシステムは例えばＡで官能化された測定基礎表面に結合する多 くの異なるキメラ分子を生ずる可能性のあること、すなわちキメラ分子は１つの 同じ表面結合構造、この場合はａを持つ一方でそのアナライト結合構造は変化す ることから相当な融通性を持つ。１つの同じ測定基礎表面はそのような方法でい くつかの異なるアナライトについて容易に官能化させることができる。類似の方 法でそれぞれ基Ｂ、Ｃ及びＤに結合する相当するキメラ分子を作ることもできる 。キメラ分子のための１つ又はそれより多い基礎システムの必要性は、なかんず く直列又は並列のいずれの液体処理システムを使用するかによる。

キメラ分子の基礎（すなわち、その表面結合構造）としてのタンパク質は測定基 礎表面上でその低分子の化学的に安定なパートナ−との強い結合を持たなければ ならない。又、もちろん測定する生体系との相互作用が可能な部分がそれにあっ てはならない。従って、例えば臨床システムは植物界から生特異的ベアを持つこ とができるが、一方植物試料は基礎として特異な動物ペアを持つことができる。

好ましくは、分析システムはキメラ分子のアナライトへの結合が測定表面とキメ ラ分子との間の結合が破壊されることを許容するようなそれとは異なる条件下で 反応され得るようなそれである。そのような方法で、条件により、検出表面は２ つの異なる水準ですなわち新しいアナライトを結合させるためか又は同−若しく は他のキメラ分子により表面を再官能化させるため再生することができる。

キメラ分子に基づ（上述のシステムは、もちろん単−検出表面又は領域並びに２ つ又はそれより多いそのような領域を用いる測定に使用することができる。この システムはＳＰＲ法に使用できるのみならず、表面におけるリガンド相互作用に より引き起こされる表面の物理的又は化学的性質の変化の測定に基づくすべての 方法、例えばすべての内部反射に基づ（方法、光音響法、圧電法、表面音波（Ｓ ＡＴ）法などを使用することができる。更に別の態様においては、本発明は従っ てそのような方法に使用する上のキメラ分子からなる試薬キットを提供する。そ のようなキットは場合により１つ又はそれより多い検出表面要素を含むことがで きる。

従って本発明は表面プラスセン共鳴法に基づくバイオセンサーシステムを使用し 、及び少な（とも金属を照射し前記フィルムから反射される光線を検出するため の光学的ブロックユニット、及び金属上の検出表面に試薬又は試料溶液を輸送す るための液体取り扱いブロックユニットを含む交換可能なセンサーユニットに関 する。各検出表面は少なくとも１つの官能基を含み、この表面は液体取り扱いブ ロックユニットから来る液体の流路中に直列又は並列に配置されている。特に本 発明はこれらの検出表面は試料に存在する生体分子と相互作用するため異なる官 能基又はリガンドを持つ点で分子内で相違するセンサーユニットに関する。更に 本発明はこれらの検出表面を測定操作が実行される場合、試料中の生体分子と相 互作用する二官能性又は多官能性リガンドを結合させることにより更に官能化さ せるための方法に関する。

本発明は又試料分子をその各々が少なくとも１つの特異なリガンドを持つ検出表 面の組合せを通過させる生体分子の特性決定法からなる。次いで各々のリガンド との相互作用の程度は生体分子の表面構造に関する情報を提供するであろう。又 、即時測定により、力学的パラメーターの情報が得られるであろう。そのような 検出表面の組合せは例えばイオン交換体基、疎水／親水基、金属イオンキレート 化基、種々な程度の生選択性又は生物異性を示す基等の種類のリガンドを含むこ とができる。その上結合した生体分子の構造は検出表面を調べようとする標的分 子の異なる構造要素と結合する分子を含む試薬溶液の流れに当てることにより調 べることができる。そのような試薬分子の例は種々なエピトープに対するモノク ローナル抗体である。各表面にリガンドの連続的注入を行うことができ、及び表 面結合分子との相互作用は問題の生体分子に関する初期の構造知見と関連させて 分析することができ、又は二官能性若しくは多官能性リガンドは次のリガンドの 基礎となることができる。

■、基礎表面すなわち結合デキストランをその上に持つ検出表面の誘導体化 １、　１　ヒドラジド表面の合成 ブロモ酢酸３．５ｇを２７ｇの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した。混合物を デキストラン処理表面に注ぎ、振盪インキュベーター中で２５℃で１６時間イン キュベートした。

表面を水で洗浄し、次いで前記方法を１回繰り返した。

洗浄後表面を２０ｇ／の水中０．８ｇのＮ−（ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′ −エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）で５分間処理し、次いで２０ｍ１の水中 ４．　Ｏｗｌのヒドラジンヒドロキシドを添加した。表面を振盪インキュベータ ー中で２５℃で１６時間インキユベートシ、次いで水で洗浄した。

１、　２　反応性エステル機能を持つ表面の合成Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ０．６９ｇとＥＤＣ１１５ｇとを３０ｍ１の水に溶解した。混合物を１．１のカ ルボキシメチル変性デキストラン表面に注ぎ、振盪インキュベーター中で２５℃ で６０分間インキュベートした。表面を水で洗浄した。

１、　３　テオフィリン表面の合成 ０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）中５ｍＩ［の８−（３−アミノプロピル） −テオフィリン（Ｒ，Ｃ，Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ等（１９８０年））の溶液をＮ −ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化デキストラン表面（実施例１．２に よる）と共に２５℃で一晩インキュベートし、次いで表面を水で洗浄した。

■、リガンドの誘導体化した基礎表面への結合ｎ、１　抗ＩｇＥ抗体 １０ｇ＋Ｉ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）中杭ＩｇＥ抗体（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を０°５ｈａｎｎｅｓｓｅｙ（１ ９８５年）により記述された方法により水浴中で１０■麗過沃素酸ナトリウムで ２０分間酸化した。緩衝液を置換した後抗体を１Ｑｓｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０ ）中でヒドラジド変性デキストラン表面に結合させた。結合しない抗体を０．１ Ｍグリシン（ｐＨ２，５）で溶離した。

■、２　抗ベーター２−ミクログロブリン抗体抗ベーター２−ミクログロブリン 抗体（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実 施例Ｉ１．１のように酸化し、ヒドラジド変性デキストラン表面に結合させた。

Ｉｌ、３　ウサギ抗マウス軽鎖抗体（Ｒ＾肛Ｃ）１０■置酢酸緩衝液（ｐＨ５， ５）中ＲＡＩＩＬＣ抗体をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体化デキ ストラン表面に２０分間結合させ（実施例１．２による）、次いで結合しない抗 体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７、４）と０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）中で表面を 洗浄することにより除去した。

１［、ＳＰＲ法による生体分子試験 検出表面をフローセルを持つＳＰＲ測定装置に取りつけた。光学装置を調整した 後測定シグナルを一定流量条件下で時間の関数として調べた。

■、１　モノクローナル抗体の濃度とサブクラス同一性の測定試験 ＲＡＩＩＬＣ抗体を検出表面上に共有固定化させた後（実施例ｎ、３）、モノク ローナル抗体を含む培養培地を注入した。

第３図は（１）培養培地の注入、（２）モノクローナル抗体を含む培養培地の注 入、及び（３）０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）による再生について得られる応 答曲線を示す。

第４図は種々な濃度のモノクローナルＩｇＧ１抗体の標準曲線を示す。用量応答 曲線の精度は５〜ｌｏＯｇｖ抗体／ｖｒｌの範囲で±１０％より良好である。

第５図はサブクラス特異的試薬の連続注入と結合モノクローナルのＩｇＧ１抗体 としての同定を示し、図中（１）表面結合モノクローナル抗体であり、続いて（ ２）抗ＩｇＧ２ａ。

（３）抗ＩｇＧ３、（４）抗ＩｇＧ２ｂ、及び（５）抗ＩｇＧ１の注入による結 果を示す（これらは表面に結合する）。系の可逆性と反復性を立証するため、抗 体結合とサブクラス同定を同じ単一表面上で１００回繰り返した。

■、２　抗テオフィリン複合体をセンサー分子の担体として用いる親和力と速度 論の研究 タンパク質Ａとタンパク質Ｇを抗テオフィリン抗体との複合体（キメラ分子）の 形態でテオフィリン表面に導入した。この方法でタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ と種種なサブクラスのモノクローナル抗体との間の相互作用を研究することがで きた。

複合体の調製 モノクローナル抗テオフィリン抗体Ｎｏ、４５９、種々なＩｇＧサブクラスのモ ノクローナル抗体、ＩｇＧ１サブクラスＮｏ、　Ｅ１６４．９５及び１２１のモ ノクローナル抗ＩｇＥ抗体、及びＩｇＥをＰｈａｒｗａｃｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃｓ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎから入手した。

抗テオフィリン抗体をペプシンで分解してＦ（ａｂ）’−２断片を形成させるか 、又は無傷の抗体として使用した。

タンパク質Ａ１タンパク質Ｇ及び５ＰＤＰはＰｈａｒ＋＊ａｃｉａ　ＩＪＢＢｉ ｏｔｅｃｈｒ＋ｏｌｏｇｙ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎから入手した。

タンパク質Ａ−抗テオフィリン複合体はＣａｒｌｓｓｏｎ等（１９７８年）によ り記述された方法により２つの分子の５ＰＤＰ変性により調製した。変性させた タンパク質Ａを１ｏ■蓋のＤＴＥで還元した後、混合物を１．８の変性度（分子 当たりピリジルジスルフィド基）を持つ抗テオフィリン３．８１と１．３の変性 度（チオール／分子）を持つ還元されたタンパク質Ａ　１３．８１１９とから調 製した。

結合を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中でｐＨ７，７で一 晩進行させた。タンパク質Ｇと抗テオフィリンのＦ（ａｂ）’−２断片との複合 体を類似の方法で調製した。

分析 結合テオフィリンを持つ測定表面は上述の複合体により官能化され易い。２つの 並列の検出表面すなわち１つはタンパク質Ａ複合体により他はタンパク質Ｇ複合 体により官能化されているそれらを用いて、一連の免疫グロブリンにつきタンパ ク質Ａ及びタンパク質Ｇとの親和力をそれぞれ極めて迅速に比較することが可能 であった。

得られた結果は例えばＧｕｓｓ等（１９８６年）により報告されているようにこ れらの点に関する差異を確認した。

この実験は速度論と親和力測定操作で定性的結果が速やかに得られる可能性のみ ならず、そのような検出表面は適当な試薬を用いた場合広範囲の種々な検定に役 立ち得ることから本発明の検出表面を使用する方法の順応性をも例証するもので ある。

タンパク質Ａ／Ｇ相互作用はｐＨ２，５で可逆的であり、一方抗テオフィリンー テオフィリン結合は性質において安定であることからタンパク質Ａ／Ｇとの免疫 グロブリンの結合は容易に交換可能である。高いｐｉ例えば７５■麗Ｎａ０ｆｌ ではキメラ分子も検出表面上で交換されることができ、このことは本性の順応性 をなお一層例証し易（するものである。

ＩＩｌ、３　所謂サンドウィッチ法によるベーター２−ミクログロブリンの検定 実施例■、２による抗ベーター２−ミクログロブリン抗体を含む検出表面を用い てベーター２−ミクログロブリン（Ｐｈａｒｖａｃｉａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓ　ＡＢＳＳｗｅｄｅｎ）の測定を行った。検出表面に結合させたベーター２− ミクログロブリンの測定シグナルを溶液中のその濃度の関数として、直接（第一 次応答）及び第二次免疫吸着剤−精製抗体によりシグナル増強させた後（第二次 応答）の両方の場合につき記録した。ここで前記精製抗体は第一次結合させたベ ーター２−ミクログロブリンを介して表面に結合して所謂サンドウィッチ構造を 形成する。この明白で実験的に簡単な方法は少なくとも１０倍近い検出水準を与 える。

■、バイオセンサーシステムにおける検出表面の誘導体化 すべてが等しく、カルボキシメチルデキストランを持つ４つの検出表面を含むセ ンサーユニットを光界面を経てバイオセンサーシステムに導入し、その上で１つ の表面をアミノテオフィリンで、及び他をアミノビオチンで誘導体化した。複合 体抗テオフィリンートランスフェリンと抗ビオチンーアルブミンを含む試薬溶液 を注入し、表面の各々の１つに結合させた。次いでそれぞれアルブミンとトラン スフェリンに対する抗体の結合を試料溶液からこれら成分を結合させることによ り例証した。

■、１　リガンドの結合 酢酸緩衝液（０，２Ｍ５ｐＨ５，５）の流れを２つのチャンネルに向け、及び０ ．２ＭＥＤＣと０．５１１ＮＩＩＳ（実施例１．２参照）の混合物の５０１を各 チャンネルに注入し、１０分間カルボキシメチルデキストランを活性化させた。

次いでこれらのチャンネルの各々にＯ，ＩＭ　ＮａＨＣＯｍ（ｐＨ８，８）中ア ミノテオフィリン（１１１９／　ｍｌ）又はアミノビオチン（１＠９／諺りをそ れぞれ含む溶液の５０μｌを注入し、結合反応を５分間進行させた。その後表面 を上述の２つの塩類パルス緩衝液で但し１．０Ｍ　ＮａＣ／を用いて洗浄した。

■、２　抗体複合体の調製 抗テオフィリン、抗ビオチン、アルブミン及びトランスフェリンのＦ　（ａｂ’ 　）　２断片を実施例１［，２に記述のように５ＰＤＰで変性し、変性アルブミ ンとトランスフェリンを還元した後、抗テオフィリンのＦ　（ａｂ’　）　２断 片を還元トランスフェリンと混合し、及び抗ビオチンを還元アルブミンで処理す ることにより複合体を調製した。結合反応を０．１Ｍリン酸緩衝液（０，ＩＭ　 ＮａＣｊ’、　ｐＨ７，７）中で一晩進行させた。

次いでチャンネルを液体取り扱い用ブロックユニットを利用して直列に結合させ 、その混合物並びに複合体を個々に含む試料溶液を注入した。測定結果は複合体 が「正確コな官能基を露出した表面にのみ結合し、すなわち抗テオフィリンート ランスフェリンはテオフィリン表面に結合し、及び抗ビオチンーアルブミンはビ オチン表面に結合することを示した。従ってこれらのそれぞれの表面はそれぞれ 抗トランスフェリンと抗アルブミン用リガンドを持ち、このことはこれらの抗体 を含む試料溶液を注入したとき確認された。それぞれの複合体プラス試酸物質（ 抗アルブミン及び抗トランスフェリン）の連続注入を示す第６図が参照される。

曲線Ａは抗テオフィリンートランスフヱリンに対する応答を表し、曲線Ｂは抗ビ オチンーアルブミンに対するそれを表す。番号を付した矢はそれぞれ（１）抗ビ オチンーアルブミン、（２）抗テオフィリンートランスフェリン、（３）抗アル ブミン、（４）抗トランスフェリンの注入を示す。表面は水酸化ナトリウムで完 全に再生可能であり、そして一連の実験に使用することができた。

■、タンパク質の結合構造、所謂エピトープマツピングに関する研究 ＩＴＩＶｐ２４タンパク質はこのタンパク質自身又はそれに対する抗体の存在が ■ＩＶ感染の最初の兆候と考えられることよりより大きな関心が持たれた。

試験システムを組み立てる場合タンパク質の多数の独立した結合部位を知ること が重要である。故に一連のｐ２４に対する抗体を本発明のバイオセンサーユニッ トを含むバイオセンサーシステムで分析した。抗ｐ２４モノクローナルを含む５ ４の培養培地を分析した。ここで使用する方法は（ｉ）実施例■のデキストラン ヒドラジドと共有結合させたウサギ抗マウス−Ｆｃとの結合によるモノクローナ ル（１２）の１つの固定化と、引き続＜　（Ｕ）生粋異的にｐ２４を表面に結合 させることからなり、ついでこのｐ２４は他のモノクローナルと結合させるリガ ンドとして使用される。この方法は第７（ａ）−７（ｂ）図に略図として示す。

第７（ａ）図はウサギ抗マウス−Ｆｃが結合された検出表面を示し、前記抗体を 介してモノクローナル（１２）が固定化される。モノクローナル（１２）は次に 試薬溶液からｐ２４を結合し、又第７（ｂ）図においてはシステムが残存するモ ノクローナルとの相互作用の分析の準備が整っており、すなわち（１２）以外の モノクローナルがｐ２４の固定化に使用される。

分析の最初の系列においては、各モノクローナルの結合を別々に調べた。その結 果それらの内３１が結合し、すなわちそれらは（１２）と同じ結合領域を利用し ないことを示した。

陽性の培地につき更に種々な異なる組合せで分析し、この目的の注入を連続的に 行った。この方法は以前に結合したモノクローナルが後続のモノクローナルの結 合部位接近性を妨げるか否かに対する直接の回答を与える。

第８（ａ）図と８（ｂ）図はそのような実験における検出器の応答を示す。５つ のモノクローナルを連続的に注入し、それらのすべてのモノクローナルがより早 い時期に結合した事実があるにもかかわらず結合することが見られた。（ｂ）に おいては第一と第二のモノクローナルは結合する（＋）ことが認められたが、一 方残りの３つのモノクローナルについては残りの結合部位が妨害（−）されてい た。

いくつかのモノクローナルの組合せの組織的な研究により、独立の結合部位を含 む６つの主要な領域が確認された。従ってこれらの結合部位は９２４分子のモノ クローナルの群の特異的且つ独立の結合に利用することができる。

この系列の実験により、なかんず（モノクローナル（２２）、（４３）、（２８ ）、（２）、（１）、（３３）、（１７）及び（３４）は独立の領域に結合する ことが例証され、これらは試験方法の組立てに関連する一層の評価のため興味が 持たれるであろう。

参考文献 Ａｆｚａｗａ、ＩＩ（１９８８年）　、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｔ　Ｓｙｓ＋ｐ、、 １７巻、６８３ページ Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ、ＲＣ等（１９８０年）、Ｉｍｍｏｎｕａｓｓａｙｓ：Ｃ １１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈ ｅ　１９８０Ｓ％Ｎａｋａｍｕｒａ、ＲＭＳＤｉｔｏ　ｌ　Ｒ及びＴｕｃｋｅｒ 編集、■巻、ＥＳ。

ＡＲＬ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８０年、４５〜６４ページＣａｒｌｓｓｏ ｎ等（１９７８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　１７３巻、７２３ベージＣｕ１ｌ ｅｎ、Ｄ　Ｃ等（１９８７／８８年）　、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、３巻・２１１ 〜２２５ページ Ｄａｎｉｅｌｓ、Ｐ　Ｂ等（１９８８年）、５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕ ａｔｏｒｓ。

１５巻、１１〜１８ページ Ｇｕｓｓ、Ｂ等（１９８６年）、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、５巻（７号 ）、１５６７〜１５７５ページ Ｌｉｅｄｂｅｒｇ、Ｂ等（１９８３年）、５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａ ｔｏｒｓ。

４巻、２９９〜３０４ページ Ｌｏｒｒｉｃｋ、　Ｊ　Ｗ等（１９８９年）　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 　７巻、９３４〜９３８ページ ０’　５ｈａｎｎｅｓｓｙ（１９８５年）、Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 ７巻、３４７ページ Ｒａｅｔｈｅｒ、ｆｌ（１９７７年）、Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｆｉ ｌｍｓ、　１ａｓｓ。

Ｇ、　Ｆｒａｎｃｏｓｂｅ、Ｍ及びＩｌｏｆｆｍａｎ、　Ｒ編集、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１４５〜２６１ページＴｅ１ｌｓａｎｎ、Ｕ等（１９８９ 年）、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　８巻（９号）、２４６３〜２４６７ ページ Ｗａｒｄ、　Ｅ　Ｓ等（１９８９年）　、Ｎａｔｕｒｅ、　３４１巻、５４４〜 ５４６ページ ＦＩＣ，Ｉ ＦＩＣ，２ ＦＩ（，３ ＦＩＣ，６ 相対的応答 ＦＩＣ，４ 応答 ＦＩ（，５ ＦＩＧ＋７（ａ） ＦＩＣ，７（ｂ） ＦＩ（，８（ａ） 相対的応答 ＦＩＣ，８（ｂ） 国際調査報告 １Ｍｌ・ｌ１１ｍｌｌｓＭＩＡｅｅｌｌ＆ａｌ１６ＭｍρＣ工／ＳＥ８９１００ ６４３Ｔｌ１１１−一１１１１１ｍ　＋１ｗ　＃ｍ−０−−ｉ−−阿ｎ＋ａｓｍ ＠　１６　＋１ＴＩ−剥ｆ−−噌剛Ｖ−ｔ＋４ｒ４暢＋ｂｅ　−−{　トーー− ｉｍｅｒ＋＋ｍ　ｗｗｔｈ　Ｉ−１？ＡＰＩ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．表面プラスモン共嗚法に基づき、及び少なくとも金属膜をその１つの側を照 射し、及び前記膜により反射される輻射線を検出するための光学装置のブロック ユニットと前記金属膜の他の側に試薬又は試料の溶液を輸送するための液体を 取り扱うためのブロックユニットとを含むバイオセンサーシステムに使用するセ ンサーユニットにおいて、バイオセンサー中で交換可能であり、及び前記金属膜 で被覆されている誘電体基体からなり、前記膜は液体取り扱いブロックユニット から発せられる液流中で直列又は並列の関係で配置されている２つ又はそれより 多い検出表面を持ち、前記検出表面の各々は少なくとも１つの官能基を含むこと を特徴とするセンサーユニット。
2. ２．個々の検出表面は異なる官能基を持ち、これらの基は試料中に存在し、検出 される生体分子と相互作用する選択的又は特異的リガンドであることを特徴とす る請求の範囲第１項記載のセンサーユニット。
3. ３．１つ又はそれより多い官能基を可逆的に検出表面に結合させ、検出表面は同 一又は他の官能基で再官能化させるため再生させることができることを特徴とす る請求の範囲第１項又は第２項のいずれか一項記載のセンサーユニット。
4. ４．官能基は二官能性又は多官能性分子であり、前記官能分子をそれらの官能構 造の一つを介して基礎検出表面により支持される特異的官能基に結合させること を特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一項記載のセンサーユニット 。
5. ５．官能基と試料中に存在する生体分子との間の結合は選択的に可逆的であり、 官能化された表面は官能化されたセンサーユニットの反復する使用を可能にする ため前記生体分子を分裂させることにより再生され得ることを特徴とする請求の 範囲第１項〜第４項のいずれか一項記載のセンサーユニット。
6. ６．二官能性又は多官能性リガンドを含む試薬溶液の進行する流れは液流のため のブロックユニットによりそれぞれの検出表面に分配され、前記リガンドには前 記リガンドを検出表面上に固定化させ、標的分子との相互作用のため検出表面上 に露出される少なくとも１つより多い機能が存在することを特徴とする請求の範 囲第１項記載の検出表面を官能化させる方法。
7. ７．各々特異的な官能基を含む検出表面は液体取扱いブロックユニットから発せ られて進行する液流中に配置され、及び各々のそれぞれの表面のための二官能性 又は多官能性リガンドを含むことを特徴とする請求の範囲第６項記載の官能化方 法。
8. ８．試薬キットは同一の表面結合構造を持つが、アナライト結合構造が変化する 多数のキメラ分子からなることを特徴とする特異な官能基を支持するバイオセン サー検出表面の官能化用試薬キット。
9. ９．表面共嗚法に基づくバイオセンサーシステムに使用される検出表面官能化の ための請求の範囲第８項記載の試薬キット。
10. １０．生体分子の表面特性決定のための請求の箱囲第１項〜第５項のいずれか一 項記載のセンサーユニットの使用。
11. １１．表面特性決定は診断目的のため実行することを特徴とする請求の範囲第１ ０項記載の方法。
12. １２．各々がそれ自身の特異的官能基を持つ多数の検出表面を備え、及び生体分 子を含む試料溶液を検出表面と直列又は並列に接触させることを特徴とする生体 分子上のエピトープの数を検出するための請求の範囲第１０項又は第１１項のい ずれか一項記載の使用。