JPH04501667A - メタンモノオキシゲナーゼを産生するメタン酸化菌を用いるハロゲン化炭化水素の分解法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 メタンモノオキシゲナーゼを産生するメタン酸化菌を用いるハロゲン化炭化水素 の分解法 発明の分野 この発明は、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）を含むハロゲン化炭化水素化合物の 生物分解法であって、可溶性メタンモノオキシゲナーゼまたは可溶性メタンモノ オキシゲナーゼを含むメタン酸化性細菌を利用する方法に関するものである。

発明の背景 ハロゲン化炭化水素化合物は、化学処理産業の大量生成物である。

例えば、６００万メートルトンを越えるトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ｔトラ クロロエチレン（ＰＣＥ）、）ジクロロエタン、四塩化炭素（ＣＴ）およびクロ ロホルム（ＣＦ）が（アメリカ合衆国）毎年生産されている。地下水から最も頻 繁に見出される上記ハロゲン化炭化水素化合物は、低分子量脂肪族ハロゲン化炭 化水素：ＴＣＥ、ジクロロエタン（ＤＣＡ）、）ジクロロエタンおよびＰＣＥで ある。ＴＣＥを含むこれらの脂肪族ハロゲン化炭化水素化合物の多くは、アメリ カ合衆国環境保護局により優先汚染物質として列挙され、既知または被疑発癌性 物質および突然変異誘発物質である。また、ハロホルム（メタンのハロゲン化誘 導体）は地下水および飲用水から検出されることが多い。ハロホルムには上水道 の塩素化処理中に生成されるものもあるが、不適当な処理技術または偶発的流出 もまた、これらのハロホルムの存在に関与し得る。

上記ハロゲン化炭化水素化合物の幾つかは、好気性水面下環境での生物分解に耐 性を示すか、またはそれらの生物学的変換は嫌気性条件下で不完全である。例え ば、嫌気性条件下では、ＴＣＥおよびＰＣＥにおいて、原汚染物質と同程度また はそれ以上の問題である化合物の塩化ビニルへの部分的生物変換が行なわれるこ とが知られている。ウィルソンおよびウィルソン、アプライド・アンド・エンバ イアロンメンタル・マイクロバイオロジー、４９：２４２−２４３（１９８５） 。

これらのハロゲン化炭化水素化合物により汚染された地下水の最新再生利用技術 では、水をポンプで表面へ汲み揚げ、曝気塔において汚染物質を取り除くか、ま たは吸着剤で汚染物質を除去する。前の方法につい−Ｃは認められていない州も あり、また後の方法は費用が高くつき、将来の問題を生じ得る濃縮毒性物質の生 成を伴う。

別の再生利用方法において、アセテート分解性メタン生成細菌は、ハロゲン化炭 化水素化合物を分解することが報告されている。クロロホルム（ＣＦ）、ブロモ ジクロロメタン（ＢＤＣＭ）、ジブロモクロロメタン（Ｂ　Ｄ　ＣＭ）、ブロモ ホルム（ＢＦ）、四塩化炭素（ＣＴ）、１゜１．１−１−ＩＪりｏｏ−１’ン（ １，１，１−ＴＣＡ）、１　、１　、２　、２−アトラクロロエタン（１，１， ２，２−ＴＥＣＥ）およびＰＣＥは全て、メタン生成混合細菌培養物を接種した 培地中−次基質とし、で使用されたｒセテー　トを含む嫌気性カラムを用いたメ タン生成条件下で実質的に分解される。２日間の保持時間によるこれらの条件下 で操作された連続流固定フィルム実験室規模カラムにより、約１５−４０μｇ／ ｌの範囲のカラム注入濃度で存在するこれらの化合物が実質的に除去された。Ｃ Ｆ、１．１．１−ＴＣＡおよび１．１．２．２−ＴＥＣＥを著しく除去するのに 要求される順化期間は約ｌＯ週間であった。

ブウエアおよびマツカーティー、アプライド・アンド・エンバイアロンメンタル ・マイクロバイオロジー、４５：１２８６−１２９４（１９８３）。

また、他の嫌気性細菌も、ハロゲン化炭化水素含有化合物を分解することが知ら れている。例えば、嫌気性細菌メタノバクテリウム・チル七アウトトロフィクム およびディー・アウトトロフィクムは、四塩化炭素をジーおよびトリクロロメタ ンに変換し、他の塩素化脂肪族化合物を部分的に脱ハロゲン化することが示され た。エグリ等、Ｆ　Ｅ　Ｍ　Ｓ　マイクロバイオロジー　・レター、４３：２５ ７−２６１（１９８７）。上記結果は、メタン生成性または他の嫌気性細菌の使 用による全ハロゲン化炭化水素の完全分解が商業的に実行不可能であることを示 している。これらの微生物は、低い初濃度のハロゲン化炭化水素の場合でさえハ ロゲン化炭化水素崩壊の速度が遅く、嫌気性条件が要求される場合には機能しに くい。

さらに、クロロホルムは、好気性生物「メチロコックス・カブス゛　ラッス」バ スにより細胞１グラム当たり３５ナノモル／分の速度で酸化される。ヒギンズ等 、「ネイチャー」、２８６：５６１−５６４（１９８０）、ハーバ−等、「サイ エンス」、２２１：１１４７−１１５３（１９８３）。「メチロコックス・カプ スラツス」バスにより酸化されなかった他のハロホルム（ただし、四塩化炭素を 除く）の場合も同様の速度での分解が観察された。ヒギンズ等、前出、ハーバ− 等、前出。

ある種のメタン酸化性細菌は、塩素化ハロホルムおよびハロゲン化炭化水素化合 物を分解することが知られている。例えば、３週間空気中０．６％天然ガス（主 としてメタン）の表面混合物にさらされ、３週間の順化期間の最後にカラム流入 水に１５０μｇ／ｌの平均濃度で加えられたＴＣＥを含む水を有する土壌カラム の場合、土壌を通過するのは適用されたＴＣＨの５％未満であった。ウィルソン およびウィルソン、前出。また、湿地から分離されたメタン利用性混合培養物は 、最近、ＴＣＥ、塩化ビニル、塩化ビニリデンおよびジクロロエチレンを二酸化 炭素へ完全に酸化することが示されている。

７オーゲル等、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５１ニア２Ｏ− ７２４（１９８６）。しかしながら、７オーゲル等により報告されたＴＣＥ分解 速度は非常に遅く、細胞１グラム当たり約２．５マイクロモル／時間であった。

さらに、テトラクロロエチレンは混合培養物により酸化されなかった。

上記試験は、幾つかの塩素化ハロホルムおよびハロゲン化炭化水素化合物が適当 な条件下で好気性／嫌気性の組み合わせインキュベージジンにより分解可能であ ることを示している。しかしながら、ハロゲン化炭化水素化合物、例えばＴＣＨ の急速な分解に関するメタン酸化性細菌またはメタノドロア　（ｍｅｔｈａｎｏ ｔｒｏｐｈ）の真の可能性はまだ開発されていない。例えば、ＴＣＥをウィルソ ンおよびウィルソン（前出）により使用された土壌カラムに加えた場合、土壌は 、３週間天然ガス混合物に先に順化していた。同様に、ブウェアおよびマツカー ティー試験において１．１．１−ＴＣＡおよび１．１．２．２−ＴＥＣＥの顕著 な除去に要求される順化期間は約１０週間であった。

偏性メタノドロアは、メタン以外の化合物の代謝からはエネルギーを一切引き出 さないことがかなり前から知られている。ハーバ−等、前出、ヒギンズ等、前出 。しかしながら、メタノドロアは多くの炭化水素化合物を分解することができる 。広い範囲の化合物に対するメタノドロアの酸化能力は、メタノドロアにより産 生される酵素、メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）の特異性の欠如と関連して いる。ハーバ−等、前出、ヒギンズ等、前出。メタノトロフィック細菌のＭＭＯ 系は、０□の開裂およびメタンへの一酸素原子の取り込みによるメタノールの生 成を触媒する。

メタノトロフィック細菌のＭＭＯ系は、生長条件により可溶性または粒子（すな わち、膜結合）形態で存在し得る。プロウス等、「ジャーナル・オブ・ジェネラ ル・マイクロバイオロジーＪ、ｌ　３０：３３２７−３３３３（１９８４）は、 メタノトロフィック細菌メチロシヌス・トリコスポリウムＯＢ　３ｂ（Ｍｔ　Ｏ Ｂ　３ｂ）の生長中における銅利用能が、そのＭＭＯの細胞内の位置（すなわち 、ＭＭＯ活性が細菌の粒子または可溶性７ラクシヨンに位置するか否か）を決定 することを報告しＩ；。しかしながら、メタノトロフィック細菌細胞がＭＭＯの 膜結合（粒子）形態のみを同化する傾向は、可溶性ＭＭＯの大量精製において繰 り返し発生する問題となっている。フォックスおよびリプスコム、「バイオケミ カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」、１５４ ：１６５−１７０（１９８８）。プロウス等（前出）は、粒子ＭＭＯが芳香族ま たは脂環式炭化水素化合物を酸化し得ない点で、ＭｔＯＢ３ｂのＭＭＯの粒子形 態は酵素の可溶性形態とは異なることを報告した。ＭｔＯＢ３ｂのＭＭＯの粒子 および可溶性形態は、両方ともメタン、プロペンおよび様々なｎ−アルカン類を 酸化することが示された。

しかしながら、現在までに、メタノトロフィック細菌の分解能力、特にこれらの 細菌により産生されたＭＭＯの可溶性形態の分解能力を充分に開発することによ り、急速かつ完全にハロゲン化炭化水素化合物を分解した者はいない。例えば、 現在までに報告されたメタノトロフィック細菌によるＴＣＥ分解速度は満足でき ないほど遅いため、商業用途には非実用的である。最適条件下で報告されたＴＣ Ｅ分゛解速度は、細胞１グラム当たり１００マイクロモル／時間を僅かに越える 。フォーゲル等、前出、ネルソン等、アプライド・アンド・エンバイアロンメン タル・マイクロバイオロジー、５４：６０４−６０６（１９８８）、ネルソン等 、アプライド・アンド・エンバイアロンメンタル・マイクロバイオロジー、５２ ：３８３−３８４（１９８６）。過去の試験で報告されたＴＣＨに対するメタノ トロフィック攻撃の時間推移は、ＴＣＥが細菌細胞またはＴＣＥ分解で機能する 酵素に対して何等かの形で毒性を示すことを示唆している。

従って、ＭＭＯの可溶性形態の使用または可溶性ＭＭＯを産生ずる方法で培養さ れたメタノトロフィック細菌の使用による、ハロゲン化炭化水素化合物、例えば ＴＣＥを急速かつ完全に分解する方法が要望されている。

発明の要旨 本発明は、ハロゲン化炭化水素化合物の微生物分解法を提供する。

この方法は、ハロゲン化炭化水素化合物、例えばＴＣＥを細胞１グラム当ｔ−り 約５００〜約１００００マイクロモル、７時間の速度で完全に分解するのに有効 な量のメタン酸化性細菌を上記ハロゲン化炭化水素化合物に接触させることを含 む。メタン酸化性細菌は連続培養条件下で培養され、上記細菌を、空気とメタン が各々約２５：ｌ−１：１０の割合で含まれている気体混合物の連続流にさらす 。連続培養細菌は、可溶性メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）を産生する。

好ましくは、本発明によるハロゲン化炭化水素分解速度は、細胞１グラム当たり 約１０００〜約９０００マイクロモル／時間である。

好ましい態様において、我々は、メチロシヌス・トリコスポリウム０Ｂ３ｂ細胞 の乾燥重量１グラム当たり２０００〜４０００マイクロモルフ′時間のＴＣＥ分 解速度を達成した。本発明は、１ｏｏｏ。

マイクロモル／ｌ以下の初濃度で存在するハロゲン化炭化水素の分解法を提供し 、好ましくは痕跡量のＴＣＥから約１０００マイクロモル／ｌまでの初濃度での ハロゲン化炭化水素化合物、例えばＴＣＥの分解法を提供する。さらに、連続培 養細胞は、他の試験で要求される細胞密度よりかなり低い細胞密度での可溶性Ｍ ＭＯを産生ずさらに、好ましい態様において、メチロシヌス・トリコスボリウム 細胞は、約０．１０ｇ／ｌ〜約２０ｇ／ｌの量、最も好ましくは約０゜２〜２． ０ｇ／ｌの量で使用される。連続培養に使用される空気／メタン混合物は変化し 得る。我々は、好ましくは、ＴＣＥの分解は、メタンが約１〜約２０％飽和の量 で存在する場合に刺激されることを見出した。

この方法は、それが急速かつ完全にハロゲン化炭化水素化合物、例えばＴＣＥを 分解する点で有利である。メタン酸化性細菌を培養するために本発明で使用され る連続培養条件は、ＴＣＥ濃度が顕著な場合に細菌によるＴＣＥの完全な分解を 確実にする。さらに、これらの連続培養条件の利用により、充分な量のＭＭＯ可 溶性形態を産生するメタン酸化性細菌が生成される。本発明の連続培養条件を用 いると、培養細胞中のＭＭＯの量は乾燥細胞重量の約５〜３０％である。

また、本発明は、ハロゲン化炭化水素化合物を完全に分解し得るメタン酸化性細 菌の培養方法を提供する。この方法では、メタン酸化性細菌を連続培養すること により、細菌によって、ハロゲン化炭化水素化合物の完全分解に有効な量の可溶 性ＭＭＯを産生させる。

連続培養条件には、空気とメタンを約２５：１〜約ｌ：２０、好ましくは約１０ ：１〜約１：２、および最も好ましくは約２．１：１の比率で含む気体混合物へ の暴露が含まれる。好ましくは、培養細胞中のＭＭＯの量は、乾燥細胞重量の約 ５％〜約３０％である。

さらに、本発明は、メタンモノオキシゲナーゼを用いたハロゲン化炭化水素化合 物の分解方法であって、メタン酸化性細菌を連続培養し、そこから可溶性メタン モノオキシゲナーゼを分離し、可溶性メタンモノオキシゲナーゼを精製すること により精製成分レダクターゼ、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼを得、精製成分を ハロゲン化炭化水素化合物の水性スラリーに加えることにより混合物を形成させ 、ハロゲン化炭化水素化合物の完全分解に充分な時間混合物を反応させることを 含む方法を提供する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求の・　範囲から明 白になるはずである。

図面の簡単な記載 図１は、２つの異なる細菌細胞密度値で測定された、連続培養ＭｔＯＢ３ｂによ るＴＣＥ分解の時間推移を示す図である。

図２は、異なるレベルのメタンの存在下での連続培養ＭｔＯＢ３ｂによるＴＣＥ 分解の時間推移を示す図である。

図３は、本発明による培養物の培養に使用されるタイプの恒成分培養槽の組立図 である。

図４は、本発明による培養物の培養に使用されるタイプの恒成分培養槽生長フラ スコの頭部を示す。

図５は、本発明による培養物の培養に使用されるタイプの恒成分培養槽生長フラ スコの本体を示す。

発明の詳細な記載 ハロゲン化炭化水素含有化合物 本発明は、ハロゲン化炭化水素化合物を急速かつ完全に分解する方法を提供する 。本発明は好ましくはトリクロロエチレン（ＴＣＥ）の分解方法を提供するが、 本発明方法により分解され得る他のハロゲン化炭化水素としては、テトラクロロ エタン、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ｌ−ジクロロエタン、ジクロロエタ ン（ＤＣＡ）およびクロロホルムがあるが、これらに限定されるわけではない。

本発明の好ましいハロゲン化炭化水素化合物であるＴＣＥ（１，１゜２−トリク ロロエテン）は、化学構造ＨＣＩｃ　−ＣＣ１２を有する脂肪族ハロゲン化炭化 水素である。ＴＣＥは、主に耐火性溶媒として業界では使用される。それは、ア ルカリによりアセチレンブトラフロリドから１分子の塩化水素を除去することに より製造され得る。

メタノトロフィック細菌 本発明では、メタン酸化性細菌を利用することにより、上記ハロゲン化炭化水素 含有化合物を分解する。好ましくは、メチロシヌス・トリコスポリウムＯＢ　３ ｂ（Ｍｔ　ＯＢ　３ｂ）株の細菌を用いて、酵素メタンモノオキシゲナーゼ（Ｍ ＭＯ）の可溶性形態が生成される。ＭＭＯを産生する他のメタン酸化性細菌も本 発明において有用であり得る。これらの他の細菌としては、メチロシヌス・スボ リウム、メチロシナス・バルブスおよびメチロモナス、メチルバクターおよびメ チロコックス属の他の種類があるが、これらに限定されるわけではない。

ＭｔＯＢ３ｂは、炭素およびエネルギーのその唯一の供給源としてメタンを利用 することにより生長し得る偏性Ｉ＋型メタノトロフィック細菌である。この細菌 は、ホウィッテンバリー等（「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオ ロジーＪ、６１：２０５−２１８（１９７０））により発見された。それは、外 生胞子を形成し、典型的には幾つかの細胞のロゼツト形状クラスターから見出さ れるグラム陰性棒または西洋ナシ形状細菌である。メタン培地におけるＭｔＯＢ ３ｂコロニーは白色−黄色である。他のＩＩ型メタノトロフと同様、Ｍｔ、　Ｏ Ｂ　３ｂは、完全なトリカルボン酸サイクルを含み、ホルムアルデヒド同化にお けるセリン経路を利用する。ＭｔＯＢ３ｂのＤＮＡは、６２．５モル％のＧ＋Ｃ 含を率を有する。ＭｔＯＢ３ｂは、４５°Ｃではなく３７°Ｃで生長する。Ｍｔ ＯＢ３ｂの生長は、酵母抽出物またはホウィッテンバリー等（前出）により試験 された他の多数炭素化合物により刺激されない。ＭｔＯＢ３ｂにより形成されｔ ；きよう膜は、細胞壁から放射状に広がる短い繊維により構成され、多糖類染色 に対して応答しない。本発明で使用されるＭｔＯＢＳｂ株は、イギリス国ワーウ ィック・ユニバージティーのＲ，ホウィッテンバリー教授から得られたもので、 ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリア（アバーディ ーン、スコツトランド）に寄託され、ＮＣ］、Ｂ−１１１３１の番号が割り当て られている。

ハロゲン化炭化水素化合物の分解 本発明は、ハロゲン化炭化水素化合物の微生物分解法を提供する。

この方法は、細胞１グラム当たり約５００〜約１００００マイクロモル／時間の 速度で上記ハロゲン化炭化水素化合物を完全に分解するのに有効な量のメタン酸 化性細菌、好ましくはＭｔＯＢ３ｂをハロゲン化炭化水素化合物、好ましくはＴ ＣＨに接触させることを含む。本発明方法では、メタン酸化性細菌を連続培養条 件下で培養させることにより可溶性Ｍ　ｒｖｉ　Ｏを産生させる。ここで使用さ れているメタン酸化性細菌の有効（な）量とは、記載された速度でＴＣＥを完全 に分解し得る細菌の量である。さらに、この明細書で使用されている「連続培養 条件」という語は、メタン酸化性細菌が、空気とメタンを各々約２５：ｌ−１： ２０、好ましくは約１０：ｌ−１：２、および最も好ましくは約２．１＋１の比 率で含む気体混合物の連続流にさらされている連続置換培地において培養された ことを意味する。連続培養および生長パラメーターは、コーニツシュ、［ジャー ナル・オプ・ジェネラル・マイクロバイオロジーＪ、１３０：２５６５−２５７ ５（１９８４）に記載されている通りであり、連続培養の希釈率は培養物１容量 当たり約０．１容量／時間である。気体混合物の空気対メタン比率は変化し得、 我々は、１−２０％飽和の濃度でのメタンがＴＣＥ酸化を大いに刺激することを 見出した。

我々は、本発明で使用されるメタン酸化性細菌の慣用的（すなわち、フラスコ震 とう、非連続的）培養方法は、顕著な初濃度の′ｒＣＥを含む培地からのＴＣＥ の除去程度の点であまり満足できるものではないことを測定した。さらに具体的 には、我々は、ｌｐｐｍまたはそれ以上のＴＣＥ初濃度で、慣用的方法（フラス コ震とう）により生長させたＭｔＯＢ３ｂを利用した場合、ＴＣＥの酸化は約５ ０％で除去を停止することを見出した。

この方法により分解されるハロゲン化炭化水素化合物を、好ましくは約０．１（ １−２０ｇ／ｌの割合でメタン酸化性細菌を含む水性媒質中でメタン酸化性細菌 と接触させ、さらに好ましくは約０．２〜２゜Ｏｇ／ｌの割合のメタン酸化性細 菌を使用する。本発明で使用される好ましい水性媒質をヒギンズ培地と称す。ヒ ギンズ培地の製造方法は、コーニッシュ等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・ マイクロバイオロジー」（前出）により開示されている。ヒギンズ培地の製造に 関して本発明で利用される方法は、下記実施例１で示されている。ヒギンズ培地 は、最少塩類硝酸培地として分類され、約２５０μｇ／ｌのＣｕ”十を含有する 。本発明での使用に適した他の水性媒質には、バット等（「インターナショナル ・ジャーナル・オブ・システマティノク・バクテリオロジー」、２６：２２６− ２２９（１９７６））により記載された培地並びにＡＭＳおよびＮＭＳ最少培地 が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。ホイツテンバーグ等、「ジ ャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー」（前出）参照。

この方法は、１００００マイクロモル／１以下の初濃度、さらに好ましくは痕跡 量から１０００マイクロモル／ｌまでの濃度で存在するハロゲン化炭化水素化合 物、好ましくはＴＣＥを完全に分解させる。これらの濃度値は、炭化水素化合物 、細菌および水性媒質を含む溶液中でのハロゲン化炭化水素化合物の初濃度を表 す。痕跡量とは、後記実施例に記載されている検定技術による最低検出限界を指 すものと理解される。

この方法は、細胞１グラム当たり少なくとも５００マイクロモル／時間のＴＣＥ 分解速度を達成し、ＴＣＥ分解速度範囲は細胞１グラム当たり約５ｏｏ−ｉｏｏ ｏｏマイクロモル／時間である。好ましくは、この範囲は細胞１グラム当たり約 １０００−９０００マイクロモル／時間である。さらに好ましくは、この方法は 、細胞１グラム当たり約２０００−４０００マイクロモル／時間のＴＣＥ分解速 度を達成する。ただし、「細胞１グラム」とは、メタン酸化性細菌細胞の乾燥重 量に基づく１グラムである。

メタン酸化性細菌の培養 さらに本発明は、ハロゲン化炭化水素化合物、好ましくはＴＣＥを完全に分解し 得るメタン酸化性細菌の培養方法に関するものである。この方法は、最少塩類培 地、例えばヒギンズ培地における連続培養条件下でメタン酸化性細菌、好ましく はＭｔＯＢ３ｂを培養することを含む。上記連続培養条件は、空気とメタンが約 ２５：ｉｌ：２０、好ましくは約１０二１−１：２、および最も好ましくは約２ ．１：１の比率で含まれる気体混合物の連続流に細菌をさらすことを含む。好ま しくは、ＴＣＥ分解中の気体混合物は、約１−２０％飽和の濃度でメタンを含む 。この方法は、連続培養メタン酸化性細菌が、ハロゲン化炭化水素化合物の完全 分解に有効な量の可溶性ＭＭＯを含むことを規定している。好ましくは、連続培 養細菌細胞において産生される可溶性ＭＭＯの量は、乾燥細菌細胞重量の約５− ３０％である。

メタンモノオキシゲナーゼ メタノトロフィック細菌ＭｔＯＢ３ｂは、酵素メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭ Ｏ）の粒子（すなわち、膜結合）および可溶性形態の両方を含み得る。トング等 、ＦＥＢＳレターズ、５８：２９３−２９９（１９７５）は、ＭＭＯがＭｔＯＢ ３ｂの粒子フラクションに位置すること、およびＭＭＯがホスホリパーゼＤでの 処理、音波処理またはトリトンＸ−１００処理により粒子７ラクシヨンから可溶 化され得ることを報告した。トング等はまた、アスコルビン酸塩がＭｔＯＢ３ｂ の粗抽出物またはその粒子フラクションの両方においてＮＡＤＨに代わる有効な 電子供与体代用物であるが、関連したＣＯ−結合チトクロムＣはＭＭＯ活性に不 可欠であると思われることを報告した。しかしながら、スターリングおよびダル トン、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリーＪ、９６：２０ ５−２ｉ　２（１９７９）は、後に、ＭｔＯＢ３ｂの細胞不含有抽出物中のＭＭ Ｏは可溶性であると思われること、および、それは活性に関する電子供与体とし てＮＡＤ（Ｐ）Ｈを要求することを報告した。さらに、彼等は、アスコルビン酸 塩がＭｔＯＢ３ｂのＭＭＯに対して有効な供与体ではないことを報告した。また 、スターリング等、「バイオケミカル・ジャーナル」、１７７：３６１−３６４ （１９７９）は、ＭｔＯＢ３ｂの粗抽出物に存在する場合にその基質特異性を含 む幾つかの方法でＭＭＯの特性検定を行った。

ＭＭＯは、メタンの酸化代謝における第一段階を触媒し、その場合、０．は開裂 され、１個の酸素原子がメタンのＣ−Ｈ結合中へ挿入されることにより、メタノ ールが生成される。７オツクス等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリーＪ、２６３：１０５５３−１０５５６（１９８８）。この段階の反応化 学量論を下記に示す。

ＣＨ４＋Ｈ（＋）＋Ｏ□＋ＮＡＤＨ−ＣＨ３ＯＨ＋Ｈ，Ｏ＋ＮＡＤメタン　ニコ チンアミド　メタノール　ニコチンアミドアデニン　アデニン ジヌクレオチド、　ジヌクレオチド、 還元　酸化 フォックスおよびリプスコーム、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル ・リサーチ・コミュニケーションズＪ、１５４：１６５−１７０（１９８８Ｘこ れを引用して説明の一部とする）は、ＭｔＯＢ３ｂからの精製ＭＭＯを提供し、 ＭｔＯＢ３ｂのＭＭＯ系を３成分に分割した。彼等は、これら３成分が全てメタ ン酸化活性のインビトロ再構成に必要とされることを見出した。これらの成分は 、フォックスおよびリプスコームにより各々レダクターゼ、成分Ｂおよびヒドロ キシラーゼとして示されｔこ。フォックスおよびリプスコームの精製方法で使用 されるＭｔＯＢ３ｂの細胞は、コーニツシュ等、「ジャーナル・オブ・ジェネラ ル・マイクロバイオロジーＪ、１３０：２５６５−２５７５（１９８４）の記載 に従い連続培養で培養された。

こうして培養されたＭｔＯＢ３ｂは、再生可能な形でＭＭＯの可溶性形態を発現 し、高収率で培養され得た。

精製メタンモノオキシゲナーゼによるハロゲン化炭化水素の分解状々は、精製Ｍ ＭＯ成分がＴＣＥを酸化することを見出した。従って、本発明は、メタン酸化性 細菌、好ましくはＭｔＯＢ３ｂを連続培養することによるハロゲン化炭化水素化 合物の分解方法であって、空気とメタンが約２５：１−１：２０、好ましくは約 １０：１−１：２、および最も好ましくは約２．１＝１の比率で含まれる気体混 合物の連続流を含む連続培養条件に上記細菌をさらしくただし、こうして培養さ れた細菌は、乾燥細菌細胞重量の約５−３０％の量で可溶性ＭＭＯを含む）、連 続培養された細菌細胞から可溶性ＭＭＯを分離し、可溶性ＭＭＯを精製すること により、レダクターゼ、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼを含む精製成分が得られ 、好ましくは３成分の重量比が各々約１１０：１３：２５０である、有効量の精 製成分を７−ロゲン化脂肪族炭化水素化合物、好ましくはＴＣＨの水性スラリー に加えることにより、混合物が形成され、この混合物を上記ノーロゲン化脂肪族 炭化水素化合物の完全分解に充分な時間反応させることを含む方法を構想するも のである。

以下、詳細な実施例により、本発明についてさらに記載する。

実施例１ ヒギンズ培地の製造哀 本発明での使用に適したメタン酸化性細菌の培養用培地を供給するため、下記溶 液を調製し、４℃で貯蔵した。

１００Ｘヒギンズ塩類溶液 成分：　容量％： Ｎ　ａＮ　Ｏｓ　８５ に、Ｓｏ、　１７ ＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ３，７ ＣａＣ１ｚ・２Ｈ！０　０４ １００ｘヒギンズ燐酸溶液 成分：　容量％： ＫＨ２Ｐ０．　５３．０ Ｎａ２ＨＰＯ４８６，０ この溶液をｐＨ７，０に調節する。

５００ｘヒギンズ微量金属溶液 成分：　容量％： Ｚｎ５Ｏａ・７Ｈ！ＯＯ，２８７ Ｍｎ５　Ｏａ　”　７　Ｈ２Ｏ０−２２３Ｈ３ＢＯ３０，０６２ ＮａＭｏＯ４・２Ｈｔｏ　０．０４８ ＣｏＣ１ｚ’　６Ｈ２００，０４８ ＫＩ　Ｏ，０８３ ＣｕＳＯａ＠５ＨｘＯＯ−１２５ １リツトルの微量金属溶液に対し１ミリモルＨ２ＳＯ４１ｍ１を加える。

１　ヒギンズ培地の製造方法は、コーニッシュ等、［ジャーナル・オブ・ジェネ ラル・マイクロバイオロジーＪ、１３０：２５６５−２５７５（１９８４）に開 示されている。

１０００ｘヒギンズ鉄溶液 成分：　濃度： ＦｅＳＯ４ｊ　７　ＨｚＯ１，１２ｇ／　１００ｍ１１００ｍｌのヒギンズ鉄溶 液に対し１ミリモルＨｚＳＯ＊５ｍｌを加える。

所望の培地１リツトルについて１０ｍ１のヒギンズ塩類溶液、１０ｍ１のヒギン ズ燐酸溶液および２ｍｌのヒギンズ微量金属溶液を一緒に混合した。蒸留水を加 えて最終容量とした。寒天プレートが調製されている場合、液体培地１リツトル 当たり１７ｇの精製寒天を加えた。混合物を２０分間ゆっくり排出させながらオ ートクレーブ処理した。培地がプレートへ注ぐのに充分な程度冷却した時点、ま たは接種前に、１リツトル当たりろ過滅菌によりｌ＋ａｌのヒギンズ鉄溶液を加 え、注意深く混合した。ヒギンズ培地寒天プレートに、赤いストライプの印を付 した。

実施例２ ＭｔＯＢ３ｂの連続培養 実施例１の記載に従い製造されたヒギンズ培地において１世代糸たり約１０時間 の割合で細菌が生長する、ＭｔＯＢ３ｂの連続培養を行った。連続培養物を、０ ．１８５リツトル容量を有する恒成分培養槽生長チャンバー中で生長させた。Ｊ 、デバンフイリスおよびＲ，ハンソン、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー Ｊ、９８：２２２−２２５（１９６９）、これを引用して説明の一部とする。

゛　上記装置は、無菌温湿空気が供給された水ジヤケツト生長チャンバーおよび 培地の一定供給装置により構成される（図３参照、矢印は媒質空気、温水および 流出水の流れを示す：酸素は空気中から供給された）。図３について述べると、 アルファベット表示は、（Ａ）恒成分培養槽生長７ラスコ、（Ｂ）媒質ポンプ、 （Ｃ）媒質レザーバー、（Ｄ）恒温浴、（Ｅ）恒温ヒーターポンプ、（Ｆ）空気 加湿チャンバー、（Ｇ）空気滅菌チャンバー、（Ｈ）空気ポンプおよび（１）培 養物採取フラスコを示す。

ａ、生長チャンバー このチャンバーは２つの部分；頭部（図４）および本体部分（図５）により構成 される。頭部は、媒質用および空気用の２つの部分を含み、すりガラスジヨイン トにより本体部分へ堅固に適合している。

本体は水被覆（ジャケット）されており、チャンバー中で一定容量を維持するた めのオーバー７０−装置を有する。このオーバー７０−・ダクトへの入り口はガ ラス・バックルにより遮蔽されており、これは、散布により生じる微量の泡が越 流を残すのを防ぐことによりチャンバーにおける容量を一定に保つのを助ける。

生長チャンバーの最大容量は２００ｍ１であった。

ｂ、恒温装置 Ａ、Ｂ、ブラウン・サーモミックスＩＩ（メルスンゲン、ドイツ国）恒温水ポン プを用いることにより、生長チャンバーの水ジヤケツト全体で温水（３０℃）を 循環させた。また、この温水は空気を加熱し、生長フラスコへ通す（図３参照） 。サーモミックスＩＩは０．１℃の変化に敏感であるため、温度変化は要求され る温度制御限度内に充分収まる。

Ｃ０曝気システム 空気の泡を用いることにより、酸素を供給し、細菌培養物の混合を促した。Ｂ２ −Ｆモデルのアクアリウム・ポンプ（ニージーンＧ。

ダナー・マニュファクチュアリング・カンパニー）により、大気中から空気をポ ンプで注入した。最初に、焼結ガラス散布器により１％ＨｇＣｌ、を含む洗浄瓶 へ空気を通し、次いで、洗浄瓶に含まれた滅菌水の温浴（３０°Ｃ）へ通し、部 分的に水浴中に沈めた。次いで、焼結ガラス気体散布管により生長チャンバーへ 空気を通した。

２５ｍ１のＭｔＯＢ３ｂ細胞を、１８５１のヒギンズ培地へ接種し、３０″Ｃの 生長チャンバー中でインキュベーションした。新しい培地を連続的に加え、排出 させた。連続空気供給はアクアリウム・ポンプにより行い、メタンは加圧タンク から供給した。気体混合物は、約１：１（ＣＨ，：メタン）の容量比で適用され た。生長容器を激しく撹はんした。ＭｔＯＢ３ｂ細胞を様々な混濁度に生長させ 、スペクトコニツタ２０分光計（６００ｎｍ）において測定し、その時点で２相 （頭部）検定を行った。

実施例３ ＴＣＥ分解速度の検定 １、頭部無しのインキュベーション２ 全般的プロトコル： ＭｔＯＢ３ｂの各培養物を３０°Ｃに予熱した１、８ｍｌのシーラムボトルに加 え、１１＋ｎｎ＋のテフロン補強ゴム隔壁で密封した。同様の初回溶解酸素レベ ルを要求する比較を行うため、まず嫌気性調合（ｍａｋｅ−ｕｐ）培地（通常０ 　、６　ｍｌ）を瓶に加え、次いで瓶を密封した。実施例１に従い製造された空 気飽和３０℃ヒギンズ培地を気密性注射器（１，０ｍ１）により加えると同時に 、２５ゲージ針を通して空気を抜くことにより１気圧を維持した。最後に、残り の頭部を２５ゲージ針により抜きながら培養物を加えた（所望の密度に濃縮）。

ＴＣＥを密封瓶の下部で注射器により加え、瓶の上部において注射器で等容量の 培養物を除去した。検定時間経過はＴＣＥ（基質）を加えることから開始された 。プラットホーム震とう器上２００　ｒｐｍで撹はんしながらインキュベーショ ンを３０℃で行った。

２１０億に対する部レベルでの水中ハロメタン測定用の慣用的液体−液体抽出方 法は、ヘンダーソン、Ｊ、Ｅ、、Ｇ、Ｒ，ペイトンおよびＷ、Ｈ，グレーズによ る「アイデンティフィケーション・アンド・アナリシス・オブ・オーガニック・ ポリュータンン・イン・ウォーターＪ（Ｌ、Ｈ，ケイス編、アン・アーバー・サ イエンス・パブリッシャーズ）、１０５−１１１頁（１９７６）に開示されてい る。

所望の時点で検定を抽出により終結させた。液体−液体抽出技術では、内部標準 として１，２−ジブロモエタンを含む００５ｍ１（７）ペンタンを使用し、これ を気密性注射器により逆向き検定瓶に加え、最初の針レベルより低い針を備えた 注射器で排水溶液を集めた。１０分間５０００　ｒｐｍでの瓶の遠心分離により 分配を平衡状態に到達させた。有機層を気密性注射器により除去し２、クロマト グラフィー分析用の１ｍｌのシーラムボトルに入れた。ただし、試料の希釈また はスプリット注射が必要な場合もあった。電子捕獲検出法が好ましかった。下記 のガス・クロマトグラフィー操作パラメーターを使用した。

表１ ガス・クロマトグラフィー・パラメーターｃｃ：　ＨＰ５７９０Ａ（ＥＣＤによ る）カラム：　ノンーパクド　Ｒ３Ｌ−１６０厚膜キヤピラリー（オールチック ） 注射温度：　１５０℃ 検出温度＝　２５０°Ｃ ランピング＝　３５°Ｃ（第１分）、１５℃／分で１２０℃にランピング 担体気体：■（２ 担体気体流速：　８　ｍｌ／ｌ ／分注量容量　１ｍ１ ＴＣＥ分解の無頭部検定： 全般的に上述した無頭部検定方法に従い下記試験１，２および３を行った。これ ら３試験の結果の要旨を下記表２に示す。

表２＝無頭隙検定の結果の要旨 試験培養物混濁度（吸光度６００ｎｍ）　ＴＣＥ利用速度（細胞１ｇ当たりのマ イクロモル／時間）（無頭部検定） １　１．３１０　３３６ ２　１．４１０　１０７０ ３　１．４６０　２４００ 使用された正確な検定プロトコルおよび各試験で得られた詳細な結果を下記に示 す。

試験ｌ−無頭頭部定 プロトコル： 吸光度Ａ、。。−１，３１０による恒成分培養槽（方法）で生長させたＭｔＯＢ ３ｂ細胞懸濁液細胞懸濁液２熱ｌた１２０ｍ１シーラムボトル中、実施例１に従 い製造された３０℃ヒギンズ培地８ｍｌに加えた（１１５希釈率Ａ、。。−０− ２５２）。瓶を空にし、０％メタン含有率の空気で再び満たした。一つの瓶を加 熱殺菌し、対照として使用した。

１、．７９ｍ１のＭｔＯＢ３ｂ細胞懸濁液を加え、１．８ｍ１（７）シーラムボ トルを密封した。１１．２５μｌの４ミリモルＴＣＥストックを加えることによ り、２５マイクロモルの名目ＴＣＥ初濃度で検定を開始した。０．６ｍｌ水溶液 を内部標準どしてｉ　ｐｐｍの１．２−ジブロモエタンを含むペンタンと置き換 えることにより、２．５．５．０．１０．０８よび１５．０分目に瓶を廃棄した 。

試験１の結果を下記表３に示す。

表３−試験ｌの結果 操作ｌ結果： 加熱殺菌対照、０％メタン： 時間　［Ｔ　ＣＥ　］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５分　１．８３６　１３ ．９７ ５．０分　２．６９１　２０．４８ １５．０分　２．８８３　２１．９４ 操作２結果： １１５希釈率、０％メタン： 時間　［ＴＣＥ］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５分　２．１０３　１６．０ １ ５．０分　０．２６１　１．９９ １０．０分　０．２５５　１．９４ １５．０分　０−２０４　１．５５ 試験２−無頭部検定 上記試験ｌの場合と同じ方法に従い試験２を行ったが、ただし、１／２０および １１５０希釈を行った。試験２の結果を下記表４に示す。

表４−試験２の結果 Ａ、。。−色成分培養槽から１．４１０１／２０希釈Ａ６゜。−０，０６９ １１５０希釈Ａ、。。−０，０２６ 名目ＴＣＥ初濃度−２５マイクロモル 操作ｌ結果二 加熱殺菌対照、０％メタン： 時間　［ＴＣＥ］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５分　２．７４９　２０．９ ２ ５．０分　２．８６１　２１．７７ ＩＯ０θ分　２．９０１　２２．０８ １５．０分　３．１３２　２３．８４ 操作２結果： Ｉ／２０希釈率、０％メタン： 時間　［ＴＣＥ］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５分　４．２２７　３２．１ ７ ５．０分　３．４７５　２６．４５ １Ｏ９０分　２．８４３　２１．６４ １５．０分　２．７４２　２０．８７ 操作３結果： １１５０希釈率、０％メタン： 時間　［ＴＣＥ］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５分　２．９２４　２２．２ ５ ５．０分　１．８４３　１４．０３ １Ｏ１０分　２．７１７　２０．６８ １５．０分　３．１８３　２４．２２ 試験３−無頭部検定 予熱した（３０　’Ｃ）　１２０ｍｌの血清瓶中、色成分培養槽（Ａ　ａｏｏ− １−４６０）中で生長させた１ｍｌのＭｔＯＢ３ｂ細胞懸濁液を、実施例１の記 載に従い製造された９ｍｌの３０℃ヒギンズ培地と混合した。新鮮なヒギンズ培 地ではなく、色成分培養槽から「使用済み」培地を加えることにより（１０分間 １１００００ｒｐでの遠心分離により細胞を沈澱させた後の傾しゃ培地）、一つ の瓶を調製した。瓶を２０ｍｍのテフロン補強ゴム隔壁で密封し、空にし、空気 （０％メタン）で再び満たした。一つの瓶を加熱殺菌し、対照として使用した。

１．７６ｍ１のＭｔＯＢ３ｂ細胞懸濁液を加え、１．８ｍｌの血清瓶を密封した （２５ゲージ針を用いて、圧力を平衡状態にした）。４５μｍの４ミリモルＴＣ Ｅストックを加えることにより、検定を開始した。震とう浴上で撹はんしながら 瓶を３０°Ｃでインキュベーションした。０．６ｍｌの水溶液を、内部標準とし てｌ　ｐｐｍの１．２−ジブロモエタンを含むペンタンと置き換えることにより 、２．５，５．０、ｌ０８０．１５．０および２０．０分目に瓶を廃棄した。Ｅ ＣＤを用いてＨＰ５７９０Ａ　ＧＣにおいて分析を行った。

試験３の結果を下記表４に示す。

表４−試験３の結果 Ａ　ａ　ｏ　ｏ−色成分培養槽から１．４６０１／ｌ　Ｏ希釈　Ａ６．、＝０． １４０名目ＴＣＥ初濃度＝＝ｌＱＯマイクロモル（水中４ミリモルのＴＣＥスト ックを使用） 乾燥重量−〇−１０ｇ／ｌ 操作ｌ結果： 加熱殺菌対照、０％メタン： 時間、分　［Ｔ　ＣＥ　］、ｐｐｍ　［ＴＣＥ］、μＭ２．５　１５．６７９　 １　ｉ９．３３５．０　１４．７１３　１１１．９８ １０．０　１４．７６０　１１２．３４１５．０　１５．２３０　１１５．９１ ２０．０　１４．６９１　１１１．８１操作２結果： ヒギンズ培地中１／ｌＯ希釈、θ％メタン：時間、分　［ＴＣｔＪ、ｐｐｍ　［ ＴＣＥ］、μＭ　速度、μＭ／時間／細胞１ｇ２．５　１４．１１９　１０７． ４６ ５．０　１４−６５１　１１１．４１ １０．０　１１．９８１　９１．１９ １５．９　８．４０６　、６３．９８　３２００（１０分−１５分）２０．０　 ７．２０８　５４．８６ 操作３結果： 恒成分培養槽からの使用済ヒギンズ培地中ｌ／１０希釈、０％メタン： 時間、分　［ＴＣＥ］　、　ｐｐｍ　［ＴＣＥ］　、ｐ　Ｍ　速度、ｔｔＭ／時 間／細胞１ｇ２．５　１４．２７７　１０８．６６ ５．０　１３．７５７　１０４．７０ １０．０　１２．９２４　９８．３６ １．５．０　８．５４３　６５．０２　３９６０（１０分−１５分）２０．０　 ７．６５０　５８．２２ ＴＣＨの最も急速な酸化が行なわれた場合、反応における上記時点での速度は、 細胞１ｇ当たり約３５００マイクロモル／時間であった。この速度は、メタンを 反応混合物に加えても刺激されなかった。

上記時間中メタンの存在下におけるＴＣＥ酸化速度は直線であり、ＴＣＥ酸化は さらに完全である。また、Ｔ　ＣＥ酸化は、低濃度のメタンの存在下でさらに急 速に行なわれる（表７）。従って、細胞は、最適条件下細胞１ｇ当たり１０００ ０マイクロモル／時間の速度でＴＣＥを酸化し得るものと考えられる。

２、頭部がある場合のインキュベーションＭｔＯＢ３ｂの各培養物を２ｍｌ量で １０ｍ１のシーラムボトルに加えた。瓶を２０ｍ１のテフロン補強ゴム隔壁で密 封した。ＴＣＥを加えることにより、検定を開始した。頭部は瓶内の総容量の８ ０％を占めたが、ＴＣＥ濃度は２ｍｌ水相に基づいて加えられた。ＴＣＥは主と して頭部に存在した。することにより、液相およびガラス間の頭部において化合 物をトラップすることにより生じ得るＴＣＥ喪失を阻止するノ；めに、全ての瓶 を逆向きにした。試料を３０℃で撹はんしながら（プラットホーム震とう器上２ ００　ｒｐｍ）逆向きでインキュベーションした。

ＧＣ較正曲線の作成 ガス・クロマトグラフへの頭部の直接注入により頭部インキュベーションを分析 した。この方法は、試料を犠牲にせずに遂行され得る。定量用の正常な較正曲線 を作成することは重要である。最善の外部標準化方法は、検定を実施し、ＴＣＥ を加える前に８０°Ｃで１０分間加熱殺菌すると想定して試料を製造することで ある。試料を３０分間試験条件下でインキュベーションすることにより、ＴＣＥ が多くの相（空気、水、細胞物質など）間で分配されるのに適当な時間放置した 。頭部試料をＦＩＤまたはＥＣＤを用いてガス・クロマトグラフへ注入した。多 くのＴＣＥ濃度を用いることにより、正常な較正曲線が得られた。

実施例４ 頭部検定によるＴＣＥ分解 実施例２記載の連続培養からの細菌細胞または使用済ヒギンズ培地で希釈した細 胞（２＋ｎｌ）を検定ガラス瓶（１０ｍｌガラス瓶）へ加えることにより、ＴＣ Ｅ分解の頭部検定を行った。

使用済ヒギンズ培地中の細胞の希釈率は、ＴＣＥ酸化速度に全（影響を与えなか った。従って、培地中に防御性化合物が存在するとは思われない。

加熱殺菌対照は、ＴＣＥがガラス瓶から失われなかったことを示しｔこ。

２相頭隙検定におけるＴＣＥ利用速度を下記表６に示す。電子捕獲検出器を備え ｔ；ガス・クロマトグラフからのレコーダーの記録のピーク高から速度を計算し た。表１に記録されたガス・クロマトグラフ・パラメーターをここでは使用しＩ ；。

表４−２相検定におけるＴＣＥ分解 検定ガラス瓶中　ＴＣＥ初濃度　速度、酸化されたＴＣＥの細胞密度（ｇ／ｌ） （マイクロモル）　μＭ／細胞細胞１侍、５２１　２２’　３０８ ．３４７　２２　４６５ ．１７３　２３　４６１ ．０７０　２２　８０８ 実施例５ ＴＣＥ分解速度に対するＭｔＯＢ３ｂ細胞密度の影響この実施例では、連続培養 （実施例２で生成）の細胞密度を０．８２５ｇ／ｌから０．６９５ｇ／ｌに高め た。図１に示されている通り、低細胞密度でのＴＣＥ分解速度は、８０μＭのＴ ＣＥ初濃度で細胞１ｇ当たり除去されたＴＣＥ１２００マイクロモル／時間に増 加しｌこ。

培養中のこれらの細胞によるメタン酸化速度は、細胞１ｇ当Ｉ；す２８６０マイ クロモル／時間であった。

また、図１に示された２つの異なるＭｔＯＢ３ｂ細胞密度での曲線は、低細胞密 度の場合、ＴＣＥ酸化が高細胞密度の場合よりも不完全であったことを示す。こ れは、反応性中間体化合物との反応に利用可能なバイオマスがさらに多く存在す るため、高密度での細胞が毒性中間体に対して抵抗することを示している。

別法として、高細胞密度における１単位量当たりの酸化速度が遅い場合、毒性中 間体の生成速度がそれらのさらに分解される速度まで制限されＩ；可能性がある 。

実施例６ 単−相検定によるＴＣＥ分解 気体移動が高細胞密度での酸化速度を制限するという仮説を試験するために、実 施例３記載の無頭部検定用技術を用いた単−相検定においてＴＣＥ分解速度を検 定した。この検定は、約０．１６０ｇ／ｌのＭｔＯＢ３ｂ細胞密度および８０マ イクロモルのＴＣＥ初濃度で行なわれた。ＴＣＥ酸化速度は、細胞１ｇ当たり２ ４００マイクロモル／時間または３１５ｍｇ、／時間であった。

実施例７ ＴＣＥ分解中に存在するメタンの作用 この実施例では、ＴＣＥ酸化速度に対するＴＣＥ酸化容器に存在するメタンの作 用を測定しｆ：。ＭｔＯＢ３ｂ細胞密度が約０．１６ｇ／ｌであり、名目ＴＣＥ 初濃度が８０マイクロモルである実施例３の方法に従い、ＴＣＥ分解の無頭部検 定を行った。結果を下記表７および図２に示す。

表７−メタンの存在下におけるＴＣＥ分解速度反応系に加えられ　ＴＣＥ酸化速 度、 たメタン（％飽和）　細胞１ｇ当たりのマイクロモル／時間無し　６６０ ５％　３３５０ １０％　３０００ ２０％　８７５ ５０％　１１０ 統いて、我々は、幾つかの細胞間（バッチ）が、メタンの非存在下で細胞１ｇ当 たり約４０００マイクロモル／時間の速度でＴＣＥを酸化することを観察した。

実施例８ ＴＣＥ分解速度に対するＴＣＥ初濃度の影響ＭｔＯＢ３ｂ細胞を下記条件下で連 続培養した。

培地：　ヒギンズ（実施例１の記載に従い製造）気体流速：　メタン　４５ｍ１ ／分、空気１３５ｍｌ／分培養容量：　２２０ｍ１ 培養温度＝　３０°に れらの細胞を用いて、実施例３記載のタイプのＴＣＥ無頭隙頭部検定を行った。

結果を下記表８に示す。

表８−ＴＣＥ酸化速度に対する”Ｉ’　Ｇ　Ｅ初濃度の影響ＴＣＥ濃度（μＭ） 　乾燥細胞１ｇ当たりの除去されたＴＣＥのマイクロモル数／時間 これらの結果および他の実験結果から、ＴＣＥ酸化に関するＫ。

は約５マイクロモルであるという結論に達した。

実施例９ 様々な初濃度におけるＴＣＥの分解 実施例２で記載された連続培養の細胞塊を０．６４ｇ細胞／ｌに生長させた。実 施例３記載の方法を用いｆ：　Ｔ　ＣＥ無頭部分解検定をこれらの細胞により行 った。結果を下記表９に示す。

表９一様々なＴＣＥ初濃度におけるＴＣＥ分解ＴＣＥ濃度（μＭ）　除去された ＴＣＥのマイクロモル数、マイクロモル７分 ５−１０分　１０−１５分　１０−２５分４０　：１９６ ８０　５．６９　３．０３ ３２０　１５．５４　１０．２ ６４０　１０．４８ 実施例１Ｏ 精製メタンモノオキシゲナーゼによるＴＣＨの分解放射性標識したＴＣＥを用い ることにより、還元ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の 存在下での可溶性メタンモノオキシゲナーゼとのインキュベーション後における 生成物へのＴＣＨの酸化を立証した。メタンモノオキシゲナーゼの３成分、レダ クターゼ、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼを７オツクスおよびリプスコーム（前 出）の方法（これらの開示を引用して説明の一部とする）により精製した。酵素 インキュベーション混合物を密封した１０ｍ１の隔壁ガラス瓶に導入した。各ガ ラス瓶は下記表９に示す成分を含んでいた。

表１０−酵素インキュベーション混合物成分成分　量／濃度 ３−［Ｎ−モルホリ刈プロパンスルホン酸　１．５ｍｌ／（ＭＯＰＳ）緩衝液’ 、ｐＨ７，５２５ｍＭＮＡＤＨ”　０．１ｍＭ レダクターゼ３　１１０Ｐｇ 成分８　１３μｇ ヒドロキシラーゼ　２５０Ｉｔｇ ｌ　シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ。

２　ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、還元形態、シグマ・ケミカル ・カンパニー、セントルイス、ミズーリ。

コ　レダクターゼ、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼは、７オツクスおよびリプス コーム（前出）により同定されたメタンモノオキシゲナーゼの３成分である。

１０５ナノモルの均一標識した１４Ｃ−ＴＣＥを、７０μＭの最終ＴＣＥ濃度に 到達するまで、反応混合物上のゴム隔壁から注射することにより各ガラス瓶に加 えた。反応を３分間２５℃で続行させ、次イで、ｐＨ２−０での硫酸（シグマ・ ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）の添加により鎮めた。

遠心分離により沈澱した蛋白質を除去後、反応混合物を高速液体クロマトグラフ ィー（ＨＰＬＣ）により分析した。使用されたＨＰＬＣ操作パラメーターを下記 表１１に示す。

表１ｌ−ＨＰＬＣ操作パラメーター カラム：　アミネックスＨＰＸ−８７ＨＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド） 移動相：　０．０１Ｎ硫酸（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミ ズーリ）中、２５％アセトニトリル（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントル イス、ミズーリ） 操作モード：　イソクラティック 速度：　１分間に０．３ｍｌ ピーク検出：　紫外線分光法、２１０ｎｍこのＨＰＬＣシステムは、様々な可能 な有機酸生成物およびトリクロロアセトアルデヒド（クロラール）の確実な標準 物質を分割した。

記載された酵素インキュベージコン条件下において、ＴＣＨの５３％がＨＰＬＣ 検出可能生成物に変換された。これらの生成物は、蟻酸、グリオキサル酸、ジク ロロ酢酸およびクロラールであった。

上記インキュベーションに加えて、メタンモノオキシゲナーゼ成分の各成分また はＮＡＤＨを省く対照インキュベーションを行った。

これらの対照実験の全てにおいて、ＴＣＥ酸化生成物は全く検出され得なかった 。

すなわち、この実験は、ＴＣＥ酸化が、ＮＡＤＨの存在下で３成分メタンモノオ キシゲナーゼ酵素系により触媒されることを立証した。

様々な実施態様および好ましい態様および技術を引用しながら本発明について記 載した。しかしながら、発明の意図および範囲から逸脱しないで多くの変形およ び修正が行なわれ得るものと理解すべきである。

時間（分） 時間（分） 恒成分培養槽アセンブリー ＦＩＧ、　４　ＦＩＧ、　５ 国際調査報告 −−＾−−”　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５１７７国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５１７７

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハロゲン化炭化水素化合物の微生物分解法であって、上記ハロゲン化炭化 水素化合物を菌ｌｇ当り約５００−約１００００マイクロモル／時間の速度で完 全に分解するに有効な量のメタン酸化性細菌を上記ハロゲン化炭化水素に接触さ せることからなり、上記メタン酸化性細菌は連続培養条件下で培養され、上記連 続培養は上記細菌を空気とメタンがそれぞれ約２５：１−１：１０の比率で含ま れている気体混合物の連続流にさらすことを含み、上記連続培養メタン酸化性細 菌は可溶性メタンモノオキシゲナーゼを産生するものである、方法。
2. （２）メタン酸化性細菌がハロゲン化炭化水素を菌１ｇ当り約１０００−約９０ ００マイクロモル／時間の速度で完全に分解し得るものである、請求項１記載の 方法。
3. （３）メタン酸化性細菌がハロゲン化炭化水素を菌ｌｇ当り約２０００−約４０ ００マイクロモル／時間の速度で完全に分解し得るものである、請求項１記載の 方法。
4. （４）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約１０：１−１：２の比率で含む、 請求項１記載の方法。
5. （５）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約２．１：１の比率で含む、請求項 １記載の方法。
6. （６）ハロゲン化炭化水素化合物を、メタン酸化性細菌が約０．１０−２０ｇ／ μ含まれている水性媒質に接触させる、請求項１記載の方法。
7. （７）ハロゲン化炭化水素化合物を、メタン酸化性細菌が約０．２−２．０ｇ／ ｌ含まれている水性媒質に接触させる、請求項１記載の方法。
8. （８）メタン酸化性細菌が初濃度１００００マイクロモル／ｌ以下のハロゲン化 炭化水素を分解し得る、請求項１記載の方法。
9. （９）メタン酸化性細菌が初濃度が痕跡量のハロゲン化炭化水素から１０００マ イクロモル／ｌまでのハロゲン化炭化水素を分解し得る、請求項１記載の方法。
10. （１０）メタン酸化性細菌がメチロシヌス属の１種である、請求項１記載の方法 。
11. （１１）メタン酸化性細菌がメチロシヌス・トリコスポリウムＯＢ３ｂである、 請求項１０記載の方法。
12. （１２）ハロゲン化炭化水素を、メタンが約１−２０％飽和の濃度で含まれてい る気体混合物の存在下で分解する、請求項１記載の方法。
13. （１３）ハロゲン化炭化水素化合物が脂肪族ハロゲン化炭化水素化合物である、 請求項１記載の方法。
14. （１４）脂肪族ハロゲン化炭化水素化合物がトリクロロエチレン（ＴＣＥ）であ る、請求項１記載の方法。
15. （１５）細菌が、乾燥細菌細胞重量の約５−３０％の量で可溶性メタンモノオキ シゲナーゼを産生する、請求項１記載の方法。
16. （１６）ハロゲン化炭化水素化合物を完全に分解できるメタン酸化性細菌の培養 法であって、上記メタン酸化性細菌を、空気とメタンがそれぞれ約２５：１−１ ：２°の比率で含まれている気体混合物の連続流に菌をさらすことを含む連続培 養条件下で培養することからなり、上記連続培養されているメタン酸化性細菌が 上記ハロゲン化炭化水素化合物を菌１ｇ当り約５００−１００００マイクロモル ／時間の速度で完全に分解するに有効な量の可溶性メタンモノオキシゲナーゼを 産生するものである、方法。
17. （１７）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約１０：１−１：２の比率で含む 、請求項１６記載の方法。
18. （１８）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約２．１：１の比率で含む、請求 項１６記載の方法。
19. （１９）細菌がメチロシヌス属の１種である、請求項１６記載の方法。
20. （２０）細菌がメチロシヌス・トリコスポリウムＯＢ３ｂである、請求項１６記 載の方法。
21. （２１）細菌が、乾燥細菌細胞重量の約５−３０％の量で可溶性メタンモノオキ シゲナーゼを産生する、請求項１６記載の方法。
22. （２２）ハロゲン化炭化水素化合物が脂肪族ハロゲン化炭化水素化合物である、 請求項１６記載の方法。
23. （２３）脂肪族ハロゲン化炭化水素化合物がトリクロロエチレン（ＴＣＥ）であ る、請求項２２記載の方法。
24. （２４）ハロゲン化炭化水素化合物の分解法であって、（ａ）メタン酸化性細菌 を、空気とメタンがそれぞれ約２５：１−１：２０の比率で含まれている気体混 合物の連続流に菌をさらすことを含む連続培養条件下で培養し、上記連続培養さ れているメタン酸化性細菌は乾燥細菌細胞重量の約５−３０％の量で可溶性メタ ンモノオキシゲナーゼを産生するものであり、（ｂ）上記連続培養メタン酸化性 細菌から上記可溶性メタンモノオキシゲナーゼを分離し、 （ｃ）上記分離した可溶性メタンモノオキシゲナーゼを精製して、レダクターゼ 、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼを含む精製成分を得、（ｄ）上記精製成分の有 効量を上記ハロゲン化炭化水素化合物の水性スラリーに加えて混合物を形成させ 、（ｅ）上記混合物を、上記ハロゲン化炭化水素が完全に分解されるに充分な時 間反応させることを含む、方法。
25. （２５）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約１０：１−１：２の比率で含む 、請求項２４記載の方法。
26. （２６）気体混合物が空気とメタンをそれぞれ約２．１：１の比率で含む、請求 項２５記載の方法。
27. （２７）細菌がメチロシヌス属の１種である、請求項２４記載の方法。
28. （２８）細菌がメチロシヌス・トリコスポリウムＯＢ３ｂである、請求項２７記 載の方法。
29. （２９）精製成分レダクターゼ、成分Ｂおよびヒドロキシラーゼをそれぞれ約１ １０：１３：２５０の重量比で水性スラリーに加える、請求項２４記載の方法。
30. （３０）ハロゲン化炭化水素化合物がハロゲン化脂肪族炭化水素化合物である、 請求項２４記載の方法。
31. （３１）ハロゲン化脂肪族炭化水素化合物がトリクロロエチレン（ＴＣＥ）であ る、請求項３０記載の方法。