JPH04501958A

JPH04501958A - ｃＤＮＡを製造する方法

Info

Publication number: JPH04501958A
Application number: JP2501004A
Authority: JP
Inventors: ホーンズ、エリック; コースネス、ラース
Original assignee: ダイナル・エイ・エス
Priority date: 1988-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1992-04-09
Anticipated expiration: 2014-10-12
Also published as: CA2003500C; AU627815B2; CA2003500A1; WO1990006044A2; DE68922743T2; ATE122721T1; DE68922743D1; JP2960776B2; EP0444119A1; AU4758590A; WO1990006044A3; EP0444119B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｃＤＮＡを製造する方法本発明はｃＤＮＡの迅速な製造方法及びそのような方法を実施するキットに関するＲＮＡからｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを製造する従来方法は、ＭｓａｉＮｉｓら［モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｗｌＩｒ　ＣｌｏｎｉＩｌｇ）。

ラボラトリ−・マニュアル（１９８２年）、コールド・スプリング拳バーバーφ ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉＢ　ＩＩＩｔｂｏｒＬｓｂｃ＋ｒｘｌｏｒ７）　’］に記載されているものである。この方法は、簡単に述べると４つの段階に分けられる。

１　細胞質ＲＮＡをリボヌクレアーゼ阻害剤存在下において細胞培養物から単離する。

２　細胞質ＲＮＡをオリゴｄＴカラムを通過させ、ｍＲＮＡをそのポリアデニレート（ポリＡ）ティルを介してこのオリゴｄＴに結合させる。カラムを洗浄し、ｍＲＮＡをカラムから溶出する。このｍＲＮＡを次に、カラムクロマトグラフィー又はアガロースゲル電気泳動を通常用いてサイズ分画する。

３　特定標的ｍＲＮＡを含有するゲル分画をウサギ網状赤血球溶解物系中におけるインビトロ翻訳によって同定することができる。

４　オリゴｄＴプライマーを次にこのｍＲＮＡにハイブリダイズし、これを次に逆転写酵素によって処理し１本鎖ｃＤＮＡ　（ｓ　５ＤＮＡ）を作製し、このｍＲＮＡを除去し、２本鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ　ｃＤＮＡ）をポリメラーゼを用いて形成する。

ｄｓ　ｃＤＮＡは、次に、各末端に適当なリンカ−を付与され、プラスミド中に挿入されることができる。

これは、通常、大過剰のリンカ−試薬を使用することによって行われる。

かなりの時間と注意がこの従来法を実施するに際して要求される。ｍＲＮＡは、加水分解及び変性によって、たとえリボヌクレアーゼ阻害剤存在下においてさえも急速に消失する。貴重なｍＲＮＡの消失が、さらにカラムからの溶出及びサイズ分画の段階において発生する。更に、過剰のリンカ−試薬は、ｄｓ　ｃＤＮＡのプラスミド中への導入前に注意深く分離しなければならない。

従って、簡便で迅速なｃＤＮＡ製造方法がめられている。本発明の目的は、この要求を満たすことである。

本発明は、不溶性支持体上でＲＮＡを単離し、次にカラムからの溶出、サイズ分画及びブライミング工程に干渉することな（ｃＤＮＡを形成するという概念に基づいている。

従って、本発明は、下記工程を含むｃＤＮＡ製造方法を提供することである。

１）　ｍＲＮＡ含有液体をＤＮＡプローブをそれに付着させた不溶性支持体にその５′末端を介して接触させ、それによって、このｍＲＮＡを前記プローブに、従って前記支持体にハイブリダイズさせる工程、ｂ）　前記液体を除去する工程、そしてＣ）　溶液中に酵素類及びヌクレオチド類を添加し、それによって、このプローブをプライマーとして作用させ、ｍＲＮＡテンプレート上に１本鎖ｃＤＮＡを作製する工程。

ｍＲＮＡが前記液体中に不純物とともに含有されている場合、不溶性支持体に結合したｍＲＮＡを工程（ｂ）及び工程（Ｃ）の間で洗浄し、このような不純物を確実に除去することができる。

５ｓＤＮＡは、必要であれば、従来法によってｄｓＤＮＡに変換することができる。例えば、（ｆ）変性によってｍＲＮＡテンプレートを除去し、溶液中に酵素類及びヌクレオチド類を添加して２本鎖ＤＮＡを作製する。

（２）ＲＮａｓｅＨを添加し、ｍＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを除去して必要な第２ＤＮＡ鎖を形成する。

（３）ｍＲＮＡテンプレートを除去し、数個の短いＤＮＡプライマーを添加して５ｓｃＤＮＡの相同配列にハイブリダイズさせ、次にＤＮＡポリメラーゼ１種及びリガーゼ１種を添加し必要な第２ＤＮＡ鎖を形成する（マルチプライマー法）。

同様に、不溶性支持体は、工程（ｃ）及び（１）の間、及び工程（１）　、（２）及び（３）の間で洗浄できる。

このプローブはｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ部分であることもでき、好適にはオリゴｄＴであり、これは、天然のｍＲＮＡ上に普遍的に存在するポリＡ “テイル”とハイブリダイズするであろう。しかし、プローブは、例えば、関連ＲＮＡ分子属の保存配列であることもできる標的ＲＮＡ分子中の特定配列とハイブリダイズする特定のＤＮＡ配列を含み得る。各プローブは、オリゴｄＴ又は特定のＤＮＡ配列であることもできる直接結合した１本鎖ＤＮＡから構成されるか、又は、ＤＮＡの２本鎖片を介して不溶性支持体に結合し得る。

以後のｃＤＮＡ合成のためにｍ　ＲＮ　Ａを単離することを希望する場合に使用するための特に有用な形態のプローブは、３′末端が重複し５′末端近くの領域にハイブリダイズし、５′末端領域の残りを付着端として残しこの標的核酸にハイブリダイズさせるＤＮＡ配列である。アミノ基のような官能基がこの付着端から遠い位置に存在すると、このループが例えばカルボキシル基を介して不溶性支持体に共有結合で結合し得る。これと異なり、ビオチン基がこのループに結合して次にこのプローブをアビジン又はストレプトアビジン被覆支持体に結合させ得る。

この付着端に対応する末端領域を有するＤＮＡは、従ってもしこれがＤＮＡを共有結合的に保持する必要があるならば、このループの隣接部分に連結される可能性を有するであろう。ＲＥ部位が、ＤＮＡの以後の分離のためオリゴｄＴプローブは、例えば２０から　２００塩基のデオキシチミジン単位の比較的短い鎖であるが、例えば２０から　２００塩基のデオキシチミジン単位を酵素的に重合することによって容易にかつ安価に製造することができる。

又、ブロブーブ及びプライマーオリゴヌクレオチド類は、例えば、アプライドφ バイオシステムズ（ＡｐｐＨｅｌＢｉｏＢ＊ｔｅｍｓ）社［カリフォルニア州ホスター市、リンカーンセンター通りＢ５０−Ｔ　（８５０−Ｔ　Ｌｉｍｃ＋Ｉ＊　ＣｅＮｅｔ　Ｄｒｉｖｔ。

Ｆｏｓｌ＊ｔ　Ｃｉｌ！、　ＣＡ　９４４０４）　］から入手できるような市販のＤＮＡ合成装置のいずれを用いても製造できる。

不要の核酸のランダムハイブリダイゼーシッンを回避しかつこのハイブリダイゼーション溶液の残りの成分を完全に除去するために、分離後好ましくは不溶性支持体を少な（とも１回、洗浄する。洗浄は、部分的ランダム相同性によって結合した核酸を除去するために、温度を上昇させるか又は、ハイブリダイゼーションに使用したよりも低濃度の塩、例えば０．５Ｍ塩化ナトリウム又は等価の溶液を用いるかのいずれかによって、緊縮条件下で行う。

緊縮性は、通常、プローブ長さ：Ｇ：Ｃ含量によって計算される。プローブオリゴヌクレオチドと標的核酸間の相同性が正確でないならば、洗浄をより緊縮でない条件下で行うべきである。一般に、洗浄は、２本鎖の融点（Ｔｍ）より１２℃ 低い温度で行うべきである。およそのＴｍは、下記の関係に従って、便利に計算できる（ＬｎｉＩ目ｓ　Ｔ、ら（１９８２年）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１＋ｎ１Ｂ）；ラボラトリ−・マニュアル３８８−３８９頁から記載）。

（ｓ）　Ｔｍ＝６９．３＋０．４１　（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／　ＬＬはヌクレオチド類中のプローブの平均長さに等しい。

（ｂ）２本鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマツチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃ ずつ減少する。

ｆｃ）　（Ｔｍ）　ｕｚ　（Ｔｍ）　ｕｎ　＝１８．５　ｌｏｇ＋ｏｌＪ２／ｕ＋［式中、Ｕ、及びｕ２は、２つの溶液のイオン強度である。］小さなオリゴツメクレオチド類では、融点は、下記のように摂氏度で近似できる。

Ｔｍ＝２Ｘ　（ＡＸＴ残基数）＋４Ｘ　（Ｇ＋Ｃ残基数）ハイブリダイゼーション反応は、好適には１Ｍ塩化ナトリウム溶液又は当該技術で公知の等価の溶液中で行われる［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈ７ｂ＋ｉｄｉ＠ａｔｉｏｎＳＢ、　Ｄ、　Ｈａｍｅｓ及びＳ、Ｉ、　Ｈｉｇｇｉｎ＋　、　ＩＲＬ　Ｐ＋！ｓｓ　（１９８５年）を参照。コ従来法では酵素操作をしばしば同一の交換していない緩衝液中で行うので、従って、これは、各反応について最適化されていない。しかし、本発明による方法は、緩衝液類などを交換させそれによってｃＤＮＡの生産を最適にする。さらに、従来のｓｓ　ｃＤＮＡ合成では、ｍＲＮＡに対するヌクレオチド試薬の比率は、通常、次の工程に、過剰の試薬が混入することを回避するためにほぼ化学量論的に保持されている。本発明による標的核酸の固定化によって生じる洗浄の容易さ及び速さによって、過剰の試薬を使用でき、その結果、効率が増大する。

不溶性支持体は様々な形態を取ることができ、例えば、マイクロタイターウェル、セルロース又はナイロンのような材料でできたフィルター類、例えばセファデックス又はセファロースビーズ、又はポリスチレンラテックスビーズ粒子を含む粒子である。表面に磁気的に集められ、次に、例えば物理的攪拌によって容易に再拡散されることができる磁気粒子を使用することが本発明の好ましい特徴である。

この粒子が単分散で及び／又は超常磁性（ｓ＋＋ｐｅｔｐｘローｍｘｇｎｅｊｉｃ）であることが有利である。これらの両特性は、粒子が関係する反応の速度に極めて大きく寄与する。粒子が保持するプローブが反応において溶液中で遊離していると実質的に同様に迅速に反応することは、本発明の驚くべき特徴である。

例えば、ｍＲＮＡの全精製が、１５分未満で行うことができ、このことは、ポリーｄＴアフィニティカラムでのｍＲＮＡの精製のために必要な２時間と明らかな対照を示している。単分散粒子、すなわち、実質的に同一の大きさの粒子を用いることによって、反応速度及びその他のパラメーターが特に均一である。超常磁性粒子（すなわち、永久磁性を保持するために必要な磁気サイズよりも小さい鉄磁気材料の小粒子含有粒子）を用いることによって、反応時における磁気集合又は粒子の塊りを防止することができ、それによって、均一かつ迅速な反応速度論を再度確保することができる。従って、粒子は、磁場を適用することによって、表面上に均一速度で容易に集合させる（Ｂｕｒｅｔｔｅ）　ことができるが、例えば、物理的攪拌によって、次の処理工程のために容易に再拡散させることができる。反応挙動の均−性及び反応の迅速性は特に自動化に寄与し、このことは、商業生産及び／又は反復的工程において要求される、多くの核酸操作法の必須要件である。反応及び分離が、最小限のヒトの介入による適当な機器によって完璧に信頼できるように実施できることが極めて重要である。

本発明において使用される好適な磁気粒子は、欧州特許１１３９０１４０６．５　［シンテフ（Ｓｉｎｌｃｌ）］に従って生産された単分散性の超常磁性ビーズであり、その開示は、本明細書で参考として組み込まれる。これらのビーズでは、鉄が極めて均一に分布しており、磁場に対して極めて均一な反応を起し、このことは、全てのビーズが同一速度で動くので、特に自動化のための再現性のある操作法を設計する上で重要である。さらに、各粒子中に再現可能な量の鉄を取り込ませることができるので、本粒子の比重を下記にに特定した範囲中にする実質的に低レベルに調節できる。これまでのより規則性に劣る生成物の場合、小粒子は磁石を適用したときにブラウン力に対抗するには余りに少量の鉄しか有していないか、又は、本材料の比重がより大きな粒子の所望でない沈降を引き起こしていた。一部の自動化システムでは、溶液通過時に反応領域内に粒子を拘束するために磁場を用いている。均−磁気特性及び流動特性は、こうしたシステムにおいて使用するための磁気粒子において必須である。

本明細書で使用する用語“単分散”は、５％未満の直径標準偏差を有するサイズ分散を包含することを意図したものである。

１．１乃至１．８、特に１．２乃至１．５の範囲の比重を有するビーズを使用することが好ましい。本発明により使用した単分散ビーズにおいて、比重は同様に、特に均一であり、均一でしかも予測可能な反応速度特性を生じる。

この単分散粒子は少なくとも直径１ミクロン、好適には少なくとも２ミクロンの球状ビーズであり、好適にはｌＯ以下、さらに好適には、例えば約３ミクロンのような直径６ミクロン以下である。粒子が小さい程ゆっくりと沈降し、反応時間に比較して沈降時間が長く、それによって物理的攪拌の必要性が回避される。しかし、平均直径０．１〜１．５ミクロンの粒子は、これよりはるかに小さい直径の細かい粒子を含めて、先行技術で使用されてきたように磁気化に対する反応において信頼度がよくない挙動を示す。

この粒子にプローブが結合するのは、直接化学結合及びアフィニティ結合によって、すなわち、ストレプトアビジン／ビオチン複合体などによることもできる。

前記プローブの結合のため、磁気粒子は、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド又はアミノ基のような官能基を有することもできる。これらは一般に非塗布単分散、超常磁性ビーズを処理し、上記の官能基の１つを有する高分子、例えば、水酸基を供与するポリグリコールとポリウレタン、又は水酸基を供与するセルロース誘導体、カルボキシル基を供与するアクリル酸又はメタクリル酸の重合体は又は共重合体、又は、アミノ基を供与するアミノアルキル化ポリマーの表面のコーティングを施すことによって提供される。米国特許第４．６５４．２６７号は、多くの上記表面コーティング類の導入を記載している。

本発明において使用する好適な塗布粒子は、米国特許第４．３３６．１７３号、第４．４５９．３７８号及び第４．６５４．２６７号に従ってこのビーズを修飾することによって調製でき、それらの開示は本明細書中に参考として組み込まれる。従って、例えば、スチレンジビニルベンゼンから調製され直径３．Ｉ５＃ｍの多孔性大綱状重合体粒子をＨＮ　Ｏ３で処理し孔の表面に−ＮＯ７基を導入した。次に、この粒子をＦｅ２“の水溶液に拡散した。Ｆｅ”は−ＮＯ２基によって酸化され、孔内に不溶性鉄オキシヒドロキシ化合物の沈降を生じる。加熱後、鉄は孔粒子容積全体にわたって磁気鉄酸化物の微細に分割された粒子として存在する。

このＮＯ２基は、Ｆｅ”′による反応でＮＨ２基に還元される。

この孔を充填しかつこの表面に所望の官能基を導入するために、異なる単量体が孔中及び表面において重合させられる。好適な種類の粒子の場合、この表面は、 −（ＣＨ２ＣＨ２０）　５−１ｏ結合を介して高分子骨格に連結された一〇Ｈ基を有している。他の好適なビーズは、メタクリル酸の重合によって得られたーＣ０ＯＨ基を有している。

従って、例えば、このビーズ中に最初に存在していたＮＨ２基は、米国特許第４．６５４．２６７号に記載のようにジエポキシドと反応し次にメタクリル酸と反応し、末端ビニル基群を付与する。メタクリル酸による溶液共重合によって下記に述べるＲ４５２ビーズ中でのように末端カルボキシル基を有する高分子性被覆が得られる。同様にアミノ基は、Ｒ２４０、Ｒ４４２及びＲ４６９ビーズのようにジエボキシドとの反応による上記生成物をジアミンに反応させることによって導入でき、一方、アミノグリセロールのようなヒドロキシルアミンとの反応はＭ４５０及びＬ２５５ビーズ中におけるように水酸基を導入する。

ダイナル［（０７ｎａｌ）　、ノルウェー、オス口］から得ることがせできるダイナビーズ（Ｄ７ｎａｂｅ！ｄｔ）　Ｍ４５０　（直径４゜５ミクロン）は、単量体エポキシドによって塗布されており、エポキシ基及び水酸基の混合物を生じる。しかし、水と接触してこのエポキシ基は水酸基に変換する。

ダイナビーズＭ２８０　（直径２．８ミクロン）は水酸基を有するポリスチレンビーズであり、前記水酸基はｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応によってトシルオキシ基に変換されている。

上記種類の官能基化コーティングを用いて、本発明者らは、特にカルボキシル化ビーズの場合ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの非特異的結合が極めて少ないことを見いだした。

上記にも述べたように、プローブ及びＲＥクリンカは好適にはカルボキシル基を介して磁気粒子に結合されており、このＤＮＡはまず最初にカルボジイミドカップリング剤を用いてこのカルボキシルとアミド結合を形成させることができる５ ′末端アミノ基を供与される。ＤＮＡの５′結合は、又、５′アミノＤＮＡと反応するＣＮＢｒで活性化されたヒドロキシル化磁気粒子を用いて行われる。

オリゴヌクレオチドＤＮＡの３′結合は、又化学合成によって行うことができる。ここでも又、単分散粒子の極めて均質な性質が、ジーン・アセンブラ−（ＧｅｎｓＡｓｓｅｍｂｌｅｒ）　［ファルマシアＡ　Ｓ　（Ｐｈａｒｍｘｅｉｘ　ＡＳ）コのような自動合成機中における合成に特に適した均一な反応速度を付与する。磁気粒子は、最初に水酸基又は保護水酸基を付与される必要がある。ダイナル＾／ＳのダイナビーズＭ２８０は、この目的に極めて適している。しかしもし必要であれば、水酸基を有するリンカ−を結合するために、カルボキシルのような他の表面官能基を又はこれの代わりに３′結合ヌクレオチドを使用できる。

５′結合は、５′−アミノオリゴヌクレオチド類をトシル活性化磁気粒子にカップリングすることによって行うことができる。後者は、ダイナルＡ／ＳのダイナビーズＭ２８０のようなヒドロキシル化磁気粒子をトシル化することによって産生できる。このトシルオシキ基を排除することによって、５′−アミノ基を直接磁気ビーズに結合させておく。

ビオチン標識ヌクレオチド類は市販されているので、ＤＮＡ断片の３′末端はＤＮＡブリメラーゼを用いて標識でき、これらは例えば水酸基１個を介して磁気粒子に結合したアビジン又はストレプトアビジンに便利に結合できる。このビオチン標識は、１個以上のε−アミノカプロン酸部分のようなスペーサーアームによってこのヌクレオチドに結合でき、立体阻害を最小とする。

一般に、ビーズの官能化及びその後のプローブの結合は、各磁気粒子が１０’− １０６プローブ（１−３００ｐｍｏｌｓ／■）を有することにも明らかであるように有益である。

磁気粒子の均一な大きさは、プローブがこの粒子と反応するときに均一プローブ密度を確保する点で有利である。

均一プローブ密度は、全てのプローブが使用される種々の操作において実質的に同じように挙動することを確保する上で重要である。

酵素活性が、例えば７塩基内のように粒子表面に極めて近接して起こるらしいことはこの磁気粒子の顕著な特徴である。従って、ＲＥ部位が下記で述べるようにリンカ−配列中に存在しているならば、及びこのプローブがプラマーとしてその後使用されるならば、５ｓｃＤＮＡ１従ってｄｓｃＤＮＡがビーズ表面に対してＲＥ部位を通過した位置でＤＮＡポリメラーゼによって合成できるここと、及びしたがってそれ自体は適当なエンドヌクレアーゼによって容易に切断されることがわかっている。カルボキシル化ビーズの場合、このビーズの微細表面が極めて不規則であり、異常な程の大きい表面積を呈しこのことによって、表面近くにおけるハイブリダイゼーション及び酵素活性に対する立体阻害を低下させることを見出した。一方、このようなカルボキシル化ビーズに対する非特異的結合は増加しない。しかし、一部の使用のためには、ビーズ１個あたりプローブ１個のみを有することが望ましい。磁気粒子の比表面積は一般に１グラム当たり２から５０ｒｒ！の範囲にある。一般にｄ当たりのプローブの数は２０から５Ｘ１０’の範囲にある。磁気粒子が極めて均一であることによって、近接した限度内にプローブ密度をコントロールすることが促進される。

本発明によるｃＤＮＡ合或は多くの異なる内容で使用でき、例えば、細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの総変換によりｍＲＮＡの不安定性から生じる問題を回避すること、英国特許出願第８８１７２６７．１号に対応する時点の我々の出願に記載させている部位特異的変異、英国特許出願第８８１７２６０、６号に対応する時点の我々の係属出願に記載されている標的核酸の検出及び定量、及びクローニングのためのＤＮＡ産生である。

本発明はサブトラクションｃＤＮＡライブラリー構築において特に有益に使用できる。このようなライブラリーは、細胞分化又は修飾の研究において特に有用である。

細胞分化研究の１つの先行技術方法では、タンパク質細胞抽出物の２次元ゲルクロマトグラフィーを行う。このタンパク質はその大きさ及び電荷がゲルに与えられたときにそれらが帯びる荷電によって分離される。ｐＨ及び塩の濃度は最初と２回目の方向で異なる。いったんタンパク質細胞抽出物が２次元クロマトグラフィーにかけられると、それは発色すなわち、なんらかの方法で染色される。細胞分化時におけるタンパク質の出現及び消失は、展開ゲル上のスポットの有無によってモニターできる。

分化研究の上記方法は極めて時間がかかる。グリコジル化のレベルは変化するので、グリコジル化されたタンパク質は、ゲル上のスメアとして出現する。単離されたタンパク質の量は極めて少量であり、それらをさらに研究することはできない。

迅速であるばかりでなく、分化に関係しているタンパク質を以後の研究のために十分量得るための経路を提供する細胞分化研究方法が、極めて必要とされている。自然の細胞分化に加えて、細胞形質転換、資源及び／又はビールス感染の産生物質研究に対して高い関心が寄せられている。

本発明の別の面は、細胞１次群からｍＲＮＡを分離すること、逆転写による対応する１次鎖ｄＤＮＡライブラリーを形成すること、及びこのライブラリーを用いて２次細胞群の全ｍ　ＲＮ　Ａから前記ｍＲＮＡを抽出し、２次細胞群内にのみ存在するｍ　ＲＮ　Ａを置き去ることに基づいている。

本発明は、さらに別の面において、細胞群及びこれらの細胞の修飾群（ｒａｏｄ目ｉｅｌ　ｐｏｐｗｌｓ目ｏｎ）に呼応したサブトラクシコンｃＤＮＡライブラリーを作製するための方法で下記の工程を含む方法を提供する。

鳳）　前記細胞群の１次群からの総量ＲＮＡ含有液体を５′結合オリゴｄＴプローブを有する不溶性支持体と接触させ、それによって実質的に全ての前記ｍＲＮＡをそれにハイブリダイズさせる工程、ｂ）　前記液体を除去する工程、Ｃ）　前記オリゴｄＴプローブをプライマーとして用い、逆転写酵素に不溶性支持体を接触させ、それによって対応する１重鎖ｃＤＮＡを形成させること、及びハイブリダイズしたｍＲＮＡを除去し前記不溶性支持体に結合したｄＤＮＡライブラリーを付与する工程及びｄ）　結合した１次鎖ｃＤＮＡを有する不溶性支持体を前記２細胞群の２次群の総量ＲＮＡ含有液体と接触させ、両細胞群中に存在するｍＲＮＡをハイブリダイズさせる工程、Ｃ）　不溶性支持体及び結合したｍ　ＲＮ　Ａを除去し、前記２次細胞群にのみ存在するｍＲＮＡ分子を溶液中に残す工程。

初期細胞群の修飾（ｓｏｄｉｆｉｃｘｉｉｏｎ）は、遺伝子の導入又は活性化を生じさせ、それによって、付加ｍ　ＲＮ　Ａ種の形成、又は遺伝子の除去又はスイッチオフをもたらし、それによっである種のｍ　ＲＮ　Ａの生成を防止する。

結果として、添加された及び除かれたｍ　ＲＮ　Ａの双方に対応するｍ　ＲＮ　Ａの単離（及びそれによるｃＤＮＡライブラリーの作製）に対して関心が集まる。

修飾された細胞によって新規に形成されたｍＲＮＡは、本発明の方法において１次細胞群として非修飾細胞群を選択することによって単離でき、修飾された細胞は２次細胞群である。これとは逆に、細胞修飾によって消失したｍ　ＲＮ　Ａは、修飾細胞を１次細胞群として選択し、非修飾細胞群を２次細胞群として選択することによって単離できる。

上記のようにして単離された残りのｍ　ＲＮ　Ａを次に用いて、いかなる所望の経路によってもサブトラクシコンｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。このよ　。

うな経路として、上記のように、オリゴｄＴプローブを有する不溶性支持体へのこのｍＲＮＡの結合及び逆転写による１重鎖ｃＤＮＡの付与が含まれる。

１重鎖ｃＤＮＡは２重鎖ｃＤＮＡに変換され、例えばＢｉｎｄ　Ｉ［リンカ−のような３′末端に適切な「付着」端が付与され、従来法によってベクター中に挿入されクローン化できる。このｃＤＮＡを次に転写し、翻訳して、細胞修飾によって導入されたか又は消失されたかのいずれかであるタンパク質を生じる。

本発明のこのもう１つの方法は、不溶性支持体としての磁気粒子によって有利に行なわれる。次に、上記粒子に関してより詳細に述べる。

オリゴ（ｄＴ）配列を有する磁気プローブは、最初に調製される。このプローブは、制限酵素部位（類）が任意に省略できる点を除き上記の固相ｃＤＮＡ合成に利用される磁気プローブに類似の構造であり得る。従って、磁気プローブは、その５′末端を介して磁気粒子に結合されたオリゴ（ｄＴ）配列を含む１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。磁気プローブは、ハイブリダイズ条件下において、１次細胞群、すなわち、問題の遺伝子（類）が抑制されている群の総ＲＮＡ、又は好適には総量ＲＮＡのいずれかの懸濁物又は溶液と接触させる。総ＲＮＡ又はｍ　ＲＮ　Ａの抽出物調製方法については、上記で示しである。典型的には、１次細胞群の総ＲＮ　Ａ　５０μｇ（又は精製総量　ＲＮ　Ａ　５　ｇｇ）当たり約５■の磁気プローブを使用できる。ハイブリダイゼーションは、例えば、０．１％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）含有６ＸＳＳＰＥ１００〆１のような高塩媒体中で１０分間、室温で行うことができる。次に磁気プローブを磁気分離ハイブリダイゼーション混合物から分離し、それとともに１次細胞群ｍＲＮＡを運び去り、これは、プローブオリゴ（ｄＴ）配列をｍＲＮＡポリ（Ａ）テイルにハイブリダイズすることによってこのプローブに結合される。このプローブを次に、例えば、４５℃の２ＸＳＳＣ，又は６×ＳＳＣで洗浄し得る。

プローブとともに回収されたｍＲＮＡは、次に、上記でより特定して記載したようにその場で磁気粒子上に逆転写される。テンプレートｍＲＮＡは、例えば、９５℃で約５分間加熱処理するか又は２分間のアルカリ処理によってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから除去される。ＳＳｃ　ＤＮＡ　をハイブリダイズした磁気プローブを磁気的に分離する。結果は、１次群細胞からの磁気ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーである。このライブラリーは、１次群細胞によって発現されたｍ　ＲＮ　Ａに相補的５ｓＤＮＡを含有する。

さらに進む前に、磁気ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーのプローブ部分のオリゴ（ｄＴ）配列は、つぎのハイブリダイゼーシコン工程における非特異的ｍＲＮＡ結合を回避するためにマスクすべきである。これは、プローブに、過剰の、適当な長さのオリゴ（Ａ）マーをハイブリダイズすることによって達成される。従って、例えばプローブオリゴヌクレオチドがｄ　Ｔ　２５配列を含有しかつこのｄＴ配列が１次鎖ｃＤＮＡ合成が生じた場合、この配列を過剰のＤＮＡオリゴマーｄＡ＋６とハイブリダイズしてマスクできる。このライブラリーが上記のように磁気ビーズ５ＩＩｇを用いて形成された場合、オリゴ（ｄＴ）配列は、適当な長さのオリゴ（ｄ　Ａ）マー５００ピコモルと６ｘＳＳ　Ｐ　Ｅ　５００μ！中でインキュベージコンすることによってマスク出来る。ホモポリマー配列のハイブリダイゼーションは、室温で約１０分間インキュベーションすることによって達成でき、次ぎに、４０℃の６ｘＳＳＣ５００μｍ中でこの磁気ｃ−ＤＮＡライブラリーを洗浄する。

このようにして形成された１次群ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーに、ハイブリダイズ条件下で２次群細胞からの総ＲＮＡ又は総量ＲＮＡの中油出物を添加する。ハイブリダイゼーションは、上記で調整した磁気ビーズ５■に基づき、６ｘＳＳＰＥ２０Ｏｘｌ中総ＲＮＡ２０ｇｇ（又は総量ＲＮ　Ａ　２ｈｇ）を９５℃で５分間予備加温し氷上でクエンチ（Ｂｅｎｃｈ）　したものに対してこのプローブを添加して行うことができる。反応物はゆっくりと混合しハイブリダイズさせる。

例えば、室温で１０分間インキュベーションすることによってハイブリダイゼーションを達成することができる。

１次群ｓｓ　ｃＤＮＡ及び２次細胞群由来ｍＲＮＡから形成されたハイブリッド２本鎖に次に結合した磁気プローブを、反応混合物から磁気的に分離する。上清のハイブリダイズしていないｍＲＮＡは、１次群細胞中で抑制されたが２次群細胞で発現された遺伝子のｍＲＮＡから構成されている。磁気ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーは、このハイブリダイズされた２次細胞群ｍＲＮＡをＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖からＲＮＡを分離するためのいかなる従来法によっても除去することによって再形成できる。このような１つの方法では、磁気ＲＮＡ／ＤＮＡ２本鎖を２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１００μｍに添加し９５℃で５分間加熱処理し、ハイブリダイズされたｍ　ＲＮ　Ａを融解し分離する。この代わりに、よりアルカリ性の条件を低温とともに用いることができる。再形成された１次群ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーをもう一回ハイブリダイゼーションに再使用できる。

好ましくは、上記の操作は、精製縁ＲＮＡよりは精製総量ＲＮＡを利用して行われる。総ＲＮＡがテンブレー）ＲＮＡの供給源として用いられる場合、それと磁気プローブとのハイブリダイゼーションでは、精製ｍＲＮＡに比べて磁気プローブ当たりやや結合の少ないｍＲＮＡが、非メツセンジャーＲＮＡによる干渉により、得られる。しかし、この総ＲＮＡを大過剰量の磁気プローブとインキュベーションすることによって、非メツセンジャーＲＮＡの干渉効果を補償することができる。

好ましくは、２次郡細胞から分化的に発現されたｍＲＮＡが追加の磁気１次群ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーと接触し、上記のように、ハイブリダイゼーション及び磁気分離を行う。この１次郡ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーとのプローブ化段階を反復して、１次群細胞中に発現された遺伝子に対応するｍＲＮＡの全てが分化発現された２次群ｍＲＮＡから分離されることを確実とする。所望の如（、この操作を反復し、分化ｍＲＮＡを濃縮する。

分化ｍＲＮＡの相対的濃縮は、１次群細胞のＲＮＡ抽出物中に無関連対照ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを導入することによって、便利にモニターできる。例えば、５μ ｇの精製総量ＲＮＡを磁気１次群ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーの形成におけるテンプレートＲＮＡの供給源として使用する場合、対照ｍＲＮＡ５ナノグラムを磁気プローブとの接触の前に精製総量ＲＮＡに添加し得る。この量のｍＲＮＡは、中等度からの低度の転写の為の精製総量ＲＮＡで期待されるであろう量のＲＮＡにほぼ対応する。

適切に標識された同一対照ｍＲＮＡのコピーは、２次郡細胞の総ＲＮＡ又はｍＲＮＡ抽出物に添加できる。磁気１次群ｓｓ　ｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション後、磁気分離後の上清に残留する標識対照ｍＲＮＡの量が決定される。

対照ｍＲＮＡの標識は、核酸標識のための適切な検出できるいかなる標識からも構成できる。好ましくは、本標識は、３２ｐ又は３５Ｓのような放射性標識から成る。このような放射性標識類は、シンチレーション計測によって簡単にモニターできる。核酸の放射性標識法は、当業者に公知である。

１次群磁気ｓｓ　ｃＤＮＡによってハイブリダイズされなかった２次群ｍＲＮＡ含有上清を、次に、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートＲＮＡとして用いる。その５′末端を介して磁気粒子に共有結合で結合したオリゴ（ｄＴ）配列を含有するプローブオリゴヌクレオチドから成る磁気プローブとハイブリダイズされない２次群ｍＲＮＡの溶液又は懸濁液をハイブリダイズ条件下で上記のように接触させる。このプローブオリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つの制限酵素部位をコードする配列を有する制限酵素部位は、オリゴ（ｄＴ）配列の上流、すなわち、５′側にある。１次群細胞中で抑制されるが２次群細胞で発現された遺伝子に対応する相補的ｃ　ＤＮＡライブラリーの形成は、上記ｃＤＮＡ合成方法によって生産される。このライブラリーは、従来のｃ　ＤＮＡクローニング技術によって適切にクローン化される。

分化ｃＤＮＡクローンの存在は、特異的ＲＮＡ検出に適した種々のハイブリダイゼーションブロッティング技術のいずれでも確認できる。上記のように調製した分化ｃＤＮＡ、すなわち、２次細胞群で発現された（しかし１次郡では発現されない（遺伝子に相補的ＤＮＡは変性される。その１本鎖を２次群細胞のプロットされた総ＲＮＡと接触させる。ノザン法又はドツトプロット法がこの目的のために適切に利用できる。１本鎖分化ｃ　ＤＮＡは、２次群のプロットされたＲＮＡにハイブリダイズするであろう。これとは逆に、分化ｃＤＮＡは、１次群細胞のプロットされた総ＲＮＡに〕１イブリダイズしないであろう。

本発明のさらに別の面によれば、（りそれに結合したＤＮＡプローブを有する不溶性支持体、及び１種以上の下記のもの（ｂ）逆転写酵素（Ｃ）ポリメラーゼ及び適宜リガーゼ及び／又はヌクレアーゼ（ｄ）デオキシヌクレオチド類（り適当な緩衝液類を含むｃＤＮＡ合成キットが提供される。

ＤＮＡプローブは適当な制限部位を含有するリンカ−配列を介してこの支持体に結合されるのが好適であり、これは、超常磁性粒子から構成されるのが有利である。

下記の実施例は、例示のためにのみ示した。

実施例１（ａ）（１）カルボキシルビーズにプローブを結合させるために使用される反応は下記のようである。Ｃｈｕら（Ｃｈｉ　。

Ｂ、　Ｆ、及び０ｒＫｅｌ　、Ｌ、　Ｅ、（１９８５年）ＤＮＡ４．３２７−３３１頁）によって記載された１工程反応方法を用いてこのプローブの５′末端に導入したアミノ基は、この塩基のアミノ官能性に比較して、このアルキルリンカ −の末端１次アミノ機の核性を大きくすることになる。従って、ビーズ上のカルボキシル基が好適にこれらの１次アミノ機と反応することが予測された。

０．１Ｍイミダゾール緩衝液ｐＨ７，０，ＩＭ　ＥＤＣ６Ｏｈｌ中の５’　−Ｎ　Ｈ２修飾プローブ１００　ｐｇをＲ４５２カルボキシルビーズ１■当たり添加した。反応混合物を室温でゆっくりと振とうしながら２０時間インキュベートした。

（ｂ）ＮＨ２主食プローブは、アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋　）合成機及びアミノリンク（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ　）　Ｕを用いて作製した。

混合反応は下記のようであった：：Ｏ，＋Ｍイミダゾール緩衝液ｐ　Ｈ７，ｒＪ、０、ＩＭ　ＥＤＣ１００ｇＩ中の５’　−Ｎ　Ｈ、修飾プローブをＲ４５２カルボキシルビーズ１■当たり１０ｐｇ添加した。反応混合物はローラーミキサー［クールター（Ｃｏｏｌｌｅｒ）　］上で室温テ２０時間インキュベートした後、０．１Ｍ　ＮａＣ１含有ＴＥ緩衝液中で洗浄した（４×）。

ハイブリダイゼーション効率：異なる量の結合プローブによるビーズの範囲を相補的２５マーポリｄＴプローブによるハイブリダイゼーション実験で試験した。

本ビーズは、１■ビーズ当たり結合プローブ１−２５０ｐモルの範囲をカバーした。

２５マーポリｄＡオリゴヌクレオチドの量が増大すると、ハイブリダイズする結合プローブの量も増大した。１９３ｐモルは２５０ｐモル結合のビーズをハイブリダイズした。

しかし、標的分子が１．０００ｂｐの範囲にあるとき［対照ｍＲＮＡプロメガ社（Ｐｒｏａ＋ｅｇｔ　Ｃｏｒｐｏｒｔｌｉｏｎ　）　］　、結合プローブｔｏｏｐモルを有するビーズとより密度が高く結合したビーズの間には、ハイブリダイゼーション効率に全く差が見られなかった。

カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）媒介５′−ホスフェートプローブのアミノビーズへの結合プローブは、Ｇｈｏｓｂ　ら（Ｇｈｏ＠ｂＳＳ、Ｓ、及びＭｕｔｓｏ　、　Ｇ、Ｆ。

（１９８７年）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（ＮＵＣＩ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５巻、５３５３−５３７２頁）に記載された方法によって、３つの異なるアミノビーズにホスホルアミデート結合を介して結合させた。

この種々のビーズに結合したＤＮＡの量は、１．４−１１Ｊマイクログラム／■ まで変化した。

ポリエチレングリコールリンカ−（８原子）の末端にアミノ基を有するＲ４６９　ビーズは、より短いリンカ−（３原子）上にこのアミノ基を有するＲ２４０　ビーズよりも大量のプローブを結合する。このリンカ−がＲ４４２ビーズの場合のようにより長くなると（原子数２０）、ビーズに結合したプローブの量が減少することが観察される。

これはおそらくこのリンカ−の２次構造により、この結果、末端のアミノ基が結合に利用できなくなる。

非特異的に結合したＤＮＡの量は、おそらく単位表面積場たりのアミノ基の数に従ってビーズ間で変化する（７−３０％）。Ｒ４６９ビーズは最大量のプローブを共有結合で結合しくｆｌａｇ／■）、最低の非特異的結合を示した。

酸加水分解による末端結合の程度を測定するために、ホスホルアミデート結合の酸不安定性（Ｃｈｕ　、　Ｂ、Ｃ，Ｆ、。

Ｌｈｌ、Ｇ、　Ｍ、及びＯｒｇｅｌ　、Ｌ、Ｅ、（１９８３年）ヌクレイツク・アシッド−リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　１１巻、６５１３ −６５２９頁））を用いた。末端結合プローブの量は、異なるビーズ間で２０− ６５％まで変化し、再度このＲ４６９ビーズは好適なもののようであり、末端結合した本プローブのｒ　６５％を有する。

本発明者らは、ｐＨ６、室温で２４時間の代わりに、ｐＨ７のイミダゾール緩衝液中で５０℃で３時間反応を行うことによって、Ｒ４６９ビーズに対して２倍量のプローブ材料を付着させることができた。ＥＤＣのモル数が１　０．１Ｍから　０，２Ｍまで増加することによって、Ｒ４６９ビーズ上のプローブの量が２０％低下した（データは示さオリゴＡ（３６マー）　６０Ｑｐモル（６１ｇ）をｆｌ、１Ｍイミダゾール、ｐＨ７、口、ＩＭ　ＥＤＣ１ｍｌ中に溶解し、アミノビーズ５■を混合し、さらに５０℃で３時間インキアプライド・バイオシステムダＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｊｅｍｓ　ＤＮＡ　５７ｎｊｈｅｓｉｘｅ＋）　３８１Ａ及びアミノリンク　（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ）　ＩＩを用いて、Ｎｌ２基をオリゴヌクレオチド類の５′末端に導入し、この５′ 末端に１次ＮＨ２基を導入した。アミノリンク■は、アプライド・バイオシステムズから供与される。合成語、これらのアミノ修飾オリゴヌクしｌオチド類を直接結合実験に用いた。

トシル活性化ト２８０　ビーズはダイナルＥ　［Ｄｙｎ１ｌ　ＡＳ）、オス口］から市販されている。

結合操作ニドシル活性化ビーズ１０ｒｎｇを０．５　Ｍ　Ｎａｚ　ＨＰＯ，１００ＪＩＩ中でＮ　Ｈ、修飾オリゴヌクレオチド５０μｇと混合し、３７℃で２０時間、ローラーミキサー［クールター（Ｃｏｎｌｔｅｒ）　］上でインキュベート後、Ｏ，ＩＭ　１ｔａｃＩ含有ＴＥ緩衝液で洗浄した。（４×）。

ダイナビーズＲ４８８ビーズを使用した。これらは、直径が２．８　ミクロンの代わりに３．＋５ミクロンである点を除いてはＭ−２１１ｆｌ　ビーズと同一のビーズであり、それらは、ト２８０ビーズの場合と同様にその表面に１次ＯＨ基を有している。

シンセサイザー［ファルマシア・ジーン帝アセンブラ−（Ｐｈｘｒｍｘｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅ＋）コを使用して、ＤＮＡの３′末端をその表面に結合させる。

わずかの修飾のみが、この３．１５ミクロンビーズを結合させるために必要であった。アブライド−システムズの標準的小型カラム中に３．０　ミクロンカットオフのテフロンフィルターを設置し、ビーズをのせカラムを組み立てた。

この支持体はジメチルトリチル（ＤＭＴｒ）基を含有しておらずこの機器は１次サイクルの１次段階で上記化学物質が放出されないと停止するので、出発操作においてわずかの修飾を行った。標準ＡＢＩ小型カラムを用いて合成を開始し、ＤＭＴｒ基が放出されるまで行った。

次に、このジーン帝アセンブラ−（Ｇｅｎｅ　Ａｔｔｅｍｂｌｅｒｌを手動で停止させ、修飾されたカラムをシーン−アセンブラ−中に入れた。次に製造業者推薦の標準合成プログラムに従った。脱保護は、ファルマシアの指示通りとした。

直接合成を用いて、オリゴ（ｄＴ）２．及びカッパ軽鎖遺伝子のＣ領域の下記配列を作製した。

５′−丁ＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧ丁ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ＾−３′グイナビーズ　ト２８０ストレプトアビジン（Ｓｔｒｓｐｔｓｖｉｄｉｎ）　（ダイナルＡ、　Ｓ、、オス口、Ｎ−０２１２、ＢＯ１１５８）を固相として用いた。これらは、ストレプトアビジンに共有結合で結合した直径２．Ｉｌ＋ｍの単分散超常磁性高分子粒子である。これらは、表面積４．３ＩＩｆ／ｇを有して１４ｃｍビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）　［アマ−ジャム（＾ｍｅｒｓｈｘｍ）］１ｎモル含有６ＸＳＳＰＥ　［燐酸及びＥＤＴＡ含有標準生理食塩水：マニアナイス（Ｍｘｎｉｘｌｉｓ）］　１００μｍをビーズ（６ＸＳＳＰＥで予備洗浄）０，５■に添加し、室温で１５分間ローラーミキサー［クールター　（Ｃｏｎｌｔｅｒ）］上に置いた。

５ｘＳＳＰＥで２回それぞれ洗浄した後、結合１４ｃ−ビオチン分画をシンチレーション計測によって測定した。

デオキシオリゴヌクレオチド類デオキシリボヌクレオチド類を、アプライド・バイオシステムズ３８１ＡＤ　Ｎ　Ａシンセサイザー上で合成した。

化学物質類は、アプライド拳バイオシステムズから購入した。５′アミノ修飾デオキシオリゴヌクレオチド類は、アミノリンク■を用いて作製した。

使用したイムノグロブリン軽カッパ鎖プローブは５’　−ＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ人−３゛ビオチンＸＮＨＳエステル（Ｎ−ビオチニルε−カプロン酸のクロンチックＮ−スクシンイミジル）を供給業者の指示通りに用いた。

水９０μｍ中ＮＨ２修飾オリゴ（ａＴ）　２５０．１μモルを標準緩衝液（１Ｍ重炭酸ナトリウム／炭酸塩、ｐＨ９，０）１０μｍに添加し、ポルテックスした。

最終的に、ジメチルホルムアミド中ビオチンＸＮＨＳエステル（１００■／ｍ１）２５μｍを添加し、室温で一晩インキユベートした。

過剰の標識試薬及び緩衝液をセファデックス（Ｓｅｐｂａｄｅｘ）　Ｇ　５０スピンカラムで除去した。

５′ビオチンオリゴ（ｄＴ）２１、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｖ）ポリメラーゼ、α −（”Ｐ）−ｄＴＴＰ及びテンプレートとしてのオリゴ（ｄＡ）２．による反応中で充填することを用いて末端標識した。過剰の標識を、セファデックスＧ５Ｇスピンカラムで除去した。

オリゴ（ｄＴ）ダイナビーズ（Ｔ−ビーズ）の調製６ｘＳＳＰＥ　２．５ｍｌ中ビオチン化オリゴ（ｄＴ）２゜２Ｈｊｇ　（２４ｎモル）を洗浄済みのダイナビーズトコ８０ストレプトアビジン５０■と混合し、室温で１５分間ローラーミキサーでインキュベートした。

６ＸＳＳＰＥで２回洗浄後、このビーズを、５　ｘ　Ｔ　Ｅ　５Ｏ１１％ＳＤＳ中に４℃で保存した。

オリゴヌクレオドハイブリダイゼーションアッセイバッチの異なるＴ−ビーズのハイブリダイピーシ３ン能を測定する標準的アッセイにおいて、エツペンドルフ管中のビーズ０．１■を６ＸＳＳＰＥ、０゜１％５Ｉ）Ｓで１回洗浄した。磁石ラック（ＭＰＣ−Ｅ、ダイナル＾、Ｓ１、オス口）を用いて、各工程間でビーズを集合させた。

洗浄緩衝液を除去した後、微量（１−２Ｘ　１０’　ｃｐｍ　）のα−（３２Ｐ）−ｄＡＴＰ標識オリゴ（ｄＡ）ｚｉを含むオリゴ（ｄ　Ａ）　２５５ＱＴ）モル含有ハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＰＥ１０．１％５ＤＳ）５ｈｌを添加した。

ゆっくりと混合した後、このチューブを室温で２分間ハイブリダイズするために放置した。

ハイブリダイズされたビーズは、２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで室温で２回洗浄し、オリゴ（ｄＴ）ｚｓダイナビーズにハイブリダイズされたオリゴ（ｄＡ）２５の百分率をシンチレーションカウンターで測定した。

ポリＡ　ｍＲＮＡ）レーサーの標識３′ポリＡ３ｏテイル１個を有する１、２００　ｂｐ　ｍＲＮＡ１　ｊｉ　［（Ｐ＋ｏｍｅｇり　］を、５×クレノウ（Ｋｌｅｎｏｖ）緩衝液１０ｊｌ、ｌｕのＲＮａｓｉｎ（プロメガ）　、１０ｍＭのＤＤＴ中のオリゴ（ｄＴ）　２５２．５ｐモルと混合した。室温に２分間室いた後、ａ、−（”Ｐ）　−ｄＡＴＰ１０ μｃ　ｉ、　１　ｕクレノウボリメラーゼ［アマ−ジャム（＾ｍｅｒｓｈｉｍｌ］及び５０ｐ１までの水を添加し、１５℃で６０分間インキュベーションを継続した。過剰のα−（”Ｐ）−ｄＡＴＰをセファデックススピンカラムを用いて除去した。

ポリ（Ａ）結合緩衝液：０．５Ｍ　ＬｉＣ１，ｌＯｍＮ　トリス−ＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｑ、Ｉ％ドデシル硫酸ナトリウム中間洗浄緩衝液：０．１５Ｍ　Ｌ　ｉ　ＣＩ　Ｓｌ０ｍＭ　トリス−ＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム。

溶出緩衝液：　２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　％ＳＤＳ、精製ｍＲＮＡの次の用途に応じ、ＳＤＳは、最後の洗浄工程及び溶出緩衝液中で省略できる。

実施例６−８下記のＲＮＡ５を利用し、相補的ＤＮＡをそれぞれ調製する。（Ｉ）リボクローン（商標名）　（Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ　”）ｃＤＮＡ合成システム（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＳｙＮｅｍ）　［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇ＊）　、米国ライスコンシン、マジソン（Ｍｓｄｉｓｏｎ）　］により供給された標準ｒｎＲＮＡ、（ＩＩ）マウス膵臓ｍＲＮＡ［クローンチック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃ）、米国］、又は（ｍ）マニアティス（Ｍｚｎｉｘｔｉｓ）ら、同上、！８７−１９６頁の方法によって２ＸＩＯ’ＡＢ１細胞から調製されたハイブリドーマＡＢＩ粗ＲＮＡ抽出物。試料■及び■　１ｐｇ１及び試料ＩＩＩ　１０μｇをそれぞれ、５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　１００μｍ中で１００℃で３分間加熱し、次に、氷水でクエンチさせた。

各溶液を、それぞれ、ＥＤＣカップリングによってビーズ上のカルボキシル基に５′アミノ基を介して結合させた下記のプローブ：５’−ＮＨ２−（ＣＨ２）　１２−ＧＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＥＣＯＲＩ　Ｓｍ５ｌ　Ｐｉｔｌ（Ｔ）　２４）−３、を有する磁気ビーズＲ５１１２１■に添加する。試料中のＲＮＡへのこのビーズプローブのハイブリダイゼーシヨンを室温で１０分間促進させる。本プローブを次に磁石で回収し、そして、室温で２ＸＳＳＣで２回洗浄する。１次鎖及び２次鎖ｃＤＮＡ合成を、下記のように、リボクローン（商標名）　（Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ”）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成システムテクニカルマニュアルに従って実施した。総容量２５１１１に対して、減菌したＲＮａ　ｓ　ｅを含まないミクロ遠心管中で、下記の成分を磁気プローブ結合テンプレートＲＮＡと氷上で下記の順に混合し、１次鎖合成混合物を形成する。

成　分　量ヌクレアーゼ非含有水最終容量１０×１次鎖緩衝液（５００ｍＭ　）リス塩酸、ｐＨ８，３（４２℃）　、７５０ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ、　、５　ｍＭスペルミジン）　２５ｇ１１００ｍＭ　ジチオトレイトール　２．５＃１４０ｍＭ　ピロリン酸Ｎａ　２．５＋１１０ｍＭ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ混合物　２．５ｇ＋ＲＮａｓｉｎ　リボヌクレアーゼ阻害剤　２５単位逆転写酵素　１５単位／ｐｇＮＡ上記の成分を、磁気プローブ結合テンプレートＲＮＡとゆっくりと混合する。この混合物５＋＋Ｉを適宜、乾燥しであるか又はｌｌ１未満の容量となっているかのいずれかであるＣａ−３２Ｐ）ｄＣＴＰ　（４００Ｃｉ／ｍモル）を含有する別の管に移す。１次鎖合成混合物の一定量をトレーサー反応として用い、すなわち、上記のリボクローン（商標名）テクニカルマニュアルにより十分に記載されているようにトリクロ酢酸沈殿及びアルカリアガロースゲル電気泳動を利用して（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ取り込みによる１次鎖合成測定に用いることができる。

主要反応及びトレーサー反応管の双方を４０℃で６０分間インキュベートし、次に氷上に置く。０．２Ｍ　ＥＤＴＡＩμｍを次にこのトレーサー反応に添加する。このトレーサー反応を総容量２Ｇ＋＋まで水で希釈し、氷上に保存する。少なくともトレーサー反応混合物の３戸１が上記のリボクローン（商標名）テクニカルマニュアルに特に記載されている取り込みアッセイに使用できる。残りの１７ｊｌを、上記のりボクローン（商標名）テクニカルマニュアルに記載された抽出後のゲル分析に使用できる。

磁気プローブ結合ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド含有１次鎖主要合成混合物管に、下記の成分を下記の順に添加し、２次鎖合成を行う。

成　分　量（１次鎖合成混合物）　（２ｈｌ）又フレアーゼ非含有水　最終容量１０×２次鎖緩衝液（４００ｍＭ　）リス塩酸、ｐｉ（７，２，８５０ｍＭ　ＫＣＩ、３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１■／ｍｌウシ血清アルブミン、１００ｍＭ　（ＮＨａ　）　２　ＳＯ４）　ＩＯｈ１１００ｍＭジチオトレイトール　３Ｊ１１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド　１０ｐＩＥ、ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　ＨＯ，８単位Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　２３単位Ｅ、ｃｏｌｉ　リガーゼ　１単位＊　（α−３２Ｐ）　ｄｃＴＦ　（４１１０Ｃｉ／ｒｎモル）　２０５ｔｔ　Ｃｉ木　この放射性ヌクレオチドは、２次鎖合成測定のための上記混合物のそれぞれの試料中で適宜使用される。

上記成分を、ゆっくりと混合し、１４℃で２時間インキュベートする。本混合物をつぎに７０℃まで１０分間加熱し、管底の内容物を短い遠心分離で回収し、氷上に置く。磁気粒子から遠位のｄｓ　ＣＤＮＡ末端上にプラント末端を作製するために、入力ＲＮＡ１μｇ当たりＴ４ポリメラーゼ２単位をこの混合物に添加し、これを３７℃で１０分間インキュベートする。プラント末端反応を０．２ＭＥＤＴＡＩＯβ１添加によって停止する。混合物を氷上に置く。

この時点において、この混合物５μｍを上記のりボクローン（商標名）テクニカルマニュアルに記載されている取り込みアッセイのために誘導できる。磁気プローブ／ｄｓｃＤＮＡ複合体を磁石で回収しりガーゼ緩衝液で洗浄する。

）１ｉｎｄｌＩ　ＲＥ部位を取り込んでいる制限酵素アダプターを次に磁気プローブ／ｄｓｃＤＮＡ複合体の遠位端に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてリガーゼ緩衝液中で３７℃で結合する。この旧ｎｄ■及びＰＮＩＲＥ部位を次に、適当な酵素を用いて切断し、同時に磁気粒子からｃＤＮＡを切断し、遠位末端に必要な付着端を付与する。磁気粒子を次に磁気誘引によって除去する。

本発明のｅＤＮＡ合成方法は、公知の又は部分的に公知のＤＮＡ配列を有する特異的遺伝子からｃＤＮＡを調整するために下記のごとく用いることができる。

実施例９Ｂ細胞分化抗原に特異的なモノクローナル抗体ＡＢＩのカッパ軽鎖のｍＲＮＡを、下記のようにしてｃＤＮＡ合成のために単離する。

総組ＲＮＡをオーフレイ（Ａｕｌ［ｒｓｒ）　ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オフ拳バイオケミストリー［（Ｅｗｔ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１０７巻、３０３−３１４頁（１００年）］に記載のＬｉＣ１−尿素法によってＡＢＩ細胞から抽出する。結果として生じた５ＸＳＳＰＥ［ＧＯａ＋１中総ＲＮＡ調製物１０＃ｇを９５℃で５分間加温し、氷上でクエンチし、そしてカッパ軽鎖遺伝子のＣ領域のヌクレオチド配列：５’　−Ｎｌ＋２−丁ＣＡＣ丁ＧＧ＾丁ＧＧ丁ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴ就＾−３′を含有する磁気プローブ１■に添加する。このプローブ配列を、例えば、１２−ＭＭ）リチルアミノドデシルーシアノエチルＮＮ−ジイソプロピルホスホルアミデートを用い、アプラ合成式イオシステムダＤＮＡ合成機を用いて５′ 末端アミノ基を有するように調製し、基ＯＰＯ□（ＣＨ２）　１２ＮＨ２を５’ 　−ＯＨ基分類に導入する。このプローブ配列を実施例２のようにＳ’　Ｎ　Ｈ２末端を介して磁気ビーズに結合させる。磁気プローブ／テンプレートＲＮＡ反応混合物は、室温で１０分間ハイブリダイズさせる。

ハイブリッドを回収し、室温で２　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ５００μｍで２回洗浄する。

洗浄後、６ｘＳＳＰＥ　１６０ｊｌをこの混合物に添加し、磁気プローブを９５ ℃で５分間熱処理することによって標的カッパ軽鎖ｍＲＮＡから融解する。次にこのプローブを磁気誘引によって回収する。カッパ軽鎖ｍＲＮＡを含有する上清を、実施例２−４に記載のように磁気粒子とオリゴ（ｄＴ）２ｓ配列の間に３つのＲＥ部位を有するオリゴ（ｄＴ）２ｓ磁気プローブに添加する。

本混合物を１０分間ハイブリダイズさせ、実施例１の操作を次に行いｄｓ　ｃＤＮＡ断片を調整する。次にこれらの断片をクローニングベクターｐＧＥＭ−３２に連結し、Ｅ、ｃｏｔ＋の形質転換に用いる。

実施例１０バンデックスアビジン（Ｐｘｎｄｅｘ　ａｖｉｄｉｎ　）粒子（直径０、７７ｐｔｒ＋、バクスター・ヘルスケア社（Ｂｘ［ｅ＋　Ｈｅｇｌｌｈｃａ＋ｅＣｏｒｐ、）、７ンデレイン［（Ｍｏｎｄｌｅｉｎ）、米国、イリノイ州コの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５％懸濁物０，５■を５゛ビオチン化オリゴｄＴ２，５００ｐモルと混合し、室温で１５分間インキュベートした。全ての沈降及び洗浄操作は、エツベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｌ）遠心分離を用いて３分間行った。

粒子をＰ　Ｂ　Ｓ　Ｉｏｏ［中で２回洗浄し、過剰の遊離オリゴヌクレオチドを除去した。

バンデックスオリゴｄＴ粒子１００βｇ及びプロメガ対照ｍＲＮＡ　０．５ｇｇ（ポリＡ３’テイルとして３ＧＡ残基を含有する１、２ｋｂ力ナマイシンｍＲＮＡ）を、実施例２に記載のように処理し、しかし、唯一の相違として、磁気ビーズによる磁気分離工程の代わりに３分間エツベンドルフ遠心分離工程を洗浄及び緩衝液交換のために導入した。

１次鎖及び２次鎖緩衝液の一定量を（α３’Ｐ）ｄＣＴＰとインキュベーションし、ｃＤＮＡ合成を行うことができるようにした。

上記ｍＲＮＡの遺伝子コードには、Ｈｉｎｄｍ制限部位が含まれている。１次鎖をα”Ｐ）ｄＣＴＰを用いて標識しバンデックス粒子上でのｃＤＮＡ合成後、インキュベーションを旧ｎｄｍとともに行い、新規合成ｃＤＮＡの品質を試験した。ｃＤＮＡ結合パンデックスビーズは、（（！”Ｐ）ｄｃＴＰＬ次鎖中に取り込まれ、Ｈｉｎｄｍで処理し、この上清を１．５％アガロースゲル上で展開した。

明確な予測サイズのバンドがＸ線フィルム上に視覚化された。

実施例１１本発明の目的は、分化Ｂ細胞系“Ｒａ　ｊ　ｉ”中に転写されているが幹細胞系ＫＭａ中では転写されていない遺伝子に対応するサブトラクションｃＤＮＡライブラリーを作製することである。

ＫＭ−３細胞系からの“磁気２１鎖ｃＤＮＡライブラリーの構築ＫＭ−３細胞系及びＲａｊｉ細胞糸からのポリＡｍＲＮＡを、磁気ビーズを用いて精製した。精製ＫＭ−３ｍ　ＲＮ　Ａ　７　ｐｇ、独特の対照ｍＲＮＡ　［プロメガ・リボクローン・キット（？ｏｍｅｇｉ　Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ　Ｋｉｔ）コ５ｎｇをオリゴｄＴ３６ヌクレオチドプローブを有する磁気ビーズＲＳＯ３５ ■に添加し、その結果としてのハイブリダイゼーション能はビーズ１■当たり＋６ｐモルとなった。

ハイブリダイゼーションを室温で１０分間６ｘＳＳＰＥ２００μｍ中で行なった。このビーズを６ｘＳＳＰＥ５００＃ｌ中で４０℃で５分間１回洗浄し、非特異的結合及び未結合ｍＲＮＡを除去した。

次にこのビーズを下記のプロメガ・リボクローン・キットにより提供される１、鎖ｃＤＮＡ合成緩衝液及び成分ＩＮ　ｌｌ中に再懸濁した。

成　分　量ヌクレアーゼ非含有水最終容量　１００ｊ１１Ｇ×１次鎖緩衝液（５００ｍＭ　）リス塩酸、ｐＨ８，３（４２℃）　、７５０ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭ　ＭｇＣｈ　、５　ｍＭスペルミジン）　ｌＯｘ１１００ｍＭ　シｆ　ｔトレイトール］　ＯＨ１４０ｍＭ　ピロリン酸Ｎ　ａ　ＩｈｌｌｏｎＭ　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ混合物　１ｈｌＲＮ＊ｔｉｎ　リボヌクレアーゼ阻害剤　５０単位逆転写酵素　７５単位１０Ｃｉα−（”Ｐ）−ｄＡＴＰ　（アマ−ジャム）上記の成分を、磁気プローブをハイブリダイズしたテンプレートＲＮＡと徐々に混合し４２℃で６０分間インキューベートした。次にビーズを磁石によって回収し、ＴＥ５００４１　（１０ｍＭ　）リス塩酸ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で１回洗浄し、過剰の試薬を除去し、０．２Ｎ　Ｎ５ＯＨ及び０．５Ｎ　ＮＩＣ＋　５００ｇ１で２回洗浄し、テンブレー）ｍＲＮＡを除去し、最終的に６ｘＳＳＰＥ２００μｍ中に再懸濁した。ビーズに結合した放射能を測定し、１．鎖ｃ　ＤＮＡ合成の量及び有効性を推定した。磁気１．鎖ＫＭ３ｃＤＮＡ　（ｓ　ｓ）ライブラリーをオリゴｄＡ２．−ヌクレオチド２［１０ｐモルと混合し、室温で１０分間ハイブリダイズさせ、ＲＥＴブラマー及びｍＲＮＡの逆転写ポリＡテイル由来の２５−２Ｎ塩基長さのポリｄＡ領域を被覆した。この領域は、Ｒａｊｉ　ｍＲＮＡのポリＡティルの結合をを避けるために被覆される。ハイブリダイゼーション後、過剰オリゴｄＡ＋ｔを室温で６ＸＳＳＰＥで洗浄する。洗浄後ビーズを下記の組成のハイブリダイゼーション溶液２００１中に再懸濁した。

５０％ホルムアミド５×デンハート（Ｄｅｎｈｓｒｄｊ）溶液（５０×デンハート溶液はフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）　５　ｇ　ｓポリビニホロリドン５　ｇ　１ウシ血清アルブミン５ｇ１水５００ｍ１となるように含む）Ｘ５ＳＰＥ０．１％５ＤＳＲａｊｉ細胞からの精製ポリＡ　ｍＲＮＡ２ｐｇ及び放射能標識（５０，０００ｃ　ｐ　ｍ）対照ｍＲＮＡ１　ｎｇを１．鎖ライブラリーに添加し、４２℃でハイブリダイズさせた。

２０分のインキュベーション後、溶液を５０℃の水浴に移し５分間置き、緊縮（Ｓｌｉｇｎｅｎｃ７）を増加させた。次にハイブリダイズされたｍＲＮＡを有するピースを磁石によって回収した。“上清”を新しい管に入れた。

上清中の残りの試験ｍＲＮＡは、添加量の９％であることがわかり、このことは、通常の相同ｍＲＮＡの９０％が除去されたことを示唆している。本実験において、Ｒａｊｉ　ｍＲＮＡ　２ｐｇに比較して最大３倍過剰のＫＭ３１．鎖ｃＤＮＡ　（ｍＲＮＡ６−７ｇｇ）で出発したので、これは、予測をはるかに越えていた。

ＫＭ３　１．鎖ｃＤＮＡライブラリーを含有するビーズは、０．２　Ｎ　ＮａＯＨ，０，５Ｎ　ＮａＣｌで２回洗浄し再生され、ＱｘＳＳＰＥ中に再懸濁され、オリゴ（ｄＡ）２．で再ハイブリダイズされ、次に“サブトラクション”ｍＲＮＡとともに通常のｍ　ＲＮ　Ａ　９％をまだ含有している上清に添加した。

サブトラクションの第２回は、第１回と同様に実施した。

結果として生じた上清は、その時に１％未満の標識トレーサーｍＲＮＡを含有していた。（正確な百分率は低ｃｐｍカウントのために不確かであった。）この極めて優れた結果は、ビーズ上のＫＭ３　１．鎖ｃＤＮＡ　（同様に５５−７ｐ　ｍＲＮＡ）が現在９％のみすなわち相同ｍＲＮＡ２μｇと反応して、モル数で３０倍過剰を呈したことから予測された。これ以上のサブトラクションの実行は必要であるとは考えなかったので、サブトラクトされたｍＲＮＡを含む上清をＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを有する新鮮ビーズ２■に添加し、室温で１０分間ハイブリダイズさせた。

室温で２ＸＳＳＣで洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。

）ＩｉｎｄＩ［［リンカ−を２重鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの遊離末端に連結し、）１ｉｎｄｎ［酵素で切断し、ＰｓｌＩ切断によってビーズから放出させた。ビーズから分離した後、ｃＤＮＡを次にフェノールで抽出（制限酵素破壊のため）シ、エタノール沈殿させ、シャトルクローニングベクターｐＣＤＭ８に連結させた。

連結後、組換えプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換させた。形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ細胞はクローン化すブトラクションｃＤＮＡライブラリーを有しており、これを（抗生物質耐性表現型発現のために１時間後）、抗生物質圧力に供し５倍加時間増幅した。その後、グリセロールを１５％まで添加し、この混合物を　０．５ｍｌハツチに分割し、液体窒素中で急激に凍結し、さらに使用するまで一７０’Ｃで保存した。

補正偶の写しくＩ訳文）提出！（特許法第１８４条の８）平成　３年　５月２１呵］

Claims

【特許請求の範囲】１　ａ）ｍＲＮＡ含有液体を、ＤＮＡプローブをそれに結合させた不溶性支持体にその５′末端を介して接触させ、それによって、このｍＲＮＡを前記プローブに、よって前記支持体にハイブリダイズさせる工程、ｂ）前記液体を除去する工程、及びｃ）溶液中に酵素及びヌクレオチドを添加し、それによって、このプローブが前記ｍＲＮＡテンプレート上に１本鎖ｃＤＮＡを作成するためのプライマーとして作用する工程、の工程を含むｃＤＮＡを製造する方法。２　前記ＤＮＡプローブが少なくとも１個の制限部位を含有する１個のＤＮＡ配列を介して前記支持体に結合する請求項１に記載の方法。３　前記プローブがオリゴｄＴである請求項１又は請求項２に記載の方法。４　前記プローブが１個の特異的ＤＮＡ配列である請求項１又は請求項２に記載の方法。５　前記特異的ＤＮＡ配列がｍＲＮＡ分子の属内の１個の保存された領域に対応する請求項４に記載の方法。６　前記不溶性支持体が磁気粒子からなる請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。７　前記粒子が単分散及び／又は超常磁性である請求項６に記載の方法。８　前記１本鎖ｃＤＮＡが続いて２本鎖ＤＮＡに変換される請求項１乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。９　ａ）細胞群の１次群からの総ｍＲＮＡ含有液体を５′結合オリゴｄＴプローブを有する不溶性支持体と接触させ、それによって、実質的に全ての前記ｍＲＮＡをそれにハイブリダイズさせる工程、ｂ）前記液体を除去する工程、及びｃ）前記オリゴｄＴプローブをプライマーとして用い、溶液中に酵素類及びヌクレオチド類を添加し、それによって対応するｃＤＮＡの１本鎖を形成させ、そして、このハイプリダイズされたｍＲＮＡを除去し、前記不溶性支持体に結合されたｃＤＮＡライブラリーを付与する工程、ｂ）結合１次鎖ｃＤＮＡを有する不溶性支持体を前記２つの細胞群の２次群の総ｍＲＮＡを含有する液体と接触させ、両細胞群中に存在するｍＲＡＮをハイブリダイズさせる工程、ｅ）この不溶性支持体及び結合ｍＲＮＡを除去し、前記２次細胞群にのみ存在するこれらのｍＲＮＡ分子を溶液中に残す工程、の工程を含む、細胞１群及びこれらの細胞の１修飾群に関するｃＤＮＡサブトラクションライブラリーの製造のための請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の方法。１０　工程ｃ）で前記ｃＤＮＡライブラリーを保持する前記不溶性支持体が工程ｄ）の前にオリゴｄＡで処理され、非特異的ｍＲＮＡ結合を回避する、請求項９に記載の方法。１１　ハイブリダイゼーション及び酵素活性を最適化するために洗浄工程及び緩衝液の交換を含む、請求項１乃至１０のいずれか１請求項に記載の方法。１２　ａ）それに結合されたＤＮＡプローブを有する不溶性支持体、及び１種以上の下記のもの：ｂ）逆転写酸素ｃ）ポリメラーゼ及び適宜リガーゼ及び／又はヌクレアーゼｄ）デオキシヌクレオチド類ｅ）適当な緩衝液を含むｃＤＮＡ合成キット。