JPH04501657A - 細胞および組織の三次元培養系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１２、生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース 、ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲１１１記載の遺伝子工 学的に作製された細胞の培養法。

１１３、三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１０８ 記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。

１１４、非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプ ロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル オロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１１３記 載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。

１１５、前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲１１１．１１２．１ １３または１１４記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。

１１６、実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学的に作 製された細胞の培養法。

１１７、実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲１ ０８記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。

１１８、実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学的に作製 された細胞の培養法。

１１９、実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学 的に作製された細胞の培養法。

１２０゜ （ａ）患者からの細胞検体を得、 （ｂ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の活性に増殖中の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に検体か らの細胞を接種し、（Ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でイ ンキュベートして接種された細胞を培養物中で増殖させ、そして （ｄ）培養増殖細胞を疾患または状態のマーカーに関して分析する、 ことを含んでなる患者の疾患または状態を分析する方法。

１２１、間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニ ズムの調査法。

１２２、間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、 形質細胞、肥胛細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲１２１記載の疾病 メカニズムの調査法。

１２３、三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１２０記 載の疾病メカニズムの調査法。

１２４、生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース 、ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲１２３記載の疾病メカ ニズムの調査法。

１２５、三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲！２０ 記載の疾病メカニズムの調査法。

１２６、非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプ ロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル オロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１２５記 載の疾病メカニズムの調査法。

１２７、前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲１２３．１２４．１ ２５または１２６記載の疾病メカニズムの調査法。

１２８、実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニズムの 調査法。

１２９、実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲１ ２０記載の疾病メカニズムの調査法。

１３０、実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニズムの調 査法。

１３１、実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニ ズムの調査法。

１３２゜ （ａ）（ｉ）細胞を付着できかつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物 質および形状からなる三次元マトリックス上の集密の内皮細胞を含んでなる三次 元間質マトリックス上に星状細胞を接種し、（ｉｉ）該星状細胞の上にさらにニ ューロン細胞を接種し、そして（ｉｉｉ　）接種された三次元間質マトリックス を栄養培地中でインキュベートすることにより作られた三次元培養系の内皮表面 に有効量の物質を露出させ、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスの星状細胞またはニューロン細胞に及 ぼすその物質の作用を検出する、 ことを含んでなる、該物質の血液−脳関門を通過する能力の検査法。

１３３、以下の方法、すなわち （ａ）細胞を付着できかつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質およ び形状からなる三次元マトリックス上の集密の内皮細胞を含んでなる三次元間質 マトリックス上に星状細胞を接種し、そしてさらに （ｂ）該星状細胞の上にニューロン細胞を接種し、そして （Ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートする、 ことにより調製された三次元組織培養物を含んでなる、血液−脳関門のためのモ デル系。

明細書 細胞および組織の三次元培養系 本出願は、１９８８年９月８日出願の同時係属出願環０７／２４２．０９６号の 一部継続出願である；この出願は１９８７年４月１４日出願の第０３８，１１０ 号の一部継続出願である；この出願は１９８７年４月３日出願の第０３６．１５ ４号の一部継続出願であり、これは１９８８年１月２６日付で米国特許出願第４ ．７２１．０９６号として許可された：これは１９８６年４月１８日出願の放棄 した出願第８５３．５６９号の継続出願である；これらの出願の各々は、その全 体が参考文献として本文にとり込まれる。

１、序論 本発明は細胞および組織の三次元培養系に関する。

この培養系は、インビボで観察される環境にいっそう近接した環境で細胞および 組織を長期間インビトロ増殖させるのに使用できる。本文記載の培養系により、 インビボ組織と同等な類似構造を形成するための増殖および適正な細胞成熟が提 供される。

生成する培養物はインビボでの移植あるいは埋め込みからインビトロでの細胞毒 性化合物および医薬化合物のスクリーニングに至るまで、さらに「バイオリアク ター」における生物学的に活性な分子の生産に至るまでの範囲の、様々な適用用 途を有する。本発明は、骨髄、皮膚、肝臓、粘膜上皮、膵臓、および腺ガンの三 次元培養を説明する実施例、およびさらに細胞毒性アッセイ、血液−脳関門モデ ル系および皮膚移植組織における三次元培養系の使用を示す実施例によって、説 明する。

２、発明の背景 を椎動物細胞のインビトロ培養物の大多数は、栄養培地に浸した人工基質上で、 単層として増殖する。単層が増殖する基質の性質は、プラスチックのような固体 またはコラーゲンまたは寒天のような半固形ゲルでありうる。使い捨てプラスチ ックが現今の組織または細胞培養に使用される好ましい基質となっている。

二、三の研究者が、基底膜成分に関連した天然基質の使用を探究した。基底膜は 糖タンパク質およびプロテオグリカンの混合物を含んでなり、これらはインビボ でほとんどの細胞を取り囲んでいる。例えば、Ｒｅ１ｄおよびＲｏｊｋｕｎｄ　 （１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第５７巻、Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　ＪａｋｏｂｙおよびＰａ５ｔｅｎ編、Ｎｅｗ　Ｙｉｒｋ 。

Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ２６３−２７８）；　Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、（ １９８０，Ｃｅ１１１９：６０７−６１７）；　Ｙａｎｇ　ら、（１９７９，Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：３４０１）は肝細胞、上皮細胞および内皮組織 を培養するのにコラーゲンを使用している。浮遊性コラーゲン上（Ｍｉｃｈａｌ ｏｐｏｕｌｏｓおよびＰｉｔｏｔ、　１９７５゜Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　３４： ８２６）およびニトロセルロース膜上（ＳａｖａｇｅおよびＢｏｎｎｅｙ、　１ ９７８．　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１１４：３０７−３１５）の細胞増 殖が最終分化を促進する試みに用いられた。しかしながら、長期間にわたる細胞 の再生およびかかる系に於ける上記組織の培養はこれまで達成されていない。

マウス胚繊維芽細胞の培養物を用いて特に低濃度で細胞増殖が増強された。この 効果は、部分的には培地の追加によっていると考えられるが、また細胞産物によ る基質の馴化のせいである可能性もある。これらの系に於いて、繊維芽細胞の支 持細胞層は他の細胞の付着に適した表面を形成する集密単層として増殖する。

例えば、正常胎児腸の集密的支持細胞層上での神経膠腫の増殖が報告されている （Ｌｉｎｄｓａｙ、　１９７９、Ｎａｔｕｒｅ２２８　：８０）。

二次元的細胞の増殖は培養細胞を調製し、観察し、研究するためには便利な方法 であり、それにより細胞を迅速に増殖させることができるが、インビボの完全な 組織の特徴である細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用に欠ける。かか る機能的および形態学的相互作用を研究するために、小数の研究者はコラーゲン ゲル（Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８０．　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６：３０６−３１ ２；　Ｙａｎｇら、１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　７６：３４０１；　Ｙａｎｇら、１９８０、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　７７：２０８８−２０９２；　Ｙａｎｇら、１９８１．　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４１：１０２１−１０２７）；　セルローススポンジ単 独（Ｌｅｉｇｈｔｏｎら、１９５１．　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎｃｅｒＩｎｓ ｔ、　１２：５４５−５６１）またはコラーゲンで被覆したもの（Ｌｅｉｇｈｔ ｏｎら、１９６８．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２８：２８６−２９６；ゼラチ ンスポンジ、Ｇｅｌｆｏａｍ　（Ｓｏｒｏｕｒら、１９７５．　Ｊ、　Ｎｅｕｒ ｏ−ｓｕｒｇ、　４３ニア４２−７４９）のような三次元基質の使用を探究して きた。

一般に、これら三次元基質に培養すべき細胞を接種する。細胞タイプの多くはマ トリックスに侵入して「組織様の１組織構造を確立することが報告されている。

例えば、三次元コラーゲンゲルを利用して、乳房上皮（Ｙａｎｇら、１９８１． 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４１：１０２１−１０２７）および交感神経ニコー ロン（Ｅｂｅｎｄａｌ、　１９７６、　Ｂｘｐ、　Ｃｅ１．ｌＲｅ５．８９：１ ５９−１６９）が培養されている。さらに、分散された単層培養物から組織様の 構造物を再生させる様々な試みが行われてきた。ＫｒｕｓｅおよびＭｉｅｄｅｍ ａ　（１９６５゜Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　２７：２７３）は、潅流された単 層が１０細胞以上の深さまで増殖し得ること、および適当な培地を供給し続ける ならば、器官様の構造物が多層培養物中に生じることを報告し７た（Ｓｅｈｎｅ ｉｄｅｒら、１９６３．　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　３０：４４９−４５９およびＢｅ１ｌ　ら、　１９７９． 　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　［１，３，Ａ、　７６：１２７４−１２７ ９も参照）；　Ｇｒｅｅｎ（１９７８，５ｅｉｅｎｃａ　２００：１３８５−１ ３８８）は、ヒト表皮の表皮ケラチン細胞がトランスファーなしで数週間維持さ れるならば、デマトグリフス（摩擦辺縁）を形成できることを報告している；　 ＦｏｉｋｍａｎおよびＨａｕｄｅｎｓｃｈｉ　１ｄ（１９８０，Ｎａｔｕｒｅ　 ２８８：５５１−５５６）は内皮増殖因子および腫瘍細胞馴化培地の存在下で培 養した血管内皮細胞の培養物における毛細管の形成を報告した；さらに５ｉｒｉ ｃａら（１９７９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 Ａ、　７６：２８３−２８７；　１９８０．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４０： ３２５９−３２６７）はコラーゲンの薄層で被覆したナイロンメツシュ上で、初 代培養肝細胞を約１０−１３日維持した。しかしながら、かかる系に於ける細胞 の長期間培養および増殖は達成されていない。

実際、骨髄のような組織の長期間培養の確立が試みられてきた。様々な種類の細 胞を含有する間質細胞層は速やかに形成されるが、有意な造血機能が実際にはい かなる時もまったく維持され得なかったという点で、全体として結果は失望であ った（総説として、Ｄｅｘｔｅｒら、Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒ ｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、１９８４．　Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、ＩｎＣ，、ｐｐ、５７−９６参照）。

３、発明の要約 本発明は種々の異なる細胞および組織をインビトロで長期間培養するのに使用で きる三次元細胞培養系に関する。本発明によれば、所望の組織由来の細胞を予め 確立された間質支持体マトリックスに接種し、増殖させる。間質支持体マトリッ クスは、三次元マトリックス上で活発に増殖中の、繊維芽細胞のような間質細胞 を含んでなる。間質細胞はまた内皮細胞、マクロファージ／単球、含脂肪細胞、 周細胞、骨髄間質にみられる細網細胞などのような、疎性結合組織に見られる他 の細胞をも包含しうる。間質マトリックスは培養細胞の長期間にわたる活発な増 殖を支えるのに必要な支持体、増殖、因子、および調節因子を提供する。この三 次元系で増殖させる場合には、増殖中の細胞が適正に成熟および分離して、イン ビボで見られる対応組織に類似した成体組織の成分を形成する。

本発明は、部分的には、間質細胞の三次元的な増殖が培養細胞の活発な増殖を単 層系よりも長期間にわたって支えるであろうという知見に基づく。これは部分的 には三次元マトリックスの表面積の増加によっている可能性があり、その結果間 質細胞の活発な増殖期間が延長されるのであろう。これら増殖中の間質細胞は間 質細胞、および間質マトリックス上に接種された組織−特異的細胞、の両者の長 期間の増殖を支えるのに必要なタンパク質、増殖因子および調節因子を作り出す 。さらに、マトリックスが三次元的であることによって、インビボでの条件によ り近似した空間的分布が可能になり、したがって細胞の成熟および移動を促す微 小環境の形成が可能となる。この支持体の存在のもとての細胞増殖は、タンパク 質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、細胞マトリックス、およびその他の 物質を支持体それ自体に添加することによって、またはこれらの物質で支持体を 被覆することによってさらに増強できる。

三次元支持体の使用により細胞が多層に増殖することが可能となり、したがって 、本発明の三次元細胞培養系が形成される。多くの種類の細胞および組織をこの 三次元培養系で増殖させることができる。

本発明の詳細な態様に於いては、骨髄、皮膚、肝臓、膵臓、粘膜上皮、腺ガンお よび黒色腫組織を三次元培養系で増殖させることができる。

さらに、生成する培養物は、生理学的または病理的条件の研究のためのモデル系 として使用できる。例えば、本発明の詳細な態様に於いては、三次元培養系は血 管−脳関門のモデルとして用いることができる。もう一つの詳細な態様に於いて は、これに限定するわけではないが、粘膜上皮の三次元培養物をヘルペスウィル スまたはパピローマウィルス感染を研究するためのモデル系として使用できる。

生成する培養物は、培養物中で増殖した細胞のインビボでの移植あるいは埋め込 みから、インビトロでの細胞毒性試験および化合物のスクリーニング、およびイ ンビトロで生物学的物質を生産するための「バイオリアクター」の設計に至るま での範囲にわたる様々な適用用途を有する。

３．１．定義および略号 ゛　本文に使用された以下の用語は、下記の意味を有するものとする： 付着層二三次元マトリックスに直接付着した細胞、またはそれ自体がマトリック スに直接付着している細胞への付着によって間接的に結びついた細胞。

間質細胞：疎性結合組織に見られる、内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球 、形質細胞、肥胛細胞、含脂肪細胞などを包含するがそれらに限定されない。

他の細胞および／または要素を含むかあるいは含まない繊維芽細胞。

組織−特異的細胞または実質細胞：器官の支持構造とは区別される、器官の必須 で特徴的な組織を形成する細胞。

三次元マトリックス：（ａ）細胞を付着でき（あるいは細胞を付着できるよう修 飾されることができ）；そして（ｂ）細胞を単層をこえて増殖させることができ る任意の物質および／または形状で構成される三次元マトリックス。この支持体 に間質細胞が接種されて三次元間質マトリックスが形成される。

三次元間質マトリックス二間質細胞を接種された三次元マトリックス。集密的で あるか、あるいは亜集密的であるかに関わらず、本発明による間質細胞は増殖と 分裂を続ける。間質マトリックスは後から接種された組織−特異的細胞の増殖を 支えて三次元細胞培養物を形成しよう。

三次元細胞培養物：すでに組織−特異的細胞が接種され、培養された三次元間質 マトリックス。一般に、三次元間質マトリックスの接種に用いられる組織特異的 細胞はその組織にかかわる「幹」細胞（または「貯蔵」細胞）を包含すべきであ る；すなわち、新たな細胞を生成するこれら細胞は成熟して分化した細胞となり 、その組織の実質を形成しよう。

以下の略号は、下記の意味を有するものとする：ＢＦＵ−Ｂ　＝赤芽球コロニー 形成細胞ＣＦＵ−Ｃ＝顆粒球マクロファージコロニー形成細胞ＣＦＵ−ＧＥＭＭ ＝顆粒球、赤芽球、単球、巨核球コロニー形成細胞 ＥＤＴＡ　＝エチレンジアミンテトラ酢酸ＦＢＳ　＝ウシ胎児血清 ＨＢＳＳ　＝ハンクス平衡塩類溶液 Ｈ３＝ウマ血清 ＬＴＢＭＣ＝長期骨髄培養物 ＭＥＭ　＝最小必須培地 ＰＢＬ　＝末梢血液白血球 ＰＢＳ　＝リン酸緩衝溶液 ＲＰＭＩ　１６４０　＝Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ培地番号１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｃ、、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ ａｎｄ、　ＮＹ）ＳＥＭ　＝走査型電子顕微鏡 ４、図面の説明 図１は繊維芽細胞の三次元マトリックスへの付着、およびメツシュの開口部を横 切る細胞突起の伸長を示す走査電子顕微鏡写真である。繊維芽細胞は活発にマト リックスタンパク質を分泌中で、組織特異的細胞の接種前に到達すべき亜集密の 適当な段階にある。

図２は赤血球性、骨髄性および他のコロニーの発現のための２１０μｍ領域を示 す三次元ＬＴＢＭＣの走査電子顕微鏡写真である。支持細胞は三次元マトリック スに沿って線状に増殖し、これを被覆している。

図３は数週間以上にわたる培養に於ける三次元ＬＴＢＭＣの付着および非付着層 の全細胞数を表すグラフである。

非付着ゾーンの全細胞数およびサイトスピンの調製は５日毎に培養物に供給する 時に除去した使用済み培地を用いて行った。付着ゾーンの細胞数の計数はＬＴＢ ＭＣの様々な間隔で、三次元細胞培養物をコラゲナーゼおよびトリプシンで処理 して付着細胞を除去することによって行われた。細胞増殖は培養数週間後に定常 状態に達した。

図４は培養数週間以上にわたる三次元ＬＴＢＭＣの着ゾーンから得られた、１０ ５細胞当りのＣＦＵ−Ｃを表すグラフである。

図５は、三次元皮膚モデルを表す概略図である。真皮／表皮接合部分が存在し、 その上に着色したメラニン細胞および数層の色素含有表皮ケラチン細胞が存在す る。間質細胞はマトリックスに付着しモして真皮成分を構成する。

図６は、メラニン細胞接種３日後の三次元間質の走査電子顕微鏡写真である。メ ラニン細胞は樹状突起形成を示し、着色されたままでありそして色素を表皮ケラ チン細胞に移す能力を保持するという点で三次元系で正常に増殖する。

図７は、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った三次元皮膚培養物の横断面の顕 微鏡写真である。正常な表皮（Ｅ）細胞の形態および方向が明白である。表皮お よび真皮（Ｄ）成分が完全にメツシュ繊維（Ｍ）を取り囲み、明確な真皮／表皮 接合部が存在する。

図８は、トルイジン染色した三次元皮膚培養物から得られた表皮部分を示す顕微 鏡写真である。表皮ケラチン細胞（Ｋ）は正常な形態を示し、色素（Ｐ）顆粒を 含有する。細胞の成熟が観察され、角質層（ＳＣ）が明白である。

図９は、ラットに移植７日後の三次元皮膚モデルの顕微鏡写真である。判然とし た区別のある真皮および表皮の接合部が明白である。細胞は拒絶反応の徴候なく メツシュへの強固な付着を示す。

図１０は、ラットに移植されて７日後の三次元皮膚モデルの顕微鏡写真である。

コラーゲン束（Ｃ）、および表皮ケラチン細胞（紛、繊維芽細胞げ）、含脂肪細 胞（ａ）、および平滑筋細胞（Ｓ）を包含するすべての種類の細胞が示され、ナ イロンメツシュ繊維…の周りに自然の配置で並んでいる。

図１１は、肝臓間質細胞上に三次元的な多層組織を形成する三次元培養法によっ て増殖させた成体肝臓培養物の顕微鏡写真である。

図１２は、三次元培養物に接種後、最初のｌＯから１２日の間の、活発に分裂中 の肝細胞の顕微鏡写真である。

これは胚芽細胞または再生肝細胞に類似している。

図１３は、粘膜上皮の三次元組織培養物の横断面の顕微鏡写真である。

図１４は、膵臓の三次元組織培養物の横断面の顕微鏡写真である。矢印は、線層 細胞中のチモーゲン顆粒を示す。星印は間質細胞を示す。

図１５は、血液・−脳関門の三次元組織培養モデル系の横断面の顕微鏡写真であ る。黒矢印は小血管内皮細胞を示す。白抜き矢印はニューロン細胞を示す。星印 は星状細胞を示す。

図１６は、腺ガンの三次元組織培養物の横断面の顕微鏡写真である。

図１７は、単層に増殖した繊維芽細胞の応答を本発明の三次元メツシュ系で増殖 した間質および全厚さ骨髄の応答と比較したグラフである。細胞生存能力に関す るニュートラルレッドアッセイを用いて、これら基質はアドリアマイシンに対し て用量関連応答を示す。

図１８は、ニュートラルレッドアッセイの結果を示すグラフであり、間質および 骨髄の三次元培養物はシスーブラチナムに対して用量関連応答を示す。

図１９は、ヒト新生真皮をミクロビッグに移植したｌ。

Ｂ後の全層創傷の表面の状態を示す写真である。わずかな収縮が示されたが、拒 絶反応または脱水の徴候はない。

図２０は、新生真皮の組織学的評価を示す顕微鏡写真であり、活性な繊維芽細胞 および自然に分泌されたコラーゲンを伴うメツシュ繊維の横断面を示す。

図２１は、新生真皮（左側）および生物分解性メツシュのみ（右側）で処置した 創傷を比較する写真である。

新生真皮を移植した創傷に於ける、収縮の減少および色素形成および発毛の増加 に注目されたい。

図２２は、ヒト真皮繊維芽細胞溶解物に浸したメツシュで処置した部位から採取 したバイオプシーの組織学的評価を示す顕微鏡写真である。個々のメツシュ繊維 の周りの上皮細胞移動の増加に注目されたい。

図２３は、移植後２１日の真皮均当物の組織学的評価を示す顕微鏡写真である。

上皮細胞は真皮表面上に移動し、均一に付着しておりそして正常な分化および増 殖を示す。深部の網状栓の増殖は、移植された皮膚の特徴である。３，４力月の うちに網状栓の消退か観察される。

図２４は、新生真皮で処置後２１日の全創傷の写真である。新生真皮の半分が、 自己由来培養上皮移植片を受けた。上皮移植片は均等に治癒し、それ以上の収縮 を防ぎ、そして下にある真皮均当物にしっかりと付着した。

図２５は、図Ｎに示した表皮／真皮部位の組織学的評価を示す顕微鏡写真である 。表皮ケラチン細胞の均一な増殖と真皮均当物に対する付着に注目されたい。メ ツシュ繊維は移植後２１日でなお明白であり、繊維芽細胞は自然に分泌されたコ ラーゲン繊維の中で活性なままである。

５、発明の詳細な説明二三次元細胞培養系本発明は三次元マトリックス、および 三次元多層細胞培養系のための支持構造体としてのその使用に関する。これまで 知られている組織培養系では細胞は単層に増殖した。本発明による三次元間質支 持体上で増殖した細胞は多層に増殖して細胞性マトリックスを形成する。このマ トリックス系は前記の単層組織培養系よりもはるかにインビボでみられる生理的 条件に近い。

この三次元細胞培養系は種々の種類の細胞の増殖、および少数例をあげれば骨髄 、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、副腎および神経学的組織を包含するがそれらに限定 されない多数の様々な組織の形成に適用可能である。

この培養系は様々な適用用途を有する。例えば、皮膚、腺などのような組織につ いては三次元培養物それ自体を生きた生物に移植または埋め込むことができる。

あるいはまた、骨髄のような散在性の組織については、増殖中の細胞を、移植の ために培養系から単離することができよう。三次元培養物はインビトロでの細胞 毒性テストおよび化合物のスクリーニングも使用できる。

さらに別の応用では、三次元培養系は細胞生産物を大量に生産させるための［バ イすりアクタ−Ｊとして使用できる。

本発明によれば、所望の組織から得られた細胞（本文では組織特異的細胞または 実質細胞と称する）を、予め確立された三次元間質マトリックスに接種し、そし て培養する。間質マトリックスは、三次元マトリックスまたは網状組織上で増殖 した間質細胞を含んでなる。間質細胞は、本文中でより完全に記載されるその他 の細胞および／または要素を含むかまたは含まない繊維芽細胞を含んでなる。間 質を含有する、繊維芽細胞およびその他の細胞および／または要素はその起源か 胎児であっても成人であってもよ（、また皮膚、肝臓、膵臓などのような好都合 な起源から得ることができる。かかる組織および／または器官は、適当なバイオ プシーによって、また剖検で得ることができる。実゛　際、遺体の器官を用いて 、間質細胞および要素を豊富に供給ｙることができる、。

胎児繊維芽細胞は、多数の異なる細胞および組織の７二ら次元培養系Ｃの増殖を 支えるであろう。したかってＪ、れを°、・トリックス上に接種し、様々な細胞 および組織の任意のものを培養するための１包括的な」間質支持体マトリックス を形成することができる。しかしながら、ある種の場合には、「包括的」間質支 持体マ（・リックスよりむしろ「特異的」マトリックスを使用する方が好ましい 可能性があり、このような場合には同質細胞および要素を特定の組織、器官、ま たは個体から得ることかできる。例えば、インビボでの移植または埋め込みの目 的で三次元培養を使用する予定である場合には、その移植または埋め込みを受け る予定の個体から間質細胞および要素を得ることが好ましいであろう。、二の方 法は宿主の疾病に対し移植片の免疫学的拒絶反応が起こりそうな場合には特に好 都合であろう。

さらに、繊維芽細胞および他の間質細胞および／または要素は三次元系中で培養 予定の組織と同じ種類のものから得ることができる。このことは、特定の間質細 胞が特別の構造的／機能的役割を担っているような組織を培養する場合に有用で あろう；例えば、神経学的組織のダリア細胞、肝臓のクツパー細胞など。

ひとたび三次元マトリックスに接種されると、間質細胞は７トリツクプ、」二で 増殖し、本発明の１次元培養系に接種される組織へ一特異的細胞の増殖を支える 。実際、組織−特異的細胞が接種されるど、三次元間質支持体？■・す・ソクス は、長期間にわたり培養物の活発心噌殖定支えるである・）。増殖および調節因 子を培養物に添加できるが、それらは間質支持体マトリックスによっ℃産生され るので必要ではない。

本発明によれば、特定の組織についてインビボでみられる細胞の微小環境を培養 時に再形成す゛ることが重要であるので、実質細胞の接種前に間質細胞を増殖為 せる程度は、三次元組織培養で増殖ざぜる予定の組織。

の種類に応じ°（変動しつる。例えば、骨髄五次元培養物では、造血細胞並集密 の間質マトリックスに接種するのが好ましい。しかしながら、皮膚の三次元組織 培養物においては、皮膚の真皮成分の構造を再形成するために、本発明にしたが って、表皮ケラチン細胞および／またはメラニン細胞の接種に先立ち、間質細胞 を集密に到達させることが好ましい。重要なことは、メツシュの開口部が培養中 の間質細胞の出口となりうるため、集密間質培養物は接触阻止を示さず、そして 間質細胞は増殖、分裂を続け、機能的に活性であり続番）るということである。

本発明は、部分的には、三次元における間質細胞の増殖が、間質細胞および組織 特異的細胞の両者の活発な増殖を単層系よりもずっと長期間支えるであろうとい う知見に基づく。さらに、この三次元系はインビトロ増殖細胞の成熟、分化、お よび分離を支え、インビボでみられる対応する組織に類似した成体組織の成分を 形成する。

出願人は、本発明が機能するメカニズムを説明する義務も責務もないが、三次元 培養系に固有の多数のファクターがその成功に貢献している可能性がある：すな わち （ａ）　三次元マトリックスは、タンパク質が付着するための、そしてその結果 間質細胞が付着するための、より広い表面積を提供する。

（ｂ）　集密まで増殖し、接触阻止を示しそして増殖および分裂を止める単層培 養物の細胞とは対照的に、間質細胞はマトリックスの三次元ゆえに活発に増殖を 続ける。間質細胞を複製することによる増殖および調節因子の産生は培養細胞の 増殖刺激と分化調節の部分的な原因となりうる。

（Ｃ）　三次元マトリックスによって、インビボの対応する組織にみられる分布 により類似した細胞要素の空間的分布か可能になる。

（ｄ）　三次元系に於ける細胞増殖可能な容積の増加によって、細胞成熟に導く 局所的微小環境を確立できよｔｅｌ　三次元マトリックスは、付着層内のマクロ ファージ、単球、および場合によってはリンパ球のような移動細胞の動きにいっ そう大きな可能性を与えることによって、細胞−細胞相互作用を最大にする。

げ）分化した細胞表現型の維持には、増殖／分化因子のみならず適当な細胞間相 互作用が必要であることが認識されている。本発明は効果的に組織の微小環境を 再形成する。

三次元間質支持体、培養系それ自体、およびその維持、ならびに三次元培養物の 様々な利用を、より詳細に以下のサブセクションで説明する。

５．１．三次元間質マトリックスの確立三次元支持体は以下のような任意の物質 および／または形状を有することができる：（ａ）その支持体に細胞を付着させ ることができる（または、細胞を付着できるよう修飾されることができる）；お よび（ｂ）一層をこえて細胞を増殖させることができる。多数の様々な物質を用 いてマトリックスを形成することができ、これらにナイロン（ポリアミド）、ダ クロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、 ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネー）　（ＰＶＣ） 、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ　；テフロン）、サーマノックス（Ｔ ＰＸ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、腸縫合糸、セル ロース、ゼラチン、デキストラン、などが包含されるがそれらに限定されない。

これら物質の任意のものをメツシュに織ることができ、例えば、三次元マトリッ クスを形づくることができる。ナイロン、ポリスチレン、などのようなある種の 物質は、細胞の付着には好ましくない基質である。これらの物質を三次元支持体 マトリックスとし７て用いる場合には、間質細胞のマトリックスへの付着を増強 するために、間質さの接種前にマトリックスを前処理するのが得策である、。

例えば、間質細胞の接種（ご先立ち、大イロンマトリックスを０．１Ｍ酢酸で処 理１７、そしてボリリ９ン、ＦＢＳ　、お゛よび／ｉたはコラーゲン中でインキ ュベーション、てナイ’Ｄ　”、／を被覆することができよう１．ポリスチレン も硫酸を用いて同様に処理″ζ゛きよう。

二次元培養物自体を１′ンビボで移植しようとする場合（、゛は、例、ｆ４ばボ リゲリ＝」・−ル酸、腸縫合糸材料、またはゼラ千゛〕のような生物分解性マト リックスを使用することが好ましいであろう１．培養物を長期間維持するか、ま たは低温で保存しようとする場合（′は、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、 ポリ了クリレート、ポリビニル、テフｒ？二）、綿、などのような非分解物質が 好ましいであろう。本発明にしたがって使用することができる便利なナイロンメ ツシュは、平均細孔サイズ２１０μｍおよび平均ナイロン繊維直径９０μｍのナ イロン濾過メツシュ、Ｎｘｔｅｘｓである（＃３−２１０／３６．　Ｔｅｔｋｏ 、　Ｉｎｃ、、　Ｎ、　Ｙ、）。

以下に述べる他の細胞および要素を伴うかまたは伴わない繊維芽細胞を含んでな る間質細胞をマトリックス上に接種する。これら繊維芽細胞は皮膚、肝臓、膵臓 などのような器官から、バイオプシー（妥当な場合）または剖検によって得るこ とができる。実際、任意の適当な遺体の器官から、かなり都合よ（繊維芽細胞を 入゛量に得ることができる。前に説明したように、胎児の繊維芽細胞を用いて種 々の異なる細胞および／また）ま組織の増殖を支える「包括的」三次元間質マト リックスを形成することかできる。しかしながら、培養すべき組織と同一タイプ から得られた繊維芽細胞、および７・′または本発明の三次元系による培養で増 殖した細胞および／または組織を後で受容することになる特定の個体から得られ た繊維芽細胞、を三次元マトリックスに接種することによって、「特異的」間質 マトリックスを調製できる。

繊維芽細胞は、繊維芽細胞の供給源として使用予定の適当な器官または組織を解 離することによって容易に単離できる。これは、当業者に知られた技法を用いて 容易に達成できる。例えば、組織または器官を機械的にばらばらにする、および ／または消化酵素および／またはキレート剤で処理することができる。これらは 、隣接する細胞間の結合を弱め、明らかな細胞破壊を伴うことなく組織を個々の 細胞の懸濁液に分散することを可能にする。酵素的解離は、組織を細断し、この 細断された組織を多数の消化酵素の任意の一つを用いて単独のまたはいくつかを 組み合わせて用いて処理することによってできる。これらにはトリプシン、キモ トリプシン″、コラゲナー・ゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルロニダー ゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ジスバーゼなどが包含されるが、それらに限定さ れない。少数例をあげればグラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、加 圧細胞、またはインソネーターなどが包含されるが、それらに限定されない数多 くの方法によって機械的破壊を行うこともできる。組織解離の方法の総説として は、Ｆｅｒｓｈｎｅｙ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ、　 Ａ　Ｍａｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａ、　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７．　Ｃｈ、９．　ｐｐ、１ ０７−１２６参照。

ひとたび組織を破壊して個々の細胞の懸濁液となすと、その懸濁液を小集団に分 画することができ、その小集団から繊維芽細胞および／または他の間質細胞およ び／または要素を得ることができる。これも細胞分離のための標準的技法を用い て行うことができる。このような技法には、特定の細胞タイプのクローニングお よび選択、不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合集団に於ける細 胞凝集能の差に基づく分離、凍結−解凍操作、混合集団に於ける細胞の付着性の 差、濾過、通常の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心傾瀉法（向流遠心分離） 、単位重量分離、向流分配法、電気泳動および蛍光活性化細胞選別が包含される がそれらに限定されない。クローン選択および細胞分離技法の総説についてはＦ ｒｅｓｈｎｅｙ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ａ　Ｍ ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａ、　Ｒ，Ｌｉ ５ｓ、　Ｉｎｓ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７．　Ｃｈ、１１および１２ ゜ｐｐ、　１３７−１６８参照。

繊維芽細胞の分離は例えば以下のようにして行うことができる：すなわち新鮮な 組織試料を十分に洗浄し、血清を除去するためにハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ Ｓ）中で、細断する。細断された組織はトリプシンのような解離酵素の新たに調 製した溶液中１−１２時間インキュベートする。このインキュベーションの後、 解離した細胞を懸濁させ、遠心によってベレットとしそして培養皿上に塗布する 。すべての繊維芽細胞は他の細胞に先立って付着しようから、それゆえ適当な間 質細胞を選択的に単離して増殖させることができる。次に、単離された繊維芽細 胞を集密まで増殖させ、この集密培養物から釣り上げそして三次元マトリックス 上に接種できるＣＮａｕｇｈｔｏｎら、１９８７．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　１８（３ ＆４）、　２１９＝２５０参照）。例えば、約１０＠から５Ｘ１０’細胞／ｍｌ の高濃度の間質細胞を用いて三次元マトリックスを接種す゛　るど、比較的短期 間で三次元間質支持体が確立されよう。

繊維芽細胞の他に他の細胞を添加して、長期間の培養での増殖を支えるのに必要 な三次元間質マトリックスを形成することができる。例えば、疎性結合組織に見 いだされる他の細胞を繊維芽細胞とともに三次元支持体に接種することができる 。かかる細胞には、内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、肥評 細胞、含脂肪細胞などが包含されるがそれらに限定されない。これら間質細胞は 皮膚、肝臓などのような適当な器官から、上記のような当業上知られた方法を用 いて、容易に得ることができる。本発明の一つの態様に於いては、培養すべき特 定の組織のために分化した間質細胞を繊維芽細胞間質に添加できる。例えば、繊 維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、含脂肪細胞および細網細胞を包含 するがそれらに限定されない造血組織の間質細胞を用いて、インビトロで骨髄を 長期間培養するための三次元並集密間質を形成できよう。

造血間質細胞は骨髄懸濁液中に形成される「バフィーコート（軟層）」から、例 えば３０００Ｘｇの低速遠心によって容易に得ることができる。肝臓の間質細胞 には繊維芽細胞、クツパー細胞、および血管および胆管内皮細胞が包含されうる 。同様に、ダリア細胞は神経学的細胞および組織の増殖を支える間質として使用 できよう；この目的のためのダリア細胞は胚または成体脳のトリプシン消化、ま たはコラゲナーゼ消化によって得ることができる（ＰｏｎｔｅｎおよびＷｅｓｔ ｅｒｍａｒｋ、　１９８０゜Ｆｅｄｅｒｏｆ、　Ｓ、　Ｈｅｒｔｚ、　Ｌ、編、 　”Ａｄｖａ、ｎｃｅ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＮｅｕｒｏｂｉｏｔｏｇｙ’、 第１巻、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐｐ、　２０９−２２７）。

繰り返すが、培養された細胞をインビボで移植あるいは埋め込みに使用する予定 である場合には、患者自身の組織から間質細胞を得ることが好ましい。タンパク 質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノ グリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン −６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸など）、細胞性マトリックス、およ び／またはその他の物質を三次元間質支持体マトリックスに添加することによっ て、またはこれらを用いてマトリックス支持体を被覆することによって、三次元 マトリックスの存在下での細胞増殖をさらに増殖できる。

間質細胞の接種後、その三次元マトリックスを適当な栄養培地中でインキュベー トすべきである。ＲＰＭＩ１６４０、フィッシャー培地、イスコープ培地、マツ コイ培地などの多くの市販の培地が使用に適していると考えられる。増殖活性を 最大にするためには、インキュベーション期間中は三次元間質マトリックスが培 地中に懸濁されている。または浮遊していることが重要である。さらに、使用済 み培地を除去し、放出された細胞を減らし、そして新鮮な培地を添加するために 、定期的に培養物に［供給」すべきである。

インキュベーション期間中、間質細胞は三次元マトリックスに沿って線状に増殖 し、マトリックスを覆うであろう。その後、マトリックスの開口部内への増殖が 始まる。組織特異的細胞を間質マトリックスに接種するに先立ち細胞を適度に増 殖させることが重要であり、その増殖程度はインビボ組織に存在する間質細胞量 を反映する。

マトリックスの開口部は、間質細胞がその開口部を横切って伸長できるのに適当 な大きさでなければならない。マトリックスを横切って伸長する活発に増殖中の 間質細胞を維持することは、その間質細胞によって作られる増殖因子の生産を増 強し、したがって長期間培養を支持することになろう。例えば、開口部が小さす ぎる場合、間質細胞は速やかに集密に達しつるが、容易にメツシュから出ること はできないであろう：捕捉された細胞は接触阻止を示し、そして増殖を支持しか つ長期間の培養を維持するのに必要な適当な因子の生産を止めるであろう。もし 開口部が大きすぎる場合には、間質細胞は開口部を横切って伸長することができ ないであろう：このこともまた、増殖を支持しかつ長期間の培養を維持するのに 必要な適当な因子の間質細胞による生産を減少させるであろう。本文に例示した 種類のメツシュのマトリックスを用いた場合、約１５０μｍから約２２０μｍま での範囲内の開口部が使用上満足できることが見出されている。しかしながら、 マトリックスの三次元構造および込み入った状態に応じて、他の大きさも同じよ うにうまく機能しよう。実際、間質細胞が伸長し、複製を続け、そして長期間増 殖することを可能にする任意の形状または構造が、本発明にしたがって、機能す るであろう。

マトリックス上に沈着した種々の種類のコラーゲンの割合の違いが、その後に接 種される組織特異的細胞の増殖に影響しうる。例えば、造血細胞の最適な増殖の ためには、マトリックスは好ましくはコラーゲン■、■および■型をおよそ６： ３：１の割合で当初のマトリックス中に含有すべきである。三次元皮膚培養系に ついては、コラーゲンＩおよび■型が当初のマトリックスに沈着するのが好まし い。適当なコラーゲン型を産生ずる繊維芽細胞を選択することによって、沈着し たコラーゲンの型の割合を操作または増強できる。これは補体を活性化する能力 を有する適当なイソタイプまたはサブクラスの、特定のコラーゲン型を限定する モノクローナル抗体を用いて達成できる。これらの抗体および補体は所望のコラ ーゲン型を発現する繊維芽細胞をネガティブ選択するのに使用できる。あるいは また、マトリックス接種に用いる間質は、所望の適当なコラーゲン型を合成する 細胞の混合物であることもできる。５種類の型のコラーゲンの分布および起源を 表■に示す。

５つの型のコラーゲンの分布および起源コラーゲンの型　主要な組織分布　起源 の細胞骨　骨芽細胞 ぞうげ質　ぞうげ芽細胞 ■　疎性結合組織；　繊維芽細胞およ 細網細胞　び細網線維 眼の水晶体色　水晶体線維 こうして、培養しようとする組織および希望するコラーゲン型に応じて、三次元 マトリックスに接種するための適当な間質細胞が選ばれる。

三次元間質支持体のインキュベーションの間に、増殖している細胞がマトリック スから遊離することがある。これらの遊離細胞は培養容器の壁に付着し、そこで 増殖し続けて集密的細胞単層を形成する。これは、例えば培地の供給時に遊離細 胞を除去するか、または三次元間質マトリックスを新しい培養容器へ移すことに より、阻止もしくは最小限に抑制すべきである。容器内に集密的細胞単層が存在 すると、三次元マトリックスおよび／または培養系での細胞の増殖が止まるであ ろう。集密的細胞単層の除去または新しい容器内の新鮮培地へのマトリックスの 移動は三次元培養系の増殖活性を回復させるであろう。このような除去または移 動は２５％の集密度を越える間質細胞単層をもつ培養容器においてなされるべき である。これとは別に、遊離細胞が付着するのを防ぐために培養系を攪拌したり 、あるいは周期的に培地を供給する代わりに、新鮮培地がその系を通って連続的 に流れるように培養系を設定することもできる。三次元培養系内での増殖を最大 限に高め、かつマトリックスから遊離した細胞を洗い流して除去するように流速 が調節されると、結果的にそれらは容器の壁に付着して集密的に増殖することか なくなるであろう。どんな場合でも、遊離した間質細胞は回収し、後で使用する ために凍結保存することができる。

５．２．三次元間質マトリックスへの組織特異細胞の接種および培養物の維持 ひとたび三次元間質マトリックスが適度な増殖を遂げたら、培養を希望する組織 特異細胞（実質細胞）を間質マトリックスに接種する。接種物中の細胞の高濃度 は低濃度よりも一層速やかに増殖を高めるであろう。

接種用に選ばれる細胞は培養すべき組織に左右され、これらの組織には、いくつ かの名を挙げれば、骨髄、表皮、肝臓、膵臓、腎臓、神経組織、副腎などが含ま れる。

例えば、制限するつもりではないが、種々の上皮細胞は三次元生存間質支持体上 で培養することができる。

このような上皮細胞の例には口腔粘膜および胃腸（ＧＩ）骨細胞が含まれ、これ らに限定されない。この種の上皮細胞は当分針で知られた方法に従って組織の酵 素処理により分離され、続いて培地でこれらの細胞を増殖させ、その後三次元間 質支持細胞マトリックス（新粘膜下組織）へ上皮細胞を適用する。粘膜下組織の 存在は、口腔粘膜細胞およびＧＩ管内層細胞の正常な分裂・分化を促進する増殖 因子や他の蛋白を供給する。この方法論を使用することにより、鼻上皮、気道上 皮、膣上皮、および角膜上皮を含む他の上皮細胞も上首尾に増殖させることがで きる。

三次元生存間質支持体上でいろいろな腫瘍を増殖させてもよい。このような腫瘍 の例には原発または転移部位から誘導される腺癌および悪性黒色腫が含まれるが 、これらに限定されない。この種の培養物は他の三次元上皮培養物と類似した方 法により確立される。簡単に述べると、患者の腫瘍または正常組織から、あるい は同種異系源から誘導された間質細胞をメツシュの上に定着させる。はぼ全面成 長に達した後、間質細胞に腫瘍細胞を接種する。腫瘍細胞は速やかに分裂Ｉ７続 けて、三次元固形腫瘍を形成するであろう。このような三次元支持体上で増殖さ せた腫瘍細胞はインビボ状態に近い形態をとり、しかも固形腫瘍と似通った方法 で表面抗原を発現する；細胞単層において増殖させた悪性細胞はインビボ　腫瘍 組織との同程度の類似性を示さない。このような腫瘍細胞の生理学的増殖は新し い化学療法剤、個別的化学療法、および転移のメカニズムの研究・開発への応用 を可能にする。さらに、このような腫瘍培養物は個別的免疫療法に有用でありう る。これに関して、ＩＩＣＲ放出研究を用いた実験は、Ｌａｋ細胞が三次元で増 殖させた腫瘍細胞に対して、単層培養した細胞と比べて、より強力な応答を誘起 することを示した。免疫細胞は慣例的なフェレーシス技法により患者から採取し 、三次元培養系で増殖させた患者自身の腫瘍細胞に感作する。

一般に、この接種物はその組織の“幹”細胞（“保存”細胞とも呼ぶ）を含むべ きである；すなわち、これらの細胞は組織の種々の成分をつくる特殊な細胞へ成 熟する新細胞を形成する。

接種物中で使用する実質細胞または組織特異細胞は、上記セクション５．１で間 質細胞を得るために記述した標準技法を使って、目的の組織を解離することによ り調製した細胞浮遊液から得られる。全細胞浮遊液それ自体を三次元間質支持体 マトリックスに接種するために使うことができる。その結果、ホモジネートに含 まれる再生細胞はマトリックス上で適切に増殖し１．成熟し、分化するが、非再 生細胞はしないだろう。別法として、上記セクション５．１で間質細胞を分画化 するために記述した標準技法を使って、細胞浮遊液の適当な両分から特定の細胞 型を単離することもできる３゜“幹”細胞または“保存”細胞を簡単に分離でき るどきは、これらを三次元間質支持体に優先的に接種する。

例えば、骨髄を培養する場合は、三次元間質に新鮮なサンプルまたは凍結保存サ ンプルから誘導された骨髄細胞を接種する。皮膚を培養する場合は、三次元間質 にメラニン細胞および表皮ケラチン細胞を接種する。

肝臓を培養する場合は、三次元間質に肝細胞を接種する。膵臓を培養する場合は 、三次元間質に膵臓内分泌細胞を接種する。種々の組織由来の実質細胞を得る方 法を調べるには、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｔｎａｌ 　Ｃｅ１ｌｓ。

Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、　２ｄ　Ｅｄ、、 　Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７．Ｃｈ、２０．９ｐ、２５７−２８８を参照され たい。

インキュベーションの間、三次元細胞培養系は栄養培地中につりさげるか、また は浮かばせる。培養物には周期的に新鮮培地を供給すべきである。この場合も、 培養物から放れた細胞が容器の壁に付着し、そこで増殖して集密的細胞単層を形 成しないように注意を払うべきである。三次元培養物からの細胞の遊離は、構造 化した組織とは対照的に、散らばった組織を培養するどき〜屓容易に起ごろと思 われる。例えば、本発明の正次元皮膚培養物は組織学的にも形態学的にも正常で ある；明確に区別できる真皮および表皮層は周囲の培地に細胞を放出しない。対 照的に、本発明の三次元骨髄培養物は、この種の細胞がインビボ　で骨髄に放出 されるように、成熟非付着細胞を培地中に放出する。

前に説明したように、放出された細胞が培養容器に付着して集密的細胞単層を形 成すると、三次元培養物の増殖は止まるであろう。このことは、培地の供給中に 遊離細胞を除去するか、三次元培養物を新しい容器に移しかえるか、容器壁への 遊離細胞の付着を防ぐために培養物を攪拌するか、または培養物に栄養分を補給 しかつ遊離細胞を除去するのに十分な速度で新鮮培地を連続的に流すことにより 回避することができる。いずれの場合にも、遊離した成熟細胞は回収して、その 後の使用のために凍結保存しておく。

増殖因子および調節因子は、これらの型の因子が三次元間質細胞によって作り出 されるので、培地に添加する必要はない。しかしながら、このような因子の添加 または他の特殊細胞の接種は培養物の増殖および細胞成熟を高め、変更し、調節 するために使用できる。

培養細胞の生育および活動はインシコリン、成長ホルモン、ソマトメジン、コロ ニー刺激因子、エリトロボエチソ、表皮増殖因子、肝造血因子（ヘパトポでチン ）、および肝細胞増殖因子のような種々の増殖因子により影響される。増殖およ び／または分化を調節する他の因子にはプロスタグランジン、インターロイキ゛ ／、および自然界に存在するケイロンが含まれる。

５．３．三次元培養系の使用 本発明の三次元培養系はいろいろな用途に使用される。これらには、制限するも のではないが、いく一つかの例を挙げると、マトリックスから得られた培養細胞 もしくは培養マトリックスそれ自体のインビボ　での移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎ ｔａｔｉｏｎ　）または植え込み（ｉｍｐｌａｎｔａ−ｔｉｏｎ）　；細胞毒化 合物、アレルゲン、増殖／調節因子、医薬化合物などのインビトロスクリーニン グ：病気の発生過程の解明；薬物および／または増殖因子の作用機構の研究；患 者の癌の診断および監視；遺伝子治療；並びに生物学的に活性な物質の生産が含 まれる。

インビボでの移植または植え込みの場合は、培養物から得られた細胞もしくは全 三次元培養物が、関係した組織の型に応じて、移植されるだろう。例えば、三次 元骨髄培養物はインビトロで長期間維持することができる；これらの培養物から 分離した細胞は移植に用いられ、これに対し全培養物は植え込まれる。対照的に 、皮膚培養物では、全三次元培養物が火傷、皮膚の潰瘍形成、外傷などを治療す るためにインビボ　で移植される。

三次元組織培養移植物は、本発明によれば、現存の組織を取り替えたり、強化す るために、新組織または改変組織を導入するために、人工補装具を修正するため に、あるいは生物学的組織または構造体を一緒に接合するために使用される。例 えば、制限するものではないが、本発明の特定の実施態様には（ｉ）化学療法に より治療中に破壊された骨髄を取り替えるために使用される三次元骨髄培養移植 物：　（ｉｉ）肝硬変患者の肝機能を増強するために使用される三次元肝臓組織 移植物；　（ｉｉｉ）三次元培養物上で増殖させた遺伝子改変細胞（例えば、イ ンシュリンをコードする組み換え遺伝子を発現する繊維芽細胞の三次元培養物） 　；　（ｉｖ）軟骨の三次元培養物を被覆した股関節補装具；　（Ｖ）口腔粘膜 の三次元培養物に結合させた義歯が含まれるであろう。

三次元培養物は細胞毒化合物、増殖／調節因子、医薬品などの多種多様の化合物 をスクリーニングするためにインビトロで使用される。このためには、培養物を インビトロで維持して、試験すべき化合物にさらす。

細胞毒化合物の活性は培養細胞に損傷を与えたり、それを死滅させるその能力に より測定できる。これは生体染色技法を使って簡単に評価できる。増殖／調節因 子の効果は、マトリックスの細胞含有量を分析することにより、例えば全細胞カ ウント数または示差細胞カウント数により評価される。これは型特異細胞抗原を 規定する抗体を使う免疫細胞化学的手法の使用を含む標準細胞学および／または 組織学的手法を用いて達成される。三次元培養系で培養した正常細胞に対する種 々の薬物の作用も評価できる。例えば、赤血球の形成を増す薬物は三次元骨髄培 養物で試験される。コレステロール代謝に、例えばコレステロールの生産を低下 させることにより、影響を及ぼす薬物は三次元肝臓系で試験されるだろう。腫瘍 細胞の三次元培養物は、例えば抗腫傷薬の効力を調べるための、モデル系として 使用される。

本発明の三次元培養物は生理学または病理学的状態を研究するためのモデル系と して使用される。例えば、本発明の特定の実施態様において、三次元培養系は血 液脳関門のモデルとして使用され、このようなモデル系は血液脳関門を通過する 物質の侵入を研究する上で有用である。別の特定実施態様において、制限するも のではないが、粘膜上皮の三次元培養物はヘルペスウィルスやパピローマウィル スを研究するためのモデル系として使用され、このようなモデル系は抗ウィルス 薬の効力を調べる上で作用である。

また、三次元細胞培養物は悪性腫瘍や疾病の診断・治療を補助するために使用さ れる。例えば、悪性腫瘍の疑いがある患者から組織（例、骨髄、皮膚、肝臓など ）の一部切除（バイオプシー）を行う。このバイオプシー細胞が本発明の三次元 系で培養されるならば、悪性腫瘍細胞は培養増殖中にクローンとして増えるであ ろう。このことは悪性腫瘍を検出する機会を増やし、ひいては診断の正確さを高 めるであろう。これは感染細胞集団がインビボ　で失われるエイズのような疾病 に特に有用である。さらに、患者の培養物は細胞毒化合物および／または医薬化 合物をスクリーニングするためにインビトロで使用され、これにより最も有効な もの、すなわち悪性細胞または病気にかかった細胞を死滅させて正常細胞に害を 与えないものが同定される。

これらの薬剤はその後患者を治療するために使用されるだろう。

本発明によれば、患者から比較的少量の骨髄が採取される（患者の骨髄は化学療 法または放射線により破壊）。その後、骨髄サンプルは適当な化学療法剤を使っ て病気の細胞をパージし、インビトロで増やし、患者に再度投与される。比較的 少量の病気にかかった骨髄を治療して効果的なパージを可能にし、続いてインビ トロで増やすことに加えて、三次元培養系は比較的大量のパージした骨髄にも利 用できる。大部分のパージ剤の副作用は正常造血細胞の破壊であり、これは長い 移植期間としばしば二次感染による患者の死をもたらす。急性非リンパ球性白血 病の場合に利用される有効なパージ剤は悪性細胞の２対数死を引き起こす４−ヒ ドロベルオキシオヨロホスファミド（４ＨＣ）である。通常の処置では、病気に かかった骨髄５００−１０００ｍｌを６Ｏ−１００ｎＨの４ＨＣ／ｍ１と生体外 でインキュベージジンすることにより治療する。その後、骨髄は凍結保存され、 ２−３週間の臨床化学療法の後で患者に再注入される。本発明によれば、匹敵す る量の骨髄を採取し、４ＨＣでパージし、その後三次元培養物を使ってインビト ロで増やすことにより、より迅速な移植期間と患者の死の減少が可能となる。

インビトロ方法論は動物（マウスの骨髄移植）とヒト（同種異系の表皮移植）の 両方において移植に使用した細胞の拒絶反応を低下させるのに有用であった。

三次元骨髄培養物はさらに外来抗原に対する細胞の寛゛　容カ増〜寅ｌ、め（二 ｆイｐａｉｌ　”’Ｊトる、＝ど７′バで：＼る４１、−オ′１シ；二関連して 、彷供ｇｒｔ）造血細胞は受容台からの三次テｌシ間賀匁旧１＞）Ｃ増殖さ１） ゛る。、１ミーの種の培養物は２．骨髄系のリンパ球の成≦（ｌを・）、・アノ バグ別の増殖因子およびシ〕化因イーを・供給する三次元胸腺ｊ８誓物の存ｆｋ 下で増殖さ！十です）よい。

造１ｆＩＪ、細胞が増殖し１：′成熟するにつれで、それらは受容者の細胞抗原 を“自己″として認めるように教育され、それによりこれらの“外来”細胞に対 して寛容になることができる。

増殖細胞および組織の意図する用途に応じて、種々の特殊細胞が三次元培養物に 加えられる。例えば、三次元培養物での骨髄細胞の長期増殖は、培養物へのある 種の単核細胞集団の添加により、培地への増殖因子の添加により、あるいは所望 の増殖因子を生産するように遺伝子操作された間質細胞の使用により促進される 。これらの培養物から集めた細胞は輸液、移植およびバンキング（ｂａｎｋｉｎ ｇ　）に使用される。三次元皮膚培養物への患者由来のリンパ球の添加は、自己 免疫病のような免疫疾患の評価および診断に役立つ。同様に、三次元皮膚培養物 への患者由来のリンパ球および肥満細胞の添加は、患者をアレルゲンにさらすこ となく、種々のアレルゲンに対する患者のアレルギー反応を評価する上で役立つ 。このために、患者のリンパ球と肥満細胞を含む三次元皮膚培養物はいろいろな アレルゲミ・（二さらさ３１、；５１．肥満細胞・＼、のリンパｆ８　、％成１ 　ｇト：　ｒ７）結合は、患１ｇが！泡じｔすいア１ノルゲン゛（、°づ）′、 １棋”　ｔ、ｙ　ｆ’ｓｌ、′、−き、ｌ−スタミンの１うな市［管イ乍動１生 メγイｆ−−・夕・４づべ出さぜ・尺′）であろ・）１．三次元培養物のアレル ゲ′ノー、ｔ））　’４　鼓に応答１１．た、Ｊ″のようなメディＪ、・・ター の於；出を測定して、、患者の）゛レルギ・−・反応の指標どする二とが可能で あるだろう。そして、危険かつ有害でありうる゛ア゛（ｙルゲンに個体をさらす ことなく、アレルギ・−試験を実施することができるだろう。この系は同様にイ ンビトロでの化粧品の試験にも使用されるだろう。

本発明の三次元培養系は遺伝子治療用の遺伝子および遺伝子産物をインビボ　で 導入するためのベヒクルを提供する。例えば、組み換えＤＮＡ技術を使って、患 者に欠損している遺伝子をウィルスまたは組織特異プロモーターの支配下におく ことができる。この遺伝子を含む組み換えＤＮＡ構築物を使って宿主細胞を形質 転換またはトランスフェクトし、この細胞をクローニングした後に三次元培養系 でクローンとして増殖させる。活性遺伝子産物を発現する三次元培養物はその産 物を欠損している個体に移植されるだろう。

遺伝子治療での三次元培養物の使用は多くの利点をもっている。第一に、培養物 が真核細胞であるので、遺伝子産物は適切に発現されて、活性産物を形成するよ うに培養下でプロセッシングされるだろう。第二に、遺伝子治療技術はトランス フェクトされた細胞の数を臨床上価値があるように、妥当であるように、さらに 役立つように実質的に増加しうる場合だけ作用である；本発明の三次元培養物は トランスフェクトされた細胞の数の増加およびトランスフェクトされた細胞の（ 細胞分裂による）増幅を可能にする。

好ましくは、使用する発現調節要素は生体内で必要な場合だけ産物を合成するよ うに遺伝子の調節発現を可能にすべきである。選ばれるプロモーターは培養する 組織および細胞に幾分か左右されるだろう。蛋白を分泌できる細胞および組織（ 例えば、たくさんの粗面小胞体とゴルジ複合体により特徴づけられるもの）が好 ましい。このために、肝臓および他の腺組織が選ばれるだろう。肝細胞を用いる 場合、Ｂ型肝炎ウィルス要素のような肝臓特異ウィルスプロモーターが外来遺伝 子を肝細胞に導入しかつこの遺伝子の発現を調節するために使用される。これら の細胞はその後本発明の三次元系で培養されるだろう。また、アルブミンプロモ ーターのような肝臓特異プロモーターも使用できる。

すでに記載されて、使用しうる組織特異性を示す転写調節領域の例としては、制 限するものではないが、膵臓線層細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子 調節領域（Ｓｗｉｆｔら、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６３９−６４６；　 ０ｒｎｉｔｚら、１９８６．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍ ｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ。

５０：３９９−４０９；　ＭａｅＤｏｎａｌｄ、１９８７．　Ｈｅｐａｔｏｌｏ ｇｙ　７：４２Ｓ−５１Ｓ）；膵臓β細胞において活性であるインシュリン遺伝 子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５− １２２　）　；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（ Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｓ　ら、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−５３８；　Ａｌ ｅｘａｎｄｅｒ　ら。

１９８７、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：１４３６−１４４４）　 ；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら。

１９８７、　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　ｌ：２６８−２７６）　；肝 臓において活性であるα−フェトプロティン遺伝子調節領域（［（ｒｕｍｌａｕ ｆら、、１９８５．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５：１６３９−１６４ ８；Ｈａｍｍｅｒら、　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８　）　 ；肝臓において活性であるα−１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓ ｅｙら、、１９８７．Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、１：１６１−１７１） 　；骨髄細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍａｇｒａｍら ｓｌ　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０；　Ｋｏｌｌｉａｓ ら、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４６：８９−９４）　；脳の乏突起神経膠細胞 において活性であるミニリン塩基性蛋白遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、 、　１９８７．　Ｃｅ１ｌ　４８ニア０３−７１２）　；骨格筋において活性で あるミオシン軽鎖−２遺伝予調節領域（Ｓｈａｎｉ、　１９８５．　Ｎａｔｕｒ ｅ　３１４：２８３−２８６　）　；視床下部において活性である性腺刺激ホル モン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ 　２３４：１３７２−１３７８）を挙げることができる。

本発明の別の実施態様では、三次元培養物は遺伝子導入を促進するために使用さ れる。例えば、制限するものではないが、組み換えウィルス発現ベクターを含む 繊維芽細胞間質の三次元培養物は、インビボ　でのウィルス伝染をまねて、組み 換えウィルスを間質マトリックスと接触状態にある細胞に移行させるために使用 することができる。三次元培養系は最近のＤＮＡ）ランスフエクション技法より も一層効果的な遺伝子導入法である。

本発明のさらに別の実施態様では、三次元培養系が生物学的産物を高収量で生産 するためにインビトロで使用されるだろう。例えば、自然界で特定の生物学的産 物（例、増殖因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体など）を大量に生産する 細胞、または外来遺伝子産物を生産するように遺伝子工学的に操作された宿主細 胞は、三次元培養系を使ってインビトロでクローンとして増殖させることができ る。形質転換細胞が遺伝子産物を栄養培地中に分泌する場合は、標準的な分離技 法（例えば、２，３の例を挙げると、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、電 気泳動法）を使って使用済みまたはならし培地からその産物を簡単に分離できる 。インビトロで三次元培養物を供給する連続流動法を利用する“バイオリアクタ ー”を考案してもよい。

本質的に、新鮮培地が三次元培養物を通過するとき、遺伝子産物は培養物から遊 離した細胞と共に培養物から流出されるだろう。この遺伝子産物は使用済みまた はならし培地の流出物から（例えば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、電 気泳動などにより）分離される。

本発明の種々の具体例は以下のセクションで説明する。単に説明だけのために、 制限としてではなく、本発明の三次元培養系はいろいろな系で使用する組織およ び細胞の型に基づいて記載される。これらの記載には骨髄、皮膚、肝臓および膵 臓が含まれるが、これらに限定されず、三次元培養系は他の型の細胞および組織 にも使用できることが明白である。本発明はまた記載したそれぞれの系でもたら された特性データを示す実施例によって例示される。

６゜三次元骨髄培養系 本発明の三次元培養物は生理学的条件に匹敵する系での骨髄細胞のインビトロ複 製をもたらす。重大なことには、この系で複製した骨髄細胞は、培養を開始する のに使用したもとの骨髄接種物中に全部の細胞型が存在していたと仮定して、正 常骨髄に存在する細胞を全部含んでいる。

骨髄細胞は単独で培養したとき増殖に限りがあるが、間質細胞またはそれらの分 泌産物が存在するときだけこれらの培養物の長期増殖が可能である。例えば、Ｌ ｏｎｇ−Ｔｅｒｍ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｄ、Ｇ、Ｗｒｉ ｇｈｔ　＆　Ｊ、Ｓ。

Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ、　ｅｄｓ、、　Ａ、Ｒ，Ｌｆｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　（１９８４）　ｐｐ。

１４１−１５６を参照されたい。

本発明によれば、骨髄細胞は（胎児または骨髄由来の）繊維芽細胞から成る間質 細胞もしくは骨髄の間質成分（繊維芽細胞、マクロファージ、細網細胞および脂 肪細胞を含む）から成る細胞型の混合物との同時培養下に三次元支持体上で増殖 させる。場合により、膵臓および／または肝臓マクロファージ培養物の培地から 、あるいは間質細胞のサブセットから誘導された因子をこの培養物に添加しても よい。本発明の三次元培養系は、骨髄が内因性のまたは環境媒介の病気により、 あるいは化学療法および／または放射線によるこの種の病気の治療により破壊さ れた場合に、骨髄再生能を有する多能性造血幹細胞の増殖を最大限に高めると考 えられる。

通常の単層細胞培養法を使用するときにも、骨髄再生活性（ＭＲＡ）をもつ幹細 胞は長期のネズミ骨髄培養物中に残存して複製することが分かっている。このよ うな系では、しかしながら、成熟造血細胞の出現は主として骨髄および単球系統 に限られる。ヒトおよびヒト以外の霊長類の骨髄細胞の単層培養物は検出可能な 前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅなど）の一定の減衰を 示す。例えば、ネズミ系では、これらの単層培養物から出現する主な成熟細胞は 顆粒球である。対照的に、本発明の三次元間質系では、全部の血液細胞系統の造 血前駆細胞および造血前駆体が複製・増殖すると思われる。さらに、分化が生理 学的方法で進むと思われる。例えば、赤血球系、骨髄系、リンパ系、マクロファ ージ系、および巨核球系コロニーは、本発明により教示された下記の系を使うこ とにより、同一培養物中に連続して発生しつる。この系での幹細胞の複製は前駆 細胞の持続した増殖から推定することができる。

６．１．骨髄細胞を得る 接種物として使用する骨髄細胞は提供者から直接採取するか、または凍結保存よ り回収する。これらの細胞は初めに物理的手段によってそれらの細網細胞から分 離する。従って、提供者の腸骨稜から少量（１〇−１５ｃｃの骨髄／末梢血懸濁 体）が吸引される。移植を目的とする場合、この方法の結果は＝　（ａ）個体が 彼／彼女の骨髄を培養および／または凍結保存のために採取する時点で４０歳以 下である；および（ｂ）患者が病気にかかっていない；ときに最良となる。しか しながら、本発明はこれらの基準に限定されない。提供者から骨髄を吸引する方 法は当分野でよく知られている。骨髄を吸引する装置および方法の例は米国特許 第４４８１９４６号と同第４４８６１８８号に開示されている。

転移性疾患または血液の悪性疾患をもつ患者を治療するために骨髄を培養しよう とする場合、患者から採取した骨髄は、培養に先立って、物理的または化学療法 手段により悪性細胞を゛パージ“する必要がある。

現在、物理的または化学療法パージ法は、これらの方法が悪性細胞と正常細胞の 両方を無差別に死滅させるので大量のサンプルを必要とする。しかしながら、選 択的パージ法が目下開発されつつある。例えば、悪性細胞を毒性物質の標的にし て、それだけを特異的に殺そうとして、悪性細胞に対し特異的な抗体が試験され つつある。このような選択的パージ法はサンプルの大きさが小さい場合に効果的 であるだろう。本発明の三次元培養系は、小さいサンプルを効率よくパージしか つ残りの健康な細胞を増やすことを可能にするものである。提供者から採取した 骨髄は複製されるか、またはあとで複製するために保存される。骨髄を保存する 場合は、コンピュータを備えた低温技術装置を使って骨髄を漸増的に凍結するこ とができる。例えば、新鮮な骨髄／血液懸濁体は無菌Ｎｕｎｃチューブに等量ず つ小分けして、凍結保存室が同様の温度（４℃）になるまで砕いた氷のビーカー に入れておく。標本を凍結保存室に入れる直前に、無菌技術を使って、溶液を各 Ｎｕｎｃチューブに、凍結保護剤のジメチルスルホキシドおよびグリセロールが それぞれ約７％および５％の最終濃度となるように、添加する。凍結プログラム は標本の導入直後に開始される。ＣｒｙｏＭｅｄ　ｌ０ＩＯ型コントローラーに よる凍結プログラム番号１が使用される。

この技術を使って、凍結および８０”Ｃ水浴中での急速解凍を行った後の細胞の 生存能は、トリパンブルー排除法で検定したとき９０％を越える。さらに、８０ ％以上のもとのコロニー形成単位培養物（ＣＦＵ−Ｃ）を凍結後に回収できる。

予め算定した温度および時間曲線に従って骨髄および生物学的物質を凍結させる システムの例は米国特許第４１０７９３７号および同第４１１７８８１号に開示 されている。好ましくは、骨髄細胞はすべての細胞代謝活性がやむ一１９６℃の 液体窒素の液相中に貯蔵される。

６．２．三次元間質マトリックスの確立骨髄懸濁体から誘導された間質細胞は他 の骨髄成分から分離すべきである。これは当分野で知られた適当な方法を使って 達成される。例えば、骨髄懸濁体を低遠心力（例えば、３０００ｘｇ）で２０分 間遠心すると、マクロファージ、繊維芽細胞、脂肪細胞、単核血液細胞、細網細 胞、内皮細胞を含む細胞の白色ベース（すなわち、“バッフィコート”）が得ら れる。バッフィコートの細胞はＦＢＳ、Ｈ８，ヒドロコルチゾンヘミスクシネー ト、および適当な抗生物質を含んでぃてもよいＲＰＭ１１６４０培地のような適 当な培地に懸濁される。

その後、細胞を三次元マトリックス上にまく。接種物として高濃度の間質細胞を 使用する場合、間質支持マトリックスは比較的短期間に適当なサブ集密度を達成 するであろう。例えば、ｍ１当たり約１０’−１０７個の間質細胞がベトリ皿ま たは他の適当なチャンバー（例、　Ｔｉｔｅｒ−Ｔｅｋ容器）に収容した無菌ナ イロンメツシュ（米国ニューヨークのＴｅｔｋｏ社製）のような三次元マトリッ クス上にまかれる。

接種したメツシュはその後適量の栄養培地を含む培養フラスコに入れる。三次元 培養物を浮かせるか、または培地表面より下に部分的に沈める。この培養物は約 ５％Ｃｏ、／空気中で約３５−３７℃、約９０％以上の相対湿度にてインキュベ ートする。主に繊維芽細胞である間質細胞が最初に増殖し、メツシュ開口へ増殖 し始める前に全部のナイロン繊維を完全に取り囲む。

接種物として用いた細胞の濃度により、この過程は約５−１８日かかる。間質細 胞のサブ集密度は造血細胞の接種に先立って図１に示したものと一致すべきであ る。

三次元マトリックスで増殖させた間質細胞は骨髄細胞について先に述べたものと 同じ手法を使って凍結保存することができる。メツシュ上のサブ集密的細胞の凍 結保存の場合は、ナイロンメツシュを巻き、ＲＰＭ１１６４０（ジメチルスルホ キシドおよびグリセロールのような凍結保護剤をそれぞれ約５％および１５％の 最終濃度で補給した）のような適当な培地を含むＮｕｎｃチューブに挿入する。

メツシュ上の間質細胞の凍結は＋１　”Ｃから一４０℃まで一り℃／分の初期冷 却速度で達成される。−８４℃の最終段階温度に到達するまでは、−２ないし一 り℃／分の冷却速度が最適である。

このプロセスの間に、約２０−２５％の間質細胞がナイロンメツシュから剥がれ 落ちるだろう。

６゜２．１．骨髄間質細胞の増殖を促進する骨髄間質細胞の増殖における一次律 速要因は、骨髄間質細胞中に含まれる、比較的低い有糸分裂指数の繊維芽細胞で ある。これらの細胞の増殖およびそれらの細胞外マトリックス成分の付着は、ヒ ドロコルチゾンヘミスクシネートおよび／または自己調節増殖因子（細胞分裂速 度の速いヒト胎児繊維芽細胞の培地から誘導された）を加えることにより促進さ れる。

メツシュ上の繊維芽細胞の付着および増殖はまた、メツシュに前もって可溶化コ ラーゲンＩ−ＩＶ型を被覆するか、またはヒト胎児繊維芽細胞により、あるいは コラーゲン型を合成する能力に基づいてサブセツティングされた成人繊維芽細胞 （以後“増殖促進繊維芽細胞”と記す）により分泌されたコラーゲンを被覆した または埋め込んだメツシュを使用することにより促進される。これに関して、増 殖促進繊維芽細胞は集密的増殖に達した時点（ヒト胎児繊維芽細胞の場合は５− ７日、成人繊維芽細胞の場合は１４−１８日）で温和なトリプシン処理によりメ ツシュから持ち上げ、その後上述したように間質骨髄細胞を接種するか、あるい は今後の使用のために凍結保存する。

本発明の一実施態様では、コラ・−ゲンおよび他の細胞外マトリックス成分を合 成している増殖促進繊維芽細胞をサブ集密的増殖に達するまでメツシュ上で増殖 させる。その後、造血細胞と間質骨髄細胞の混合物をサブ集密的増殖促進繊維芽 細胞メツシュ製作物に接種する。

増殖促進繊維芽細胞を増やし、サブセツティングし、凍結保存する方法は次の通 りである： （ａ）増殖促進繊維芽細胞の培養　適当な方法はどれも増殖促進繊維芽細胞を培 養するために使用できる。

例えば、繊維芽細胞は２−１Ｏ％ＦＢＳまたは２−１０％Ｈ３を補給したＲＰＭ Ｉ　１６４０　（Ｒμｇ／’ｍｌヒドロコルチゾンヘミスクシネートおよび２μ ｇ／ｍ１ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、フンギシンのよう な抗生物質が加えである）のような適当な培地で生育させる。この培養物は約５ ％Ｃ０２／空気中で約３５−３７°Ｃ１約９０％以上の相対湿度にて増殖させる 。

（ｂ）増殖促進繊維芽細胞のサブセツティング　増殖促進繊維芽細胞をサブセツ ティングするために多数の方法を使用することができる。例えば、骨髄懸濁体の バッフィコート、真皮繊維芽細胞、または死体肝臓由来の繊維芽細胞から誘導さ れた約５．０ｘｌＯ−繊維芽細胞をマイクロタイターウェル（１ｍｍ”）にまき 、集密的に増殖させる。これらの細胞を、Ｃａ”＋またはＭｇ＋＋を含まないハ ンクスの平衡塩類溶液で反復洗浄（通常、４−５回）して培養ウェルから取り出 す。

マイクロタイター・プレートに残っているマトリックスは、直接または間接標識 で視覚化された種々のマトリックス成分に対するモノクローナル抗体を利用する 間接免疫蛍光法により調べることができる。例えば、特定のマトリックス成分に 特異的な未標識マウスＩｇＧモノクローナル抗体の結合は、存在するコラーゲン 型を確かめるために、酵素で標識したまたはフルオレセインイソチオシアネート で標識したウサギ抗マウス免疫グロブリンＧを用いて視覚化される。その後、ネ ガティブ選択が多くの技法により達成される。例えば、懸濁細胞を、補体（例、 ＩｇＧ、ＩｇＭなど）を活性化することができかつ特定のマトリックス成分（例 。

コラーゲンｌ−１Ｖ型、エラスチン、トロボエラスチン、またはフィブロネクチ ン）を規定するアイソタイプのモノクローナル抗体で処理して、それぞれの産物 を合成しつる細胞のサブ集団を分離する。その後、これらの細胞をモルモット補 体で処理すると、モノクローナル抗体が結合している細胞は損傷を受けるか、破 壊されるだろう。サンプル中に残存する生存細胞は先に述べたようにマイクロタ イターウェルに再度まき、集密的に増殖させ、そして取り出す。この分離技術の 効率は、生き残っている細胞が分泌したマトリックスを、直接または間接標識に より視覚化した適当なモノクローナル抗体を用いて調べることにより立証される 。

造血細胞の最適増殖のためには、初期マトリックスはコラーゲンＩＩ■型、ＩＶ 型およびＩ型をだいたい６：３：１の比で含むべきである。

（ｃ）増殖促進繊維芽細胞の凍結保存　増殖促進繊維芽細胞は間質細胞について 先に述べたものと同じ手法を使って凍結保存することができる。間質細胞と同様 に、若干の増殖促進繊維芽細胞も凍結の間にメツシュから離れるだろう。しかし ながら、このマトリックスはまだ骨髄間質細胞の付着に寄与し、それ故に造血細 胞の増殖へ導くマトリックスの確立に要する時間を短縮する。

６．３．造血細胞の接種 骨髄細胞は適当な栄養培地（例えば、ＦＢＳ、Ｈ３、ヒドロコルチゾンを補給し たＲＰＭＩ／１６４０、適当な抗生物質を使用できる）に浮遊させ、三次元間質 支持体に接種する。これらの細胞は新鮮であるか、または例えば８０°Ｃの温水 浴中で急速融解した凍結保存サンプルから誘導される。適切な濃度の細胞がサブ 集密的間質細胞メツシュ製作物に接種される。例えば、１０”−１０７細胞を２ ５ｍｍ’プラスチック培養フラスコ内の三次元間質マトリックスに接種し、約３ ３−３４°Ｃおよび５％ＣＯ□／空気で生育させることができる。これらの培養 物の相対湿度は約９０％以上である方がよい。３日後、培養物の温度は約３５− ３７°Ｃに上げる。

一般に、造血細胞はサブ集密的間質細胞により形成された天然ポケット内で増殖 し、前駆細胞は細胞付着層に残るだろう。この付着層はメツシュに直接付着した 細胞、またはメツシュに直接付着した細胞に付着することにより接合された細胞 である。造血コロナイゼーションは速やかに起こるけれども、接種物からの造血 細胞は主に間質支持マトリックスが存在する場所に接種するので、間質の接種が 造血の律速段階であると考えられる。コロナイゼーションは部分的に発生した間 質層により形成された天然間隙に起こり、さらにマトリックスの最も外側の表面 にも見られる。表面コロニーはマトリックス内のものよりもやや小さく、往々に して非付着ゾーンの一部であるように見える。実際には、それらはゆるく結合し ており、培地の供給後に残存する。これらの細胞（単層型ＬＴＢＭＣにも常に存 在する）は“擬似付着層（ｐｓｅｕｄ−ａｄｈｅｒｅｎｔ　１ａｙｅｒ）　’と 名付けられた（Ｃｏｕｌｏｍｂｅｌら、　！９８３．　Ｂｌｏｏｄ　６２：２９ １−２９７）。

４−５日後、成熟顆粒球、単核細胞および赤血球がサイトスピン調製によって観 察されるように非付着層に現れる。７−１０日後、多数の造血コロニーがメツシ ュ間隙に観察され、形態学的にＣＦＵ−Ｃ１混合コロニーおよびリンパ系コロニ ーと一致する。巨核球の増殖は限られるが、このマトリックスにも観察される。

平均３．６ｃｍ’培養物は週あたり４５０−９５０のＣＦＵ−Ｃをつくるだろう 。

同一個体由来の間質細胞および造血細胞から成る培養物（自系）は週に２回培地 を供給されるべきである。

別の個体から誘導した間質細胞メツシュ製作物に接種された患者の骨髄から成る 培養物（同種異系）は、非付着層からの成熟免疫能細胞の十分な膜集合（ｄｅｐ ｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を確実なものとするために、週に３回培地を供給されるべ きである。

６．４．三次元骨髄培養物の長期増殖 場合により、三次元骨髄培養物は長期増殖を促すために単核細胞を接種すること ができる。末梢血単核細胞はフィコール−ハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑ ｕｅ）またはパーコール（ｐｅｒｃｏｌＮ　）を使ってヘパリン処理懸濁体から 調製される。末梢血細胞および骨髄造血細胞は好ましくは同一個体（自系）に由 来すべきである。これらは静脈穿刺により得られ、骨髄標本が採取される時に凍 結保存される。必要ならば、培養中に追加の末梢血細胞を患者から採取すること もできるだろう。しかしながら、転移性疾患が疑われる場合には、初めにサンプ ルを上記のようなパージに付すべきである。単核細胞は骨髄細胞の接種後まもな く三次元培養物に接種される。例えば、５ｘｌＯ’−１０″単核細胞（単球サブ 集団がこの段階の単核細胞層の中で好適な細胞型である）を、骨髄造血細胞の初 期接種の４−５日後、その後は３週毎にメツシュ製作物に接種する。この方法は 、週基準で観測したとき、造血機能をＩ　Ｏ−１３％高めることができる。

我々の経験では、集密的間質細胞培養物は造血をサポートしないか、サポートし たとしても不十分であるだろう。ヒト造血前駆細胞の限りない増殖は、それらが 必要な間質誘導増殖／調節因子を供給される場合に、可能である。本発明の三次 元培養系は、間質細胞がサブ集密状態を維持して、造血に必要な因子を長期間に わたって生産することを可能にする。しかしながら、この期間は三次元培養系の 更なる操作によって引き延ばすことができる。

例えば、初期骨髄サンプルを多数のアリコート（各アリコートは約１０＠造血細 胞を含む）に分ける。これらの各々をサブ集密的間質細胞メツシュ製作物に接種 する。この培養物は倒立顕微鏡を使った直接観察により、あるいはそれぞれの培 地供給後に使用済み培地のサイトスピン調製において観察される非付着細胞の鑑 別計数によりモニターされる。集密的増殖に達する前に、培養物をコラゲナーゼ で処理し、穏やかな超音波処理下に約６−１Ｏ分間おく。培養物から解離された 造血細胞および間質細胞は、例えば密度勾配法により、分画化することができる 。造血細胞は血球針を使って計数し、約５０％を先に述べた方法を用いて凍結保 存する。造血細胞の残りの５０％はそれぞれ約１０”細胞から成るアリコートに 分割され、平行して振どう・増殖させたサブ集密的間質細胞培養物に接種される 。

これらが集密的増殖に達し始めたら、同じ方法を繰り返し行う。この技術は（ａ ）必要な増殖因子をつくる微小環境を与えることにより造血細胞の増殖を永久の ものにする、（ｂ）移植に適した数が達成されるまで造血前駆細胞を預けるため の連続バンクを形成する。

６．５．三次元長期骨髄培養物での造血の調節ヒト骨髄の種々の細胞成分は三次 元系で別々の培養物として継代培養することができる。マクロファージ、細網細 胞、脂肪細胞および繊維芽細胞を別々に増殖させ、いろいろな物質での処理によ りそれらの分泌活動を変更できる。繊維芽細胞活動の調節は前に記載した通りで ある。

三次元メツシュ製作物による長期ヒト骨髄培養物での造血はまた、以下の方法で 培養下に増殖させたときの骨髄外マクロファージ（クツパー細胞）の分泌によっ ても調節される。クツパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ　ｃｅｌｌ）は、例えばプロナ ーゼ消化により、それらの器官間質から分離できる。簡単に述べると、組織標本 をプロナーゼ溶液〔０，２％プロナーゼ（Ｃａ　ｌｂ　ｉｏｃｈｅｍ）およびゲ イスの平衡塩類溶液（ＢＳＳ））中で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベー トする。この溶液のｐＨは例えばＩＮ　ＮａＯＨを用いて７．　３−７．　５に 保持すべきである。上記方法のあいだ３０分間隔でデオキシリボヌクレアーゼ（ ０、５ｍ　ｇ　；　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、得られた細胞懸濁体を濾過 し、３５０Ｘｇで１０分遠心する。ペレットはゲイスのＢＳＳに再懸濁させ、パ ーコール（Ｐｔ＋ａｒｍａｃｉａ　）勾配を使って沿岸細胞（ｌｉｔ−ｔｏｒａ ｌ　ｃｅｌｌ　；マクロファージおよび内皮細胞）を細胞破片および成熟血液細 胞から分離する。得られた細胞画分は、例えば１０％ウシ胎児血清を加えた修飾 ダルベツコ培地を用いて、３分間ずつ３回洗浄し、プラスチック培養皿に約３− ４ｘｌＯ”細胞を含む量でまく。

１日のインキュベーション後、培地で洗って非付着゛　細胞を除き、付着細胞を 約６％Ｃｏ、／空気の混合気体中で３３°Ｃ１約８０％を越える相対湿度にて維 持する。これらの細胞の増殖および／または分泌活動は（ａ）ＣＯ２：Ｏｘ比を 変える、（ｂ）培養物をラテックスビーズで処理する、（Ｃ）培養物をシリカで 処理する、（ｄ）培地にプロスタグランジンＥ、、Ｅ。

またはＦ１ａを加える、および（ｆ）培地にインターロイキン１またはインター ロイキン２を補給することにより刺激することができる。マクロファージ分泌産 物はこれらの方法／物質により調節される。

これらのマクロファージ分泌産物で調整された培地は、長期骨髄培養物の赤血球 形成／顆粒球形成比を調節するために使用される。

６．６．三次元骨髄培養系の使用 ６．６．１．移植 本発明の三次元骨髄培養物は、健康な骨髄細胞を破壊するか又はそれらの機能を 弱める病気もしくは症状を治療するために使用される。この方法は特に血液学的 悪性腫瘍や骨髄に転移する他の新生物の治療に有効である。本発明のこの面はさ らに、骨髄が環境因子（例えば、放射線、毒素など）、骨髄を直接冒さない病気 により必要とされた化学療法および／または放射線療法により悪影響を受けた患 者を治療する際にも有効である。これらの場合に、もし万一患者が骨髄を直接破 壊する病気またはその治療が骨髄に悪影響を及ぼす病気にかかったら、健康そう な患者から骨髄細胞を採取し、保存し、その後複製させて再注入することができ る。

本発明の三次元培養系は骨髄移植を必要とする患者に対していくつかの利点をも っている。患者が彼または彼女自身の細胞を受け取っている場合、これは自系移 植と呼ばれる；このような移植は拒絶反応をほとんど起こさない。自系移植は骨 髄移植の拒絶反応の主要原因、すなわち対宿主移植片反応を排除する。骨髄が悪 性細胞または病気にかかった細胞を含む場合、小さいサンプルは本発明の三次元 培養系を使うとき一層効果的にパージされる。先に説明したように、悪性細胞ま たは病気の細胞をパージする選択的方法は小容量の骨髄細胞において最もうまく ゆくであろう。ここに記載した三次元培養系はこれを実行可能にするものである 。従って、患者から採取した小サンプルは悪性細胞を死滅させるが正常細胞を助 ける選択的方法を用いてより効果的にパージされる。残存する正常細胞はその後 本発明の三次元培養系を使ってかなりの程度に増やすことができる。さらに、本 発明方法は化学療法剤および放射線による新生物疾患のより積極的な治療を可能 にする。現在のところ、これらの治療の程度は骨髄毒性によりしばしば制限され る。

６　、６．２．患者の症状をモニターする癌または他の病気をもつ患者では、患 者の骨髄の一部を吸引し、そのサンプルを試験することにより、患者の症状をモ ニターすることが往々にして効果をあげている。この方法では、転移や再発が臨 床的に明らかになる前に検出できる。骨髄細胞を調べることにより検出しうる他 の疾患をもつ患者もこの方法でモニターすることができる。

本発明の三次元系を使用する場合、パージしていない吸引骨髄標本から誘導され た細胞の長期増殖は、染色体異常をもつクローン転移性細胞および造血細胞の検 出可能性を高める。この種の細胞は本発明の三次元培養系でクローンとして増や されるために、一層簡単に検出できるだろう。これらの細胞は吸引しだての（未 培養の）骨髄の普通の標本では検出を逃れるかもしれない。

６　、６．３．化合物のスクリーニング医薬品、抗癌剤、発癌物質、食品添加物 および他の物質の骨髄に対する細胞毒性は本発明のインビトロ骨髄複製系を使う ことにより試験される。

初めに、安定した、増殖しつつある骨髄細胞培養物（間質細胞と造血細胞の両方 を含む）を確立する。次に、この培養物をいろいろな濃度の被検物質にさらす。

被検物質とインキュベーション後、培養物を位相差顕微鏡で観察して最大許容量 （ＨＴＤ）−最初に形態学的異常が現れる被検物質の濃度−を決定する。細胞毒 性試験は、当分野でよく知られた技法により、この三次元系で細胞生存能を評価 するために種々の超生体色素を使って行われる。ＨＴＤの決定は更なる試験のた めの濃度範囲を与える。

ひとたび試験範囲が確立されると、いろいろな濃度の被検物質が、当分野でよく 知られた手法により、骨髄培養物を構成する様々な細胞型の生存能、増殖および ／または形態に対するそれらの影響について試験される。

同様に、薬物の有益な効果がインビトロで三次元培養系を使って評価される；例 えば、増殖因子、ホルモン、赤血球形成を促進する薬物などが試験されるだろう 。この場合も、安定した増殖しつつある培養物を被検物質にさらす。インキュベ ーション後、培養物は被検物質の効能の指標として生存能、増殖、形態、細胞型 などを調べる。いろいろな濃度の薬物が用量−反応曲線を引き出すために試験さ れる。

本発明により開示された他の三次元細胞培養系も細胞毒性試験および薬物のスク リーニングでの使用に適している。細胞毒性検定での三次元骨髄培養物の使用の 例は以下のセクション１８に示しである。

７、三次元皮膚培養物系 本発明の三次元培養系は、生理学的条件に匹敵する系での上皮および真皮要素の インビトロ複製を与える。

重要なこととして、この系で複製する細胞は適切に分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｅ　 ）　して、形態学的および組織学的に正常な上皮および真皮成分を形成する。

上皮および真皮細胞の増殖における三次元同時培養系の使用は、現在用いられて いる単層系と比べて多くの利点をもっている。このモデルは正常な細胞−細胞相 互作用、天然増殖因子の分泌、およびインビボ　で見られるものと殆ど同じ結合 組織網状構造の確立を可能にする；特に、間質細胞は型特異および種特異コラー ゲンをつくり出す。完全に分離しうるこのメツシュ製作物は移植されるか、凍結 保存されるか、または細胞毒性および薬物の作用機序の研究において標的組織と して使用される。さらに、このモデルは真皮同等物を形成するための繊維芽細胞 単独の増殖、あるいは完全な厚さの皮膚同等物を形成するための表皮ケラチン細 胞およびメラニン細胞と一緒の繊維芽細胞の増殖を可能にする。この三次元系中 の細胞はすべて代謝的に活性のままであり、しかも他の多くのモデルと比べて大 きな利点である有糸分裂を受ける。

本発明の三次元皮膚培養物は、化合物のスクリーニングのための基質としてのそ の使用、移植および皮膚移植、皮膚病の研究および治療を含めて多種多様の用途 をもっている。例えば、有毒でありうる化学物質の徹底的な試験の必要性が一般 的に認められており、さらに薬物、化粧品、食品添加物および殺虫剤を評価する ための感度のよい、再現性のある、短期インビトロ検定を開発することが明らか に必要である。ここに記載した三次元皮膚モデルは検定基質としての組織同等物 の使用を可能となし、インビボ状態にきわめて似ている系での正常細胞相互作用 の利点をもたらす。

火傷の患者のための皮膚置換の必要性もまた明白である。米国やヨーロッパの数 カ所のセンターは、火傷や慢性潰瘍を永久にカバーするために、培養したヒト表 皮ケラチン細胞同種異系移植片および自己移植片を利用している（Ｂｉｓｉｎｇ ｅｒら、、　ｆ９８０．　Ｓｕｒｇｅｒｙ　８８：２８７−２９３；　Ｇｒｅｅ ｎら、、１９７９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６：５ ６６５−５６６８；　Ｃｕｏｎｏ　ら、１９８７．　Ｐｌａｓｔ、Ｒｅｃｏｎｓ ｔｒ、Ｓｕｒｇ、８０：６２６−６３５）。これらの方法はしばしば不成功に終 わり、最近の研究は、移植上皮層の下に形成された１つ以上の結合組織成分に異 常があるために、治癒移植物に水痘形成および／または皮膚ぜい弱性が見られる ことを明らかにした（Ｗｏｏｄｌｅｙ　ら、１９８８．　ＪＡＭＡ　６：２５６ ６−２５７１）。

本発明の三次元皮膚培養系は上皮および真皮の両方の皮膚同等物を提供し、広く 用いられている培養表皮ケラチン細胞移植片に特有の諸問題を解決するであろう 。

細胞毒性および皮膚置換に加えて、三次元皮膚培養物は皮膚病を研究して新薬お よび治療法を開発するためのモデルとして、または天然に分泌される薬理活性物 質の供給源として、多くの産業分野で応用することができる。

７．１．三次元間質支持体の確立および真皮同等物の形成 三次元マトリックスへの繊維芽細胞の接種およびそれらのサブ集密的増殖は真皮 同等物の形成へ導く。本発明の好適な実施態様では、全部の増殖支持体が覆われ るまで繊維芽細胞を増殖させる；繊維芽細胞は集密的増殖に達した後でさえも、 三次元培養物が細胞の退去を可能にして接触阻止を抑制するので、繊維芽細胞は 分裂し続けることに留意されたい。接種物としてどのような繊維芽細胞を使用し てもよいが、皮膚繊維芽細胞は適当な型のコラーゲンを生産しかつ他の真皮構成 成分をつくるので、それらを使用することが有利である。繊維芽細胞は同種異系 か自系であり、真皮組織の機械的および／または酵素的解離により調製した細胞 懸濁体から容易に得ることができる。得られた細胞懸濁体をまく場合、繊維芽細 胞は他の細胞より速やかに付着するだろう。これらは集密的に増殖させ、温和な 酵素処理で取り出して、先に述べた三次元マトリックスに接種することができる 。

ひとたび三次元マトリックスに接種すれば、繊維芽細胞の付着がすぐに（例えば 、数時間以内に）見られ、そして繊維芽細胞は数日以内にマトリックス開口部を 横切って広がり始める。これらの繊維芽細胞は代謝的に活性であり、細胞外マト リックスを分泌し、活動的な繊維芽細胞とコラーゲンから成る真皮同等物を速や かに形成する。あとで接種される上皮細胞の増殖を助けるためには、三次元マト リックス上に約６０９６の集密度の繊維芽細胞が必要とされる。

繊維芽細胞単独の使用は真皮同等物として機能する三次元間質マトリックスを形 成するのに十分であるが、別の型の間質細胞を三次元マトリックスに接種しても よい。これらには、制限するものではないが、内皮細胞、周皮細胞、マクロファ ージ、単球、リンパ球、形質細胞、脂肪細胞などが含まれる。

７．２．真皮同等物への上皮細胞の接種完全な厚さの皮膚、すなわち上皮層と真 皮層の両方から成る皮膚を培養するためには、上皮細胞を真皮同等物に接種すべ きである。このために、メラニン細胞と表皮ケラチン細胞が同時に、または好ま しくは順々に接種される。例えば、間質マトリックスに前もって接種されたサブ 集密的メラニン細胞に表皮ケラチン細胞を接種する。

メラニン細胞と表皮ケラチン細胞は線維芽間質細胞との関係において同種異系か 自系であり、真皮層と上゛　皮層を分離するためにトリプシンのような消化酵素 中で皮膚をインキュベートすることを含む既知方法を使って、皮膚から分離する ことができる。

例えば、制限としてではなく、メラニン細胞とケラチノサイトは次のように分離 される。組織サンプル（例えば、包皮）は全表面が抗生物質にさらされるように 形を整える。初めに、組織を濃厚な抗生物質溶液中で２０分間洗い、続いて１０ 分間ずつ２回洗う。その後、組織の外側部分は小片に切断し、０．１５％トリプ シン溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含まないＰＢＳ中）にいれ、すばや く取り出し、同一のトリプシン溶液の新しい容器に（全部の組織が溶液で覆われ るように）いれ、約２−８°Ｃで一晩冷却する。翌日、組織片をトリプシン溶液 から取り出し、曲がった鉗子を使って真皮から上皮を分離する。上皮はコニカル チューブにいれ、ＰＢＳ　（カルシウムまたはマグネシウム不含）中の約０．１ ５％トリプシンを使って組織を消化し、単細胞懸濁体を得る；、二の方法を促進 するために、サンプルをパスツールピペットから繰り返し吸ったり出したりする 。サンプルが単細胞懸濁体であると見えたら、それを１４００ｘｇで約７分遠心 し、その後メラニン細胞を選択する増殖培地または０．０１ｍｇ／ｍｌのＰＭＡ を含む増殖培地に再懸濁する。

こうして、表皮ケラチン細胞またはメラニン細胞の培養物が得られる。上皮細胞 は懸濁して、真皮同等物に接種するために使われる。別法として、上皮細胞懸濁 体をプレートにまき、メラニン細胞と表皮ケラチン細胞をそれらの異なる付着特 性に基づいて分離することもできる。分離したメラニン細胞は初めに真皮同等物 に接種し、表皮ケラチン細胞の接種に先立って２，３日増殖させる。この“組織 ”は速やかに増殖し、外因性増殖因子を含まない栄養培地中に維持することがで きる。

すべての皮膚置換の欠点は移植面に毛包、汗腺および皮脂腺が不足することであ る。この欠陥により、患者は温度調節ができず、重症の乾燥肌となり、またコン トロールできない程に激しい動悸を起こす。この問題を軽減するために、影響を うけていない皮膚面からバイオプシーを切除し、これを真皮同等物に移植する。

これらのバイオプシーを戦略的に位置づけることにより、毛包と関連した腺が移 植部位に導入される。バイオプシーはその大きさが好ましくは約４−８ｃｍの範 囲であり、標準的なベイカーのパンチ（Ｂａｋｅｒ’ｓ　ｐｕｎｃｈ）により切 除しうる。その後、同じ大きさのバイオプシーを真皮移植物から取り出し７、毛 包含有移植物と置き換え、これにより組織学的に正常で、機能的に正常な皮膚と 類似した移植部位をつくることができる。

例として、制限としてではなく、三次元皮膚細胞培養系は次のようにつくられる ： （ａ）インビトロ骨髄複製系で使われる増殖促進繊維芽細胞に関して先に記載し たように、繊維芽細胞をメツシュに付着させ、約７−９日間培養してサブ集密的 増殖を達成させ、そしてコラーゲンＩおよびＩＩＩ型を沈着させる； （ｂ）メラニン細胞をこの間質メツシュにまき、約５日間サブ集密的に増殖させ る； （Ｃ）表皮ケラチン細胞をサブ集密的メラニン細胞に接種する。

本発明の好適な実施態様では、三次元皮膚細胞培養系は以下のように作製される ： （ａ）繊維芽細胞をメツシュに付着させ、約１４日間培養して集密的増殖を達成 させ、そしてコラーゲン■およびＩＩＩ型を沈着させる； （ｂ）メラニン細胞をこの間質メツシュにまき、約５日間サブ集密的に増殖させ る： （Ｃ）表皮ケラチン細胞をサブ集密的メラニン細胞に接種する。

本発明の特定の実施態様では、例えば、火傷の患者に対して、負傷後直ちに傷を カバーで覆うことが有利である；このような場合は、大部分が繊維芽細胞から成 りかつ真皮に対応する本発明の三次元細胞培養物（以後新真皮（ｎｅｏｄｅｒｍ ｉｓ　）と呼ぶ）を負傷部の上に載せ、その後メラニン細胞と表皮ケラチン細胞 を加える。新真皮は患者に対して自系または同種異系の細胞でありうる。上皮細 胞は患者に対して同種異系であってもよいが、好ましくは自系である。本発明は 、インビボ　またはインビトロで上皮細胞を加えることのできる、増殖しつつあ る新真皮の移植を包含する；また、患者自身の細胞が移植した新真皮に植え込ま れてもよい。

７．３．三次元皮膚培養物の形態学的特性決定三次元間質の形態学的特性決定に より、マトリックスに接種された繊維芽細胞は開口部を横切って広がり、マトリ ックス沈着を示し、そしてメツシュ間隙に移行することが分かる。図１は、繊維 芽細胞が天然に分泌されたコラーゲン束の間に平行層にそれら自体を配列する能 力をもつことを示す。これらの繊維芽細胞は迅速な細胞分裂と蛋白分泌を示す。

メラニン細胞は、それらが樹状突起の形成を示し、色素を産生じ、色素を移行さ せる能力を保持するという点で三次元系において正常に増殖するであろう（図６ −８参照）。

完全な厚さの皮膚は空気を接触させるいろいろな方法で増殖させることができる 。表皮ケラチン細胞を空気にさらすと、表皮ケラチン細胞のより速やかな分化と ケラチン層のより豊富な分泌（皮膚浸透実験において非常に重要である）が促進 される。

皮膚科学的研究および移植実験に通常使用さねる方法と比べたときの、′、の細 胞培養系の主な利点Ｉよ、先に述べたよ・うに、サブ集密的またはＳ密約な、三 次元マトリックスの繊維芽細胞が代謝的に活発であり、天然増殖因子と自然界に 存在するコラーゲン■およびＩＩＩ型を分泌するということである。これらの細 胞の正常な代謝活動のために、この系は細胞毒性検定およびコラーゲン分泌に直 接影響を与える疾患の研究、または真皮細胞と上皮細胞間の相互作用が病気と一 致した病理学的変化をもたらす疾患の研究に使用することが特に有利である。

７．４．インビボ　移植 移植または植え込みのためには、生物分解性の材料（例えば、腸線縫合糸、ゼラ チンなど）から作製された三次元マトリックスを使用することが好ましい。これ らは三次元系の利点をすべて可能にし、しかもメツシュが生体によって自然に分 解・吸収され、その領域に移行する正常細胞と置き換わるのに対し、移植した“ 組織”をそのまま残すことができる。

三次元間質マトリックスをつくるためには、移植を受けようとする患者から得ら れた皮膚繊維芽細胞を用いることが好ましい。また、胎児繊維芽細胞あるいは胎 児繊維芽細胞と患者の繊維芽細胞の混合物も使用できる。しかしながら、本発明 によれば、自系、同種異系、または異種系の供給源に由来する繊維芽細胞も使用 される；実施例はクジコン１９（ごは、本発明に従、っでヒｌ−ｍ維芽細胞を培 養し、ブタに上首尾で移植しまた本発明の特定の実施態様が示しである。しかし ながら、より重要なこととして、あとで接種される上皮細胞は移植の拒絶反応の リスクを最小限に抑えるために患者から誘導することが有利である。

本発明のこの面の別の実施態様では、新真皮を形成する三次元間質支持マトリッ クスそれ自体が患者の損傷部に移植される。この場合、損傷部の患者自身の上皮 細胞が間質マトリックスに侵入し、この間質マトリックス上でインビボ　増殖し て、完全な厚さの皮膚（すなわち、上皮層と真皮層の両方）を形成するであろう 。

これとは別に、新真皮の上に上皮細胞をまいたり、上皮細胞のシートを載せるこ ともできる。大きな負傷面をカバーしようとする場合は、完全な三次元皮膚培養 物を移植すること、または新真皮と完全な厚さの皮膚培養物の両方を併用するこ とが好適である。例えば、増殖および治癒を促進しかつ傷痕の形成を最小限にく い止めるために、新真皮は傷の縁部に移植され、完全な厚さの培養物は傷の中心 部に移植されるであろう。

７．５．三次元皮膚培養物のインビトロ使用三次元皮膚培養物はインビトロで維 持することができ、毒性についての化合物のスクリーニング、薬物の作用機序の 研究、皮膚病の研究など、いろいろな目的に使用される。

三次元皮膚培養物は化合物や他の物質の細胞毒性を試験するための基質として利 用される。例えば、細胞毒性検定で使用するために、９６−ウェル平底組織培養 マイクロテストプレートに置いて適当な培地を供給したメツシュ（６ｍｒｎのデ ィスクに切断）上でヒト細胞を増殖させる。その後、各サンプルに被検物質を加 える。被検物質は限界希釈法により有利に添加され、この場合には、毒性物質の 濃度範囲を試験することができる。３通りのデータを得るために、それぞれの組 織型は３列のメツシュにより表される。適切に制御された検定は次のように行わ れるであろう：メッシュ単独；繊維芽細胞を接種したメツシュ：繊維芽細胞と表 皮ケラチン細胞を接種したメツシュ；繊維芽細胞とメラニン細胞を接種したメツ シュ：および繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞およびメラニン細胞を接種したメツ シュ。これらの基質のそれぞれに化学物質を加え、例えば２４時間インキュベー トする。この種の物質の細胞毒性作用は多くの方法を使って評価される。例えば 、慣用方法である、よく知られたニュートラルレッド検定がこの系で使用するの に適しているだろう。このために、培地を除去した後、各ウェルを洗い、ニュー トラルレッド色素の０．４％水性原液を加える。異なる時間の経過後、色素を除 き、細胞を４．０％ホルムアルデヒド、１．Ｏ％Ｃａ　Ｃ１ｔで速やかに洗う。

約２０分後、各組織サンプル中に存在する色素の量を、５４０ｎｍフィルターを 備えたｏｙｎａｔｅｃｈマイクロプレートリーダーで吸光度を読み取って測定す る。吸収された生体色素の量は各ウェル中に存在する生存細胞の数に直接比例す る。読み取った値を平均して、結果を対照培養物の基底線レベルに対する観察さ れた吸光度として表す。

最近の研究は、皮膚が免疫系の欠くことのできない活性要素であることを示した （　Ｃｏｏｐｅｒら、、　１９８７．　Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｏｂｕｌｌｏｕｓ　 ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｉｎ：　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　３ｄ、　Ｅｄ、、　ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ、　ＮＹ、 　ｐｐ、６１０−６２）。いろいろな免疫活動の原因となる主要な皮膚細胞の１ つはランゲルハンス細胞である。これらの細胞を新鮮な皮膚サンプルから調製し 、三次元皮膚培養物に加えて免疫学的に完成した組織系をつくることが可能であ る。これらの細胞を通常の組織培養技術で長期間培養下に増殖させることは困難 である。三次元系でこれらの細胞を増殖できることは、移植、細胞毒性および病 気の機構を含むあらゆる研究面で非常に重要であるだろう。このタイプの皮膚培 養系は直接または間接の皮膚病変を伴う自己免疫疾患（エリテマトーデス、水庖 性類天庖癒なと）に関連した研究に最大の効果を発揮するであろう。

先に説明したように、三次元皮膚培養物はアレルゲンに対する感受性を試験する 際にも使用される。アレルギー試験の場合には、皮膚培養物に患者由来の肥満細 胞およびリンパ球（または形質細胞）を接種する。

肥満細胞に結合したＩｇＥ抗体（リンパ球により生産された）を“架橋”するア レルゲンにこの培養物をさらすと、肥満細胞によってヒスタミンのような血管作 動性メディエータ−が放出される。培養物におけるヒスタミンの放出を測定して 、試験したアレルゲンに対する患者のアレルギー反応と相関させる。

８、三次元肝臓組織培養系 肝細胞はヒト肝臓生検または剖検材料に適合する慣用方法（Ｂｅｒｒｙ　ａｎｄ 　Ｆｒ１ｅｎｄ、　１９６９．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　４３：５０６−５ ２０　）により単離される。簡単に説明すると、カニユーレを門脈または門脈技 に挿入し、組織が青白く見えるようになるまで肝臓にカルシウム不含またはマグ ネシウム不含緩衝液を潅流する。その後、この器官にコラゲナーゼ溶液のような 蛋白分解酵素を適度な流速で潅流する。これは結合組織の枠組を消化するはずで ある。次に、肝臓を緩衝液で洗い、細胞を分散させる。細胞懸濁体は７０μｍナ イロンメツシュを通して濾過し、細胞破片を取り除く。肝細胞は２回または３回 の分別遠心により細胞懸濁体から選別する。

切除したヒト肝臓の個々の小葉の潅流においては、ＨＥＰＥＳ緩衝液が使用され る。ＨＥＰＥＳ緩衝液中のコラゲナーゼの潅流は約３０ｍ１／分の速度で達成さ れる。単細胞懸濁体はコラゲナーゼと３７℃で１５−２０分間さらにインキュベ ートすることにより得られる（Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ　ａｎｄ　Ｇ ｕｉｌｌｏｕｚｏ、　ｅｄｓ、１９８６゜“ｌ５ｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”　Ｐａｒｉｓ、ＩＮＳＥＲＭ。

ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｌｉｂｂｅｙ　Ｅｕｒｏｔｅｘｔ、　ｐｐ 、１−１２；　１９８２゜Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、Ｉｎｔ、Ｒｅｐ、　６：６２５ −６２８）。

その後、単離した肝細胞は三次元間質に接種する。

接種した間質は骨髄および皮膚のところで記載したように培養して、生理学的条 件に匹敵する系で肝細胞をインビトロ複製する。これは肝細胞による機能的発現 の増加をもたらすであろう。　この方法で維持された肝臓培養物は細胞毒性試験 、薬物のスクリーニングなどを含むいろいろな目的に利用される。１つの実施態 様では、三次元肝臓培養物を使って、発癌物質および突然変異原をインビトロで スクリーニングすることができる。より詳細には、多数の化合物は細菌や真菌の ような試験生物において突然変異原として作用しないが、マウスのような動物で は腫瘍を発生させることがよく知られている。これは代謝活性化のためである； すなわち、一部の化学物質は肝臓（Ｐ４５０オキシダーゼ系およびヒドロキシル 化系）または他の組織で酵素により代謝され、突然変異原性でかつ発癌性である 新しい化合物を生成する。このような発癌物質を同定するために、Ａｍｅｓと彼 の共同研究者は、試験生物を代謝産物にさらす前に、化学物質を肝臓抽出物とイ ンキュベートすることを含むスクリーニング検定を提案した（　Ａｍｅｓら、、 　１９７５．　Ｍｕｔ、Ｒｅｓ、　３１：３４７−３６４）　ｏ　Ａｍｅｓの検 定法は、比較的精巧な方法であるが、まだ感度に乏しい。対照的に、三次元肝臓 培養物は被検物質の突然変異原性または発癌性を調べるための代謝変換体および “試験生物”として利用することができる。

９、血液−脳関門のための三次元モデル系本発明によれば、血液−脳関門のため の三次元組織培養モデル系が作製される。簡単に説明すると、初めに三次元メツ シュで脳の小血管から誘導された内皮細胞を集密的に増殖させることにより、中 枢神経系を血流から分離する内皮細胞バリヤーを作製する。最初に星状細胞を、 次に神経細胞を、内皮細胞により形成された集密的間質マトリックスに加える。

その結果として、内皮細胞は培養物の一面（上）と神経細胞（下）の間にバリヤ ーを形成する。内皮細胞表面に加えられた物質は、下方の神経細胞に達するため には、内皮細胞層を通って侵入しなければならない。

例えば、内皮細胞はＬａｒｓｏｎらの方法（１９８７，Ｍｉｃｒｏ−標準方法を 使ってインビトロで培養してそれらの数を増やす。その後、小血管内皮細胞を適 当なメツシュ（例えば、Ｔｅｔｋｏ社で作製されたナイロン濾過スクリーン；＃ ３−２１０／３６）に接種し、完全集密的に増殖させる；銀染色を使って、小血 管内皮に特有で、内皮の“バリヤー”機能と関連した密着結合複合体の存在を確 かめる。

神経細胞と星状細胞はその後胎児または周生期ラットから採取し、標準方法を使 って互いに分離する（Ｈａｔｔａｎら、、　１９８８．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、　１０６＋）　。例えば、神経細胞は支持体に対する分別付着により星状細 胞から分離でき、星状細胞は１００μｇ／ｍｌのポリ−ローリシンを塗布した皿 に付着し、神経細胞は５００μｇ／ｍｌのポリ−ローリシンを塗布した皿に付着 する。

星状細胞は集密的内皮細胞三次元間質マトリックスに接種し、約５日間培養した 後神経細胞をさらに接種する。

多重層三次元組織培養系は１つの小血管内皮細胞層ともう１つの星状細胞と神経 細胞の層から成り、インビボで見られる血液−脳関門の構造（ここでは、血液中 の物質は脳の神経組織に達するために小血管の内皮を通過しなければならない） を再現する。この系は血液−脳関門を通過する物質の能力を試験するために用い られる。多くの物質はこの関門を通過することができないので、被検物質の通過 能力を迅速にスクリーニングするためのインビトロ系の必要性が存在する。例え ば、多くの抗生物質は血液−脳関門を通過することができない。新たに開発され た抗生物質をそれらの通過能力について迅速にスクリーニングできることは有益 であるだろう：中枢神経系の感染症の治療に用いられる抗生物質は比較的少数し かなく、その多くはペニシリンに関係しているため、アレルギー反応の危険性を 伴うので、新しいＣＮＳ作動薬が早急に開発される必要がある。

１０、三次元膵臓組織培養系 膵臓豚房細胞の懸濁液は、他の研究者により記載された技術を適合させることに より製造しつる（ＲｕｏｆｆおよびＨａｙ、　１９７９．　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ ｕｅ　Ｒｅｓ、　２０４＋２４３−２５２；およびＨａｙ、１９７９．“Ｍｅｔ ｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｕｒｖｅｙｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ 、第８巻、Ｃｅ１ｌ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ、”　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｌｌｉ ｓＨｏｒｎｗｏｏｄ、　Ｌｔｄ、、第１４３−１６０頁）。簡単に述べると、組 織を細断し、カルシウム不合、マグネシウム不合緩衝液中で洗う。細断された組 織断片をトリプシンおよびコラゲナーゼの溶液中でインキュベートする。解離し た細胞は２０μｍナイロンメツシュを使用して濾過し、ハンクス平衡塩類溶液の ような適当な緩衝液中に再懸濁し、そして遠心にてペレットにしうる。得られた 細胞ペレットは最小量の適切な媒質中に再懸濁して前述のようにして調製された 三次元間質上に接種しうる。

線層細胞はチモーゲン小滴封入体に基づき確認できる。

三次元間質系中における膵臓豚房細胞の培養により培養中の細胞の生存が延長さ れる筈である。

１１、実施例：三次元骨髄培養系 以下のサブセクションは、三次元培養系がヒト、ヒト以外の霊長類（マカークザ ル）およびラットに対する長期間骨髄培養物の確立に使用できることを示す。

三次元培養物は走査型電子顕微鏡により評価され、そして、細胞性含量は多くの 方法により評価した。前駆細胞含量はＣＰＵ−ＣおよびＢＦＵ−Ｈにより、そし て細胞性含量は種々の造血細胞系に特異的な標識モノクーロナル抗体を使用する 種々の計測およびサイトフルオログラフィー分析により評価した。

この結果は、ヒト、マカークザルおよびラット細胞の非付着および付着ゾーンの 分画計測により証明されるように、三次元培養系により数種の血液学的系統の発 現が支持されることを示している。三次元間質すなわち付着ゾーンに付着した細 胞のサイトフルオログラフィー分析により、初期および後期の骨髄性前駆体、成 熟顆粒球、ＢおよびＴリンパ球、巨核球／血小板および単球／マクロファージの 存在が明らかにされた。

マトリックス中に存在する前駆細胞の数は変動性であるが、これは支持マトリッ クスを形成するのに用いられた間質細胞のランダムな集団から生じた可能性があ る。　造血は、増殖と関連する活性および支持細胞により生成された因子の如何 による可能性があるから、三次元培養物は間質細胞の集密単層をも含有するフラ スコ中で成長させた。三次元培養系における造血細胞および間質細胞両者の抑制 は集密間質細胞の存在下で観察された；すなわち、フラスコ内の間質細胞の集密 単層は、三次元培養系を［シャットアウトＪすると思われる。三次元培養物を新 しいフラスコに移すと、造血が回復することが観察された。この結果は、間質細 胞産物が造血細胞ばかりでなく、他の間質性要素にも影響することを示唆してい る。

以下のサブセクションにおいては、方法、結果およびデータをより詳細に記載す る。

１１．１．骨髄試料の調製 １１、１．１．　ヒト骨髄 告知と同意後の血液学的に正常な成人志願者の背部腸骨稜上の複数部位から骨髄 を吸引した。標本はヘパリン添加管に集め、そして１０％ＦＢＳおよび５〜ｌＯ ％ＨＳで馴化し、ヒドロコルチゾン、フンギゾーン（ｆｕｎｇｉｚ。

ｎｅ）およびストレプトマイシンを補充したＲＰＭ１１６４０培地８ｍｌ中に培 地８廿ｌ中細胞塊をばらばらにさせるに５Ｘ１０’核形成細胞ずつに分割した。

１１．１．２．非ヒト霊長類骨髄 無傷のジノモルゲス　マカークの大腿骨をＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ霊長類セン ター（Ｐｏｒｔｅｒ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＮＹ）から購入した。大腿骨の 置端を無菌条件下で骨幹から分離した。赤色様をとり出し、培地中に懸濁させ、 モして５Ｘ１０’核形成細胞ずつに分割した。

１１、１．３．ラット骨髄 成体雄Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（２２５−４００ｇ）をエーテルで麻酔し、 その大腿骨をとり出した後、ヘパリン添加注射器を用いて腹部大動脈から放血さ せた。大腿骨を分割し、骨髄内容物を１０％ＦＢＳおよび１０％Ｈ３で馴化しヒ ドロコルチゾン、フンギゾーン、ヘパリンおよび抗生物質を補充したＦｉｓｅｈ ｅｒ培地（Ｇｉｂｅｏ、　ＮＹ）３ｍｌを含有する滅菌ベトリ皿にかき集めた（ Ｎａｕｇｈｔｏｎら、１９８７゜Ｊ、　Ｍｅｄ、　１８：２１９−２５０）。５ 〜７Ｘ１０”細胞ずつが調製された。

１１．２．三次元間質マトリックスの確立以下の実施例において記載するすべて のＬＴＢＭＣを支枝するための鋳型として、ナイロン濾過スクリーン（＃３−２ １０／３６．　Ｔｅｔｋｏ　Ｉｎｃ、　ＮＹ）を使用した。このスクリーンは、 直径９０μｍの繊維からなり、２１０μｍの篩開口部を有するスフウェア織りパ ターンに組み立てられた繊維から成っていた。間質細胞は以下のサブセクション 記載のプロトコルを用いて接種した。間質要素の付着およびその後の増殖は倒立 位相差顕微鏡および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して監視した。

１１．２．１．　ヒトのＬＴＢＭＣのためのスクリーンの調製および間質細胞の 接種 ８　ｍｍ　Ｘ　４５ｍｍのスクリーン片を０．１Ｍ酢酸中に３０分間浸漬しそし て支持細胞の付着を高めるために１０ｍＭポリリジン懸濁液で１時間処理した。

これらを滅菌ペトリ皿に入れ、５×１０″個のヒト骨髄細胞又は同数のヒト胎児 繊維芽細胞（＃ＧＭ　１３８０．　Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｎ Ｙ）を接種した。ヒト胎児繊維芽細胞は１０％ＦＢＳ、　５〜１０％Ｈ３で馴化 し、ヒドロコーチシン、フンギゾーンおよびストレプトマイシンを補添したＲＰ Ｍ１１５４０培地を用い、３５℃、５％Ｃ０２、および９０％を越える相対湿度 で単層に集密化するまで増殖させた。これらの細胞をコラゲナーゼ（１０℃ｇ／ ｍｌで１５分間）を用いて上に上げそしてスクリーン上に移した。５％ＣＯ□で １〜２時間インキュベーション後、スクリーンをコーニング２５ｃｏｆ培養フラ スコに入れ、そしてさらに５ｃｃの培地を用いて浮遊させた。骨髄間質細胞が接 種されたスクリーンを同様の方法で移した。

１１．２．２．非ヒト霊長類ＬＴＢＭＣのためのスクリーンの調製および間質細 胞の接種 ２個のマトリックスをサルの細胞のＬＴＢＭＣに使用した＝（上述のとおりの） ヒト胎児繊維芽細胞を接種したナイロンメツシュおよびジノモルゲス　マカーク からの５Ｘ１０”個の大腿骨髄細胞を接種したナイロンメツシュ。培養条件およ びスクリーン前処理プロトコルは上述したヒト培養物について用いられたと同一 であった。

１１．２．３．ラットＬＴＢＭＣのためのスクリーンの調製および間質細胞の接 種 ８　ｍｍＸ　４５ｍｍのナイロンスクリーン片を０．１Ｍ酢酸に３０分間浸漬し そして可溶化した■型マウスコラーゲン（ＧＩＢＣＯｔａｂｓ、　ＮＹ）を用い て１〜２時間被覆した。コノスクリーンに５−７Ｘ１０＠個のＬｏｎｇ−Ｅｖａ ｎｓラット大腿骨髄細胞を接種し、３３°Ｃ，５％ＣＯ２で１−２時間インキュ ベーション後にこのメツシュを２５ａＩｆ培養フラスコに移した。スクリーンを 浮遊させるために、５ｍｌの培地を添加した。

１１．３．三次元間質基質への造血細胞の接種および培養の確立 約７０％のメツシュ開口部が支持細胞により架橋されたところで（ラット間質で は１０−１４日、ヒト又はサル間質では７−１３日、そしてヒト胎児繊維芽細胞 では４〜７日）、スクリーンを無菌ペトリ皿に移しそして５×１０６個のヒト又 はサルの核形成した骨髄細胞又は２〜５Ｘ１０’個のラット大腿骨髄細胞をそれ ぞれ接種した。５％ＣＯ□中で２時間インキュベーション後、各スクリーンを５ ｍｌの培地を添加した２５ｒｄコーニングフラスコ中で穏やかに浮遊させた。培 養物には、消費した培地を新しい培地で代えることにより５日毎に供給した。培 養容器を容器の壁面上の細胞単層の出現について検査した。かかる単層が２５％ 以上の集密度で存在した場合には、三次元培養物を新しいフラスコに移した。

１１．４．三次元骨髄培養物の評価 骨髄細胞の増殖および三次元培養物の細胞含量を分画計測、ＣＦＵ−ＣおよびＢ ＦＵ−Ｅ分析、および以下に記載するサイトフルオログラフィー分析により組織 学的にアッセイした。

１１、４．１．組織学的評価 電子顕微鏡による検査には、培養物を間質細胞の第１回の接種および造血細胞の 第２回の接種に続いて種々の間隔で殺した。簡単にいうと、ナイロンスクリーン を約４個の等しい部分に切り、３％グルタルアルデヒドリン酸塩緩衝液中で固定 し、洗浄し、アセトン中で脱水しそしてＤｅｎｔｏｎ　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｐｏ １ｎｔ　Ｄｒｙｅｒ中に置いた。いくつかの場合には、間質層を物理的に破壊さ せて下部に存在する細胞の増殖を可視化した（Ｎａｕｇｈｔｏｎら、１９８７． 　Ｊ、　Ｍｅｄ、　１８：２１９−２５０）　、標本を６０％金および４０％白 金で被覆しそしてＡｍｒａｙ　ＳＥＭで検査した。

三次元ＬＴＢＭＣにおけるヒトおよびマカークザル細胞の増殖パターンはラット 骨髄についてのそれと同様であった。要約すると、間質細胞（骨髄由来又は胎児 ヒト繊維芽細胞のいずれかは線状に増殖しそしてメツシュの開口部にまたがり始 める前に各ナイロン繊維を包囲した（図１）。第２の接種の造血（および間質） 細胞は３．６ｄメツシュ開口部の少くとも７０％に存在する間質細胞プロセスに より形成される自然の間隙中に接種する（図２）。造血細胞はナイロンには直接 に結合しないで、むしろ支持細胞が付着した領域に結合すると思われた。造血細 胞の第２回接種の後３〜６日で全ての培養物においてコロニー形成が明白であっ た。

２１０μｍの篩により赤血球性、骨髄性およびその他のコロニーの発現にとって 十分な領域が提供された（図２）。

造血はナイロンスクリーンＬＴＢＭＣの外側表面上で観察されたが、生成中の支 持細胞の間隙において最も広範であった。

１１．４．２．三次元ＬＴＢＭＣの使用済培地の全細胞計測及びサイトスピン（ ｅｙｔｏｓｐｉｎ）分析全細胞計測およびす・ｒトスビン調製物は培養物が供給 された場合に（５日毎に）取り出された使用済みの培地を用いてなされた。細胞 計測は球計計数法を用いて実施された。サイトスピンはＷｒｉｇｈｔ’　ｓ−Ｇ ｉｅｍｓａを用いて染色されそして分画計測はランダム視野で実施した。各供給 後に調製されたサイトスピンスライドの分析から、ヒトおよびサルの培養物にお いて赤血球性、骨髄性およびリンパ球性系統の後期前駆体の存在が明らかになっ た（表Ｉ［）。細胞型の相対的パーセントは変動するが、これらは試験した各標 本の培養期間中（ラットで３９週、霊長類では１２．５週）存続した。ヒトの培 養物の非付着ゾーンに放出されたマクロファージ／単球／繊維芽細胞は、骨髄細 胞を主に犠牲にして、時間とともに増加した（表■）。

（本頁以下余白） 表■ １２　３５．４　６．０　６．９　３９．２　１２．５＊結果は３−５の培養物 の平均を反映。各培養物は３．６２のナイロンスクリーン１個を含有した。

ＭＹ＝骨髄性、Ｅ＝赤血球性、Ｌ＝リンパ球性、ＭＡＣ／ＳＴＲ＝マクロファー ジ、単球および繊維芽細胞、その他＝巨大核細胞、未確認芽細胞。

ＮＤ＝測定せず １１．４．３．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンの全細胞計測およびサイトスピン 分析 付着ゾーンの細胞計測はコラゲナーゼおよびトリプシンのｌ：ｌ混合物（１０μ ｇ／ｍｌ）でスクリーンを処理しそして穏やかな超音波処理によりＬＴＢＭＣの 種々の間隔で実施した。ヒトおよびシノモルグスマカークＬＴＯＭＣの付着ゾー ンにおけるかかる分析により、造血細胞に対する間質細胞の相対的パーセントが 培養物中に時間とともに増加することが明らかになった（表■）。

特に、造血細胞コロニー形成が進行するにつれて、間質要素の相対的パーセント が低下した。しかしながら、ＬＴＢＭＣの後期における間質細胞の増殖は造血を 犠牲にして起る。

（本頁以下余白） 表■ １２　７４．７　２．９　１７．４　５．０１２　６５．３　４．２　２１．９ 　８．６付着ゾーンの細胞は酵素処理により非凝集化した。間゛　質には、繊維 芽細胞、マクｌ’、、−１：’、７アージ、含脂肪細胞様細胞、内皮が包含さＡ ）る：Ｅ′；、赤ＩｉＩ′１球性−ＭＹ−骨髄性；その他＝リンパ球性、血栓性 、未確認芽細胞。

ＮＤ−未測定。

細胞増殖は数週間の培養後定常状態に達した；　ＬＴＢＭＣを週毎に検査すると 、付着および非付着ゾーンにおいて同様の数の細胞が見い出された（図３）。培 養後、最初の１〜２週の非付着ゾーンにおける細胞数は、幾分間違っていた。我 々の実験において、培養初期の段階で培地中に出現する細胞の多くは、マトリッ クスに以前はゆるやかに結合していた。これらは容易に脱着して、非付着ゾーン に人工的に高い細胞数を生じる。

同様に、相対的に低い接種効率のゆえに、たとえ、接種容量が５Ｘ１０”細胞で あっても５Ｘ１０’から１０＠のみの細胞しか当初はメツシュに付着しない。こ れは、培養の第１週の間のメツシュ上で生ずる細胞増殖の２〜３倍を「隠してい る」。

１１．４．４．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンのＣＦＵ−ＣおよびＢＦトＥ含量 ラットＬＴＢＭＣの付着ゾーンのＣＦＵ−Ｃ含量はＢｒａｄｌｅｙおよびＭｅｔ ｃｌａｆの方法（１９６６、Ａｕ５ｔｒ、　Ｊ、　Ｅｘｐｔｌ、　Ｂｉ。

１、Ｍｅｄ、　Ｓｅｉ、　４４：２８７−３００）の改変を用いて測定した。

簡単に言うと、３７℃、７−７．５％ＣＯｚで４Ｘ１０’細胞Ｘｔ、：塗布しイ ンキｊべ−ｌ−シた９、Ｘ１７゛ゴボウ　゛イ、ｆトジエンンット牌臘細胞馴化 培地をラッｌ＝　ＣＦＩＪ−Ｃのための二ゴロニ・−刺激活性（Ｃ３Ａ）源とし ２て使用し、ＣＦ［Ｊ−ｃは培養１４日後に計測した。ヒトのＣＦＵ−Ｃは、２ ０％ＦＢＳと補添したイスコープ改良ダルベツコ培地中に１０６個の核形成細胞 ／ｍｌずつ入れ、そして０．５％寒天中の１０”　ＰＢＬ層上に塗布することに より測定した（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９８１、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、６８：　９３２）。塗布後（３７℃、７％００２）　、７日および１４日日 日コロニーを数えた。ヒトＢＦＵ−Ｅは、３０％ＦＢＳ、１％ウシ血清アルブミ ン、ｌｏ−４Ｍメルカプトエタノール、２．５〜５１．Ｌ１．／ｍｌの部分精製 ヒト尿エリスロボエチン（Ｎａｕｇｈｔｏｎら、１９８５．　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、 　０ｎｃｏ１．３０　：　１８４−１９７）および４．５％フィトヘマグルチニ ン−刺激ヒト白血球馴化培地（Ｃａｓｈｍａｎら、１９８３゜Ｂｌｏｏｄ、　６ １：８７６−８８４）を含有するイスコープ培地中の０．８％メチルセルロース 中で、ＬＴＢＭＣの種々の間隔後アッセイした。

初期接種物中に存在するものに比較してかなりの数のＣＦＵ−Ｃがラットおよび ヒトＩ、ＴＢＭＣの付着ゾーンから回収された（図４）。予備的な知見では、ヒ トのＬＴＢＭＣにもＢＦＵ−Ｅが存続することが示される（表■）。

（本頁以下余白） 表■ ＬＴＢＭＣの種々の間隔における付着ゾーン中のＢＦＵ−Ｅ非培養骨髄　１９± ６ １０　８±３ ＊　１０’個細胞当たりのコロニー＝３〜４プレートの平均±ＳＥＭ １１．４．５．三次元ＬＴＢＭＣの付着ゾーンの細胞含量のサイトフルオログラ フィー分析 ＥＰＩＣＳシステム（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｈｉａｌｅ ａｈ。

Ｆｌａ）を使用して、ヒトおよびサルＬＴＢＭＣの付着ゾーンの細胞含量のサイ トフルオログラフィー分析を実施した。造血細胞の接種後コラゲナーゼおよびト リプシンを使用し、続いて十分に洗浄することにより種々の間隔で細胞をナイロ ンスクリーンから分離した。次いで、Ｃａ−又はＭｇ−を含有するハンクス平衡 塩類溶液中にて細胞を４５〜６０分間インキュベートした。これらはフルオレセ インイソチオシアネー）−（ＦＩＴＣ）に接合した以下のモノクローナル抗体： 　Ｍｏ−１，Ｔ−３，Ｂ−１，Ｐｉｔ−１，およびＭＹ−９と反応させた（Ｃｏ ｕｌｔｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｏｇｙ、　Ｆｌａ）。

マウス１ｇＭ−Ｆｉｒｅ−処理細胞を対照として使用した。選別ウィンドー（ｓ ｏｒｔｉｎｇ　ｗｉｎｄｏｗｓ）はケイ光と光散乱ヒストグラムに基づき選択し た。０．２５５ウインドーが適切にゲート制御され、細胞のプロフィールが測定 された。

２．７および１０．５週でヒト培養物の付着ゾーンをサイトフルオログラフィー 分析することにより初期（ＭＹ−９）および後期（Ｍｏ−１）骨髄様細胞、Ｂ（ Ｂ−１）およびＴ（Ｔ−３）リンパ球、巨大核細胞／血小板（Ｐｉｔ−１）　、 および単球／マクロファージ（Ｍｏ−１）の存在が確認された（表Ｖ）。

（本頁以下余白） 表Ｖ モノクローナル抗体と非培養骨髄および三次元ＬＴＢＭＣＢ−１１０，２０±１ ．４３　６．７６±０．９８　２２．７３±１．３７　１１．９６±１．１３Ｔ −３１，８，６４±１．８８　１１．１８±１．８６　１３．０１±１．８４　 ９．９０±０．６４Ｐｉｔ（４，４０±１．３３　８．０８±０．９２　１７． ０５±４．１０　８．７２±１．８３Ｍｏ−１１０，１０＋１．０４　１７．２ ６±２．２９　２０．９８±１．１４　３゜４６±０．２５八（ｙ−９３，９８ ±０．２６　３．７０±０．６８　３．４６±０．２５　１．４６±０．５４Ｂ −１３１，０１８，３７±０゜９９ Ｔ−３１８，１３−１１，５６±２．１ＰＩ　ｔ−１４６，５０８，５３±１． ０９Ｍｏ−１４０，８７２６，６４±２．２５Ｍｙ−９２１，６４５゜４９±ｏ 、８３ａ平均パ一セント反応性は、マウス−ＩｇＭ−ＦＩＴＣ対照による非特異 的標識化を引き算することにより計算された。

Ｍａｂ＝モノクローナル抗体。

ｂ結果は、４〜５培養物からのデータを反映している（±Ｉ　ＳＥ）。

記載した時間は組織特異的細胞の接種以降のものである。

Ｃヒト胎児繊維芽細胞上に接種された２個の培養物の平均。

ヒトおよびサルのＬＴＢＭＣはヒト胎児繊維芽細胞層上には確立できたが、この マトリックスはラットＬＴＢＭＣの増殖は支持しないだろう。胎児繊維芽細胞は 亜集密の段階に到達し、これはその後の骨髄細胞の接種を骨髄間質よりずっと速 やかに行えるものとなすであろう。

マカークザルの骨髄を胎児繊維芽細胞の床上で増殖させると、付着ゾーンの表現 型プロフィールは、我々の検討した他の培養物よりも多くの細胞がＰＩ　ｔ−１ 抗体と反応するが、他の血液学的系統も表わされることを示している（表Ｖ）。

この所見がどの程度抗体の交差反応性を反映しているか、又は胎児細胞により媒 介される付着ゾーンの細胞集団のシフトを反映しているかはわからない。

Ｉｌ、　４．６．三次元培養物における細胞増殖に及ぼす集密的な間質細胞単層 の効果 Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット又はジノモルゲス　マカークからの大腿骨髄細胞を 、Ｂｏｓｗｅｌｌおよびその共同研究者により記載されたようにして充填Ｆｅｎ ｗａｌウールカラムを通して注いだ（Ｂｏｓｗｅｌｌら、１９８７．　Ｅｘｐｔ ｌ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　１５：　４６−５３）。簡単に述べると、１０７〜１ ０１個の大腿骨髄細胞を４ｍｌの培地中に入れ、培地中３７°Ｃで４５分間予備 インキュベートしたナイロンウールカラムに注いだ。さらに４５分間インキュベ ーションした後、非付着細胞を排出させ、付着細胞は十分な洗浄およびＥＤＴＡ −Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液（１：５０００食塩水中、ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ ｌａｎｄ、　ＮＹ）での溶出によりとり出した。約１０７個の細胞を並行して２ ５ｃｎｆフラスコ中に接種し、５０％および１００％集密となるまで増殖させた 。第２の接種後の時間に関して標準化された予め確立されたナイロンスクリーン ＬＴＢＭＣを各フラスコ中に挿入した。ナイロンスクリーンＬＴＢＭＣ上で増殖 させ、単層を穎微鏡的に観察した。細胞の計測と非付着ゾーンのサイトスピンを ５日毎に実施した。

酵素解離された付着細胞のサイトスピン調製物の分画計測は、ナイロンスクリー ンＬＴＢＭＣの挿入５日後に実施された。

集密間質細胞単層をナイロンスクリーンＬＴＢＭＣとともに培養すると、付着間 質のない（ｐは０．０５以下）又は約５０％集密で間質細胞（ｐは０．０５以下 ）を有するフラスコ内で懸濁されたＬＴＢＭＣに比較して、懸濁培養物上におけ る造血および間質細胞の両方の増殖が抑制された（表■）。加えて、集密間質単 層との共培養により、メツシュ関連間質細胞の脱着および非付着ゾーンへの放出 が引き起こされる。造血コロニーは癒着して増殖を止める。ＬＴＢＭＣを新しい フラスコに移すと、３〜５日で造血の回復がみられる。

（本頁以下余白） 表■ ラットの懸濁ナイロンスクリーンＬＴＢＭＣ中での細胞増殖に及ぼす約５０％お よび１００％集密での間質単層の効果 間質細胞ｅ　７　０±２．５　−１３．５±４．７１５　＋３．３±２．０　− １８．０±５．１２８　＋１．７±０．９　−２４．３±４．０造血細胞’　７ 　−１．０±４．１　−１７．３±３．２１５　＋６．３±３．４　−３０．８ ±　７．７２８　＋２．７±１．９　−４９．９±１０．２ａ結果は、フラスコ 底部に付着細胞の存在しない状態で増殖したＬＴＢＭＣに比較したときの平均パ ーセント差異（＋／−）±Ｉ　ＳＥＭとして表わされる。

ナイロンスクリーン骨髄培養物は第２の接種（造血細胞の）の後２週間口に検査 した。

ｂ約５０％又は１００％集密のいずれかにおける付着細胞含有フラスコ中へのナ イロンスクリーンＬＴＢＭＣ導入後の時間。

Ｃ繊維芽細胞、マクロファージ、含脂肪様細胞、内皮を含む。

ｄ芽細胞およびすべての系統の後期前駆体を含む。

゛１２．実施例二三次元皮膚培養系 以下のサブセクションはインビトロで皮膚を培養するための本発明の三次元培養 系を記載する。簡単に言うと、繊維芽細胞の培養物を予め滅菌されたナイロンメ ツシュ上に確立した。接種して６〜９日で、付着繊維芽細胞は増殖開始して網様 開口となり、平行的なコラーゲンの束を沈着させた。モノクローナル抗体を使用 した間接的免疫蛍光では幾分かの■型もあるが主に■型のコラーゲンが示された 。７日後に、ヒトのメラニン細胞と表皮ケラチン細胞の共培養物を繊維芽細胞の 網上に置いた。付着層の亜集密的な繊維芽細胞により栄養因子が生成されるゆえ 、ＴＰＡおよびコレラトキシンは添加しなかった。電子顕微鏡検査によれば正常 な形態学的特徴および細胞−細胞付着を有する皮膚細胞が示された。

１２．１．三次元間質の確立 皮膚の繊維芽細胞は、皮膚組織を細断し、２時間トリプシン処理を行ない、物理 的手段により懸濁物中に細胞を分離することにより単離した。繊維芽細胞は２５ ｄのファルコン組織培養血中で集密になる迄増殖させ、１０％のウシ胎児血清（ ＦＢＳ）、フンギゾーン、ゲッタマイシンおよびペニシリン／ストレプトマイシ ンを補添したＲＰＭ１１６４０（Ｓｉｇｍａ、　ＭＯ）を供給した。繊維芽細胞 を緩和なトリプシン処理により持上げ、そして細胞を直径約９０ｕｍで、２１０ μｍのメツシュ開口部を存するスフウェア織りに組み立てられた繊維から成るナ イロン濾過メツシュ上に置いた（Ｔｅｔｋｏ、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ）。メツシュ は緩和な酸洗浄により前処理しそしてポリリジンおよびＦＢＳ中でインキュベー トした。繊維芽細胞の付着は３時間以内にみられ、繊維芽細胞は最初の接種後５ 〜７日以内にメツシュの開口部を横断して伸び始めた。

これらの繊維芽細胞は代謝的に活性であり、細胞外マトリックスを分泌しそして 活性な繊維芽細胞とコラーゲンから成る皮膚均等物を迅速に形成した。図１は繊 維芽細胞の付着およびメツシュ開口部を横断する細胞過程の伸展を示す走査電子 顕微鏡写真である。

１２．２．　メラニン細胞と表皮ケラチン細胞の接種メラニン細胞は（Ｅｉｓｉ ｎｇｅｒおよびＭａｒｋｏＸ１９８２．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：２０１８−２０２２）の方 法にしたがって単離した。要約すれば、皮膚試料をトリプシン中４〜６時間イン キュベートし、表皮および皮膚層を分離させた。表皮細胞を培地中に懸濁させ２ ５ｃｏｆのＦａｌｃｏｎ組織培養フラスコ中に入れた。メラニン細胞は選択的付 着特性により表皮ケラチン細胞から分離された。単離されたメラニン細胞は繊維 芽細胞で被覆されたナイロンメツシュ上に置き、３日間増殖させたのちのち表皮 ケラチン細胞を添加した。メラニン細胞はこの系中では樹状突起の形成を示し、 染色されたままでありそして色素を表皮ケラチン細胞に移す能力を保持している という点で正常に増殖した。図６は三次元培養系においで３日後にメラニン細胞 が出現することを示している。単離された表皮ケラチン細胞を３〜４Ｂ後にメラ ニン細胞上に塗布した。この「組織」は急速に増殖し、ＲＰＭＩ　１６４０．１ ０％ＦＢＳおよび適当な抗生物質中で維持された。天然の増殖因子が皮膚要素か ら分泌されるから、外因性ファクター（例えばＴＰＡ、コレラトキシン等、Ｓｅ ｎｇｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 ５ｋｉｎ。

第１巻、ｐ１０２〜１３１．０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、 およびＥｉｓｉｎｇｅｒら、１９８８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８５：１９３７−１９４１）の添加は必要でない。

１２、３．皮膚培養物の組織学的分析 皮膚培養物を次の手順により、光学顕微鏡により組織学的に評価した：すべての 組織を２．５％緩衝グルタルアルデヒド中で固定し、エタノール中で脱水しキシ レン中で清浄にしたのちパラフィンで包埋した。切片は６〜８μｍの厚さに切断 され、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、正常な形態学的特性であるか、変わ っているかについて検査した。

この皮膚モデルの横断面が図７および８の写真に示されている。正常な細胞の方 向性および形態が明らかである。表皮および皮膚成分は完全にメツシュ繊維を包 囲しそして明白な皮膚−表皮の接合がみられる（図７）。表皮ケラチン細胞は正 常な形態を示し、色素顆粒を含有し、角質層の形成の証拠を伴った細胞の成熟が みられる（図８）。

１２、４．インビボでの三次元皮膚培養物の移植ラットでの我々の移植研究では 、この三次元系が拒絶反応を伴うことなく、皮膚および表皮成分の速やかな合体 を可能とすることが示されている。

皮膚移植研究には２４匹のラットを使用した。メツシュを６ｍｍの環状片に切断 し、オートクレーブ処理し、緩和な酸で処理し、コラーゲン■型とインキュベー トし、ウシ胎児血清とインキュベートし、そして第２の表皮ケラチン細胞の接種 を行うか又は行うことなく間質細胞を接種した。皮膚および／又は表皮細胞成分 で被覆されたメツシュを創傷部位に縫合し、１２〜２４時間毎に次のようにして 綿密に検査した。すなわちラットを軽くエーテル麻酔し、そしてその背部表面を そり、ベタジン溶液で洗浄した。使い捨てＢａｋｅｒバンチバイオプシー針で４ 個の６ｍｍパンチをあけ、そして移植したメツシュを適所に保持するためにサブ クチクラ縫合を用いた。

ラットは手術後１２時時間群細に検査し、その後、２４時間毎に監視した。

メツシュの移植領域は何ら紅斑、腫脹、滲出物又はもろさの徴候を示さなかった 。メツシュを移植７日、１４日および２１日後にとり出した。これらの移植の結 果を図９および１０に示す。すべての皮膚細胞は移植７日後に示されいてる（図 ９）。図１０は、表皮ケラチン細胞（２）、繊維芽細胞げ）、コラーゲン（Ｃ） 、含脂肪細胞（ａ）、および平滑筋細胞（Ｓ）を示しており、すべてナイロンメ ツシュ繊維…の周囲に天然の配置で整列されている。

メツシュへの細胞の強い自然の付着に伴ったリンパ球および他の免疫成分が存在 しないことは、インビボにおいて何ら拒絶反応が生じないことを示している。

皮膚および表皮成分を有するメツシュを１０ｍｍＸ　１０ｍｍの皮膚バイオプシ ー中に移植し、次いでこれを１４日間培養状態に維持しそして組織学的に検査す るという平行実験を実施した。これらインビトロ移植においても同様の細胞移動 、付着および分化パターンが観察された。これ迄の移植研究は、我々の三次元マ トリックス系が全ての細胞成分が活性化され、天然の増殖因子が生産されるとい う真の生理学的系であるという仮説の実証を助けるものである。

本発明を特定の態様に言及して詳細に記述するが、上述の記載および以下の請求 の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく変更が可能であることは 理解されよう。

１３、実施例二三次元肝臓培養系 １３．１．材料および方法 １３．１．１．麻酔 約３００ｇの体重の生体Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットに、０．３ｍｌの注射用ベ ントパルビタールナトリウムを腹腔内注射した。

１３．１．２．切開 十分な麻酔を確保するために、鋭利なピンセットで動物をつまんだ。剣状突起と 成膜部領域の間で中心線切開を行ない、次いでさらに切開して腹腔への導入を可 能とするフラップを作った。腸および他の臓器を動物の右側に押し込んで肝臓間 静脈を露出させた。肝臓の門静脈を切開によりさらに露出させ、カテーテルの置 かれる場所から遠位にある肝臓間静脈の周辺で４．０縫合糸を結んだ。第２の縫 合はカテーテルの置かれる場所に近位の肝臓間静脈の周辺で行なった。２１ゲー ジの針で小さな切目を肝臓間静脈に設けた。螺動ポンプをオンにし、５００ｍ１ のＨＥＰＥＳ緩衝液（４，１，ｇ　ＮａＣ１，０，２５ｇ　ＫＣＩ、　３ｍｌの Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨおよび１０ｍ１の０゜２４％Ｗ／Ｖ　ＨＥＰＥＳ貯蔵液含有の 注入を始めた：その直後に、工大静脈を切断して緩衝液を逃がした。注入が完了 した後、ポンプを閉じ、肝臓を静かにブフナーロートにとり出し、次いでコラゲ ナーゼ溶液（１００ｃｅ中０．４ｇ　ＮａＣ１，０，０５ｇＫＣＰ、　１０ｍ１ 　ＨＥＰＥＳ貯蔵液（上述）、０．０７ｇ　ＣａＣ１ｚ　２Ｈ２０゜６．６ｍｌ のＩＭ　Ｎａ１ｌ（、５０ｍｇ　：］ラゲナーゼ、ｐＨを７．６にし、３７°Ｃ にした）で潅流した。潅流を１５〜２０分間続けた。

ブフナーロートの内容物を濾過し、肝臓をとり出し、そして１．５％（Ｗ／Ｖ） 　ＢＳＡを含有するコラゲナーゼ溶液中に入れた。

１３、１．３．細胞溶液の調製 潅流した肝臓の葉を分離し、その外側実質を切りとった。次に内側実質を生理的 Ｃａ”＋およびＭｇ＋＋を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で細断 した。大きな肝組織片を沈降させ、細胞懸濁物をパーコール勾配（５ｍｌのＤＭ ＥＭに０．５１μ／ｍｌのインスリン、０．００７ｍｇ／ｍｌのグルカゴンおよ び２０パーセントのウシ胎児血清を加えた）を通して遠心し５０ｍ１の円錐形の 遠沈管中に入れ、ＨＢＳＳプラス生理的Ｃａ”＋およびＭｇ−を５０ｍ１マーク まで添加し、８００ｇで１０分間遠心することによりＨＢＳＳの頂部に５ｍｌの パーコール作業溶液〔７０％の貯蔵パーコールプラス３０％ ＰＢＳ　；　貯！パーコールは９部のパーコールと１部の１０倍濃縮ダルベツコ 培地から成る〕を積層させた。肝実質細胞を勾配の底部から集め、亜集密間質含 有三次元メツシュ培養物に添加した。

１３、１．４．三次元間質マトリックスの調製８　ｍｍＸ　４５ｍｍ片のナイロ ン濾過スクリーン（＃３−２１０／３６、　Ｔｅｔｋｏ、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ） を０．１モル酢酸中に３０分間浸し、１０ｍＭポリリジン懸濁液で１時間処理し た。メツシュを無菌ペトリ皿に入れ、ラットの肝臓からＤＭＥＭ完全培完全−地 中したｌＸｌ０”個の繊維芽細胞を接種した。５％ＣＯ□で１〜２時間インキュ ベーション後、スクリーンをコーニング２５ａ１組織培養フラスコ中に入れ、更 に５ｍｌの培地を加えて浮遊させ。３日間隔で供給することにより亜集密化に到 達させた。

１３、１．５．三次元肝臓組織培養物の維持肝実質細胞を三次元間質マトリック スに接種した後、培養物を加湿した雰囲気中３７°Ｃ，５％ＣＯ２でＤＭＥＭ完 全培完全−地中し、三日毎に新鮮な培地を供給した。

１３．２．結果および考察 このようにして培養された成体肝細胞は活発な有糸分裂を示し、３週間にわたっ てタンパク質を分泌し続けた。肝細胞は細胞の索に向けてそれ自体配向しく図１ １）、そして、三次元培養の最初の１０〜１２日間は胚芽細胞または再生肝細胞 に似ていた（図１２）。培養物が高度に集密となると、実質細胞が胆管細胞、Ｋ ｕｐｆ　ｔｅｒ細胞および他の肝間質細胞が依然として存在している成熟した成 体肝細胞に似始めた。細胞は培養の最初の１０〜１２日間、約１２時間毎に分裂 し、３週間まで７２時間毎に分裂を続けた。アルブミンの分泌は３週間の培養期 間に亘って続き、そして肝細胞はその活性化された酵素を保持し、それによりイ ンビトロで生成物を代謝することができた。培養物が完全な集密に到達した後は 、これは１２週間迄生存能ある基質として維持できた。

１４．実施例二三次元粘膜上皮組織培養系１４、１．材料および方法 １４、１．１．粘膜上皮細胞の調製 口腔粘膜組織試料を歯科矯正外科標本より入手した。

組織は、抗生物質（ＭＥＭ　１００ｍ１当り抗生抗真菌溶液、ＧＩＢＣＯカラ入 手、Ｃａｔ、　＃６００−５２４０ＡＧを２　ｍｌ　；　ＧＩＢＣＯＣａｔ。

＃６００−５７１０ＡＤからのゲンタマイシン溶液０．０１ｍ１）を含有する新 鮮なＭＥＭで３回洗い、小片に切断し、次いで、０．０２％ＥＤＴＡ（Ｗ／Ｖ） で洗った。Ｃａ”＋もＭｇ”＋も含有しないＰＢＳ中の０．２５％トリプシンを 添加した；２〜３秒後、組織片をとり出し、（Ｃａ４４もＭｇ＋＋も含有しない ＰＢＳ中の）新鮮な０．２５％トリプシン中に入れ、４°Ｃに一晩冷蔵した。組 織をとり出して新鮮なトリプシン溶液中に入れ、細胞が単離細胞浮遊液を形成し たようにみえるまで穏やかに攪拌した。単離細胞浮遊液を１０％熱不活化ウシ胎 児血清を含有するＭＥＭ中に希釈し、１４００ｇで７分間遠心した。上清をデカ ンテーションし、粘膜上皮細胞を含有するベレットを接種培地中に入れた。培地 は２％のｕｌｔｒｏｓｅｎ　Ｇ、１　ｘＬ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、 ペニシリンおよびストレプトマイシンから構成された。細胞を次に三次元間質マ トリックス（後述）上に接種した。

１４、１．２．三次元間質マトリックスの調製粘膜上皮培養物に使用される三次 元間質マトリックスは口腔の繊維芽細胞および８　ｍｍ　Ｘ　４５ｍｍ片のナイ ロン濾過スクリーン（＃３−２１０／３６．　Ｔｅｔｋｏ　Ｉｎｃ、　ＮＹ）を 用い１３、１．４セクシヨンの三次元肝培養物において既述したようにして生成 された。

１４．１．３．三次元粘膜上皮組織培養物の維持粘膜上皮細胞を三次元間質マト リックス上に接種した後、培養物を加湿した雰囲気中、３７°Ｃ，５％ＣＯ，に て、ＤＭＥＭ完全培地中に維持し、３日毎に新鮮な培地を供給した。

１４．２．結果および考察 図１３は、上述の方法により生成された三次元粘膜上皮組織培養物の横断面の顕 微鏡写真である。組織培養物は、インビボで口腔粘膜の層状になったうろこ状の 上皮を発生反復することが見い出された：細胞が培養物の表面に接近すると、核 は扁平になり、インビボで生じるような、表面に平行な平面に配向することに注 目すべきである。

１５、実施例二三次元膵臓組織培養系 １５、１．材料および方法 １５、１．１．膵臓豚房細胞の調製 膵臓線層細胞は、ＲｕｏｆｆおよびＨａｙ、　（１９７９，Ｃｅ１ｌＴｉｓｓｕ ｅ　Ｒｅｓ、　２０４：２４３−２５２）およびＨａｙ（１９７９，”Ｍｅｔｈ ｏｄｏ−１ｏｇｉｃａｌ　５ｕｒｖｅｙｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ” 第８巻、Ｃｅ１ｌＰｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ”　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｌｌｉｓ　Ｈ ｏｒｎｗｏｏｄ、　Ｌｔｄ、第１４３−１６０頁）に記載された方法を応用して 調製された。組織は成体雄Ｌｏｎｇ−ＥｖａｎｓラッＩ・から集め、細断し、カ ルシウム不含、マグネシウム不合ＨＢ　Ｓ　Ｓ緩衝液中で洗った。

細断した組織を次に００２５％リブシン（ｒｙｐｓｉｎ）およびコラゲナーゼを 含有する溶液中でインキュベートした。

解離した細胞は２０μｍのナイロンメツシュを使用して濾過し、ＨＢＳＳ中に再 懸濁しそして３００ｇで１５分巻遠心してベレットにした。生成したベレットを 少量のＤＭＥＭ完全培地中に再懸濁して三次元間質上に接種した（下記参照）。

１５、１．２．三次元間質マトリックスの調製膵臓組織培養物に使用された三次 元間質マトリックスは成体ラット膵臓繊維芽細胞およびセクション１３．１゜４ において三次元肝臓培養物に関して上述したとおりの８　ｍｍ　Ｘ　４５ｍｍ片 のナイロン濾過スクリーン（＃３−２１０／３６゜Ｔｅｔｋｏ、Ｉｎｃ、、　Ｎ Ｙ）を使用して調製した。

１５、１．３．三次元膵臓組織培養物の維持三次元間質マトリックス上に膵臓豚 房細胞を接種した後、培養物は加湿した雰囲気中、３７°Ｃ１５％ＣＯ□にてＤ ＭＥＭ完全培地中に維持し、３日毎に新鮮な培地を供給した。

１５、２．結果および考察 図１４は上述の方法により生成された三次元膵臓組織培養物の横断面の顕微鏡写 真である。組織培養線層細胞は、間質細胞のより均一な外観（星印）に比較して 酵素前駆体小滴封入体（矢印）に基づき同定できよう。

小島細胞は各メツシュ開口部の中心に濃縮されたままであり、そして１〜２Ｘ１ ０’個のインシュリン−分泌細胞を含有する構造物を形成する。

１６、実施例：血液−脳関門のための三次元モデル系１６、１．材料および方法 １６、　ｉ、　ｉ、小血管内皮細胞の調製小血管の内皮細胞はＬａｒｓｏｎらの 方法（１９８７，Ｍｉｃｒｏ−ｖａｓｃ、　Ｒｅｓ、　３４：１８４）に従って 脳から単離されモしてＴ−７５組織培養フラスコを使用してインビトロで培養さ れた。細胞はダルベツコ改良イーグル培地／Ｈａｍｓ−Ｆ−１２培地組み合わせ 物（溶液は１：１混合物として入手しうる）中に維持された。培地は２０％熱不 活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質が補添された。

細胞はフラスコ当たりｌＸｌ０’個の濃度で接種し、１週間以内に集密状態に達 した。細胞を１週間に一度継代し、さらに１週間に一度前記ＦＣ３、グルタミン および抗生物質を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ−Ｆ−１２を供給した。細胞を継 代するために、５ｍｌのＰＢＳ（Ｃａ−又はＭｇ”＋なし）で２度すすぎそして ３ｍｌの０．０５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡでトリプシン処理 した。細胞をペレット化し、再懸濁し、トリバンブルー排除による生存能力試験 を行い、接種しそして上述のＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ−Ｆ−１２補添培地２５ｍ１を 供給した。第■因子関連抗原アッセイ（Ｇｒｕｌｎｉｃｋら、１９７７、　Ａｎ ｎ、Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、８６：５９８−６１６）を積極的に内皮細胞を同定する ために使用しそして銀染色は小血管内皮にのみ特異的な強固な結合複合体を同定 するのに使用した。

１６、１．２．メツシュの調製および接種ナイロン濾過スクリーンメツシュ（＃ ３−２１０／３６．　Ｔｅｔｋｏ。

Ｉｎｃ、　ＮＹ）は肝臓、膵臓、骨髄等の組織培養系において実質的に記載した ようにして調製した。メツシュを酢酸溶液（１ｍｌの氷酢酸と９９ｍ１の蒸留水 ）中に３０分間浸し、多量の蒸留水ですすぎ次にオートクレーブ処理した。メツ シュを８　Ｘ　８　ｃｍメツシュ当たり６ｍｌのウシ胎児血清で被覆して１晩イ ンキユベートした。次いでメツシュを三層に積み重ね、この積み重ねの上に３Ｘ １０７個の小血管内皮細胞（上述のとおりにして培養）を接種し、加湿雰囲気中 ３７℃、５％Ｃ０２で３時間インキュベートした。接種したメツシュには、完全 な集密に達する迄３−４日毎に１０ｍ１のＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ−Ｆ−１２培地を 供給した（約２週間）。

１６、１．３．ニューロンおよび星状細胞集団の調製ラット胎児小脳からニュー ロンおよび星状細胞を単離した。５匹のラットの小脳を切り出してＰＢＳ緩衝液 中に入れた。次いでＰＢＳを除き、それぞれに１ｍｌのトリプシン溶液（１０ｍ ｇ　）リブシン、１ｍｌのＰＢＳこれは０゜０１ｇのＭｇ５Ｏｉ４ＨｚＯ含有、 および６μｌのＩ　Ｎ　Ｎａ０Ｈ）を添加した。３分後組織を約１ｍｌのＰＢＳ 緩衝液および、７．５　ｍｇ　ＤＮアーゼと、１５ｍ１のＥａｒｌｅｓ　ＢＭＥ から成る２ｍｌの貯蔵溶液を用いてすすいだ。次に個々の細胞を１８から２５ゲ ージの範囲の漸進的に小さい注射針を通して溶液が混濁する迄組織を吸引するこ とにより懸濁液にとり込んだ。生成した単離細胞浮遊液を８００ｇで５分間遠心 し、そして細胞ベレットを培地中に再懸濁し、次いで３３μｍフィルターに通し た。細胞を６０％／３５％パーコール段階的勾配上に積層させ、８００ｇで１０ 分間遠心した。θ％／３５％界面での細胞は大部分がダリアと星状細胞であった ：３５％／６０％の界面での細胞は大部分がニューロンであった。両方の集団を 集め、５ｍｌのＰＢＳ中に別個に希釈し、洗浄しそして、２５００ｇで５分間遠 心することにより集めた。細胞を次に培地（１０％熱不活化ウマ血清含有ＢＭＥ ）に再懸濁した。両方の細胞型は、ポリーＤ−リジンを予め被覆した培養皿上に 別個に塗布した。最初に、これらを１００μｇのポリーＤ−リジンで予め被覆し た皿に塗布し、２０〜４５分間インキユベートシ、次いでＰＢＳで軽くすすいだ ；グリアと星状細胞が培養皿に選択的に付着したが、ニューロンは洗い去られた 。すすぎ緩衝液を次いで５００μｇのポリーＤ−リジンを被覆した培養皿に塗布 し、この場合二ニーロンが培養皿に付着した。

１６、１．４．三次元内皮細胞培養物への星状細胞の接種メツシュから培地を除 去し、このメツシュに星状細胞を加え、次いで加湿した雰囲気下３７°Ｃ１５％ ＣＯｚで１時間インキュベートすることにより集密内皮細胞で被覆されたメツシ ュ上（上記）に５Ｘ１０’個の星状細胞を接種した。このメツシュに、インター フェロン、トランスフェリン、セレンを含有するＤＭＥＭ−に１２を供給し、引 き続き２〜３日間隔で供給した。

１６、１．５．三次元内皮細胞−星状細胞組織培養物へのニューロンの接種 約５日後に、ニューロンを内皮細胞−星状細胞組織培養物上に接種した。神経突 起の生長を示している（培養約１週間後に観察された）ニューロン細胞培養物を 収集し、約５Ｘ１０’個の細胞を内皮細胞／星状細胞三次元培養メツシュ上に接 種した。ニューロン細胞を最小量の培養培地中に接種し、次いで３７°Ｃ１加湿 した雰囲気中５％ＣＯ□にて３時間インキュベートし、その後、メツシュには標 準量のＤＭＥＭ／Ｆ１２を供給し、再びインキュベートし、その後２〜３日間隔 で供給した。

１６、２．結果および考察 ナイロンメツシュはウシ胎児血清で予め被覆しこれに標準的な単層培養にて集密 となるまで増殖させた小血管内皮細胞を接種しそして完全な集密となるまで増殖 させた。

ニューロンと星状細胞は胎児ラットの小脳から調製し分画付着により分離した。

星状細胞は集密内皮細胞三次元間質マトリックス上で増殖させ、次にニューロン 細胞をこの三次元組織培養物に添加した。

生成する内皮細胞／星状細胞／ニューロン三次元組織培養物を、それが内皮細胞 の層を覆う半集密の第二段階に達する迄維持した。図１５に示されるように、こ の多層三次元組織培養系、ここでは１つの層は集密の小血管内皮細胞から構成さ れ、他層は星状細胞とニューロンから構成されているが、これはインビボで見ら れる血液−脳関門の構造を再生成し、そこでは血液中の物質は脳のニューロン組 織に到達するためには小血管の内皮を貫通しなければならない。かかる血液−脳 関門モデル系は化学的物質又はウィルスの脳への通過又はその欠除を研究するの に使用できる；中枢神経系の感染を治療するためには、例えば如何なる抗生物質 又は抗ウィルス剤が血液−脳関門を通過しつるか判定することが有利である。さ らに、かかるモデル系は種々の神経毒の作用および強さを研究するための基質と して使用できる。

１７゜実施例二三次元腺癌組織培養系 １７．１．材料および方法 １７、１．１．腺癌間質細胞および実質細胞の調製ＨＢＳＳ中に腫瘍細胞を細断 することにより腺癌細胞を間質細胞から分離し、細胞を００２７％トリプシン中 ３７°Ｃで２４時間インキュベートし、さらにプラスチックペトリ皿上のＤＭＥ Ｍ完全培地中に懸濁した細胞を３７℃で１２時間インキュベートした。間質細胞 は選択的にプラスチック皿に付着した。

１７、１．２．三次元間質マトリックスの調製腺癌組織培養物中に使用される三 次元間質マトリックスは腫瘍由来の間質細胞（上記１７．１．１参照）およびセ クション！３．１．４で三次元肝臓培養物に関し前記した８　ｍｍ　Ｘ　４５ｍ ｍ片のナイロン濾過スクリーン（＃３−２１０／３６゜Ｔｅｔｋｏ、Ｉｎｃ、、 　ＮＹ）を使用して生成させた。

１７、１．３．三次元腺癌組織培養物の維持三次元腫瘍間質マトリックスに腺癌 細胞を接種した後、培養物を高濃度グルコース、１５％ＦＢＣおよび０．０３％ グルタミンを含有するＤＭＥＭ完全培地中加湿した雰囲気気圧中で３７°Ｃ１５ ％ＣＯ□で維持し、３日毎に新しい培地を供給した。

１７．２．結果および考察 図１６は、三次元腺癌組織培養物の顕微鏡写真である。

腺癌細胞は特徴的な積み重ねおよび三次元腫瘍様構造物への配向を示した。細胞 はその上皮様外観を保持した。

１８、実施例２三次元組織培養細胞毒試験系１８、１．材料および方法 １８゜１．１．三次元骨髄組織培養物の調製三次元骨髄組織培養物は、上記セク ション１１で概説した方法に従って調製された。

１８．１゜２．細胞毒剤への三次元骨髄培養物の露出側々の三次元骨髄培養物を 細胞毒性試験用の９６ウ工ル組織培養皿の各ウェル内に維持した。

培養物を０．１から１０μｍの範囲の１０倍連続希釈アドリアマイシンに２４時 間露出させた。対照は１０倍連続希釈のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に露出さ せた。

同様に、９６ウ工ルマルチウエル組織培養ユニット中の他の三次元骨髄培養物を ７１〜７５μｍの範囲の１０倍連続希釈のシスーブラチナムに２４時間露出させ た。対照はＢＳＡの連続希釈物に露出させた。

すべての場合において、慣用法を用いて培養されたヒト繊維芽細胞の単層を、間 質細胞単独の三次元培養物又は造血細胞と一緒に培養した三次元培養物と比較し た。

１８、１．３．細胞毒性アッセイ 培地を細胞から除去し、０．２ｍｌの中性赤色色素培地溶液（下記１８．１．４ 参照）を各ウェルに加えた。培養物を３７°Ｃで３時間インキュベートした。三 次元培養物を含有する培養トレイにおいて、ウェルＩＡを対照として用い、この ものは細胞なしのメツシュのみを含有しインキュベーション後、色素／培地を除 去し、とり込まれなかったニュートラルレッドを除去し、細胞の基層・〜の付着 を高めるためにホルマール（ｆｏｒｍａｌ）　−カルシウム（下記１８．１．４ 参照）を用いてすみやかに各ウェルを洗った。

０．２ｍｌの酢酸／エタノール溶液（１８，１，４参照）を各ウェルに加え、培 養物を室温で１５分間保持しく色素を抽出するため）、次いで振盪プレート上に ２〜３秒振盪した。

培養トレイを次に５４０ｎｍフィルターを備えたＤｙｎａｔｅｃｈマイクロプレ ートリーダーに移して自動分光測光読みとりおよび記録を行った。対照ウェル中 の酢酸／エタノール溶液をブランクとして用いた。

１８、１．４．細胞毒性アッセイのための溶液ニュートラルレッド／培地を以下 のようにして調製した。ニュートラルレッドは０．４％の貯蔵水溶液として調製 しそしてホイルにより光から遮断した。色素の新鮮な１：８０希釈物を調製した 。使用直前に、色素培地溶液を１５００ｇで５分間遠心しそして上溝液をニュー トラルレッドアッセイに使用した。

ホルマール−カルシウムは以下のようにして調製した。５ｇのＣａＣ１□（無水 ）を４９７．５ｍｌの滅菌蒸留水に加えた。次に、２．５ｍｌの４０％ホルムア ルデヒドを加えて、１％ＣａＣ１□そして０．５％ホルマリンであるホルマール −カルシウム溶液を生成させた。

酢酸エタノール溶液は次のようにして調製した。

１、０９ｍ１の氷酢酸を９９ｍ１の５０％エタノールに加えた。

アドリアマイシンおよびシスーブラチナムは（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から入手した。

１８、２．結果および考察 図１７および図１８は、試験薬剤としてそれぞれアドリアマイシンおよびシスー ブラチナムを用いる三次元骨髄培養物細胞毒性アッセイの結果を示す。それぞれ の場合に、三次元培養系は試験薬剤に対して用量関連応答を示すことに注目され たい。アドリアマイシン又はシスープラチナムのいずれか一方では、骨髄三次元 培養物に対するＴＤ、。は通常の繊維芽細胞単層培養物を使用して測定されたＴ Ｄ、。とは有意に相違していた。重要なことは、これらの結果は、単層培養物は 細胞毒性に関する正確な測定とはなりえない可能性があることを示していること である；恐らく細胞が極めて不自然な環境下で増殖するので、単層細胞培養物は 有毒薬剤に対してより感受性が強いのかもしれない。試験物質の正確な毒性を測 定しうることは非常に重要である；例えば、化学療法において、悪性細胞を効果 的に排除するのに許容しうる最大量を投与することが重要でありうる。許容しつ る最大量を過少に見積もることは、有動量より少ない抗腫瘍剤の投与を生ずる可 能性がある。

骨髄および他の正常な組織の三次元組織培養物のみならず腫瘍組織の三次元組織 培養物も提供することにより、本発明により化学療法剤の最適量のインビトロに おける測定が可能となる。

１９、実施例：ミクロビッグ（ｍｉｃｒｏｐｉｇ）における新生真皮（ｎｅｏｄ ｅｒｎｉｓ）を使用する移植のための三次元皮膚培養系 皮膚移植は４匹のＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　ミクロビッグで実施した。実験 は、厚さを分けた創傷および完全な厚さの創傷の収縮、治癒および上皮形成に及 ぼす新生真皮、細胞溶解物を浸透されたメツシュ基質およびメツシュ単独物の効 果を比較することを目的とした。各領域における治癒の正確な評価を可能とする ために、複数の平行した創傷を各動物の背中表面に沿って比較した。

これらの実験において、生物分解性メツシュにブタの皮膚繊維芽細胞を接種し、 そして皮膚代替物として移植した。他のメツシュはブタの表皮ケラチン細胞を接 種したヒト皮膚繊維芽細胞およびブタ皮膚繊維芽細胞を含有した。移植された領 域を組織学的切片および外観の著しい変化（滲出物、紅斑等）を通して監視する ことにより我々は移植様式としての三次元皮膚系の有効性を調べることができた 。

１９．１．材料および方法 １９、１．１．創傷床の調製 表皮移植片を適正に評価するためには、何ら真皮。

毛包、汗腺又は皮脂腺が残らない創傷移植片床を調製することが必須要件であっ た。これを達成するため、０、０７５から０．０９０インチに設定されたＢｒｏ ｗｎｅ皮膚切除器を使用してブタ上方側面部から全厚さの皮膚を切り取った。５ ｃｍＸ５ｃｍの創傷部が生成された。下方側面領域を設ける際には、セツティン グは０．６０から０．０７５インチに調節された。メツシュ単独又は培養細胞を 有するメツシュを筋膜のすぐ上の床上に置いた。無菌の皮膚切除器で調製された 床により雑菌混入の可能性が低下しそして移植床における完全な止血が可能とな った。

もし、小出血が皮膚除去後に生じる場合は乾燥ガーゼ包帯を創傷部にあてて１０ から１５分間圧力を加えた。

移植片を筋膜の上に置く迄は常に、ＰＢＳで予め湿らせた滅菌ガーゼで無菌床を 覆った。適所に圧迫ステントを保持するために、調製された移植床の両側から約 １゜５インチ離れて、絹縫合材（３−０）を置いた。

無菌ビンセットを用い組織培養フラスコから培養した移植片（細胞を有するメツ シュ）を取り出し、慣用の表皮上縫合を用いて所定の場所に縫合した。移植片を ワセリンガーゼでおおい、絹結紮糸を圧迫ステントを与えるように結んだ。ブタ をエラストブラストで包帯した。傷の包帯は４日で取り変えた。

１９．１．２．麻酔 ブタをケタミン塩酸（Ｋｅｔａｌａｒ）を使用して麻酔しそしてハロタン、亜酸 化窒素および酸素の混合物により麻酔状態に保持した。皮膚面をポビドン−ヨウ 素（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）および７％アルコールで洗い次にブタの側面に上述のよ うにして４個の完全厚さ移植床を調製した。

１９、１．３．動物の維持 ４から５日後、創傷包帯を除去し、移植領域を感染および／又は拒絶反応の徴候 に関して検査し、それから、再度ワセリンガーゼでおおい、エラストブラストで 包帯した。創傷は引き続き処置部位からバイオプシーをとって４日間隔で観察し た。使い捨てＢａｋｅｒパンチと無菌手法を用いて４ミリのバイオプシーを無菌 で採れるように、動物をケタラールで麻酔した。試料は移植片の付着と創傷治癒 を評価するための組織学的評価に送った。

１９、１．４．上皮移植片 選択された動物に真皮均等物を移植して１０日後に、自己由来の表皮ケラチン細 胞の半移植片を与えた。集密以上まで増殖した単離された細胞から生成した表皮 ケラチン細胞シートは皮膚均等物上への移植に先立ち１０から１４日間培養した 。シートを４個の局部的な縫合により結合しそして細胞を付着できるようにワセ リンガーゼと包帯で覆った。

１９．２．結果 処置された全動物において、皮膚均等物は良好に付着し、収縮と脱水が防止され そして上皮細胞がその上で移動可能であるか又は自己由来移植片に載置しつる生 きた組織床を提供した。図１９は、ヒト真皮均等物（新生真皮）を全厚さの創傷 部に移植１０日後の治癒の代表例である。我々はその部位において最小の収縮を 観察し、何らの拒絶反応の徴候も観察しなかったが、これは移植における同種繊 維芽細胞の有用性を示している。この部位の組織学的評価では、繊維芽細胞の活 発な増殖と、最小の白色細胞の浸潤があるコラーゲンの沈着が示される（図２０ ）。厚さを分けた創傷は、真皮均等物で処置した傷（左側）および生物分解性メ ツシュのみで処置した傷（右側）と比較すると、収縮、上皮形成、色素沈着およ び毛の成長における著明な差違を示した（図２１）。繊維芽細胞の溶解物に浸漬 したメツシュは、メツシュ繊維の周辺での上皮増殖の増強を示した（図２２）が 、全体的には生きた新生真皮で処置した領域よりも治癒進行が遅いことを示した 。

新生真皮は治癒領域への上皮の移動を高めた。図２３に見られるように、表皮ケ ラチン細胞が生きた真皮均等物の方向に移動してそれに付着するに伴い深い網条 杭（ｒｅｔｅ　ｐｅｇｓ）が表皮ケラチン細胞により形成される。

４、〜（４りバク−うは治ハ、部ｔ７．　ｉ−、、、”、お１“ｉ、、　、ｆ、 　Ｊ・ドロ形成の特徴ご・、払自己］ｈ　ｒＦ　２：皮う゛−ラチン細胞（ｉ「 １好！ｒ、（”ｆ若ｊ５１、そ１、Ｃ１己；−）３、皮＼の均一・ハ］治に、　 ’：ｆｉ’：　’Ｇ　Ｕ−（いｌ：：：　、図２４ｉ’！、創傷の治癒の比較　 そのイこの４６分は自己由来上皮移植片を受ｊ３たものＣ，ｔＩ゛）りそ１．で 傷の半分は新生真皮のみをう（）たもの−を示”−１−、、ｊ−皮の移植片は淘 −に治癒し、それ以」二の収縮を防止し、８載置されている真皮均等物に強固に 付着した。図２５は新生真皮への表皮細胞の均一な増殖と付着を示す。新生真皮 は活発に増殖中の繊維芽細胞および自然に分泌された繊維芽細胞から構成されて いると思われる。メツシュ繊維は横断面にみられるように依然として存在してい る。

１９゜３、考察 これまでの移植実験では、新生真皮（生物分解性メ、ソシュ上の繊維芽細胞およ び自然に分泌されたコラーゲン）は全厚さの創傷に対してすぐれた治療を提供す ることか示される。異種間の移植片の成功裏の使用は、やけどの犠牲者および床 ずれの潰瘍を有する患者における同種間の新生真皮の使用可能性を示している。

この移植は、自家移植の上皮シートを支持し、増殖させるのみならず、上皮細胞 の移植表面への移動を可能とする。移植片は、４ケ月後にも表面上或いは深部で の傷あとがなく、永久的である。

培養週数 培養週数 ＦＪ６．７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、　ｆｏ ＦＩＧ、　１１ アドリアマイシン（ｕＭ） ÷…州妊÷　ヒＩ・繊維芽細胞単層 上ｊ、−ｊＪ−ｔ　間質を伴うメツシュ間質および骨ルＵを伴うメツシュ シスーブラチアム（ｕＭ） ＋相拝…拝ヒト繊維芽細胞単層 □　間質を伴うメツシュ □　間質および骨髄を伴うメッシュ 補正書の翻訳文提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成　３年　３月　４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を１ 層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリックス 上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス。 ２．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲１記載の三次元間質マトリッ クス。 ３．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形質 細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲２記載の三次元間質マ トリックス。 ４．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１記載の三次 元間質マトリックス。 ５．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、ゼ ラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲４記載の三次元間質マトリ ックス。 ６．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１記載の三 次元間質マトリックス。 ７．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピ レン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロ エチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲６記載の三次 元間質マトリックス。 ８．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲４、５、６または７記載 の三次元間質マトリックス。 ９．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を１ 層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリックス 上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養された実質 細胞を含んでなる三次元細胞培養物。 １０．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲９記載の三次元細胞培養物 。 １１．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲１０記載の三次元細 胞培養物。 １２．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲９記載の三 次元細胞培養物。 １３．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲１２記載の三次元細胞培 養物。 １４．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲９記載の 三次元細胞培養物。 １５．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１４記載の 三次元細胞培養物。 １６．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲１２、１３、１４、ま たは１５記載の三次元細胞培養物。 １７．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス土の亜集密の間質細胞を含んでなる三次光間質マトリックス上で培養きれた造 血細胞を含んでなる三次元骨髄培養物。 １８．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養されたメ ラニン細胞および表皮ケラチン細胞を含んでなる三次元皮膚培養物。 １９．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養されたメラ ニン細胞および表皮ケラチン細胞を含んでなる三次元皮膚培養物。 ２０．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状かもなる三次元マトリック ス上の集密の小血管内皮細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養され たニューロン細胞および星状細胞を含んでなる三次元培養系。 ２１．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状かもなる三次元マトリック ス上の集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養された粘膜 上皮細胞を含んでなる三次元培養物。 ２２．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養された腫 瘍細胞を含んでなる三次元腫瘍培養物。 ２３．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養された群 細胞を含んでなる三次元肝臓培養物。 ２４．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で培養された内 分泌腺房細胞を含んでなる三次元すい臓培養物。 ２５． （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の間質 細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に実質細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの細胞培養法。 ２６．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲２５記載の方法。 ２７．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲２６記載の方法。 ２８．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲２５記載の 方法。 ２９．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲２８記載の方法。 ３０．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲２５記載 の方法。 ３１．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲３０記載の 方法。 ３２．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲２８、２９、３０また は３１記載の方法。 ３３． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上に造血細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの骨髄細胞培養法。 ３４． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上にメラニン細胞および表皮ケラチン細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの皮膚細胞培養法。 ３５． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の集密の間質細胞を含んでなる三次元間 質マトリックス上にメラニン細胞および表皮ケラチン細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの皮膚細胞培養法。 ３６． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の集密の内皮細胞を含んでなる三次元間 質マトリックス上に星状細胞を接種し、そしてさらに、 （ｂ）該星状細胞上にニューロン細胞を接種し、そして （ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートする、 ことを含んでなるインビトロでのニューロン細胞培養法。 ３７． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上に粘膜上皮細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの粘膜上皮培養法。 ３８． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上に腫瘍細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでの腫瘍組織細胞培養法。 ３９． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上に肝細胞を接種し、そして（ｂ）接種された三次元間質マト リックスを栄養培地中でインキュベートして接種された細胞を培養物中で増殖さ せる、 ことを含んでなるインビトロでの肝臓細胞培養法。 ４０． （ａ）細胞を付着でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質お よび形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス上にすい臓腺房細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなるインビトロでのすい臓細胞培養法。 ４１． （ａ）移植または埋めこみ予定の組織型由来の実質細胞を培養して実質細胞をイ ンビトロで増殖させ、そして、 （ｂ）増殖した実質細胞をインビボで埋め込む、ことを含んでなるインビボでの 細胞の移植または埋め込み法。 ４２．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の亜集 密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に実質細胞を接種し、そし て （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲４１記載の移植または埋め込み法。 ４３．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲４２記載の方法。 ４４．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲４３記載の方法。 ４５．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲４２記載の 方法。 ４６．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲４５記載の方法。 ４７．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲４２記載 の方法。 ４８．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲４７記載の 方法。 ４９．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲４５、４６、４７また は４８記載の方法。 ５０． （ａ）造血細胞をインビトロで培養して造血細胞を増殖させ、そして （ｂ）増殖した実質細胞をインビボで埋め込むことを含んでなるインビボでの骨 髄細胞の移植または埋め込み法。 ５１．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に造血細胞を接 種し、そして（ｂ）接種された三次光間質マトリックスを栄養培地中でインキュ ベートして接種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲５０記載の骨髄細胞の移植または埋め込み法。 ５２． （ａ）メラニン細胞および表皮ケラチン細胞をインビトロで培養してメラニン細 胞および表皮ケラチン細胞を増殖させ、そして （ｂ）増殖したメラニン細胞および表皮ケラチン細胞をインビボで埋め込む ことを含んでなるインビボでの皮膚細胞の移植または埋め込み法。 ５３．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の亜集 密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上にメラニン細胞および表皮 ケラチン細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲５２記載の皮膚細胞の移植または埋め込み法。 ５４．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の集密 の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上にメラニン細胞および表皮ケ ラチン細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲５２記載の皮膚細胞の移植または埋め込み法。 ５５． （ａ）肝細胞をインビトロで培養して肝細胞を増殖させ、そして （ｂ）増殖した肝細胞をインビボで埋め込むことを含んでなるインビボでの肝臓 細胞の移植または埋め込み法。 ５６．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の亜集 密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に肝細胞を接種し、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートして接 種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲５５記載の肝臓細胞の移植または埋め込み法。 ５７． （ａ）すい臓腺房細胞をインビトロで培養してすい臓腺房細胞を増殖させ、そし て （ｂ）増殖したすい臓腺房細胞をインビボで埋め込む、ことを含んでなるインビ ボでのすい臓細胞の移植または埋め込み法。 ５８．前記培養が （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質からなる三次元マトリックス上の亜集 密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上にすい臓腺房細胞を接種し 、そして（ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベー トして接種された細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる請求の範囲５７記載のすい臓細胞の移植または埋め込み法。 ５９．細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の亜集密の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックスを埋め込むことを 含んでなるインビボでの間質細胞の埋め込み法。 ６０．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲５９記載の埋め込み法。 ６１．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲６０記載の埋め込み 法。 ６２．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲５９記載の 埋め込み法。 ６３．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲６２記載の埋め込み法。 ６４．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲５９記載 の埋め込み法。 ６５．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲６４記載の 埋め込み法。 ６６．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲６２、６３、６４また は６５記載の埋め込み法。 ６７． （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上活性に増殖中の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上で増殖した 実質細胞を含んでなる三次元細胞培養物を、試験物質に露出させ、そして （ｂ）損傷または死滅細胞の数が試験物質の細胞毒性と関連するものである、細 胞培養物中の損傷または死滅細胞の数を測定する、 ことを含んでなる試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ６８．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲６７記載の試験物質の細胞 毒性を検査する方法。 ６９．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲６８記載の試験物質 の細胞毒性を検査する方法。 ７０．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲６７記載の 試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ７１．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲７０記載の試験物質の細 胞毒性を検査する方法。 ７２．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲６７記載 の試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ７３，非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲７２記載の 試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ７４．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲７０、７１、７２、ま たは７３記載の試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ７５．実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲６７記載の試験物質の細胞毒性を 検査する方法。 ７６．実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲６７ 記載の試験物質の細胞毒性を検査する方法。 ７７．実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲６７記載の試験物質の細胞毒性を検 査する方法。 ７８．実質細胞がすい臓腺房胞からなる請求の範囲６７記載の試験物質の細胞毒 性を検査する方法。 ７９． （ａ）細胞を付着できるかまたは細胞を１層をこえて増殖させうるように修飾さ れることができる物質および形状からなる三次元マトリックス上の亜集密の間質 細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に増殖した実質細胞を含んでなる三 次元細胞培養物を、薬剤に露出させ、そして （ｂ）培養細胞に及ぼす薬剤の作用を測定する、ことを含んでなる薬剤の作用を 検査する方法。 ８０．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検 査する方法。 ８１．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲８０記載の薬剤の作 用を検査する方法。 ８２．三次元マトリックスが生物分解性物質を食んでなる請求の範囲７９記載の 薬剤の作用を検査する方法。 ８３．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース、 ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲８２記載の薬剤の作用を 検査する方法。 ８４．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲７９記載 の薬剤の作用を検査する方法。 ８５．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロ ピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ ロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲８４記載の 作用を検査する方法。 ８６．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲８２、８３、８４また は８５記載の検査方法。 ８７．実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検査する 方法。 ８８．実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲７９ 記載の薬剤の作用を検査する方法。 ８９．実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検査する方 法。 ９０．実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検 査する方法。 ９１．実質細胞が粘膜上皮細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検査 する方法。 ９２．実質細胞がウイルス感染粘膜上皮細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤 の作用を検査する方法。 ９３．実質細胞がヘルペスウイルス感染粘膜上皮細胞からなる請求の範囲７９記 載の薬剤の作用を検査する方法。 ９４．実質細胞がパピローマウイルス感染粘膜上皮細胞からなる請求の範囲７９ 記載の薬剤の作用を検査する方法。 ９５．実質細胞が種瘍細胞細胞からなる請求の範囲７９記載の薬剤の作用を検査 する方法。 ９６． （ａ）患者からの細胞検体を得、 （ｂ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の活性に増殖中の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に検体か らの細胞を接種し、（ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でイ ンキュベートして接種された細胞を培養物中で増殖させ、そして （ｄ）培養増殖細胞における悪性細胞の存在を判定する、 ことを含んでなる患者の悪性腫瘍を診断または監視する方法。 ９７．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲９６記載の悪性腫瘍を診断 または監視する方法。 ９８．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、形 質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲９７記載の悪性腫瘍 を診断または監視する方法。 ９９．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲９６記載の 悪性腫瘍を診断または監視する方法。 １００．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース 、ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲９９記載の悪性腫瘍を 診断または監視する方法。 １０１．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲９６記 載の悪性腫瘍を診断または監視する方法。 １０２．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプ ロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル オロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１０１記 載の悪性腫瘍を診断または監視する方法。 １０３．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲９９、１００、１０ １または１０２記載の悪性腫瘍を診断または監視する方法。 １０４．実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲９６記載の悪性腫瘍を診断また は監視する方法。 １０５．実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲９ ６記載の悪性腫瘍を診断または監視する方法。 １０６．実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲９６記載の悪性腫瘍を診断または 監視する方法。 １０７．実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲８２記載の悪性腫瘍を診 断または監視する方法。 １０８． （ａ） （ｉ）トランスフェクションされた実質細胞が発現エレメントの制御下にある外 来遺伝子を含有し、そして（ｉｉ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できる ように修飾でき、かつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質および形 状からなる三次元マトリックス上の活性に増殖中の間質細胞を含んでなる三次元 間質マトリックス、 である三次元間質マトリックス上に、トランスフェクションされた実質細胞を接 種し、そして（ｂ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュ ベートしてトランスフェクションされた細胞を培養物中で増殖させる、 ことを含んでなる、遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １０９．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学 的に作製された細胞の培養法。 １１０．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、 形質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲１０９記載の遺伝 子工学的に作製された細胞の培養法。 １１１．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１０８記 載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １１２．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース 、ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲１１１記載の遺伝子工 学的に作製された細胞の培養法。 １１３．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１０８ 記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １１４．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプ ロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル オロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１１３記 載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １１５．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲１１１、１１２、１ １３または１１４記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １１６．実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学的に作 製された細胞の培養法。 １１７．実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲１ ０８記載の遺伝子工学的に作製された細胞の培養法。 １１８．実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学的に作製 された細胞の培養法。 １１９．実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲１０８記載の遺伝子工学 的に作製された細胞の培養法。 １２０． （ａ）患者からの細胞検体を得、 （ｂ）細胞を付着できるかまたは細胞を付着できるように修飾でき、かつ細胞を １層をこえて増殖させることができる物質および形状からなる三次元マトリック ス上の活性に増殖中の間質細胞を含んでなる三次元間質マトリックス上に検体か らの細胞を接種し、（ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でイ ンキュベートして接種された細胞を培養物中で増殖させ、そして （ｄ）培養増殖細胞を疾患または状態のマーカーに関して分抗する、 ことを含んでなる患者の疾患または状態を分析する方法。 １２１．間質細胞が繊維芽細胞を含んでなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニ ズムの調査法。 １２２．間質細胞がさらに内皮細胞、周細胞、マクロファージ、単球、白血球、 形質細胞、肥胖細胞または含脂肪細胞を含んでなる請求の範囲１２１記載の疾病 メカニズムの調査法。 １２３．三次元マトリックスが生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１２０記 載の疾病メカニズムの調査法。 １２４．生物分解性物質が綿、ポリグリコール酸、腸線縫合系材料、セルロース 、ゼラチン、またはデキストランを含んでなる請求の範囲１２３記載の疾病メカ ニズムの調査法。 １２５．三次元マトリックスが非生物分解性物質を含んでなる請求の範囲１２０ 記載の疾病メカニズムの調査法。 １２６．非生物分解性物質がポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプ ロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフル オロエチレン、またはニトロセルロース化合物を含んでなる請求の範囲１２５記 載の疾病メカニズムの調査法。 １２７．前記物質がコラーゲンで被覆されている請求の範囲１２３、１２４、１ ２５または１２６記載の疾病メカニズムの調査法。 １２８．実質細胞が造血細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニズムの 調査法。 １２９．実質細胞がメラニン細胞および表皮ケラチン細胞からなる請求の範囲１ ２０記載の疾病メカニズムの調査法。 １３０．実質細胞が肝細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニズムの調 査法。 １３１．実質細胞がすい臓腺房細胞からなる請求の範囲１２０記載の疾病メカニ ズムの調査法。 １３２． （ａ）（ｉ）細胞を付着できかつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物 質および形状からなる三次元マトリックス上の集密の内皮細胞を含んでなる三次 元間質マトリックス上に星状細胞を接種し、（ｉｉ）該星状細胞の上にさらにニ ューロン細胞を接種し、そして（ｉｉｉ）接種された三次元間質マトリックスを 栄養培地中でインキュベートすることにより作られた三次元培養系の内皮表面に 有効量の物質を露出させ、そして （ｂ）接種された三次元間質マトリックスの星状細胞またはニューロン細胞に及 ぼすその物質の作用を検出する、 ことを含んでなる、該物質の血液−脳関門を通過する能力の検査法。 １３３．以下の方法、すなわち （ａ）細胞を付着できかつ細胞を１層をこえて増殖させることができる物質およ び形状からなる三次元マトリックス上の集密の内皮細胞を含んでなる三次元間質 マトリックス上に星状細胞を接種し、そしてさらに （ｂ）該星状細胞の上にニューロン細胞を接種し、そして （ｃ）接種された三次元間質マトリックスを栄養培地中でインキュベートする、 ことにより調製された三次元組織培養物を含んでなる、血液−脳関門のためのモ デル系。