JPH04501849A - 脂肪合成の阻止 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脂肪合成の阻止 皿１血藍 本出願は、１９８８年７月８日に出願された米国特許出願２１６３７９号、１９ ８８年５月９日に出願された米国特許出願１９１９８６号および１９８７年１２ 月１これら三つの出願のおのおのは、参照により本明細書に含まれる。

１且 脂肪細胞の中への脂質の過剰蓄積は、ヒトおよび動物の肥満の重要な特徴の一つ である。脂肪細胞の脂肪合成は、インシュリン、ホルボールエステル、および成 る条件下では成長ホルモンによって刺激される。

インシュリンリセプターチロシルキナーゼは、インシュリンの活性に重要である ことが知られている。さらに、キナーゼＣはインシュリンおよび成長ホルモンの 、ラット脂肪細胞への刺激効果に関与する事が最近示された（Ｊ、Ｓｍａｌおよ びＰ、ＤｅＭｅｙｔｓ、Ｂｉｏｃｈ−免凹ユー戊」」しＬ上」−Ｌ工Ｊし艷１工 」；旦ｊす１旦」工、＋　１４７　：１２３２　（１９８７）。ホルボールエス テル１２−ミリステート　１３−アセテートはキナーゼＣの活性化剤であるが、 脂肪合成を刺激する。その効果はインシュリンまたは成長ホルモンの効果をさら に付加するものではない。キナーゼＣの抑制調節は両ホルモンの効果を阻害する （Ｊ、Ｓｍａ　１およびＰ、ＤｅＭｅｙｔｓ、上記）。

従って、複雑な脂肪合成代謝経路の第一過程であるグルコース吸収に対するプロ ティンキナーゼ拮抗剤の影響を評価するために研究を行った。

一ゼＣおよびインシュリンリセブターチロシンキナーゼの拮抗剤を含む）が、通 常のおよび基礎的動物脂肪細胞の脂肪合成を阻止もしくは完全抑制するという発 見に関する。脂肪合成の禁止の程度は、脂質細胞が利用できる拮抗剤の実質有効 量の関数である。ホルモン−刺激脂肪合成は比較的低濃度でブロックされるが、 高濃度においては基礎的脂肪合成も完全に抑制される。

本発明の他の観点は、哺乳類、例えばヒトにおける脂肪合成を抑制するために、 治療上有効な量のプロティンキナーゼ拮抗剤の投与にも関する。

好ましいプロティンキナーゼ拮抗剤は、リソフィンゴリピッド（ｌｙｓｏｓｐｈ ｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）類、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）お よびアミノアクリジン（ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ）類を含む。

式Ｉは、本発明に有効なある種のりソフィンゴリピッドである。

（Ｉ） （式中、Ｘは例えばＨ（スフィンゴシン）、ガラクトース（サイコシン：ｐｓｙ ｃｈｏｓｉｎｅ）、スルホガラ５ｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−（ｌｙｓｏ　ＧＭｓ） 、およびそれらの誘導体を表す） 式■は、本発明のこの態様に使用するために有用な好ましい化合物、スフィンゴ シンの分子構造である：Ｈ スタウロスポリンは、日本国東京の協和発酵（株）から入手でき、次の構造式■ を有する微生物アルカロイドである： ＮＨＣＨ。

（ｍ） スタウロスポリン アミノアクリジンは、本発明の実施に有用なさらに別のキナ、−ゼＣ阻害剤の群 を形成する。本発明のこの態様には、他のアミノアクリジンに加えて、プロティ ンキナーゼＣ拮抗剤として、特にハンナンおよびベル（Ｈａ　ｎ　ｎｕｎ　ａｎ ｄ　Ｂｅ１ｌ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

、２６３．５１２４−５１３１　（１９８８）により記載された化合物を含む。

アクリジンオレンジが好ましく、ラット脂肪細胞における基礎脂肪合成およびイ ンシュリン−刺激脂肪合成の両方を阻害することが判明した。その阻害作用は１ ０μＭで最高である。

又肌立亘丞 本発明はプロティンキナーゼ拮抗剤、好ましくはスフィンゴリビッド類および（ リソ）スフィンゴシン・ノド類、スタウロスポリンおよびアミノアクリジン類が 、哺乳類の脂肪細胞の脂肪合成を阻止もしくは完全抑制するという発見に関する 。脂肪合成の阻害の程度は、脂質細胞中の若しくは該細胞が利用できるプロティ ンキナーゼ拮抗剤、例えばスフィンゴリピッドまたは（リン）スフィンゴリピッ ドまたはスタウロスポリンまたはアミノアクリジンの有効量の関数である。

より詳しくは、インシュリン、成長ホルモンおよびホルボールエステルによる脂 質細胞の脂肪合成の刺激が、そのようなプロティンキナーゼ拮抗剤の有効且つ比 較的低濃度で可逆的にブロックされ、他方、高濃度においては基礎脂肪合成（ホ ルモンの不存在下での脂肪合成）も完全に抑制されることが発見された。

実施例１ スフ　ンゴシンによる　八　の 第１Ａ図および第１Ｂ図は、ホルボールエステル（ＰＭＡ）、ヒト成長ホルモン （ｈＧＨ）およびインシュリンによるラットの脂肪細胞（アジボサイト）での脂 肪合成の最大刺激に対するスフィンゴシンの効果を示すグラフである。

トレーサーとしてＤ−３［３Ｈｌ−グルコースの脂質への取込みを、試験管当た りの放射活性の１分間のカウント数（ｃｐｍ）として示している。値は３回の測 定の平均であり、上方および下方へのばらつきは標準偏差（Ｉｓ、Ｄ、）である 。得られた値はグラフを単純化するために１０００で割って表示した。従って、 第１Ａ図のグラフにおける３の値は、実際には３．ＯＯＯｃｐｍの測定値を表す 。

細胞を、５０ｇＭのスフィンゴシンを加えずに（Ｏの棒グラフ）またはこれを加 えて（５０の棒グラフ）、ホルモンの不存在下（基礎脂質合成：斜線を付した棒 グラフ）または各々１１００ｎ／ｄのＰＭＡ、　１０００Ｂｇ／ｄ１００μＭス フィンゴシンにおいて、基礎脂肪合成およびホルモン刺激脂肪合成のいずれもが 、ゼロの値まで減少した。

この脂肪合成アッセイは、スマル（Ｓｍａ　ｌ）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ 、、２６２：１１０７１−１１０７９　（１９８７）の方法で行った。要約して 述べれば、解剖して取り出した精巣上体および腹膜後の脂肪パッド（ｆａｔ　ｐ ａｄｓ）を、３７℃で３０分間激しく撹拌しながら、クレブスーリンゲルーヘベ ス（ＫＲＨ）でｐＨ７，４に緩衝化され、３５Ｉｎｇ／ｗ１１の透析ウシ血清ア ルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）および０．２７ｍＭグルコースを含む液中のコラゲナー ゼで（１，０■／Ｉｄ）で消化した。チーズ濾布で濾過し、１０■／ｄＢＳＡを 含むＫＲＨで４回洗浄した後、この脂肪細胞を同じ緩衝液中で３７℃、４時間ブ レインキュベートした。この細胞に、脂肪合成のアッセイの１０分間前に、スフ ィンゴシン（エタノール中の１００ｍＭのストック溶液）を添加して最終濃度を 第１Ａ図では５０ｇＭとし、第１Ｂ図では０〜１００μＭとした。対照細胞には 、スフィンゴシンを含まない同濃度のエタノールを添加した。

脂肪合成のアッセイは、６−のポリエチレン製バイアル中で、順次４００μｍの 脂肪細胞懸濁液（８０Ｘ１０４細胞／−）、ホルモンを含まない（基礎脂肪合成 ）またはヒト成長ホルモンを１０００Ｂｇ／ｄ、インシュリンを１１００ｎ／ｉ ｄまたはホルボールエステルＰＭＡを１１００ｎ／−を含む５０μｌのＫＲＨ緩 衝液、ｐＨ７，４（１％ＢＳＡ、０．２７ｍＭグルコース）、および５０μｍの Ｄ　（３−”　Ｈ）−グルコースを全量０．５ｍとなるように加えて３回づつ実 施した。バイアルを穏やかに振とうしながら３７℃で２時間インキュベートした 。反応停止のため、激しい撹拌下（細胞を破壊するために３０ｇ）でトルエンシ ンチレータ−液（トルエン１リツトル＋０．３ｇの１．４−ビス（２−（４−メ チル−５−フェニルオキサシリル）ベンゼンを試験管当たり５ｄおよび５ｇの２ ，５−ジフェニルオキサゾール）を添加し、さらに少なくとも１時間静置して、 放射線カウント前に脂質をトルエン層に抽出した。カウントはベックマンＬＳＩ ８８０ベータカウンターで行った。種々のサンプルのカウント効率は、冷却トリ チウムの内部標準化により測定した。Ｄ−［３−３Ｈ）−グルコースの脂質中へ の取込みは、ｃ　ｐｍＸｌ　０−ａ／試試験管様標準偏差より表示する。

第１Ａ図は、５０ｇＭスフィンゴシンがＰＭＡによる脂肪合成の増大を完全にブ ロックし、ｈＧＨの効果を顕著に減少させ（６５％）、そしてインシュリンの効 果も顕著に減少させた（８９％）ことを示す。

第１Ｂ図は、スフィンゴシンの効果の用量一応答曲線は種々の細胞タイプに関し て、キナーゼＣのインビボおよびインビトロ阻害に関していたるところで記載さ れている（Ｙ、Ａ、Ｈｎｎｕｎ、Ｃ，Ｒ，Ｌｏｏｍｉｓ、Ａ、Ｈ，Ｍｅｒｒｉｌ 　ＪＲ，およびＲ，Ｍ、Ｂｅ　１１゜上、ｌ工且土、立上！工、、２６１　：１ ２５０４　（１９８６）；Ｅ、Ｗｉ　１ｓｏｎ、Ｍ、Ｃ，０１ｃｏｔ　ｔ、Ｒｏ Ｍ、Ｂｅ１ｌ、Ａ、Ｈ，Ｍｅｒｒｉｌ　Ｊｒ、およびＪ、Ｄ、Ｌａｍｂｅｔｈ、 Ｊ、旦上且上　Ｃｈｅｍ、。

２６１　：１２６１６　（１９８６）；Ｙ、Ａ、Ｈａｎｎｕｎ、Ｃ，Ｓ、Ｇｒｅ ｅｎｂｅｒｇおよびＲ，Ｍ、Ｂｅ１１、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、、２６２：１ ３６２０　（１９８７））のと同じ範囲であることを示す。この図はさらに、１ ００μＭスフィンゴシンが基礎脂肪合成並びにインシュリン、ＰＭＡおよびｈＧ Ｈの効果を完全に消失させることを示す。

トリパンブルー排除法により評価した、脂肪細胞の生存度（パイアビリティ−） は、１００μＭスフィンゴシンの存在下で変化しなかった。細胞の洗浄後に、基 礎脂肪合成に対するスフィンゴシンの効果は完全に可逆的であり、そして刺激さ れた脂肪合成に対するその効果は部分的に可逆的であった。

実施例■ スフ　ンゴシンによる　八　の スフィンゴシンによる脂肪合成の阻害の特異性をスフィンゴミエリンの効果と比 較して試験した。プロティンキナーゼＣの特異的阻害に関してリソスフィンゴリ ピッドに要求される重要な構造要件は、式Ｉに示すとおり、第一アミノ基および 疏水性の長鎖である。第２図が示すとおり、スフィンゴミエリンは下記式■を参 照するとわかるように、スフィンゴイド塩基の２−アミノ位置にアミド結合脂肪 酸を有するが、 （ＩＶ） ２５０μＭ迄の濃度において、基礎脂肪合成もホルモン刺激脂肪合成も阻害しな い。従って、脂肪合成の阻害はキナーゼＣ阻害と同様の特異性を有する。

第２図に反映されるデータを得るために、増加する濃度のスフィンゴシンの存在 下（閉じた記号）のみならず、増加する濃度のスフィンゴミエリンの存在下（開 いた記号）において、詳細は上記したようにして第１Ｂ図のように脂肪合成を測 定した。

実施例■ Ａ　およびグルコース　°みに・　るスフ　ンゴシ之旦且ｌ立皇笠 本実施例は同じバッチのラット脂肪細胞に対して同時に実施した実験を包含する 。第３図は、脂肪合成およびグルコースの取り込みが同程度阻害されたことを示 す。

このデータは、スフィンゴシンの脂肪合成に対する観察された効果は、脂肪合成 の代謝経路でのグルコースの取り込みに衝撃を及ぼすことを示唆している。

第３図に反映されているデータを得るために、各実験において脂肪合成およびグ ルコース取り込みを平行して同じ脂肪細胞のバッチについて測定した。脂肪合成 のプロトコールは第１図に関して説明した。グルコース取り込み測定のために、 単離した脂肪細胞（１６Ｘ１０’細胞／−）を、脂肪合成過程の後、増加する濃 度のスフィンゴシン（θ〜１００μＭ）で３７℃１０分間インキュベートし、飽 和用量のインシュリン（１００ｎｇ／ｄ）、ｈＧＨ（１μｇ／Ｍ１）、またはホ ルボールエステルＰＭＡ　（１００ｎｇ／ｉｄ）および９ｎＭのＤ−（３−’　 Ｈ）−グルコースを添加してから、２時間３７℃でインキュベートした。インキ ュベートを中断するために、試験管当たり３−の水冷９％ｏＮａＣ１および１１ １＆のジノニルフタレートを連続して添加した。試験管を直ちに４℃、３０００ ｒｐａ＋で５分間遠心分離した。浮遊細胞を切断先端のチップを備えた５００μ ｌピペツトで回収し、１０ＩＫｇの汎用シンチレーション用液（Ａｑｕａ−ｓｏ ｌ　ｎ、ＮＥＮ　リサーチプロダクト社、ボストン、ＭＡ）を１〇−含むシンチ レーションバイヤルに移し、カウント前に細胞を破壊するため十分に振とうした 。スフィンゴシンを用いない場合（コントロール）の効果に対する％で表示した 結果は、用いたスフィンゴシンの濃度の関数としてプロットした（棒グラフの下 にその濃度は示されている）、、黒捧は脂肪合成を示し、白樺はグルコース取り 込みを示す。

実施例■ ホルモンーリセブター　Ａの　の　ではないスフ−とゴｊ仁ｍに インシュリンおよび成長ホルモンのそれらリセブターへの結合は、Ｊ、Ｓｍａｌ 、Ｊ、Ｃ１ｏｓｓｅｔ、Ｇ。

ＨｅｎｎｅｎおよびＰ、ＤｅＭｅｙｔｓ、により研究され、Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、、２６２：１１０７１　（１９８７）１．：記載されティる。１！Ｉｓ　 Ｉ　−Ａ　１４Ｔｙｒ−インシュリンおよび”’Ｉ−ｈＧＨは、ＪｏＭａｒｋｕ ｓｓｅｎおよびＶ、Ｄ、Ｌａｒｓｅｎ、ｒインシュリン：インシュリンおよび関 連ホルモンの化学、構造および機能（Ｉｎｓｕｌｉｎ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ５ｕｆｉｎ　ａｎ ｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）Ｊ　（Ｄ、Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇお よびＡ、Ｗｏｌ１ｍｅｒ編）　、　Ｗ、　ＤｅＧｒｕｙ　ｔ　ｅ　ｒ、ベルリン 、１６１頁（１９８０）およびＪ、Ｃ１ｏｓｓｅｔ、Ｊ、Ｓｍａｌ、Ｆ、Ｇｏｍ ｅｚおよびＧ、Ｈｅｎｎｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２１４：８８５　（１９ ８３）に記載されたようにして調製した。単離した脂肪細胞（インシュリン結合 には８　Ｘ　１０５細胞／−１ｈＧＨ結合には１６Ｘ１０ＩＳ細胞／−）のブレ インキュベーションは、二連で（最終量０．５Ｎ１／試験管）結合緩衝液（クレ ブス　リンゲル　ヘペＸ　ｐＨ７，４，０，２７ｍＭ、５％ＢＳＡ　（Ｗ／Ｗ） ＋０．５■／１１１１バシトラシンおよび０．５μｇ／ｄアプロチニン）中で、 増加する濃度のスフィンゴシン（０−２００μＭ）とともに、３７℃で１０分間 行い、その後１２１１Ｉ−インシユリン（３０，ＯＯＯｃｐｍ／試験管、最終濃 度３０ｐＭに相当）または１！＋５ｔ−ｈＧＨ（５０，０００ｃｐｍ／試験管、 最終濃度４５ｐＭに相当）を添加した。インキュベーション時間はインシュリン においては３７℃４５分、ｈＧＨにおいては３７℃７５分とした。インキュベー ションを中断するために、試験管当たり水冷９％。ＮａＣ１を３ｄおよびジノニ ルフタレートを１Ｍ１連続して添加した。試験管を直ちに４℃で５分間３０００ ｒｐｍで遠心した。浮遊細胞を先の切断されたチップをつけた５００μｌのピペ ットで回収し、細胞の放射能の活性をカウントした（全結合）。同じ方法を繰り 返して、それぞれ１０μｇ／−の未標識インシュリンおよびｈＧＨの存在下で１ ２５■−インシュリンおよび”’Ｉ−ｈＧＨの結合を測定した。

結果は第４Ａ図および第４Ｂ図に、未標識ホルモン１０μｇ／ｉｄの不存在下（ 全結合）または存在下（Ｎ、Ｓ、結合）において結合したトレーサーが、ｃｐｍ Ｘｌｏ−３／試験管の値で、スフィンゴシンの増加する濃度（０〜２００μＭ） の関数として示されている。

第４Ａ図および第４Ｂ図が示すとおり、スフィンゴシンは、２００μＭにおいて インシュリン結合に対して有意な影響を示さなかった（第４Ａ図）。これとは対 照的に成長ホルモンのそのリセブターへの結合はスフィンゴシンの濃度の増大と 共に次第に減少した（第４Ａ図）。

しかしながら、脂肪合成を完全に阻害するスフィンゴシンの濃度（１００μＭ） においても、成長ホルモンの特異的結合は対照値の４３％を下回ることはなかっ た。

実施例Ｖ 第５図は、単離されたラットの脂肪細胞でのインシュリンによる脂肪合成の最大 刺激に対する、スタウロスポリンの影響を示している。トレーサーであるＤ−３ ［”Ｈ］−グルコースの脂肪への取り込みは、試験管当たりの放射能の１分当た りのカウント（ｃｐｍ）で表されている。この値は二連の結果であり、上下１標 準偏差（ＩＳ、Ｄ、）も示されている。細胞は増加する用量のスタウロスポリン （０〜２１．４μＭ）の存在下で１１００ｎ／−のインシュリンの不存在下（基 礎曲線）および存在下（インシュリン曲線）にインキュベートした。脂肪合成ア ッセイは前記Ｓｍａ　１の方法で行った。第５Ｂ図において第５Ａ図に示された 実験の結果が、標準化されて示されている。即ち、増加する用量のスタウロスポ リンの存在下での、インシュリン刺激脂肪合成および基礎脂肪合成が、スタウロ スポリンの存在しない初期値に対する百分率で示されている。ラット脂肪細胞で の刺激脂肪合成は、スタウロスポリンによって用量依存的に阻害されている。ス タウロスポリンのそれぞれ約２．５マイクロモルおよび２５マイクロモルにおい て、基礎およびインシュリン刺激脂肪合成・は完全に阻害されたが、固定度の阻 害効果をスフィンゴシンで得るには１００マイクロモルの濃度が必要である。

実施例■ 第６Ａ図および６Ｂ図は、インシュリン、ホルボールエステル、ＰＭＡおよびヒ ト成長ホルモンによるラット脂肪細胞での脂肪合成の最大刺激に対するスタウロ スポリンの影響を示す。

第６Ａ図および６Ｂ図の実験は、上で詳細に説明した第１Ａ図および１８図と厳 密に同じ方法で行ったが、但しスフィンゴシンの代わりにスタウロスポリンを、 横軸の下に示した濃度で（第６Ａ図では２．１４μＭ、第６Ｂ図ではＯ〜２１． ４μＭ）用いた。第６Ａ図は、スタウロスポリンが２．１４μ鉦の濃度で、基礎 脂肪合成を変化させること無しに、脂肪合成に対するＰＭＡおよびｈＧＨの効果 をほぼ完全に阻害し、そしてインシュリンの効果を顕著に抑制することを示して いる。第６Ｂ図は基礎脂肪合成およびｈＧＨ刺激、ＰＭＡ刺激およびインシュリ ン刺激脂肪合成に対するスタウロスポリンの効果の、用量応答曲線を示す。２１ ．４μ舅でスタウロスポリンは基礎脂肪合成および刺激脂肪合成の両者を完全に 阻害する。

実施例■ 第７Ａ図および７Ｂ図は、それぞれスタウロスポリンの効果に起因する脂肪合成 の阻害の百分率およびホスホリル化の阻害の百分率を示す。第７Ａ図は第６Ｂ図 と同じデータを標準化したものであり、第７Ｂ図の各曲線は脂肪合成の阻害の百 分率として強調されており（ｉｏ。

％はスタウロスポリンの不存在下で測定した脂肪合成であり、ＰＭＡ刺激、ｈＧ Ｈ刺激またはインシュリン刺激脂肪合成から基礎脂肪合成を引いたものである） 、スタウロスポリンの濃度（０〜２１．４μＭ）の関数である。第７Ｂ図はスタ ウロスポリン濃度（０〜２１．４μＭ）の関数として、精製キナーゼＣおよび精 製インシュリンリセブターチロシンキナーゼのキナーゼ活性に対する阻害の百分 率を示す。キナーゼ活性は精製キナーゼが合成ペプチド、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅ ｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇ ｌｙ、をホスホリル化する能力によって測定され、その詳細はＹ、Ｆｕｊｉｔａ −ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＳ、Ｋａｔｈｕｒｉａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　 ｈｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ　、１５７：９５５−９６２（１９８８）に記載さ れている。

インシュリン１セブターキナーゼの　１＝インシユリンリセブターは、トリトン ｘ−ｉｏｏで溶解したヒト胎盤の膜から、Ｙ、Ｆｕ　ｊ　ｉ　ｔ　ａ−Ｙａｍａ ｇｕｃｈｉ、Ｓ、Ｃｈｏｕ、Ｙ、Ｓａｋａｍｏｔｏおよびに、Ｉｔａｋｕｒａ、 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、、２５８　：　５０４５−５０４９　（１９８３）に 記載されているようにして、ＷＧＡ−セファロースおよびインシエリンーセフ７ ０−スの連続アフィニティークロマトグラフィーで、２４００倍に精製された。

チロシン　・プロティンキナーゼアッセイホスホリル化の活性は２５℃で４０分 間、３０μｌの５０ａ＋Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７，４中で行った。該緩 衝液には、１ｍＭの５ｒｃ−関連ペプチド、２ｍＭのＭｎＣｆ、、１５ｍＭのＭ ｇＣ１＊、０．１％のトリトンＸ−１００１および４０μＭの［γ−”Ｐｌ　Ａ ＴＰ　（〜１２、ＯＯＯｃｐｍ　／ｐｍｏｌｅ）および精製インシュリンリセブ タ−（０，１μｇ）を含ませ、予め０．１μＭのインシュリンまたはＩ　ＧＦ− Ｉの存在下または不存在下で阻害剤の１つの種々の濃度で２５℃１時間予備イン キュベーションしておいた。反応は５０μｌの５％トリクロロ酢酸および２０μ ｌのウシ血清アルブミン（１９■／ｎｌ）を添加して停止した。この溶液を０℃ で３０分間インキュベートした後、蛋白質を遠心で沈澱させた。上澄から３５μ ｌのアリコートを二連で、ホスホセルロース紙（ワットマン、Ｐ−８１）の片に スポットした。この紙片を７５■Ｍ燐酸中で充分に洗浄した。８２ｐのペプチド への取り込みは液体シンチレーションカウンターでカウントして定量した。精製 プロティンキナーゼＣのキナーゼ活性は、基質としてヒストン■Ｓ（シグマ社） を用いて、Ｔ、Ａｋｉｙａｍａ、Ｅ、Ｎ１５ｈｉｄａ、Ｊ、ｌ５ｈｉｄａ、Ｎ、 ５ｏｙｉ、Ｈ，Ｏｇａｒａｗａ、Ｍ、Ｈｏ５ｈｉ、Ｙ、ＭｉｙａｔａおよびＳ、 ５ａｋａｉ、Ｊ　Ｂｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、、２’６１　：１５６４８−１５６ ５１（１９８６）に記載されたようにして調べた。第７Ａ図および第７Ｂ図の比 較は、スタウロスポリンによるインシュリン刺激脂肪合成の阻害に関する用量一 応答曲線は、該薬剤によるインシュリンリセブターチロシンキナーゼの阻害と平 行し、一方、ｈＧＨおよびＰＭＡ刺激の阻害はプロティンキナーゼＣの阻害に平 行することを示している。

実施例■ 第８Ａ図および８Ｂ図は、単離されたラットの脂肪細胞における、インシュリン およびｈＧＨのそれらのりセブターへの結合に対するスタウロスポリンの効果を 説明するものである。実験は第４Ａ図および４Ｂ図と同様に行ったが、スフィン ゴシンの代わりにスタウロスポリン（０〜２１．４μＭ）を用いた。このデータ によると、スタウロスポリンはホルモン刺激脂肪合成をほぼ完全に阻害する濃度 でホルモンの結合に対しては、殆どもしくは全く影響しない。

実施例■ 第９図は、基礎脂肪合成ならびにｈＧＨ，ＰＭＡおよびインシュリン刺激脂肪合 成に対して、アクリジンオレンジ（プロティンキナーゼＣに対する活性な阻害剤 ｊは影響を有し、および９−アクリジンカルボン酸（プロティンキナーゼＣに対 して不活性）は無効果であることを説明する。このアッセイはＳｍａｌ、Ｊ、、 Ｓ、ＫａｔｈｕｒｉａおよびＰ、ＤｅＭｅｙｔｓ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ　ｔ、、２ ４４　：　４６５−４６８　（１９８９）に詳細に説明されている。この実験は 第１Ｂ図に関して説明したようにして行ったが、但しスフィンゴシンの代わりに 、アクリジンオレンジ（閉じた記号）または９−アクリジン−カルボン酸をＯ〜 １００μＭで用いた。このデータはインシュリン、ＰＭＡおよびｈＧＨで刺激さ れる脂肪合成並びに基礎脂肪合成を、アクリジンオレンジが完全に阻害したこと を示す。

実施例Ｘ 第１０Ａ図および１０８図は、単離されたラット脂肪細胞中でのインシュリンお よびｈＧＨがそれらのりセブターに結合することに対する、アクリジンオレンジ の影響を示す。実験は第４Ａ図および４Ｂ図と同様に行ったが、但しスフィンゴ シンの代わりにアクリジンオレンジ（Ｏ〜１００μＭ）を用いた。このデータは 、脂肪合成の阻害がほぼ最高になる１０ｐＭの用量において、この薬剤はホルモ ン結合に何の影響も持たないが、１００μＭでは両者のホルモンの結合を５０％ 抑制することを示す。

上記実施例において示した脂肪合成阻害を証明するデータを与えた、遊離脂肪細 胞によるアッセイ方法は、薬品工業分野で開発されたもので、現在では工業規格 の一つにされている。このデータはヒトを含む哺乳類において脂肪合成を阻害し 、したがって肥満を抑制するために本発明が有用であることを、当業者が肯定す るであろう有力な証拠である。

反亙亙圭仄朋ｌ 投与方法および用量の選択は、当業者にとって容易であり、適宜決定される。本 発明はその広い観点において、ヒトを含む哺乳類の脂質代謝を阻害するために有 用な、プロティンキナーゼ拮抗剤、例えばスタウロスポリンまたはスフィンゴリ ビッドまたはリンスフィンゴリビッドまたはアミノアクリジンを含有する治療用 組成物にも関する。この拮抗剤は、それ自体でまたは治療上許容される担体とと もに、例えばリポソームの形で投与することができる。

非経口投与が好ましい。経皮投与はジメチルスルホキシドのような透過促進剤を 含むゲルまたはクリームで行ってよい。プロティンキナーゼ拮抗剤、即ちスタウ ロスポリンまたはスフィンゴリピッドまたはりソスフィンゴリピッドまたはアミ ノアクリジンは、哺乳類の脂肪細胞の脂肪合成のホルモン刺激もしくは基礎刺激 を、部分的にもしくは完全に抑制するために治療上有効な量で投与される。

抑制の程度は用量の関数である。好ましくはスフィンゴリピッドについては、約 １５〜約１００■／ｋｇ患者体重のキナーゼ拮抗剤が適当である。少なくとも約 １５■／ｋｇの投与が脂肪合成を部分的に抑制するために十分である。少なくと も約６０ｍｇ／ｋｇの投与が基礎脂肪合成を完全に抑制するために提唱される。

スタウロスポリンのためには少なくとも約１５■／ｋｇが基礎脂肪合成の完全抑 制のために提唱される。投与は、所望の治療効果が観察されるまで適当な期間継 続される。

脂肪合成を阻止する種々の薬剤、例えばホルモン（カテコールアミン、グルカゴ ン、八〇ＴＨ）、クロフィブレート（ｃｌｏｆｉｂｔａｔｅ）、ハロゲネート（ ｈａｌｏｇｅｎａｔｅ）、フェンフルラミン（ｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）、ア ンフェタミン（ａｍｐｈｅ　ｔ　ａｍｉｎｅ）、シンコカイン（ｃ　１ｎｃｈｏ ｃａ　１ｎｅ）　、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｏｍａｚｉｎｅ）およびそ れらの成る種の誘導体が知られている。しかしながら、これらの薬剤はいずれも 、本発明のプロティンキナーゼ拮抗剤のように効果的には脂肪合成を促成するこ とができない。

濠　７ｊ（μＭン 第５Ａ回 スタウロスｒリン（μＭ） 第５８凹 第７Ａ回 第７８ＶＪ 手続補正書（ｊ５炙 平成　３年１７月、８日国

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類の脂肪合成（リポゲネシス）を抑制するために治療上有効な量のプロ テインキナーゼ拮抗剤を哺乳類に投与することよりなる方法。
2. ２．プロテインキナーゼ拮抗剤が、リソスフィンゴリビッド、アミノアクリジン またはスタウロスポリンである、請求項１記載の方法。
3. ３．哺乳類がヒトである、請求項２記載の方法。
4. ４．プロテインキナーゼ拮抗剤がスフィンゴシン、スタウロスポリンまたはアク リジンオレンジである、請求項３記載の方法。
5. ５．プロテインキナーゼ拮抗剤が、ホルモンにより刺激される脂肪合成の抑制の ために治療上十分な量でヒトに投与される、請求項１、２または３記載の方法。
6. ６．基礎脂肪合成を抑制するのに治療上十分な量でプロテインキナーゼ拮抗剤が 投与される、請求項１、２または３記載の方法。
7. ７．基礎脂肪合成を阻止するために治療上有効な量のプロテインキナーゼ拮抗剤 を哺乳類に投与することよりなる、哺乳類の肥満を治療する方法。
8. ８．プロテインキナーゼ拮抗剤が、リソスフィンゴリビッド、アミノアクリジン またはスタウロスポリンである、請求項７記載の方法。
9. ９．インシュリンにより刺激される脂肪蓄積を阻止するために、治療上有効な量 のプロテインキナーゼ拮抗剤を哺乳類に投与することよりなる、哺乳類の肥満の 治療方法。
10. １０．哺乳類がヒトである、請求項７、８または９記載の方法。
11. １１．哺乳類がヒトであり、アミノアクリジンがアクリジンオレンジである、請 求項３記載の方法。