JPH04501719A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、外科または治療によるヒトまたは動物の体を処置する方法あるいはヒトま たは動物の体について実施されるまたは診断方法において使用するための薬物の 調製における、上記第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド、上記第５〜７ 項のいずれかに記載の核酸断片、上記第８項記載の構成体、上記第９〜１１項の いずれかに記載のベクター、上記第１２項記載の細胞、上記第１３項記載のプロ ーブ、上記第１４または１５項記載の抗体、上記第１６項記載の製剤学的配合物 あるいは上記第１７または１８項記載の細胞の使用。

２１、処置または診断を必要とするヒトまたは動物に、有効な無毒の量の上記第 １〜４項のいずれかに記載のポリペプチド、上記第５〜７項のいずれかに記載の 核酸断片、上記第８項記載の構成体、上記第９〜１１項のいずれかに記載のベク ター、上記第１２項記載の細胞、上記第１３項記載のプローブ、上記第１４また は１５項記載の抗体、上記第１６項記載の製剤学的配合物あるいは上記第１７ま たは１８項記載の細胞を投与することからなる処置または診断の方法。

２２、異常なヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われる試料を上記第１ ４または１５項記載の抗体と接触させることからなる、診断試験方法。

２３、上記第１４または１５項記載の抗体からなる診断試験キット。

明細書 ポリペプチド 本発明は、ヒト多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）上の抗原性エピトープに相当する配 列を有するポリペプチド、その産生および癌の診断および治療におけるその使用 に関する。

ＷＯ３８１０５０５４において、正常および形質転換された上皮細胞により発現 されたヒトＰＥＭタンパク質における現れるアミノ酸残基の直列の反復の配列が 記載されている。少な（とも乳癌の場合において、悪性細胞は５Ｍ−３モノクロ ーナル抗体により検出されるＰＥＭのグリコジル化された形態を発現する。その 抗体は、正常細胞により産生され、完全にプロセシングされたＰＥＭと反応しな いので、乳癌の診断および治療において使用される。

それ以上の研究において、驚（べきことには、５Ｍ−３により認識されるエピト ープは、従来記載された直列の反復配列内に存在する小さい、連続的アミノ酸配 列であることが明らかにされた。このエピトープの同定は、正常ＰＥＭと反対に 腫瘍に対する改良された特異性をもつ抗体を発生するとき有用であるエピトープ をまねる、ペプチドの合成的調製を可能とする。

したがって、本発明は、（ａ）式（Ｉ）（Ｘｌ　、　（（Ａ）　、％ＰＤＴＲＰ 　（Ａ）、＋７（Ｘｌ　□　（Ｉ）式中、 Ｘおよび２は、同一であるかあるいは異なり、そして各々は０または１゛または それ以上の整数であり、 ｙは１またはそれ以上の整数であり、 各Ｘは、存在する場合、アミノ酸残基から独立に選択され、ｍおよびｎは、同一 であるかあるいは異なり、そして各々はＯまたは１であり、そして Ａ、Ｐ、ＤＳＴおよびＲは、それぞれ、アミノ酸の残基、アラニン、プロリン、 アスパラギン酸、スレオニンおよびアルギニンでである、の合成ポリペプチド、 （ｂ） （Ａ）　、、ＰＤＴＲＰ　（Ａ）、 に免疫学的に同等の配列を含有するポリペプチド、および（ｃ）１または２以上 のサツカリドを有する上の（ａ）および（ｂ）において定義されたポリペプチド 、およびその製剤学的に許容されつる塩、 ただしＷＯ３８１０５０５４に特定的に開示されているポリペプチドおよびベー ターグルクロニダーゼを除外する、を提供する。

上の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）に定義されているポリペプチドは、同一の限定 を受け、以後［ＰＤＴＲＰエピトープ」と呼ぶ。

本発明による最も簡単なポリペプチドは、ペンタペプチドＰＤＴＲＰ。

その免疫学的類似体およびペンタペプチドのグリコジル化誘導体およびその類似 体である。本発明によるヘキサペプチドは、ＡＰＤＴＲＰ、ＰＤＴＲＰＡ、その 免疫学的類似体およびペンタペプチドのグリコジル化誘導体およびその類似体を 包含する。本発明によるヘプタペプチドは、ＡＰＤＴＲＰＡ、その免疫学的類似 体およびペンタペプチドのグリコジル化誘導体およびその類似体を包含する。本 発明によるより大きいポリペプチドは、ペンタ−、ヘキサ−およびヘプタ−ペプ チド、類似体および誘導体のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に追加の アミノ酸残基を含む。このようなポリペプチドは、例えば、約２００まで、例え ば、約５０まで、とくに３０まで、好ましくは２０まで、より好ましくは１０〜 １５アミノ酸残基を含むことができる。Ｘおよび２の最大の好ましい値はそれ応 じて決定される。ポリペプチドは少な（とも１つの５アミノ酸残基の配列ＰＤＴ ＲＰまたはその免疫学的類似体を包含しなくてはならず、そしてこの配列のい（ つかの反復、例えば、２または３の反復、および多分１００またはそれ以上の反 復を含むことができる。各このような反復は、独立に、アミノ末端および／また はカルボキシ末端の１つまたは両者、またはその免疫学的同等体を含むことがで き、モしてＮ−およびＣ−末端のいずれかまたは両者において他のアミノ酸で伸 長することができる。典型的には、各反復は１９またはそれ以下のアミノ酸残基 からなるであろう。ポリペプチドがグリコジル化されている場合、ＰＤＴＲＰ配 列またはその類似体の反復は、独立に、グリコジル化され、例えば、連鎖の糖、 例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＰＤＴＲＰのスレオニン残基上におよび ／またはエピトープＰＤＴＲＰ配列の外側のスレオニンまたはセリン残基上に取 り付けるか、あるいはこれらはＰＤＴＲＰの免疫学的同等体のエピトープ配列内 に含めることによって、グリコジル化される（例えば、ここでスレオニン残基は セリン残基により置換されている）。

本発明による免疫学的類似体は、式（Ｉ）の配列に相当する配列を有するポリペ プチドであるが、ただし配列（Ａ）、ＰＤＴＲＰ　（Ａ）、は少なくとも１つの アミノ酸残基において置換により修飾されているおよび／または１または２以上 の追加のアミノ酸残基の挿入により修飾されているが、ただし修飾された配列は 抗体の発生のためのエピトープとして作用することができ、そして修飾されたエ ピトープを認識するそのように発生した抗体は、 （ａ）式（１）のポリペプチド、 Ｃｂ）ＷＯ８８１０５０５４において定義されているような直列の反復配列から なるポリペプチド、および （ｃ）ヒトＰＥＭコアタンパク質、 の少な（とも１つを、また、認識するが、各場合において、正常の乳汁を出すヒ ト乳腺により産生される、完全にプロセシングされたヒトＰＥ間糖タンパク質と の反応が減少しているか、あるいはそれと反応しないか、あるいは好ましくは実 質的に反応しない。

免疫学的類似体は、また、ミモトーブ（ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）として知られてお り、例えば、「ペプチドタンパク質および遺伝子技術の進歩（Ｐｅｐｔｉｄｅ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ　Ａｄｖａｎｃｅｓ）Ｊ、発行Ｎｏ、２、ケンブリッジ・リサーチ・バ イオケミカル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｊｏｃｈｅｍｉｃａ ｌ）（コピーを添付する）および「アセンブリングしたエピトープをまねること ができるペプチドの描写（Ｔｈｅ　ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　ａｂｌｅ　ｔ、ｏ　ｍｉｍｉｃａｓｓｅｍｂｌｅｄ　Ｅｐｉｔｏｐｅｓ） Ｊ、Ｈ，Ｍ、ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら、「抗原としての合成ペプチド（Ｓｙ ｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）Ｊ　［チバ・ファ ンディジョン・シンポジウム（Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　１９）Ｊ、Ｒ，ポーター（Ｐｏ　ｒ　ｔ　ｅ　ｒ）およびＪ、ウニラン （Ｗｈｅｌａｎ）（編）、ピットマン、ロンドン　１９８６　ｐｐ、１３０−１ ４９に記載されているように設計することができる。

好ましくは、本発明のポリペプチドは合成である。

本発明によるＰＤＴＲＰエピトープは、合成法によるか、あるいは下に記載する 適当なりＮＡ断片の発現により、組み換えＤＮＡ技術により新規に合成し、そし てヒトまたはヒト以外の細胞の中でグリコジル化してまたはグリコジル化しない で発現することができる。

ペプチドは単一のアミノ酸からおよび／または２またはそれ以上のアミノ酸から 予備形成したペプチドから所望のペプチドの配列の順序で構成することができ、 そして必要に応じて製剤学的に許容されつる塩に転化することができる。

固相または溶液の方法を使用することができる。固相合成において、所望のペプ チドのアミノ酸配列は不溶性樹脂に結合したＣ−末端のアミノ酸から順次に構成 される。所望のペプチドが産生されたとき、それを樹脂から切断する。溶液相合 成を使用するとき、所望のペプチドを再びＣ−末端のアミノ酸から構成するが、 この酸のカルボキシ基は適当な保護基でブロッキングしたままにし、この保護基 は合成の終わりにおいて初めて除去する。いずれの技術を使用するときも、反応 系に添加される各アミノ酸は典型的には保護されたアミノ基および活性化された カルボキシ基を有する。アミノ基はフルオレン−９−イルメチルカルボニル（Ｆ ｍｏｃ）またはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基により保護することができ る。カルボキシ基はペンタフルオロフェニルまたは１−オキシ゛　−２−ヒドロ キシジヒドロベンゾトリアジンエステルとして活性化することができる。機能的 側鎖の基、例えば、リジンの側鎖のアミノ基およびスレオニンの側鎖カルボキシ 基はまた保護することができる。各縮合工程ははジシクロへキシルカーポジイミ ドまたは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下に実施することができる。

合成において各工程後、アミノ保護基を除去する。側鎖の官能基の保護基は、一 般に、合成の終わりにおいて除去する。

生ずるペプチドを製剤学的に許容されつる塩に転化するために、それを有機酸ま たは免疫グロブリン酸で処理して酸付加塩を形成することができる。適当な酸は 、酢酸、コハク酸および塩酸を包含する。あるいは、ペプチドはカルボン酸塩、 例えば、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカ リウム塩に適当な塩基の使用により転化することができる。

本発明のＰＤＴＲＰエピトープは、また、組み換えＤＮＡ方法により調製するこ とができる：発現ベクターを使用し、このベクターはＰＤＴＲＰエピトープをエ ンコードするＤＮＡ配列を組み込みそして適当な宿主の中に配置されたときＰＤ ＴＲＰエピトープを発現することができる。

ＤＮＡ配列をベクター中の翻訳開始および停止シグナルの間に配置する。

また、適当な転写コントロール要素、例えば、ＤＮＡ配列のプロモーターおよび 転写停止部位を準備する。ペプチドの発現がベクターと適合性の宿主の中で起こ ることができるように、正しいリーディングフレームでＤＮＡ配列を準備する。

適当な宿主−ベクター系を使用することができる。例えば、ベクターはプラスミ ドまたはウィルスのベクターであることができ、そして宿主は任意の原核生物ま たは真核生物の細胞、例えば、バクテリアの細胞または酵母菌の細胞または哺乳 動物の細胞系の細胞であることができる。

あるいは、ＰＤＴＲＰエピトープは自然ヒトムチン糖タンパク質（これはそれ自 体ヒト組織の試料からの分離によるか、あるいはヒト細胞系における発現および 完全なプロセシングにより産生ずることができる）から炭水化物をストリッピン グし［バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅ　１１）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、４７．５４６７−５４８２　（１９８７）］　、 そしてコアタンパク質を消化することによって得ることができる。

キャリヤータンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミ ンまたはチログロブリンに連鎖したＰＤＴＲＰエピトープは、また、本発明の範 囲内である。連鎖は既知の化学的方法によるか、あるいはここに記載するように 遺伝子の形質転換された細胞によるＰＤＴＲＰエピトープおよびキャリヤータン パク質の融合タンパク質としての発現により形成することができる。

他の面において、本発明はＰＤＴＲＰエピトープをエンコードする核酸断片を提 供する。

本発明による断片はＲＮＡまたはＤＮＡであることができ、そしてＤＮＡ断片は 一本鎖または二本鎖であることができる。好ましいこのような核酸断片は、前に 定義した式（Ｉ）のＰＤＴＲＰエピトープをエンコードする、式（Ｉ　Ｉ）の連 続的解読配列を含有するＤＮＡ断片である、（ＸＸＸ）　、（（ＧＣＸ）、ＣＣ Ｘ　ＧＡＰＶ　ＡＣＸ［ＣＧＸ］ ［または］　ＣＣＸ　（ＧＣＸ）、１　、（ＸＸＸＩ　、　（Ｉ　Ｉ）［ＡＧＰ ｕｌ 式中、ｍＳｎ、ｘＳｙおよび２はすべて式（１）に関して定義した通りであり、 Ｘはデオキシリボヌクレオチドであり、ＸＸＸはアミノ酸残基をエンコードする コドンであり、ｐｙはＣまたはＴであり、 ＰｕはＡまたはＧであり、そして Ａ、Ｃ，ＧおよびＴは４つのデオキシリボヌクレオチド塩基について国際的に認 められた１文字のコードである。

本発明の好ましい核酸断片は、配列 （ＧＣＣ）、ＣＣＧ　ＧＡＣＡＣＣＡＧＧ　ＣＣＧ　（ＧＣＣ）。

からなる。

ＰＤＴＲＰエピトープをエンコードする別の配列は、Ｅ、ｃｏｌｉのβ−グルク ロニダーゼの中に存在し、モしてＰＤＴＲＰのための解読配列 ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＡＣＣＣＧＴ　ＣＣＧを含有する。この配列を含有しそして必 要に応じてさらに、β−グルクロニダーゼ配列に関係づけることができるか、あ るいは関係づけることができないフランキング配列［プロシーデインダス・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８４４７−８４５１に詳しくに記載されている完全な β−グルクロニダーゼ遺伝子および断片以外］からなる断片は、本発明のそれ以 上の面を形成する。

本発明は、さらに、上に定義した式（Ｉ）のペプチドに免疫学的に類似するＰＤ ＴＲＰエピトープをエンコードする核酸断片を提供する。

これらの断片は、後述するようにＰＤＴＲＰエピトープを発生するためにおよび ＰＤＴＲＰエピトープをエンコードするＤＮＡを検出するプローブの両者として 有用である。このような目的のために、検出可能な標識（例えば、放射性同位元 素、蛍光性または酵素の標識）を断片に取り付けるか、あるいは固体の支持体に 結合することは便利であることがある。これらのすべては慣用方法により達成す ることができる［マシューズ（Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ）ら、アナリティカル ・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１６９．］、− ２５（１９８８）］。

本発明の核酸断片は、普通の合成技術により新規に産生ずることができるか、あ るいはヒト上皮細胞から慣用方法により得ることができる［フィン（Ｈｕｙｎｈ ）ら、ｒＤＮＡのクローニング：実際のアプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ、グロウバー、Ｄ、Ｍ、（編） （ＩＲＬ、オックスフォード）、１９８５、Ｖｏｌ、１、ｐｐ、４９−４８］。

他の面において、本発明は、上に定義した核酸断片からなるクローニングおよび 発現ベクター（発現ベクターは開始および停止シグナルに関するオープンリーデ ィングフレームで断片を有し、そして発現配列を形成するために適当な調節およ びプロモーター配列と関連する）およびこのようなりローニングまたは発現ベク ターにより形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明の核酸断片は、また、活性な免疫化技術において使用することができる。

このような方法において使用するために、ＰＤＴＲＰエピトープの遺伝情報を指 定する断片は、５′または３゛末端のいずれかまたは両者であり、それ以上の解 読または非解読の核酸配列は調節またはプロモーター配列、マーカー配列および スプライシングまたは結合部位を包含する。ＰＤＴＲＰエピトープをエンコード することに加えて、解読配列はムチンタンパク質の他の部分または他のポリペプ チド鎖の遺伝情報を指定することができる。本発明による断片は、任意の必要な または所望のフランキング配列と一緒に、適当なオーブンリーディングフレーム の整合で、適当なベクター、例えば、プラスミドまたはウィルスのゲノム（例え ば、ワクシニアのウィルスのゲノム）の中に挿入し、次いでポリペプチド産生物 として普通の技術により発現される。１つの面において、ＰＤＴＲＰエピトープ を包含するポリペプチド産生物は、ベクターで形質転換された適当な細胞を培養 し、収穫し、そして免疫原として使用して、ムチンコアタンパク質に対する活性 な免疫性を誘発することができる［タルタグリア（Ｔａｒｔａｇｌｉａ）ら、Ｔ ｉｂｔｅｃｈ、、６．４３　（１，９８８）Ｅ。他の面において、ベクターは、 とくにウィルスの形態で、免疫化すべきヒトまたは動物に直接接種することがで きる。

次いで、ベクターはＰＤＴＲＰエピトープの発現を指令し、そしてこれは引き続 いて免疫原として作用して、ムチンコアタンパク質に対する免疫性を誘発する。

ＤＮＡ配列は、１つの実施態様において、他の遺伝子の中に挿入し、そして融合 タンパク質として発現することができる。例えば、他のアミノ酸配列（ｋｏｒｅ ｌａｈ、ａｎｃ直列の反復配列と同一であるか、あるいは異なることができる） によりフランキングされたＰＤＴＲＰエピトープをエンコードするヌクレオチド 配列は、他のタンパク質エピトープについて実施されたように、オリゴヌクレオ チドをポリオウィルスのサビン（Ｓａｂｉｎ）１型ワクチン菌株のカプシドタン パク質をエンコードする遺伝子の中に挿入することによって発現される［エバン ス（Ｅｖａｎｓ）ら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９．３８５−３８８］。こ のような操作されたウィルスは、ヒトにおいて腫瘍を誘発するか、あるいは再発 を遅延し、そして究極的に腫瘍の発生を防止するその能力について容易に試験す ることができる。

したがって、本発明は、外科または治療によりヒトまたは動物の処置の方法にお いておよびヒトまたは動物の体について実施される診断方法において使用するた めの、およびこのような方法において使用する薬物の調製において使用するため の、プローブ、ベクターおよび形質転換された細胞を提供する。本発明は、また 、このようなローブ、ベクターおよび形質転換された細胞を有効な無毒の量でヒ トまたは他の哺乳動物に投与することからなる、外科または治療によりヒトまた は動物の処置の方法および生体内ならびに生体外で実施される診断方法、ならび に体液または組織の試料を断片またはプローブと接触することからなる生体外ま たは生体内で実施される診断方法を提供する。

本発明は、さらに、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、そして発 現されたポリペプチドを回収することからなる、ＰＤＴＲＰエピトープを産生ず る方法を提供する。

他の面において、本発明は、上に定義したＰＤＴＲＰエピトープを認識すること ができそして、好ましくは、正常の乳汁を出すヒト乳腺により産生される、完全 にプロセシングされたヒトＰＥＭ糖タンパク質との反応性が減少しているか、あ るいはそれと反応しない、５Ｍ−３およびＨＭＦＧ−２以外の、抗体を提供する 。

ここで使用するとき、用語「抗体」は、抗原結合部位を有する、ポリクローナル 抗体およびモノクローナル抗体および抗体の断片、例えば、Ｆ（ａｈ’）２断片 、ならびに化学的にまたは遺伝子的に修飾されて、１または２以上のポリペプチ ド鎖のアミノ酸配列を変化させて、種特異性および／またはアイソタイプ特異的 領域を変化しおよび／または異なる源からのポリペプチド鎖を組み合わせた、こ のような抗体または断片を包含することを意図する。このような抗体は慣用方法 ［ウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　１　ｉａｍｓ）　、Ｔｆｂｔｅｃｈ、６．３６　（ １９８８）］により得ることができ、そして診断および治療の応用、例えば、受 動免疫化において有用である。

本発明による抗体は上に定義したＰＤＴＲＰエピトープと反応する；それらは、 また、ＨＰＥＭコアタンパク質、ことに結腸、肺、卵巣およびとくに乳癌により 発現されたコアタンパク質と反応するが、対応する完全にプロセシングされたＨ ＰＥＭとの反応性が減少しているか、あるいはそれと反応しない。特定の面にお いて、抗体はＨＰＥＭコアタンパク質と反応するが、正常の乳汁を出すヒト乳腺 により産生された、完全にプロセシングされたＨＰＥＭ糖タンパク質と反応しな い。本発明による抗体は、好ましくは、乳汁を出すまたは妊娠した個体の哺乳動 物の上皮組織により産生されたムチン糖タンパク質と有意に反応しないが、哺乳 動物の上皮腺癌細胞により発現されたムチンタンパク質と反応する。

これらの抗体は、良性の乳房腫瘍と非常に減少した反応を示し、したがって乳癌 の診断および局在化においてならびに治療方法において有用である。

抗体は、ヒト乳房上皮ムチン遺伝子、またはその断片のポリペプチド発現産生物 、とくに発生期の発現産生物の細胞培養物のスクリーニングを包含する、他の目 的に使用することができる。この場合において、抗体は便利にはポリクローナル 抗体またはモノクローナル抗体であることができる。

本発明は、さらに、既知の技術により治療学的または診断的に有効な部分にある いは連鎖部分に連鎖された抗体を提供する。連鎖部分は、抗体に治療学的または 診断的に有効な部分を結合するための既知の連鎖因子であることができ、例えば 、連鎖部分は特異的結合因子の特異的結合相手であることができ、治療学的また は診断的に有効な部分は特異的結合因子に結合される。抗体：連鎖部分（特異的 結合相手）の付加物および治療学的または診断的に有効な部分：特異的結合因子 の付加物の別々の投与、特異的結合因子の特異的結合相手への結合は、抗体に結 合された治療学的または診断的に有効な部分を生ずる。特異的結合因子：特異的 結合相手の好ましい例は、ビオチンおよびアビジンまたはビオチンが結合因子ま たは結合相手であることができるストレプトアビジンである。

抗体の治療学的使用のために、治療学的に有効な部分は癌の乳房または他の組織 に放出して、形質転換された細胞を不能化または殺す、致死的因子である。致死 的因子は、毒素、放射性同位元素および「直接の殺す因子」、例えば、補体の成 分ならびに細胞障害性または他の薬物または細胞障害性薬物を腫瘍部位において 活性化する酵素を包含する。

診断の使用のために、診断的に有効な部分は、固体の支持体および検出可能な標 識、例えば、酵素の標識、発色因子、蛍光因子および放射性同位元素および他の 直接または間接の検出可能な標識のような部分であることができる。好ましくは 、モノクローナル抗体を診断において使用する。

゛　本発明は、さらに、異常なヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われ る試料を、上に定義した抗体とを含有するさせることからなる、診断の試験方法 およびアッセイ方法を提供する。このような方法は、患者に抗体を添加しそして 、別々に、同時にまたは順次に、いずれかの順序で、抗体またはその断片に選択 的に結合することができる標識づけ実在物を投与することを包含する、腫瘍の局 在化を包含する。

抗体の特定の使用は、乳房、結腸、卵巣および／または肺の癌の程度を検出およ び／または評価する診断アッセイを包含する。

診断の方法およびアッセイにおいて使用のための診断試験キットが提供され、そ してこのキットは、抗体および、必要に応じて、適当な標識および他の試薬、例 えば、緩衝剤、抗体を標識しおよび／または標識した抗体を検出のための試薬お よび、ことに競争アッセイにおいて使用するための、抗血清からなる。

本発明は、さらに、ヒトまたは動物の体について実施される外科、治療または診 断の方法において使用するか、あるいはこのような方法において使用する薬物の 調製において使用するための、上に定義したＰＤＴＲＰエピトープおよび抗体を 提供する。本発明は、また、有効な無毒の物質の前述のポリペプチドまたはペプ チドをヒトまたは動物に投与することからなる、処置または診断の方法を提供す る。投与の割合は、患者の年令、体重、大きさ、性および一般的健康に依存し、 そして望ましくないか、あるいは耐えることのできない副作用なしに、適当なレ ベルの抗体を循環させるために十分な割合であろう。

投与は経口的または非経口的ルートで、例えば、皮下、静脈内または筋肉内の注 射によりなすことができる。典型的には、ＰＤＴＲＰエピトープはヒトの大人に Ｉｇ／投与まで、好ましくは１〜２００ｍｇ／投与の量で、経口的または非経口 的ルートで投与される。

したがって、本発明は、また、本発明のＰＤＴＲＰエピトープおよび適当な担体 、希釈剤および／またはアジュバントからなる製剤学的組成物を提供し、前記担 体、希釈剤および／またはアジュバントは、もちろん、投与のルートにより決定 されそしてＰＤＴＲＰエピトープとの適合性について選択される。適当な担体、 希釈剤およびアジュバントは、次の通りである：フロインド不完全アジュバント （ＩＦＡ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ムラミ ルジペプチド、鉱油、中性油、例えば、ミグリオール、植物性部、例えば、ビー ナツツ油、「イスコムス（ｉ　ｓｃｏｍｓ）Ｊ　、リポソーム、プルロニタック （Ｐｌｕｒｏｎｊｃ）（商標）、ポリオールまたはリビ（Ｒｔｂｉ）アジュバン ト系［英国特許出願（ＧＢ−Ａ）２１８９１４１号］。注射のために、組成物は 水性の無菌の、非ビオゲンの溶液であり、必要に応じて緩衝剤、酸化防止剤、殺 微生物剤、例えば、抗バクテリア剤および抗菌・かび剤および張度調節剤を含有 する。あるいは、組成物は、注射のための水を添加することによって再構成する ための、乾燥粉末として提供することができ、そして必要に応じて賦形剤、例え ば、前述のものを含有することができる。

ＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナ ル抗体であっても、ヒトおよび動物を処置する治療学的方法において、例えば、 受動免疫化のためのワクチンの形態で使用することができる。好ましくは、それ らは製剤学的組成物、例えば、前述したように、配合される。

ことに治療学的応用において、Ｆａｂまたはその相補性決定領域を、処置すべき 種から誘導された抗体のＦｃまたは全フレームワーク領域にカップリングする（ 例えば、マウスモノクローナル抗体のＦａｂ領域をヒトＦｃ領域とともに投与し て、ヒト患者による免疫応答を減少することができる）ことによって抗体を修飾 するか、あるいは抗体のアイツタ・イブを変化させることは適当であることがあ る［参照、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第２３９　４００号］。

本発明は、また、宿主動物に、ＰＤＴＲＰエピトープを発現することができるト ランスフェクションした細胞を接種し、そして抗体を動物の血清または他の体液 から回収することからなる、ＰＤＴＲＰエピトープに対するポリクローナル抗体 を産生ずる方法を提供する。

本発明は、さらに、宿主動物にＰＤＴＲＰエピトープまたはＰＤＴＲＰエピトー プを発現することができるトランスフェクションした細胞を接種し、そして抗体 を分泌する細胞を動物から取り出すことからなる、ＰＤＴＲＰエピトープに対す る抗体を分泌することができる細胞を産生ずる方法を提供する。細胞は生体外で 、例えば、適当な細胞培養条件下におよび／または生体内で、例えば、腹水中の 成長により、抗体を産生ずることができる。

ここで使用するとき、用語「動物」は、抗体を産生ずることができる任意の動物 、例えば、補乳動物、例えば、実験室の鋸歯類、および鳥類を呼び、そしてヒト を包含する。

トランスフェクションされた細胞は、ＰＤＴＲＰエピトープをエンコードする発 現可能な配列を含有するＤＮＡ発現ベクターを含有する細胞である。解読配列は 自然または合成であることができ、そしてエンコードされたポリペプチドは直接 または融合タンパク質として発現することができる。例えば、ＰＤＴＲＰエピト ープの遺伝情報を指定するＤＮＡを、自然源から同定しそして得るか、あるいは 部分的または完全な合成により産生される。特定のポリペプチドをエンコードす る自然または人工的ＤＮＡは、遺伝子工学の分野においてよ（知られており、そ してマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、　、フリトシ（Ｆｒ　ｉ　ｔ　ｓｈ ）　、Ｅ。

およびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、Ｊ、（１９８２）　、分子クロー ニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、：＋−ルドースプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、に記載されている。ベクターは慣用方法に より構成して、トランスフェクションすべき細胞中の発現を保証し、そしてＤＮ Ａおよびトランスフェクションされた細胞の同定を可能とするマーカー配列を設 けることができる［マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、ｆｏｅ、ｃ ｉｔ、］ｏ本発明においてと（に適当な選択的マーカーは、薬物抵抗性マーカー 、例えば、ｔＫ−細胞のためのチミジンキナーゼ（ｔＫ）遺伝子を包含する［ス ジパルスキ（Ｓｚｙｂａｌ　５ｋａ）　、Ｅ、およびスジパルスキ（Ｓ　ｚ　ｙ 　ｂａｌｓｋｉ）、Ｗ、（１９６２）、プロシーディンゲス・イブ・ナショナル ・アカデミ−・イブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ 、）ＵＳＡ、４２．２０６２］。

適当には、プロモーター配列をベクターの中に挿入して、トランスフェクション された細胞中のＰＤＴＲＰエピトープの発現を増加することができる［スブラマ ニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）、Ｓｌ、ムリンガン（Ｍｕ１１　ｉｎｇａｎ）　、Ｒ ，Ｃ，およびベルブ（Ｂｅｒｇ）、Ｐ、（１，９８１）、モレキュラー・アンド ・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、Ｌ　１．８５４−’ ８６４］。

トランスフェクションすべき細胞、すなわち、ベクターを挿入すべき細胞（以後 「ドナー細胞」）は、ドナー動物、例えば、鰯歯類、ことにラットおよびマウス 、および霊長類、例えば、サルから得られる。ドナー細胞は、いったんトランス フェクションされたならば、ＰＤＴＲＰエピトープを、必要に応じてＰＤＴＲＰ エピトープの後翻訳プロセシングを用いで、発現することができな（ではならな い。好ましくは、ドナー細胞および必要に応じて修飾されたＤＮＡは、ＰＤＴＲ Ｐエピトープが細胞外にまたは細胞表面に現れるように選択するが、また、本発 明を細胞内でのみ発現されるポリペプチドに適用することができる。

ことに細胞内で発現されたポリペプチドについて、ドナー細胞は常態で腹膜内に 存在しないか、あるいは宿主動物の血流中を循環しない型のものであることが好 ましい。

好ましくは、トランスフェクションされた細胞を接種した動物（以後［宿主動物 ｊ）とシンジエネイックであるトランスフェクションすべき細胞は動物（以後Ｉ −ドナー動物」）から誘導される。特定の理論に拘束されたくないが、シンジエ ネイックドナー動物からの細胞を使用するこ、！−によって、トランスフェクシ ョンされた細胞と、検出しかつ宿主動物の免疫系により作用されることができる 宿主動物自身の細胞との間の差は最小となると信じられる。こうして、免疫応答 は、ＤＮＡ配列の発現により、トランスフェクションされた細胞により産生され た外来ポリペプチドに対して向けられる可能性が多い。

宿主動物の免疫系への指令作用を最大とするために、宿主動物およびドナー動物 は実質的に遺伝子的に同一であり、そして通常それらは、この分野においてよく 知られているような、よく確立された同血統交配の系統であることが望ましい。

−卵性のドナー動物および宿主動物が同血統交配の系統を形成するか否かに拘ら ず、あるいは宿主動物それ自体からの細胞でさえ、これらの使用は考えられる。

ドナー細胞のトランスフェクションは、慣用方法により、例えば、リン酸カルシ ウムを使用して［オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、Ｐ、　、）ロウスデイル（Ｔｒ ｏｗｓｄａｌｅ）、ｊｌ、ルッド（Ｒｕｄｄ）　、Ｃ，、ポド？−（Ｂｏｄｍｅ ｒ）　、Ｗ、　、フェルトマン（Ｆｅ　ｌｄｍａｎｎ）、Ｍ、およびランプ（Ｌ ａｍｂ）　、Ｊ、（１９８５）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　１．３１３． １−４１またはエレクトロポレイション技術により［＝　、、　−マン（Ｎｅｕ ｍａｎ）　、Ｅ、　、シェファーーリッダー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｆｄｄｅｒ ）、Ｍ、　、ランプ（Ｗａ　ｎ　ｇ）　、Ｙ、およびホシュネイダ−（Ｈｏｆｓ ｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｐ、Ｈ，（１９８２）、ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）、１ ．８４１−８４５］またはレトロウィルスのベクターを使用して［バイオロジ− クス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、６．６０８−６１４　（１９８８）］。

トランスフェクション後、細胞、またはクローンまたはそのサブクローンをスク リーニングして、ＰＤＴＲＰエピトープを発現することができるものを選択する ことは便利であることがある。細胞表面で発現された遺伝子産生物では、蛍光性 抗体および蛍光性活性化細胞のソーターはとくに便利である［オースチン（Ａｕ ｓｔｉｎ）、ｌｏｃ、ｃｉ　ｔ、　］が、他の技術をスクリーニングおよび選択 に利用することができる。

トランスフェクション体の細胞は、必要に応じて選択後、処理して遺伝子産生物 の発現を増加することができる。種々の既知の増強方法、例えば、次の物質を使 用する処理を用いることができる：酪酸ナトリウム［ゴールマン（Ｇｏｒｍａｎ ）　、Ｃ，Ｍ、およびホワード（Ｈｏｗａ　ｒｄＬ　Ｂ、Ｈ，（１９８３）核酸 の研究（Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１１．７６３１−７ ６４８１またはインターフェロン［バルクウィル（Ｂａ　Ｉｋｗｆ　Ｉ　１）　 、Ｆ、　Ｒ，、ステベンス（Ｓｔ　ｅｖｅｎｓ）　、Ｍ、Ｈ，、グリッツイン（ Ｇｒｉｆｆｉｎ）、Ｄ、Ｂ。

、トマス（Ｔｈｏｍａ、ｓ）　、Ｊ、Ａ、およびポドマ−（Ｂ　ｏ　ｄｍｅ　ｒ ）、Ｊ、　Ｇ、（１９８７Ｌ　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、０ｎｃｏ ＋、　、２３．１０１−１０６１゜増強方法はドナー・細胞の型に対して適当な ように選択される。

１または２以上の宿主動物にＰＤＴＲＰエピトープまたはトランスフェクション された細胞を接種し、好ましくは適当な媒質中のトランスフェクションされた細 胞の腹膜内または静脈内の注射により接種する。好ましくは、接種は間隔を置い て反復し、そして動物の抗体の力価を監視して、所望の免疫応答が起こることを 確認する。投与および接種の方法のために選択するルートは、好ましくは、所望 のクラスの抗体の優先的に産生されるように選択され、例えば、ＩｇＭ抗体を分 泌する細胞の産生が接種および抗体分泌細胞の回収の間の間隔を短くすることに よって好適に起こるが、ＩｇＧ抗体の産生は反復する接種および抗体分泌細胞の 究極の回収の間の間隔を長くすることによって好適に起こる。

接種が完結すると、抗体を分泌する細胞、例えば、肺細胞を接種した動物から取 り出し、そして適当な培地の中で維持する。慣用方法を使用して宿主細胞を獲得 しそして維持することができる。抗体を産生ずる細胞は、また、癌を有する宿主 動物の体液または組織から、とくにヒト癌、ことに乳癌または卵巣癌の患者の切 除したリンパ節からのリンパ球から得ることができる［ジャーナル・イブ・イム ノロジカル・メソッズ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｔｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１０５．２６３−２７３　（ １９８７）］。

他の面において、本発明は、癌を有するか、あるいはＰＤＴＲＰエピトープまた はＰＤＴＲＰエピトープを発現することができるトランスフェクションされた細 胞を接種した宿主動物から、抗体を産生ずる細胞を取り出すことからなる、ＰＤ ＴＲＰエピトープに対する抗体を分泌することができる細胞を産生ずる方法を提 供する。

それ以上の面において、本発明は、癌を有するか、あるいはＰＤＴＲＰエピトー プまたはＰＤＴＲＰエピトープを発現することができるトランスフェクションさ れた細胞を接種した宿主動物から取り出された、ＰＤＴＲＰエピトープに対する 抗体を分泌することができる細胞を提供する。

この段階において、宿主動物から得られた抗体を分泌する細胞の集団をスクリー ニングして、ＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体を分泌するものを選択すること は便利であることがある。

細胞は、ＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体（以後モノクローナル抗体またはＭ Ａｂ）を分泌することができる永久増殖性細胞系を形成するための免疫化にと（ に有用である。永久増殖性を付与することは、任意の既知の方法により実施する ことができるが、永久増殖性細胞との融合によりハイブリドーマを形成すること は最も便利な方法である。

したがって、本発明は、また、抗体を産生ずる動物細胞、ＰＤＴＲＰエピトープ を接種した宿主動物から取った抗体を分泌する細胞またはＰＤＴＲＰエピトープ を発現することができるトランスフェクションされた細胞に永久分裂能を与える ことからなる、ＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体を産生ずることができる永久 増殖性細胞を産生ずる方法を提供する。

融合に適当な永久増殖性細胞（これらの細胞は適当な培養条件下に反復した細胞 分割をすることができる）はよく知られている。永久増殖性細胞は、抗体を分泌 する細胞と同一の血統であることができ、そして通常宿主動物からの抗体を分泌 する細胞と同一の種であろうが、これは必須ではない。と（に便利な永久増殖性 細胞は骨髄腫細胞である。融合はコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスティン （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５旦、４９５−４９ ７　（１９７５）の方法および文献に記載されているようにその変法により達成 される。

融合後、生ずるハイブリッド細胞の集団をスクリーニングして、ＰＤＴＲＰエピ トープに対する抗体を分泌する細胞を選択することは便利であることがある。

本発明は、また、ＰＤＴＲＰエピトープを接種した宿主動物から取ったＰＤＴＲ Ｐエピトープに対する抗体を分泌することができる抗体産生細胞またはＰＤＴＲ Ｐエピトープを発現することができるトランスフェクションされた細胞からなる か、あるいはこのような細胞の子孫である、ＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体 を分泌することができる、永久分裂能を与えられた細胞、好ましくはハイブリド ーマを提供する。

本発明による永久増殖性細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞）は、ＰＤＴＲＰエ ピトープに対するＭＡｂを産生ずるために使用することができる。

したがって、本発明は、上に定義したＰＤＴＲＰエピトープに対する抗体を分泌 することができる永久分裂能を与えられた細胞、またはこのような細胞の子孫を 培養し、そしてモノクローナル抗体を回収することからなる、ＰＤＴＲＰエピト ープに対するモノクローナル抗体を産生ずる方法を提供する。

本発明は、さらに、上に定義した永久増殖性ハイブリッド細胞の組織培養物また は腹水中の成長から得られた、ＰＤＴＲＰエピトープに対するモノクローナル抗 体を提供する。

前述したように永久分裂能を与えられた細胞により産生された抗体は、普通の技 術によりスクリーニングして、ＰＤＴＲＰエピトープに対するＭＡｂを産生ずる 細胞を同定することができる。このような細胞は、増殖および培養して、本発明 によるＭＡｂを大量に産生ずることができる。

適当な培養技術および抗体を分泌する細胞の成長条件は、よく知られており、そ して関係する特定の永久分裂能を与えられた細胞系および産生ずべきＭＡｂに適 当なように選択される。

本発明は、さらに、上に定義したＰＤＴＲＰエピトープおよびＰＤＴＲＰエピト ープのＣ−末端またはＮ−末端に結合したキャリヤーのポリペプチドまたはタン パク質からなる、融合タンパク質を提供する。

キャリヤーのポリペプチドまたはタンパク質は任意の適当なポリペプチドまたは タンパク質であることができる。便利なキャリヤータンパク質はチログロブリン およびウシ血清アルブミンである。

本発明の融合タンパク質は、ポリペプチド合成およびタンパク質化学の普通の技 術により個々のアミノ酸の前駆体からまたはより小さいポリペプチドのカップリ ングにより産生ずることができる。あるいは、融合タンパク質は、融合タンパク 質をエンコードする遺伝子の発現を包含する組み換えＤＮＡ技術により産生ずる ことができる。これらの方法はすべてこの分野においてよく知られている。

本発明は、さらに、外科または治療によりヒトまたは動物の体を処置する方法ま たはヒトまたは動物の体について実施される診断方法において使用するための、 上に定義した融合タンパク質；ヒトまたは動物の体の治療学的、外科的または診 断の処置において使用する薬物の製造における融合タンパク質の使用；融合タン パク質およびその製剤学的に許容されつる希釈剤または担体および、必要に応じ て、普通の助剤の成分からなる製剤学的組成物、および有効な無毒の量の融合タ ンパク質をヒトまたは動物に投与することからなる、ヒトまたは動物の体を処置 する方法を提供する。

融合タンパク質は、と（に、癌、例えば、乳癌の処置または予防において、患者 の腫瘍細胞に対する免疫性を増加することによって、そして癌の診断および治療 学的処置において使用するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生 において有用である。

本発明を、ここで、添付図面を参照することによって説明する。

第１図は、実施例１に従う１系列のオクタペプチド／ＳＭ３の反応の４５０ｎｍ における光学密度（０，Ｄ、　）のグラフである。

第２図は、オーバーラッピングするペプチドのオクタマーの設計を示す。出発配 列は２０アミノ酸の直列の反復から成り、隣接する反復の４アミノ酸はアミノ末 端およびカルボキシ末端上に存在する。オーバーラッピングするオクタマー［− ］で示され、そして［Ａ］はビン上のスペーサーとして使用したアラニンを示す 。注、オクタマー１および２１は同一である。アミノ酸について１文字のコード を使用する。

第３図はモノクローナル抗体５Ｍ−３のオクタマーのペプチドへの結合のグラフ である。モノクローナル抗体（５０μｇ／ｍｌ、１００μｍ／ビン）をオクタマ ー１−２１で反復しく第２図において定義されている）そして結合をＥＬＩＳＡ アッセイを使用して可視化した。インサート中の箱で囲まれた配列は５Ｍ−３に より認識されるエピトープを表す。

第４図は、モノクローナル抗体のＨＭＦＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｍ８および ｃ５のオクタマーのペプチドへの結合を示す、１系列のグラフである。モノクロ ーナル抗体（５０μｇ／ｍｌ、１００μｍ／ビン、ＨＭＦＧ−２およびｏｎｃ− Ｍ１５について、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｍ８腹水ｎｏｔ　：　５００希釈）をオク タマー１−２１で反復しく第２図において定義されている）そして結合をＥＬＩ ＳＡアッセイを使用して可視化した。括弧内の配列はエピトープを示す。

第５図は、ＰＥＭムチンコアタンパク質と反応性のモノクローナル抗体により認 識されたエピトープの線図的表示である。潜在的グリコジル化部位は矢印で示さ れている。

第６図は、蛍光活性化細胞ソーターにより検出された、リンパ芽球様および乳癌 細胞系へのＨＭＦＧ−２の結合を示す、１系列のグラフである。懸濁液中の細胞 をＨＭＦＧ−２（−）またはＴＡＬ−４（−−−）抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナ ル抗体とともにインキュベーションし、そして結合を蛍光標識したウサギ抗方法 を使用して検出した。Ａ、ＨＬＡ−ＤＲ２を発現するリンパ芽球様細胞系ＰＧＦ 、β鎖は配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　（ＤＴＲＰ）を含有する。ＢＳ ＨＬＡ−ＤＲ７を発現するリンパ芽球様細胞系Ｍａｎｎ、β鎖は配列Ａｓｐ−Ｔ ｈｒ−ＧＩｎ−Ｐｒｏ　（ＤＴＱＰ）を含有する。ＣＳＰＥＭムチンを発現する 乳癌細胞系Ｔ４７Ｄ０ 第７図は、オクタマーのペプチドに対する抗ペプチド抗血清の結合のグラフであ る。１　：　２００に希釈した抗血清を第２図に記載するようにペプチドと反応 させた。インサート中の箱で囲った配列は、この抗血清により認識された優性エ ピトープを表す。

第８図は、抗ペプチド抗血清を使用する乳癌細胞系の染色を示す対の顕微鏡写真 である。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明をいか なる方法おいても限定することを意図しない。

われわれが前に示したように、モノクローナル抗体ＭａｅｌｌＩはＰＥＭコアタ ンパク質の中に見いだされる２ｏアミノ酸の直列の反復内のエピトープを認識す る［ゲンドラ−（Ｇｅｎｄｌｅｒ）ら、ジャーナル・イブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、！旦、１２８２０−１２８２３　（ １９８８）］。ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉ。

Ｃ１１ｅｍｉｃＣ１１ｅケンブリッジ、英国）から購入したエピトープ走査キッ トを使用して、われわれはさらに５Ｍ−３により認識されるエピトープを明らか にし、そして最小エピトープがプロリン−アスパラギン酸−スレオニン−アルギ ニン−プロリンから成ることを示した。

この方法は、ポリプロピレンのビンの末端で小さい、オーバーラッピングするペ プチドを合成することから成り、９６のビンをマイクロタイタープレートのフォ ーマットおよび間隔でプラスチックの支持体の中に保持する。ピンの先端を化学 的に誘導化して官能基を産生じ、これにアミノ酸をカップリングすることができ 、そしてペプチドをビンの先端上で１アミノ酸／日の付加でペプチド鎖の段階的 伸長により合成する。

いったん所望の長さのペプチドが合成されたとき、ピンを標準のＥＬＩＳＡ型ア ッセイにおいて抗体とのそれらの反応性についてアッセイすることができ、ここ で試薬を９６ウエルのマイクロタイタープレートの中に分配し、次いでそれらの 中にピンを配置する。

オーバーラッピングするオクタマーを合成することを選択し、直列の反復に沿っ て、合成される各オクタマーとともに１つのアミノ酸を動かし、そしてすべての 可能なオクタマーをカバーして、第１ペプチドおよび最後のペプチドが同一であ るようにする。こうして、オクタマーを設計するために、１直列の反復および次 の反復の８アミノ酸、すなわち、ＶＴＳＡＰＤＲＴＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶ ＴＳＡＰＤＴＲを使用した。こうして、最初のオクタマーＶＴＳＡＰＤＴＲ，お よび第２のＴＳＡＰＤＴＲＰ、第３の５ＡＰＤＴＲＰＡなどであった。したがっ て、オクタマー２〜５はここに定義するようにｒＰＤＴＲＰＪエピトープである 。オクタマー１および６〜２１はＰＤＴＲＰエピトープではな（、それらの各々 はＰＤＴＲＰ配列の一部分のみを含有するか、あるいはそれを含有せず、そして ５Ｍ−３とほとんど反応しないか、あるいはまった（反応しない。このような組 のオクタマーを使用して得られた結果を第１図に示し、この図面は５Ｍ−３のエ ピトープがＰＤＴＲＰであること上皮特異性を示しそして腫瘍関連抗原を認識す るモノクローナル抗体の多くは、大きい分子量のムチン分子上に見いだされるエ ピトープと反応する。最近まで、ムチンの生物学的特性決定は、例えば、胃腸管 、肺および頚において産生された、大きいムチンを使用して実施された［ハウン セル（Ｈｏｕｎ　ｓ　ｅ　Ｉ　Ｉ）およびフエイジ（Ｆｅ　ｉ　ｚ　ｉ）　、１ ９８２；マーシャル（Ｍａｕｓｈａｌｌ）およびアレン（Ａｌｉｅｎ）、１９７ ８；スレイター（Ｓｌａｙｔｅｒ）ら、１９８４　；ラールステット（Ｃａｒｌ ｓｔｅｄｔ）ら、１９８３］。しかしながら、乳腺、汗腺および唾液腺を包含す る他の腺はムチンを産生じそして、われわれはが多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）と 名付ける１つは、上皮または癌関連決定基を認識する多数のモノクローナル抗体 のための標的抗原であると思われる［バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅ　Ｉ　Ｉ）およ びタイラー−パパジミトリオウ（Ｔａｙ　ｆｏｒ−Ｐａｐａｄ　ｉｍｉ　ｔ　ｒ 　１ｏｕ）　、１９８９］　。

ＰＥＭ成分はいくつかの正常上皮組織により産生され、そして乳汁を出す乳腺に より豊富に産生されるので、と（に興味があるものであり、それは、また、乳癌 および他の癌により発現される［タイラー−パパジミトリオウ（Ｔａｙｌｏｒ− Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）ら、１９８６；ガーリング（Ｇｉｒｉｎｇ）ら、 １９８９］、そのうえ、ムチンは癌細胞により異なるようにグリコジル化される ように思われ、その結果新規な炭水化物のエピトープが現れ［クジエルドセン（ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ）ら、１９８８］、そして正常ムチンにおいてマスキングされ ているコアタンパク質のエピトープは癌関連成分において露出される。１つのこ のようなコアタンパク質のエピトープは抗体５Ｍ−３により検出され、この５Ｍ −３は化学的に脱グリコジル化された正常ＰＥＭムチンを使用して発生された［ バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅ　ｌ　Ｉ）ら、１９８７］。この抗体は乳癌の９０％ より多（と反応するが、正常の乳房ムチンまたは乳から精製されたＰＥＭムチン とほとんど反応しないか、あるいはまったく反応しない［バーチエル（Ｂｕｒｃ ｈｅ　Ｉ　１）ら、１９８７　ニガーリング（Ｇｉｒｉｎｇ）ら、１９８９］　 、５Ｍ−３抗体の特異性はそれを乳癌の診断および処置における潜在的に有用な 道具とし、したがって５Ｍ−３エピトープの同定は大きい重要を有する。

最近、ＰＥＭムチンの免疫原性ドメインのアミノ酸配列［ゲンドラ−（Ｇｅｎｄ 　１　ｅｒ）ら、１９８８］は、この領域の遺伝情報を指定するｃＤＮＡクロー ンのヌクレオチド配列から推定された［ゲンドラー（Ｇｅｎｄｌｅｒ）ら、１９ ８７］。このドメインは２０アミノ酸長さの反復ユニットから構成され、そして 反復の数は個々に異なり、ＤＮＡおよびタンパク質のレベルで見られる多形性を 生ずる［スワロウ（Ｓｗａ　１１ｏｗ）ら、１９８７］。直列の反復のリーディ ングフレームは、対応する配列をもつ合成ペプチドに対する３つのコアタンパク 質反応性抗体（ＨＭＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２および５Ｍ−３）の結合を示すこと によって明確に確立された［ゲンドラ−（Ｇｅｎｄ　］　ｅｒ）ら、１９８８］ 。

この配列はムチンについて期待することができるものと一致し、そしてプロリン に富んだ伸長により分離されたセリンおよびスレオニン（多分Ｏ−グリコジル化 部位）を含有し、線状構造を示唆する。２０アミノ酸の直列の反復の配列を包含 するオーバーラッピングするオクタマーを使用して、われわれは、今回、連続的 アミノ酸配列、Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを５Ｍ−３エピトープ のコアとして同定することができた。興味あることには、正常および癌関連の両 者のムチン上に見いだされ、そして他の抗体により認識される、他のコアタンパ ク質のエピトープは、また、この領域にマツピングされるが、いずれも５Ｍ−３ エピトープのアミノ末端にプロリンを含有しない。このデータは、癌関連ムチン 上の５Ｍ−３のエピトープの露出をより短い炭水化物側鎖を生ずる異常のプロセ シングに起因させることができるという考えと一致する。予備的研究において、 乳癌と反応性のＰＥＭムチンに対する抗体を発生させるために、直列の反復の配 列の一部分に相当するペプチドを使用することができるが示された。

材料および方法 ペプチド：　ペプチドは、固相技術により、４３０Ａペプチド合成装置［アプラ イド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）］で、商業 的に入手可能なｔ、　−ｂ　ｏ　ｃ保護されたアミノ酸および制限を使用して前 に記載されたように［タウンセンド（Ｔｏｗｎｓｅｄ）ら、１９８６］合成した 。

オーバーラッピングペプチドオクタマーの合成二　オーバーラッピングペプチド オクタマーは、ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら（１９８４）により本来発表された 方法に基づくエピトープ・スキャニング・キット［ケンブリッジ・リサーチ・バ イオケミカルス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ）、ケンブリッジ、英国］を使用して、ポリプロピレンのピンの末端上に合 成した。ピンはスペーサーとして作用する末端に取り付けられたアラニンをもっ て供給され、ｔｕＳ合成されたペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸はア ラニンへのペプチド結合より接合されている。

抗体：　モノクローナル抗体ＨＭＦＧ−１、！（ＭＦＧ−２および５Ｍ−３［タ イラー−パパジミトリオウ（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉ　ｔｏｒｔｏｕ） ら、１９８１　；ブルチェル（Ｂｕｒｃｈｅｌ　１）Ｉａ１１９８３　；　１９ ８７　；ガーリング（Ｇｉｒｌｉｎｇ）ら、１９８９］　、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ− Ｍ８　［フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら、１９８２］、ｏｎｅ−Ｍ２Ｓ、ｏｎｅ −Ｍ２３、ｏｎｅ−Ｍ２７　［リンスレイ（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら、１９８８］の 発生および特性決定はどこがで記載された。モノクローナル抗体ＴＡＬ１４．１ はＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒに向けられている。

抗ペプチドマウス抗血清は、トログログリンにカップリングされた２５μｇのＰ ＤＴＲペプチド１−２４　（参照、表２）で腹腔内で免疫化し、次いでウシ血清 アルブミンに接合された２５μｇのＰＤＴＲＩ−１４を３回注射することによっ て産生された。

ＥＬＩＳＡ：モノクローナル抗体（５０４ｇ／ｍｌまたは１　：　５００希釈物 の腹水、１００μＩ／ピン）およびポリクローナル血清（１：２００）を、ペル オキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ，デンマーク）を使用して、前 に記載されたように［バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ）ら、１９８３］　ＥＬＩ ＳＡアッセイにおいてそれらのオクタマーとの反応性について試験した。オクタ マーは９６ウエルのマイクロタイタープレートのフォーマットを与えるピン上に 合成し、それゆえアッセイのためにピンを抗体または試薬を含有するマイクロタ イターディツシュの中に挿入した。

細胞系へのＨＭＦＧ−２の結合：　１０６細胞を含有する細胞ペレットを１０％ の胎児仔ウシ血清を含有するＲＰＭＩで洗浄し、そして０．０２％のアジ化ナト リウムを含有する１ｍｌのハイブリドーマの組織培養上澄み液の中に懸濁し、そ して４℃において１時間インキュベーションした。１０％のＦｅ２，０．０２％ のアジ化ナトリウムを含有するＲＰＭＩ（洗浄緩衝液）で２回洗浄した後、洗浄 緩衝液中で１＝２０に希釈しそして使用の前に濾過した蛍光接合したウサギ抗マ ウス（ＤＡＫＯ。

デンマーク）の１ｍｌの中に細胞ベレットを懸濁した。４℃において３０分後、 ペレットを洗浄緩衝液（２０ｍｌ）で１回洗浄し、そしてＰＢＳＡ　（２０ｍｌ ）で１回洗浄し、次いで１ｍｌのＰＢＳＡの中に懸濁した。次いで、蛍光接合ウ サギ抗マウスをスペクトラ−フィジックス（Ｓｐｅｃ　ｔ　ｒａ−Ｐｈｙｓ　ｉ 　ｃｓ）蛍光セルソーター中で分析した。

結果 抗体５Ｍ−３により認識されるエピトープの同定ＰＥＭムチンの直列反復ユニッ トの配列を第２図に示す。任意に、配列はＰＤＴＲで開始するとして書いた。な ぜなら、これはｃＤＮＡクローンの１つにおける第１の直列の反復の介しであっ たからである［ゲンンドラ−（Ｇｅｎｄ　Ｉ　ｅ　ｒ）ら、１９８７］、抗体５ Ｍ−３は、１つの直列の反復および次の反復の４アミノ酸に相当するＰＤＴＲペ プチド（１−２４）と反応することが従来示された（参照、表１）。５Ｍ−３抗 体により認識されるエピトープをさらに明らかにするために、単一の反復および 隣接する反復の８アミノ酸を包含する、１系列のオーバーランピングペプチドオ クタマ−（第２図）をポリプロピレンのピンの先端上に合成した（参照、材料お よび方法）。第３図は、ペプチドをＥＬＩＳＡにおいで５Ｍ−３と反応させたと き得られた結果を示す。理解することができるように、５Ｍ−３と反応性のすべ てのペプチドは配列Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含有し、したが ってこれは最小エピトープを表すように思われる。

ｏｎｅ−Ｍ２Ｓ　ＭＣＦ−７，ＨＭＦＧ　＋　＋　＋　リンスレイら、ｏｎｅ− Ｍ２３　ＭＣＦ−７，ＨＭＦＧ　＋　＋　＋ｏｎｃ−Ｍ２７　Ｗ５−６．ＨＭＦ Ｇ　＋　＋　＋宜ＰＤＴＲペプチド（１−２４）　ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ ＡＴＩＧＶＴＳＡＰＤＴＲ２ＰＤＴＲペプチド（１−１４）　ＰＤＴＲＰＡｒ’ ＧＳＴＡＰＰＡＣ＊３ＶＴＳＡペプチド（１７−２０，１，−１０）　ＶＴＳＡ ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴ’　Ｆ！ＭＦＧヒト乳脂小球 京カップリングを可能とするためにシスティンを含めた。

５Ｍ−３エピトープを含有するドメインの免疫原性ＰＥＭムチンと反応性のモノ クローナル抗体は、ムチンを含有する種々の免疫原、例えば、ヒト乳脂小球抽出 物［タイラー−パパジミトリオウ（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｊ、ｍ１ｔｏｒｉ ｏｕ）ら、１９８１：ヒルケンス（Ｈｉｌｋｅｎｓ）ら、１９８４　；フォスタ ー（Ｆｏｓｔｅｒ）ら、１．９８２：セリア−（Ｃｅｒｔａｎｉ）ら、１９８３ ］および癌細胞［プラムウェル（Ｂ　ｒ　ａｍｗｅ　１１）ら、１９８３ニブラ イス（Ｐｒｉｃｅ）ら、１９８５］を使用して発生させた。あるものはムチンお よび培養した細胞の両者から得た［タイラー−ババジミトリオウ（Ｔａｙｆｏｒ −Ｐａｐａｄｉｍｉｔｏｒｔｏｕ）ら、１９８１；バーチエル（Ｂｕｒｅｈｅｌ ｌ）ら、ｉ、９８３；参照、表１］。われわれは、これらの抗体のあるものを直 列の反復をエンコードするペプチドとのそれらの反応性について試験し、そして 多数がＰＤＴＲペプチド（アミノ酸、１−−２４、表１）と強い陽性の反応を示 すことが発見された。これらは表１に列挙する抗体ならびに抗体ＮＣＲＣＩＩ　 ［プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら、１９８５］およびＤＦ３　［セキネ（Ｓｅｋｉｎ ｅ）ら、１９８５］を包含する。これらの抗体のあるものと反応性のドメインを より詳細に同定するために、より小さいペプチドとのそれらの反応性を検査した 。表１に示すように、試験した抗体のすべては２つのより小さいペプチドと反応 し、それらの両者はＰＤＴＲペプチドの最初の１０アミノ酸を含有した。この領 域は、また、５Ｍ−３エピトープをを含有し、直列の反復のこの部分がマウスに おいて免疫優性であるエピトープを含有することを示唆する。表１に示す抗体の うちの３つ、すなわち、ＨＭＦＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｍ８およびｏｎｅ− Ｍ２Ｓ、と反応性の特異的エピトープは、第２図に例示するオーバーラッピング オクタマーを使用してより詳細に同定し、そして結果を第４図に示す。抗体ＨＭ ＦＧ−２およびＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｍ８はオクタマーと顕著に類似するパターン を示し、そして両者の場合において、最小のエピトープはＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒ ｇ　（ＤＴＲ）であると思われるが、ｏｎｅ−Ｍｉ５により認識されるものはＴ ｈ　ｒ　−Ａ　ｒ　ｇ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａ　１　ａ　（ＴＲＰＡ）である。

詳細なエピトープのマツピングの結果は、単一のスレオニンおよび潜在的グリコ ジル化部位の間のフランキングアミノ酸がＰＥＭの直列の反復の高度に免疫原性 のドメインを構成することを示す。異なるエピトープの間のオーバーラツプは第 ５図示されている。

隣接するアミノ酸の役割 ＰＩＲのタンパク質のデータベースを第５図に示すエビトー・ブについてサーチ するとき、バクテリアのタンパク質からＨＬＡ−ＤＲβ鎖までの領域の多数のタ ンパク質が配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇを含有することが示された。しかしなが ら、抗体ＨＭＦＧ−２およびＭ８は多形性上皮ムチンと制限された反応を示すこ とが報告された。これらの抗体の１つが異なるフランキングアミノ酸をもつＡｓ ｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇを含有するタンパク質と結合するかどうかを研究するために 、われわわは最小エピトープを含有することが知られている自然タンパク質への ＨＭＦＧ−２の結合を研究した。ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖は配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ− Ａｒｇ−Ｐｒｏを含有するが、ＨＬＡ−ＤＲ７のβ鎖は配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇ ｉｎ−Ｐｒｏを含有し［ヤウング（Ｙｏｕｎｇ）ら、１９８７］、しかしながら 、隣接するアミノ酸はＰＥＭムチンと相同性を示さない。

ＨＬＡ−ＤＲ２（ＰＧＦ細胞）およびＨＬＡ−ＤＲ７（ＭＡＮＮ細胞）を発現す るリンパ芽球に似た細胞系へのＨＭＦＧ−２の結合を分析し、そしてＰＥＭムチ ンを発現する乳癌細胞系（Ｔ　４７　Ｄ）へのＨＭＦＧ−２の結合と比較した。

第６図が示すように、期待するように、ＨＭＦＧ−２はＤＲ７を発現するＭＡＮ Ｎ細胞に結合せず、また配列Ａｓｐ−Ｔｂｒ−Ａｒｇを含有するＤＲ２を発現す る細胞に結合しなかった。しかしながら、ＨＭＦＧ−２は事実乳癌細胞系Ｔ４７ Ｄへの強い結合を示した。こうして、ＨＭＦＧ−２の最小エピトープはコンフォ メーション的に遊離のペプチドに関して３つのみのアミノ酸から成るが、コンフ ォメーションの制限を有する自然タンパク質において、隣接するアミノ酸は抗原 性部位の決定において重要な役割を有する。

乳癌反応性抗体の発生のための免疫原としてのペプチド５Ｍ−３の発現では、前 述のモノクローナル抗体は乳から分離するか細胞に関連するグリコジル化ムチン を使用して発生させ、そしてこれらの場合において、炭水化物の側鎖はコアタン パク質のエピトープとのどれが露出されるかどうかを決定するとき主要な役割を 演するであろう。

われわれは、ここで、ＰＤＴＲ−ペプチド（１−２４）およびキャリヤータンパ ク質にカップリングしたＰＤＴＲペプチド（１−１４）（参照、材料および方法 ）で注射したマウスの応答を、抗血清とオーバーラッピングオクタマーとの反応 を追跡することによって、検査した。第７図が示すように、全体の結合はモノク ローナル抗体より高いが、ペプチド４および５において結合のピークが存在する ように思われた。これは配列Ｐ−Ｄ−Ｔ−Ｒ−Ｐ−Ａ−Ｐを認識するエピトープ を認識する血清の中に存在する抗体に相当する。抗血清は一次乳癌および細胞系 と陽性の反応を示しく参照、第８図）、存在する抗体のあるものが癌関連ムチン 上で露出されたエピトープと反応したことを示す。この最初の実験が示唆するよ うに、直列の反復配列に基づくペプチドを免疫原として使用して、癌関連ＰＥＭ ムチンと反応性の抗体を発生させることができる。

論考 多形性上皮ムチンのコアタンパク質はある数の直列の反復から構成され、それら の各々は５つの潜在的〇一連鎖グリコシル化部位を含有する［ゲンドラ−（Ｇｅ ｎｄｌｅｒ）ら、１９８８］。これらの直列の反復は、このムチンに対して向け られたモノクローナル抗体の多数により認識されるエピトープを含有する。オー バーラッピングオクタマーを使用することによって、５Ｍ−３により認識される エピトープは明らかにされ、そして位置３に単一のスレオニンを含有することが 示された。さらに、他のモノクローナル抗体と反応性のエピトープは、また、こ の領域にマツピングされることが示された。したがって、少なくともマウスにお いて、この直列の反復の配列は高度に免疫原性であるように思われる。

ＨＭＦＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｍ８、ｏｎｃ−Ｍ２Ｓおよび５Ｍ−３により 認識されるエピトープはオ・−バーラッピングするが、ムチンとこれらの抗体と の反応性は非常に異なる。すべては乳癌細胞により発現されるムチンと反応する が、ＨＭＦＧ−２、ｏｎｃ−Ｍ２ＳおよびＭ８の決定基は、また、正常ムチン上 で発現される［バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅ　Ｉ　ｌ）ら、１９８３　；リンスレ イ（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら、１９８８；フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら、１９８２ ］が、５Ｍ−３決定基は反応しない［バーチエル（Ｂｕｒｃｈｅｌ　ｌ）ら、１ ９８７；ガーリング（Ｇｉｒｌｉｎｇ）ら、１９８９］　。５Ｍ−３モノクロー ナル抗体が化学的に脱グリコジル化された正常孔ムチンに対してレイズされたと いう事実は、炭水化物が正常細胞により産生されるＰＥＭ上のこのエピトープを マスキングするときある役割を演じうろことを示唆する。正常ムチンと反応する ３つの抗体により認識される組み合わせられたエピトープは配列ＤＴＲＰＡを包 含し、この配列はフランキンググリコジル化部位の間の中央に配置される（第２ 図においてＴ１８’　、８１９″、Ｓ−８ＩＯ１参照、また、第５図）。しかし ながら、５Ｍ−３エピトープＰＤＴＲＰはアミノ末端にプロリンを含有し、これ はグリコジル化部位（セリン１９′）から離れた唯一のアミノ酸である。これが 示唆するように、正常ムチンにおいて、５Ｍ−３エピトープのアミノ末端上のプ ロリンは炭水化物によりマスキングされるが、腫瘍において、セリン１１１１お よびスレオニン１８′上の糖鎖の早期のターミネーションのために、それを露出 される。最近の結果がこの考えを支持し、ヒト乳から分離された正常ムチンは伸 長および／または枝分かれしたポリ−Ｎ−アセチル−ラクトサミン側鎖を含有す ることが示された［ハニシ（Ｈａｎｉｓｃｈ）ら、１９８９］が、乳癌細胞系Ｂ Ｔ２０により産生されたムチンのオリゴサツカリド側鎖はわずかに３または４の 糖から成る［フル（Ｈｕ　Ｉ　１）ら、１９８８］。

マツピングされたエピトープのすべての４つはそれらのコアにスレオニンを含有 するので、反応性エピトープ中のこのアミノ酸はグリコジル化されることができ ない。しかしながら、癌関連ムチン上よりすくないＨＭＦＧ−２特異的エピトー プは乳の中に見いだされる正常ムチン上に存在することに注意すべきである［バ ーチエル（Ｂｕｒｃｈｅ　ｌ　Ｉ）ら、１９８３］。これが意味しつるように、 ＤＴＲエピトープ中のスレオニンのあるものは事実正常ムチン」二でグリコジル 化される。換言すると、炭水化物側鎖の長さの異質性のために、正常ムチン上の ＤＴＲエピトープのあるものは長いまたは枝分かれしたポリラクトサミン鎖によ りマスキングされるが、他のものはされない。ＨＭＦＧ−２エピトープの他の特 徴は、抗体に対する親和性が、ミクロの環境に依存して、変化するように思われ ることである。正常ムチンおよび癌芳香族ムチンへの抗体の結合を比較すると、 抗体は正常ムチンに対してより高い親和性を示すことが発見され、正常オリゴサ ツカリド側鎖は最大の親和性のために要求されることを示唆する。オリゴサツカ リド側鎖が重要でありうることは、また、ＨＭＦＧ−２および５Ｍ−３の両者が 、すべての炭水化物をストリッピングされたムチンへより部分的に脱グリコジル 化されたムチンへ強く結合するという事実により示される［バーチエル（Ｂｕｒ ｃｈｅｌｌ）　ら、　１９８７コ　。

オリゴサツカリド側鎖は抗体ＨＭＦＧ−２および５Ｍ−３により認識されるコア タンパク質のエピトープのコンフォメーションの決定においである役割を演する が、免疫原性であるかつ乳癌により発現されるＰＥＭムチンのコアタンパク質の 中に抗原決定基が存在することは極めて明らかである。タンパク質キャリヤーへ カップリングした直列の反復配列に相当する合成ペプチドを使用して、われわれ は乳癌との反応性を示す抗体をマウスにおいて誘発することができた。抗血清を 使用するエピトープのマツピングにおいて、優性エピトープが配列１）ＤＴＲＰ ＡＰの中にグリコジル化部位の間のＴｈｒ”’　、Ｓｅｔ”’および５ｒｅ９、 Ｔｈ　ｒ　１０に見いだされ（第２図）、再びこのドメインの免疫原性を確証す るが示された。これらの結果が示唆するように、今回、乳癌と反応する５Ｍ−３ 様特異性をもつモノクローナル抗体の産生に対する直接アプローチを取ることが でき、そしてこのような研究は現在進行中である。

さらに、癌細胞において選択的に露出されるエピトープの同定は腫瘍細胞により ムチンの異常なプロセシングの研究に集中させ、そして直列の反復を含有するペ プチドまたはポリペプチドをあるヒト癌のための合成ワクチンとしての使用を可 能とすることを示唆する。

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Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８４．４９２９−４９３３　（１９８７）。

実施例３ Ｅ、ｃｏｌｔにおいて融合タンパク質としていくつかの直列の反復の遺伝情報を 指定する部分的ｃＤＮＡの発現ゲンドラ−（Ｇｅｎｄｌｅｒ）ら、（ＰＮＡＳ　 ８４．６０６０−６０６４．１９８７）により分離されそしてほぼ１０の直列反 復ユニットから構成されているクローン７を、ブルースフリブ１−のベクターＳ ＫからＥｃｏＲＩで切り出し、そして発現ベクターｐＲＸ−１の中に挿入した［ リム（Ｒｉ　ｍｍ）およびボラード（Ｐｏｌ　１　ａｒｄ）　、Ｇｅｎｅ。

ヱ互、３２３−３２７．１９８９］　、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　ＤＨ−１菌株中のムチ ン断片の発現についての選択は、抗体を使用して形質転換のブロービングリフト により実施した。ムチン断片を発現するプラスミドからのＤＮＡを調製し、そし てＥ、ｃｏｌｉ菌株ＣＡＧ−４５６［参照、リム（Ｒｉｍｍ）およびボラード（ Ｐｏｌｌａｒｄ）］をムチン断片のより高い発現のために形質転換した。１８ア ミノ酸のｔ　ｒｐＥタンパク質を含有する断片は、ウェスタンプロットでほぼ３ ０ｋＤの分子量の断片として抗体で検出することができた。ゲル分離したバクテ リアのリゼイトのクーマツシーブルーの染色はこのバンドを可視化することがで き、これはインドリルアクリル酸で誘発した細胞において増加され、そして１０ 〜２０％のバクテリアタンパク質から構成されているように思われた。

実施例４ 哺乳動物細胞におけるいくつかの直列の反復の遺伝情報を指定する部分的ｃＤＮ Ａの発現 クローン７をブルースクリプトのベクター［ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）、カリフォルニア州コからＥｃｏＲＩで切り出し、そして直列の反復の正 しいリーディングフレームが維持されるように、ｐＪ３発現ベクターに基づくベ クターのＥｃｏＲ１部位の中に挿入した。

正しい向きでインサートを含有するクローンを、ベクターのインサート配列とオ ーバーラッピングするオリゴヌクレオチドを使用して選択した。

標準の方法に従いＤＮＡを調製し、精製し、そしてＣｏｓ細胞の中にトランスフ ェクションした。４８時間後、細胞をアガロースゲルの電気泳動のために試料緩 衝液中に溶解し、そしてゲルをニトロセルロース紙上にブロッティングした。プ ロットをＥＬＩＳＡを使用して抗体でプロービングすると、トランスフェクショ ンされた細胞において３０ｋＤ付近のバンドが示された。

実施例３および４の手順を使用して、本発明によるＰＤＴＲＰエピトープのポリ ペプチドまたは融合タンパク質を発現しそして試験することができる。

ぺブナド ５Ｍ３ ペプ÷ド゛ ＯＮＩニーＭ１５　（ＴＲＰＡＩ ぐ７゛ゆド 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年５月ＩＯ日 賢

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式（Ｉ） ｛Ｘ｝ｘ｛（Ａ）ｍＰＤＴＲＰ（Ａ）ｎ｝ｙ｛Ｘ｝２（Ｉ）式中、 ｘおよびｚは、同一であるかあるいは異なり、そして各々は０または１またはそ れ以上の整数であり、 ｙは１またはそれ以上の整数であり、 各Ｘは、存在する場合、アミノ酸残基から独立に選択され、ｍおよびｎは、同一 であるかあるいは異なり、そして各々は０または１であり、そして Ａ、Ｐ、Ｄ、ＴおよびＲは、それぞれ、アミノ酸の残基、アラニン、プロリン、 アスパラギン酸、スレオニンおよびアルギニンである、の合成ポリペプチド、ま たは配列 （Ａ）ｍＰＤＴＲＰ（Ａ）ｎ 式中、 各記号は上に定義した通りである、 に免疫学的に同等の配列を含有する前記合成ポリペプチド、必要に応じて１また は２以上のサッカリド部分を含有する前記合成ポリペプチド、またはその製剤学 的に許容されうる塩、ただしベーターグルクロニダーゼを除外する。 ２、（ａ）ＰＤＴＲＰ ＡＰＤＴＲＰ ＰＤＴＲＰＡ ＡＰＤＴＲＰＡ （ｂ）１または２以上のサッカリド部分を有するポリペプチド（ａ）、および （ｃ）上のポリペプチド（ａ）および（ｂ）の製剤学的に許容されうる塩、 から選択されるポリペプチド。 ３、キャリヤータンパク質に連鎖された上記第１または２項記載のポリペプチド 。 ４、キャリヤータンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン およびチログロブリンから選択される、上記第３項記載のポリペプチド。 ５、上記第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチドをエンコードする核酸断片 。 ６、式（ＩＩ） ｛ＸＸＸ｝ｘ｛（ＧＣＸ）ｍＣＣＸＧＡＰｙＡＣＸＲＲＲＣＣＸ（ＧＣＸ）ｎ｝ ｙ｛ＸＸＸ｝２（ＩＩ）式中、 ＲＲＲはＣＧＸまたはＡＧＰｕ ｛Ｘ｝ｘ｛（Ａ）ｍＰＤＴＲＰ（Ａ）ｎ｝ｙ｛Ｘ｝２であり、 ｘおよびｚは、同一であるかあるいは異なり、そして各々は０または１またはそ れ以上の整数であり、 ｙは１またはそれ以上の整数であり、 各Ｘは、存在する場合、アミノ酸残基から独立に選択され、ｍおよびｎは、同一 であるかあるいは異なり、そして各々は０または１であり、そして Ａ、Ｐ、Ｄ、ＴおよびＲは、それぞれ、アミノ酸の残基、アラニン、プロリン、 アスパラギン酸、スレオニンおよびアルギニンであり、Ｘはデオキシリボヌクレ オチドであり、ＸＸＸはアミノ酸残基をエンコードするコドンであり、ＰｙはＣ またはＴであり、 ＰｕはＡまたはＧであり、そして Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは４つのデオキシリボヌクレオチド塩基について国際的に認 められた１文字のコードである、の配列連続的解読配列を含有する、上記第５項 記載の断片。 ７、解読配列 （ＧＣＣ）ｍＣＣＧＧＡＣＡＣＣＡＧＧＣＣＧ（ＧＣＣ）ｎからなる、上記第６ 項記載の断片。 ８、操作遺伝子からなり、融合タンパク質をエンコードし、発現可能な形態で上 記第５〜７項のいずれかに記載の断片を含有するＤＮＡ構成体。 ９、上記第５〜８項のいずれかに記載の核酸断片または構成体を含有するクロー ニングまたは発現ベクター。 １０、上記第５〜８項のいずれかに記載の核酸断片または構成体をエンコードす る発現可能な形態の解読配列を含有するポリオウイルスのゲノムのＤＮＡから成 る発現ベクター。 １１、断片はポリオウイルスのカプシドタンパク質遺伝子とともに含有される、 上記第１０項記載のベクター。 １２、上記第９〜１１項のいずれかに記載のクローニングまたは発現ベクターで 形質転換された宿主細胞。 １３、上記第５〜７項のいずれかに記載の断片および検出可能な標識からなる核 酸プローブ。 １４、上記第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチドを認識することができる 、ＳＭ−３およびＨＭＦＧ−２以外の、抗体。 １５、治療学的または診断的に有効な部分に連鎖された、上記第１４項記載の抗 体。 １６、担体または希釈剤またはアジュバントおよび上記第１４または１５項記載 の抗体からなる製剤学的配合物。 １７、上記第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体を分泌する ことができる、ＨＳＭ−３以外の、細胞。 １８、上記第１７項記載の永久増殖性細胞。 １９、外科または治療によるヒトまたは動物の体を処置する方法あるいはヒトま たは動物の体について実施されるまたは診断方法において使用するための、上記 第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド、上記第５〜７項のいずれかに記載 の核酸断片、上記第８項記載の構成体、上記第９〜１１項のいずれかに記載のベ クター、上記第１２項記載の細胞、上記第１３項記載のプローブ、上記第１４ま たは１５項記載の抗体、上記第１６項記載の製剤学的配合物あるいは上記第１７ または１８項記載の細胞。 ２０、外科または治療によるヒトまたは動物の体を処置する方法あるいはヒトま たは動物の体について実施されるまたは診断方法において使用するための薬物の 調製における、上記第１〜４項のいずれかに記載のポリペプチド、上記第５〜７ 項のいずれかに記載の核酸断片、上記第８項記載の構成体、上記第９〜１１項の いずれかに記載のベクター、上記第１２項記載の細胞、上記第１３項記載のプロ ーブ、上記第１４または１５項記載の抗体、上記第１６項記載の製剤学的配合物 あるいは上記第１７または１８項記載の細胞の使用。 ２１、処置または診断を必要とするヒトまたは動物に、有効な無毒の量の上記第 １〜４項のいずれかに記載のポリペプチド、上記第５〜７項のいずれかに記載の 核酸断片、上記第８項記載の構成体、上記第９〜１１項のいずれかに記載のベク ター、上記第１２項記載の細胞、上記第１３項記載のプローブ、上記第１４また は１５項記載の抗体、上記第１６項記載の製剤学的配合物あるいは上記第１７ま たは１８項記載の細胞を投与することからなる処置または診断の方法。 ２２、異常なヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われる試料を上記第１ ４または１５項記載の抗体と接触させることからなる、診断試験方法。 ２３、上記第１４または１５項記載の抗体からなる診断試験キット。