JPH04502009A - Ｃｄ２８刺激関連免疫療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には、免疫療法に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｔ細胞が 仲介するｉｎ　ｖｉｖｏ　免疫応答を増強するためのＣＤ２８　Ｔ細胞表面分子 の刺激に関連する免疫治療方法に関する。

Ｔ細胞と呼ばれる胸腺由来リンパ球は、ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫応答の重要な調節細 胞である。Ｔ細胞は、細胞障害作用および遅延壓過敏症（ＤＴＨ）に関し、Ｂリ ンパ球抗体産生に対してヘルパー機能を提供する。さらに、Ｔ細胞は、免疫調節 分子として機能する様々なリンホカインを産生ずる。たとえば、Ｔ細胞の細胞サ イクルの進行を促進できるインターロイキン−２（ＩＬ−２）　、腫瘍細胞の溶 解に関与することが示されているサイトカイン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α ）およびリンホトキシン（ＬＴ）、広範囲の抗ウィルスおよび抗腫瘍作事を示す インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、ならびに多系統造血因子として機能する 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）である。

たとえは癌、後天性免疫不全症候群（エイズ）および重大な感染症のような疾患 に対する現在の免疫療法的処置には、Ｔ細胞の増殖による免疫応答の増強を試み る、リンホカインの全身投与がある。しかしながら、投与されたリンホカインは 、感染または腫瘍の部位の近位の活性化Ｔ細胞に特異的に向けられるものではな いから、このような投与ては、Ｔ細胞仲介免疫応答の非特異的増強が生じる。さ らに、これらの分子の薬理学的用量の全身注入は、重大な毒性を招くことになる 。免疫不全または免疫抑制患者に対する現在の治療も、濃厚なγ−グロブリン製 剤またはＴ細胞リンホカインの全身注入を用いた、全身的副作用の欠点を伴う免 疫系の非特異的増強である。

免疫調節因子のｉｎ　ｖｉｖｏ分泌の刺激は、これまで、そのような治療法の効 果および／または機構、ならびに想定される利点を評価することがなかったため 、実現可能な方法とは考えられていなかった。

したがって、Ｔ細胞仲介免疫応答を増強し、しかもそれが標的細胞によって産生 される抗原により活性化されたＴＪＩ胞に特異的に向けられる免疫治療方法が提 供されるとすれば、望ましいことである。患者の自然の免疫特異性を利用できる 免疫治療方法を提供することはまた、望ましい。免疫抑制患者に使用できる免疫 治療方法の提供も望ましい。さらに、免疫調節分子の、重大な毒性作用を示す量 を投与することに一義的に依存するものではない免疫治療方法の提供は望ましい ことである。

また、Ｔ細胞集団の採取および再導入を行わないで、所望により直接投与か可能 な免疫治療方法の提供が望まれる。さらに、Ｔ細胞仲介免疫応答を増強させるの みでなく、その免疫抑制が有利である場合、たとえば移植患者およびショック症 状を起こ−している患者にはＴ細胞仲介免疫応答を抑制にも使用できる免疫治療 方法の提供が望まれる。

発明の要約 本発明の免疫治療方法は、活性化Ｔ細胞集団を有する患者に、ＣＤ２８　Ｔ細胞 表面分子の細胞外ドメインの少なくとも部分に対して結合特異性を有するリガン ドの治療有効量を投与することによるヒトＴ細胞リンホカインのｉｎ　ｖｉν０ レベルを選択的に調節する工程からなる。

本発明の免疫治療方法は、活性化Ｔ細胞のＣＤ２８分子の刺激の驚くべき、これ まで真価が認められていなかった作用を利用するものである。活性化Ｔ細胞とは 、Ｔ細胞受容体ＴＣＲ／ＣＤ３　Ｔ細胞表面複合体と外来性抗原またはその均等 物の相互作用によりその免疫応答が開始または「活性化」された細胞を意味する 。このような活性化は、Ｔ細胞の増殖と、リンホカイン産生のようなＴ細胞エフ ェクター機能の誘導を生しる。

ＣＤ２８細胞表面分子の抗−Ｃ０２８抗体による刺激は、Ｔ細胞をそのＴＣＲ／ ＣＤ３複合体の最大上刺激により活性化した場合のＴ細胞増殖とＩＬ−２リンホ カインレベルに、著しい増加を生じる。驚くへきことに、ＴＣＲ／ＣＤ３１１合 体の刺激を最大にした場合、抗−ＣＤ２８による共刺激は、ＩＬ−２リンホカイ ンのレベルを実質的に増大させるか、Ｔ細胞の増殖には抗−ＣＤ３単独で誘発さ れる以上の有意な増大は認められない。

さらに蔦くへきことには、ＩＬ−２レベルが存意に増大するのみでなく、前には ＣＤ２８刺激に伴わなかった全セットのリンホカインのレベルも上昇する。注目 すべきことは、ＣＤ　２８１１１１１激によるＴ細胞増殖もリンホカイン産生の 増大も、シクロスポリン糖質コルチコイドによる免疫抑制に抵抗性を示すことで ある。

すなわち、本発明の免疫治療方法は、ＣＤ２８Ｔ細胞表面分子を刺激することに よってＴ細胞仲介免疫応答を調節し、生体の感染または癌からの脱却を補助でき る方法を提供する。本発明の方法はまた、ＴＪＩ１１胞の増殖を増大させるのみ てなく、それが所望の場合には、現在ＣＤ２８刺激によって調節されることか知 られている全セットのＴ細胞リンホカインのレベルおよび産生を増大させて免疫 応答を増強させるために使用することかできる。

さらに、Ｔ細胞免疫応答の増大におけるＣＤ２８刺激の有効性は、Ｔ細胞活性化 およびある形でのＴＣＰ／ＣＤ３複合体の刺激を必要とすると思われることから 、本発明の免疫治療方法は、生体を特定の感染または癌から保護できる予め活性 化されたＴ細胞を選択的に刺激するために使用することか可能で、この場合、現 在、免疫機能の増強に用いられている方法の非特異的毒性を回避することかでき る。加えて、本発明の免疫治療方法は、免疫抑制状態下でもＴｍ胞仲介免疫機能 を増強させ、したがって免疫不全症たとえばエイズに罹患している患者にとくに 有利である。

本発明およびその利点は、図面および以下の特定例と合わせて、好ましい実施態 様の詳細な説明を読めば、さらに明瞭に理解てきるものと信じる。

図面の簡単な説明 図１は、ＣＤ２８刺激Ｔ細胞によるチミジン取り込みの増大がないことを例示す る棒グラフである。

図２は、抗−ＣＤ３刺激Ｔ細胞のＣＤ２８刺激によるウリジン取り込みの上昇を 例示する棒グラフである。

図３は、ＣＤ２８刺激により誘発されたＴ細胞増殖におけるシクロスポリン抵抗 性の増大を例示するグラフである。

図４は、抗−ＣＤ２８によって誘発されたＰＭＡまたは抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞 リンホ力イン発現に対するシクロスポリンの作用を例示するノーザンプロットで ある。

図５は、ＣＤ２８Ｍ激によるサルＴＩ胞のｉｎ　ｖｉｖｏ活性化のグラフである 。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明の免疫治療方法の好ましい実施態様においては、抗原活性化Ｔ細胞または その均等体のＴ細胞仲介免疫応答を増大させるために、ＣＤ２８分子を刺激する 。ＣＤ２８は約８０％の成熟Ｔ細胞の発現上に発現する４４キロダルトンの蛋白 質で、免疫グロブリン遺伝子に対して実質的なホモロジーを示す。Ｐｏｇｇｉ、 　Ａ、　ら：　Ｅｕｒ、　Ｊ。

びＡｒｕｆｆｏ　、　Ａ、ら：　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　、８５７３〜８５７７ 　（１９８７）参照。両記載を参考として本明細書に導入する。本発明の方法に よるＣＤ２８分子の細胞外ドメインと抗−ＣＤ２８抗体との結合は、Ｔ細胞増殖 の増大とリンホカインレベルの上昇を生じる。

特定例Ｉｌｌ　−ＩＶ　およびＶｌ−Ｖｌｌｌｌ、：おいてハ、Ｔ細胞の活性化 は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（これがＴ細胞免疫応答の特異性を仲介する） を、固定化抗−ＣＤ３モノクローナル弘体たとえばｍＡｂ　Ｇ１９−４で刺激す ることにより、またはＰＭＡおよびイオノマイシンで化学的に刺激することに達 成された。しかしながら、Ｔ細胞の活性化は、上記方法に代えて、ＣＤ３刺激が 直接関与しない経路、たとえばＣＤ２表面蛋白質の刺激によって行うこともでき ることを認識すべきである。

しかしながら、実際には、活性化Ｔ細胞集団は、完全な免疫抑制の場合を除いて 、疾患または感染により存在する異種抗原またはレベルが実質的に上昇した抗原 に応答して活性化されたＴ細胞を有する患者自身の免疫系によって与えられるこ とになる。「異種抗原」の語は本明細書では広い意味で使用され、正常時には生 体によって産生されない抗原、または癌の場合のように正常時にはそれを産生じ ている細胞によっては産生されない抗原を意味する。レベルが［実質的に上昇し た」抗原は、正常範囲を越え、この上昇によって生体に有害な作用を生じる可能 性があるレベルの抗原を意味する。

本発明の方法によれば、Ｃ２８分子自体の刺激は、０２８に対する結合特異性を 有するモノクローナル抗体またはその部分のような、リガンドの投与によって行 われる。適当な抗体には、広く分与されていて、請求により、Ｊｅｆｆｒｅｙ、 　Ａ、博士、Ｏｎｃｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　５ｅａｔｔｌｅ、　 ＷＡから入手できる（販売以外の目的で）ＩｇＧｇ−抗体であるｍＡｂ９．３、 またはｍＡｂ　ＫＯＬＴ−２が包含される。これらの抗体はいずれも、Ｌｅｕｋ ｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇｏ、第１２章、１４７〜１５６頁、Ｒｅ１ｎｈｅｒｔ ｚ、　Ｅ、　Ｌ。

ら編（１９８６）に記載されているように、ＣＤ２Ｂの細胞外ドメインに対して 結合特異性を有することが明らかにされている。ｍＡｂ９．３のＦ　（ａｂ’　 ）！フラグメントが、現時点では、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験で有害な副作用も報告さ れていないことから、好ましい。しかし、本発明の方法は、キメラ抗体ならびに 、ＣＤ２８表面分子を結合する非免疫グロブリン抗体の使用も意図するものであ ることを理解すべきである。

Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、ら：ＰＡＮＳ　（ＵＳＡ）　、８４　：　８５７３〜８５ ７７　（１９８７）によって配列決定が行われたＣＤ２８の細胞外ドメインは、 一般に、以下のアミノ酸配列からなるものである。

Ｍｅ　ｔ　ＬｅｕＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡ　ＩａＬｅｕＡｓｎＬｅｕＰｈｅ ＰｒｏＳｅｒ　Ｉ　Ｉ　ｅＧ　１　ｎＶａ　１ＴｈｒＧ　１ｙＡｓｎＬｙｓ　Ｉ 　１ｅＬｅｕＶａ　ＩＬｙｓＧ　Ｉ　ｎ　Ｓｅ　ｒＰ　ｒｏＭｅ　ｔ　ＬｅｕＶ ａ　ｌＡ　１ａＴｙｒＡａ　ｐＡｓ　ｎＡ　１ａｖａ　ＩＡｓｎＬｅｕＳｅｒＣ ｙ　５ＬｙｓＴｙ　ｒＳｅｒＴｙ　ｒＡｓｎＬｅｕＰｈｅＳｅ　ｒＡｒｇＧ　Ｉ 　ｕＰｈｅＡｒｇＡ　１ａｓｅｒＬｅｕ）ｌ　ｉ　ｓ　ＬｙｓＧ　Ｉ　ｙＬｅｕ Ａｓ　ｐＳｅｒＡ　１ａｖａ　ＩＧ　１ｕＶａ　ＩＣｙｓＶａ　ｌＶａ　１Ｔｙ ｒＧ　１ｙＡｓｎＴ　ｙｒＳｅｒＧ　ｌｎＧ　ＩｎＬｅｕＧ　Ｉ　ｎＶａ　１Ｔ ｙｒｓｅｒＬｙｓ　Ｔｈ　ｒＧ　Ｉ　ｙＰｈｅＡｓｎＣｙｓＡｓ　ｐＧ　１ｙＬ ｙｓＬｅｕＧ　Ｉ　ｙＡｓｎＧ　Ｉ　ｕｓｅｒＶａ　ＩＴｈｒＰｈｅＴｙ　ｒ　 ＬｅｕＧ　１ｎＡｓ　ｎ　ＬｅｕＴｙ　ｒＶａ　１ＡｓｎＧ　１ｎＴｈｒＡｓ　 ｐ　Ｉ　ＩｅＴｙｒＰｈｅＣｙｓＬｙｓ　ｌ　ｌｅＧ　１ｕＶａ　１Ｍｅ　ｔＴ ｙｒＰｒｏＰｒ。

ＰｒｏＴｙ　ｒＬｅｕＡｓ　ｐＡｓｎＧ　Ｉ　ｕＬｙｓＳｅｒＡｓｎＧ　Ｉ　ｙ Ｔｈｒ　Ｉ　ｌｅ　［ＩｅＨｉ　ｓＶａ　ＩＬｙｓＧ　Ｉ　ｙＬｙ　ｓＨｉ　ｓ 　ＬｅｕＣｙｓＰｒｏＳｅｒＰｒｏＬｅｕＰｈｅＰｒｏＧ　ｌ　ｙＰｒｏＳｅ　 ｒＬｙｓＰｒ。

本明細書および請求の範囲において以下に用いられる［細胞外ドメイン」の語は 、上に掲げたアミノ酸配列、その任意の実質的な部分、またはそれと実質的なホ モロジーを有する任意の配列を意味する。

特定例１１１〜Ｖのデータから明らかなように、ＣＤ２８刺激によるＴ細胞仲介 免疫応答の実質的な増大は、活性化Ｔ細胞に特異的と考えられる。このような特 異性は、臨床的にとくに重要であり、本発明の免疫治療方法の重要な利点のひと つである。抗−ＣＤ２８抗体たとえばｍＡｂ９．３の投与は、すでに活性化され 免疫応答に従事しているＴ細胞または活性化の過程にあるＴ細胞の応答を特異的 に増強させる。しかしながら、本発明のＣＤ２８特異的リガンドのＣＤ２８受容 体への結合後にＴ細胞が活性化された場合でも、ＣＤ２８刺激は有効であること を評価すべきである。すなわち、腫瘍部位もしくは感染部位またはそれらの付近 にあるＴ細胞は、産生された抗原によって活性化されていてもまたそれらの部位 に存在していても、ＣＤ２８刺激によって選択的に［追加免疫」されることにな る。

以上述べたように、また特定例によってさらに例示されるように、活性化Ｔ細胞 に対するＣＤ２８刺激の相剰作用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が最大に刺激されて いない場合には、Ｔ細胞増殖の増大のＩＬ−２リンホカインレベルの上昇を生じ る。しかしながら、ＴＣＲ／ＣＤ３刺激が最大である場合には、Ｔ細胞の増殖は 著しい増大を示さないものの、ある種のリンホカインのレベルは実質的に上昇し 、これらのリンホカインの細胞産生の増加を示している。すなわち、自然の最大 ＴＣＲ／ＣＤ３刺激またはそれと同等の刺激ならびに疾患または感染によるＴ細 胞のｉｎ　ｖｉｖｏ活性化を受けている患者では、本発明の方法によるＣＤ２８ を刺激する抗−ＣＤ２８抗体の投与は、リンホカイン産生の実質的な上昇を生じ ることになる。

とくに特定例ＩＩＩに示されるように、本発明の方法のＣＤ２８刺激剤の投与に よって達成されるリンホカイン産生の増加は、驚くべきことに、全セットのリン ホカインの産生増加を生じ、これはこれらのリンホカインがある形のＣＤ２８調 節下にあることを示している。ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＩＮＦ−γおよび ＧＭ−ＣＳ　Ｆを包含するこのセットのリンホカインは、Ｍｏｓｍａｎｎ、　Ｔ 。

Ｒ１ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、８　：　２２３〜２２７　（１９８７ ）によって記載されたマウスに存在する７、１細胞リンホカインにかなり類似し ている。この所見は、ＣＤ２８刺激によってヒトＩＬ−４の産生は増大せず（デ ータは示していない）、これはマウスのＴＨ１細胞によっても産生されないリン ホカインであることでも支持される。

したがって、言及の便宜上、ＣＤ２８刺激によって影響されるヒトリンホカイン 群を以下、ヒトＴ、ｌリンホカインと呼ぶことにする。しかしなから、「ヒト７ ．１リンホカイン」の語は、上に掲げたリンホカインに限定されるものではなく 、ＣＩ）２８Ｔ細胞表面分子の結合または刺激によってその産生か影響または調 節されるすべてのヒトリンホカインを包含することを意味するものである。すな オ〕ち、本発明の免疫治療方法の抗−ＣＤ２８抗体の投与によって、全セットの ヒトリンホカインの産生およびレベルを有意に上昇させることかできる。

本発明の免疫治療方法はまた、免疫抑制患者、たとえばエイズに罹患している患 者の、Ｔ細胞仲介免疫応答を強めるために使用することかできる。特定例ｖ１〜 ｖｌ目に示すように、ＣＤ２８調節リンホカインのレベルおよび産生の増大は、 たとえばシクロスポリンまたはデキサメサゾンによって惹起されるような免疫抑 制の存在下でさえも、起こり続ける。すなわち、ＣＤ２８刺激剤たとえばｍＡｂ ９．３の投与は、免疫抑制患者を処置して１ｎｖｉｖｏリンホカインレベルを上 昇させるために使用できる。

さらに、敗血症性ショックおよび腫瘍誘発悪液質を包含する様々な症状にはＣＤ ２８経路の活性化およびリンホカインの多分毒性レベルまでの産生増大か関与し ている場合が考えられる。したがって、たとえば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント またはＣＤ２８分子に対する天然リガンドとＣＤ２８を結合させることによるＣ Ｄ２８経路の下方調整は、それらの臨床症状に対する免疫療法も提供することが できる。

抗−ＣＤ２８抗体の投与か、活性化Ｔ細胞部位におけるリンホカインレベルの実 質的な上昇による免疫治療方法としての可能性を真剣に考慮されたことはこれま でになかった。たとえばｍＡｂ９．３の付加はＴ細胞の増殖のある程度の増強に ついてのろ考えられていて、ヒトＴ）Ｉ　１リンホカイン産生の実質的な誘発に ついては顧みられることはなかったのである。

ＣＤ２８結合がＴ細胞仲介免疫応答を調節する特定の機構に拘泥するものではな いが、刺激の機構に対するモデルは、特定例Ｖ［１１にその一部が示されている 実験データによって想定され、支持されてきた。

多数のリンホカイン遺伝子は、構成的に発現されたハウスキーピング遺伝子から のｍＲＮＡよりも細胞°質中で急速な分解を受けることは以前から明らかにされ てきたが、これから、これらの誘導性ｍ　ＲＮ　Ａの不安定性が遺伝子発現の急 速な調節を可能にするように選択されるとの仮説が導かれている。本明細書に記 載され、請求されているＣＤ２８調節の機構は、上述のヒトＴＭＩリンホカイン のセットの急速に分解するｍＲＮＡの安定化に関連するものと考えられる。今日 まで、真核細胞系では、細胞表面活性化経路がｍ　ＲＮ　Ａの分解に特異的変化 を誘導して遺伝子発現を変化させうろことを示す以外の機構は述べられていない ように思われる。

特定例１■に示すように、ＣＤ２８とＣＤ３の共刺激はヒトＴ、ｌリンホカイン のｍＲＮＡの増加を生じた。これは、すへてのＴ細胞活性化関連遺伝子の定常状 態におけるｍ　ＲＮ　Ａ発現の全般的増加の結果てはなかった。この増加は均衡 がとれたものではなく、したかって、培養液中の細胞の増殖率の増加によっては 説明できなかった。

これらのデータは、本明細書には詳細を示さなかった他の研究とともに、活性化 Ｔ細胞のＣＤ２８表面分子の活性化は、リンホカインｍＲＮＡを特異的に安定化 する機能を有することを示している。ｍＲＮＡの安定性の増大、すなわちその分 解の遅延は、ｍＲＮＡの翻訳の増加を生じ、その結果、細胞あたりのリンホカイ ン産生の増加を招くことになる。

したかって、本発明の原理によれば、ＣＤ２８分子に対する結合特異性をもつリ ガンドたとえばｍＡｂ９．３は、ＣＤ２８経路を刺激するためのｉｎ　ｖｉｖｏ 投与に適当な生物学的に適合性のある形で投与される。ｒＣＤ２８の刺激」とは 、Ｔ細胞の増殖もしくはヒトＴ。ｌリンホカインの産生または両者の増大を生し るＣＤ２８分子の刺激を意味する。ｒｉｎ　ｖｉｖｏ投与に適当な生物学的に適 合性のある形）とは、リガンドの治療効果が、それに毒性があってもその毒性作 用を上回るようなリガンドの投与形態を意味する。ＣＤ２８リガンドの投与は任 意の適当な薬理学的形態て行うことがてきる。たとえば、リガンド溶液を静脈内 注射することができるが、これに限定されるものではない。

リンホカイン産生のＣＤ２８調節のモデルはリンホカインレベルの刺激および上 昇に関して説明されるが、本発明の原理によれば、ＣＤ２８結合に対し適当なリ ガンドを選択することにより、ＣＤ２８経路の下方調節または抑制も達成できる ことを理解すべきである。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）９．３、ＣＤ２８分子の細胞外ドメインに結合す るｒｇＧｔ、モノクローナル抗体は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０　： 　２４７〜２６０　（１９８０）に記載されているように、Ｈａｎｓｅｎらによ って最初に誘導されたハイブリッド細胞系によって産生された。

高力価のモノクローナル抗体９．３を含有する腹水は、予めＰｒ１ｓｔａｎｅ　 （Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅｌｌ）０ ．５ｍｌを腹腔内に免疫したＢａ１ｂ／ＣｘＣ５７ＢＬ／６Ｆ、マウスに、５〜 ｌ０ＸＩＯ＠ハイブリツド細胞を腹腔内接種して製造した。モノクローナル抗体 ９，３は、腹水から、Ｈａｒｄｙ、　Ｒ，、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３章（１９８６）の記載に従ってス タヒロコツカスプロテイン−Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で精製した。

機能的検定に使用する前に、精製されたｍＡｂ９．３をリン酸緩衝食塩溶液（Ｋ （１０，２ｇ／Ｉ！ｄＨｔ　Ｏ；ＫＨｔ　ＰＯａ　０．２ｇ／Ａ’　ｄＨｔ　Ｏ ；ＮａＣ１８，Ｏｇ／Ａ’　ｄＨｘ　Ｏ；Ｎａｇ　ＨＰＯ４”７８ｔ　Ｏ２，１ ６ｇ／１２　ｄＨｔ　Ｏ）に対して広範囲に透析し、ついで０．２２立方ミクロ ン滅菌フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ、　Ｇｅ１ｉ＋ａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、 　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｌ）を通して濾過した。ｍＡｂ９．３プレバレージ ヨンを２０℃、１００．０００Ｘｇで４５分間遠心分離して凝集物を除去した。

得られた精製ｍＡｂ９．３をリン酸緩衝食塩溶液に再懸濁し、０Ｄ２８０分析で 測定して最終濃度２００μｇ／ｍｌとし、使用時まで４°Ｃに保存した。

年齢２■〜３１歳の健康ドナーの血液を低速白血球分離に付してバッフイーコー トを得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）約２．５ＸｌＯ”個を、バッフイーコート から、リンパ球分離メジウム（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ。

Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ、　ＭＤ）密度勾配遠心分離によって単離した。゛Ｔ子細 胞ＣＤ２８“サブセットを次に、Ｙａｍａｄａら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、ｌ　５　：１１６４〜１６８８　（１９８５）に記載されているように ＣＤＩＩおよびＣＤ２８表面抗原の相反する非重複分布を利用して、免疫吸収を 用いる陰性選択によってＰＢＬから単離した。ＰＢＬを、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７，４）（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ　ｌ ５ｌａｎｄ、ＮＹ）、５ｒｎＭ　ＥＤＴＡ（Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）および５％熱活性化ヒトＡＢ血清（ Ｐｅｌ　−Ｆｒｅｅｚｅ、　Ｂｒｏｗｎ　Ｄｅｅｒ。

ＩＩ）含有ＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　 Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中に、約２０×１０＠／ｍｌになるように 懸濁した。細胞を、ローチーター上４°Ｃで、飽和量のモノクローナル抗体６０ ．１（抗１９８６参照）；１Ｆ５（抗−ＣＤ　２０　）　（Ｃ１ａｒｋ、　Ｅ。

Ａ、らＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、８２　：　１７６６〜１７７０．１９８５参照） ；ＦＣ−２（抗−ＣＤ　ｌ　６）　（Ｊｕｎｅ、　Ｃ。

Ｈｏら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７７　：　ｌ　２２４〜ｌ　２３２ ．１９８６参照）；および抗−ＣＤ１４とともに、２０分間インキュベートした 。この抗体混合物はすべてのＢ細胞、単球、大顆粒球およびＣＤ２８Ｔ細胞を、 マウス免疫グロブリンで被覆した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して非結合抗体を除 去し、ついでヤギ抗−マウス免疫グロブリン被覆磁性粒子（Ｄｙｎａｌ　Ｉｎｃ 、、　Ｆｏｒｔ　Ｌｅｅ、　ＮＪ）の細胞あたり３磁性粒子の割合とともに４℃ で１時間インキュベートした。磁性粒子に結合した抗体被覆細胞を次に、Ｌｅａ 、　Ｔ、ら、５ｃａｎ、　Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、　２２　：　２０７〜２１６ （１９８５）の記載に従って磁性分離に付し、取り除いた。通常、約７００Ｘ１ ０＠のＣＤ２８”Ｔ細胞が回収された。

細胞の精製は流動細胞計測法および組織化学によって定常的にモニタリングされ た。流動細胞計測法はＬｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ｊ、　Ａ、ら、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ ｅ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ。

１１９〜１２９頁、Ｈｅ１ｓｅ、　Ｂ、編（１９８４）の記載に従って行われた 。略述すると、ＣＤ２８”Ｔ細胞は、フルオレセイン　イソチオシアネート（Ｆ ＩＴＣ）−接合抗−ＣＤ２　ｍＡｂ　０ＫＴＩ　ｌ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ、　Ｈｉ ａｌｅａｈ。

ＰＬ）およびＦ　ＩＴＣ−接合抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３により、Ｇｏｄｉｎ ｇ、　Ｊ、　Ｗ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＰｒｉｎｃ ｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　２　ａ　ｏ頁、Ｇｏｌｄｉｎｇ、　 Ｊ、　Ｗ、ｌｌ（１９８３）に記載されたようにして染色された。ＣＤ２８＋Ｔ 細胞は、非結合、アイソタイプ合致、ＦＩＴＣ−標識対照抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ 、　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）に比較した場合、ＦＩＴＣ−接合モノクローナル 抗体０ＫＴＩＩで９９％以上か陽性、Ｆ　ＩＴＣ−接合モノクローナル抗体９． ３で９９％以上が陽性であった。残りの単球は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から入手した市販のキットを用いて 非特異的エステラーゼに対する染色によって定量したが、この研究に用いた全細 胞集団で０．１％未満てあった。生存度は、Ｍｉｓｈｅｌｌ、　Ｂ、　Ｂ、ら、 ５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｉ　６ 〜ｌ　７頁（１９８０）の記載に従いトリバンブルー排除試験で測定し、約９８ ％であった。

）Ｔ、Ｉリンホカインの細胞産生の増大ＣＤ２８”Ｔ細胞は、様々な組合せの刺 激剤の存在下に、約ｌＸｌ０″細胞／ウエルで培養した。刺激剤は、ホルボール ミリステートアセテート（ＰＭＡ）（ＬＣＳｅｒｖｏｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ、　Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ）　３ｎｇ／ｉｆ　濃度：抗−ＣＤ２８　ｍＡ ｂ９．３、ｌ　００　ｎｇ／ｍｌ　；　Ｇｅｐｐｅｒｔｌ〜２３３６　（１９８ ５）に以前記載されたようにプラスチック組織培養プレートの表面に吸着させて 固定化した抗−ＣＤ３　ｍＡｂ　Ｇ１９−４．２００　ｎｇ／ｍｌ　；イオノマ イシン（Ｉｏｎｏ）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｃａｌｂｉｏｃ ｈｅｍ。

ＣＡ）　１００　ｎｇ／ｍｌとした。培養上清を２４時間目に収穫し、系列希釈 についてヒトＴ、Ｉリンホカインを検定した。

とくに、ＩＬ−２を、Ｇ１１ｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２６８　：　１５４〜１ ５６　（１９７７）により以前に記載されたバイオアッセイを用いて検定した。

１単位（Ｕ）は７×１０’　ＣＴＬＬ−２（ヒト細胞障害性子細胞系）細胞の半 最大増殖を２４時間の培養で誘導するのに必要な１Ｌ−２の量と定義された。別 個の実験では、上述の各培養条件について、ＩＬ−２の相対レベルを、市販品を 入手できるＥＬＩＳＡ検定（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、　 ＭＡ　）を用いて、独立に確認した。ＴＮＦ−α／ＬＴレベルは、４（１９８８ ）に以前記載された半自動化し９２９線維芽細胞溶解検定を用いて測定した。Ｔ ＮＦ−α／ＬＴの単位はＴ　Ｎ　Ｆ　−ａ　（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｒｐ、、　 Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）に対する内部標準を用いて定義した。ＴＮＦ−αおよ びＬＴ両者の独立した存在は、各サイトカインに特異的なモノクローナル抗体か 固定化抗−ＣＤ３　ｍＡｂ　ＧＩ９−４おＪ：び抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３で 共刺激された細胞からの−Ｉ−清によって仲介される細胞溶解を部分阻止する能 力によっ工確認された。ＩＦＮ−γは、市販のキラｌ−（Ｃｅｎ？ｎＣｏｒ、　 Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ　ｉを用いラジオイムノアッセイで測定された。Ｉ　Ｆ Ｎ−γの９位は、試験キットに与えられた　＋２６１−標識ヒ１〜ＪＦＮ−γを 用い、標準曲線から決定された。ＧＭ−Ｃ３Ｆは、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ依存性細胞 系ＡＭ１．、−１９３の増殖の刺激により、しａｎｇｅ　ら、Ｂｌｏｏｄ、７０ 　：１９２〜Ｉ　９９　（１９８７）の記載に従い、ＴＮＦ−αおよびＬＴに対 する中和モノクローナル抗体の存在下に検出された。１０ｎｇ／ｉ＋ｌの精製Ｇ Ｍ−ＣＳ　Ｆ　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃａｍｂｒｉ＋Ｊ ｇｅ、　ＭＡ　）によって誘導される’Ｈ−チミジンの取り込みを＋００Ｕと定 義した。細胞の別個のサンプルをｉｌＪ激後４８時間に回収し、Ｔｈｏｍｐｓｏ ｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４　：　３６３−３６６（＋９８５）の以ｉ？ｒの記 載に従い、ヨウ化ブロピシウｊ、染色および流動細胞計測法により、細胞ザイク ルの後１ｇ１　（Ｓ＋Ｇ、　＋Ｍ、）における細胞の百分率を検定した。

表Ｉに示すように、ＣＤＵや１１激Ｔ細胞のＣＤ２８刺激は、本明細書において はヒトＴ、Ｉリンホカインと呼んだＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ〜αおよびＧ Ｍ−Ｃ３Ｆの細胞内産生の著しい増加を生じた。

（ＣＤ２　Ｂ−）Ｔ細胞の苛酷な枯渇の結果である。各実験において、細胞はフ ルオレセイン接合抗−ＣＤ２ｍＡｂＯＫＴＩ＋およびフルオレセイン接合抗−Ｃ Ｄ２８　ｍＡｂ９．３で染色し、それぞれ９９％以上および９８％以上表面陽性 であることが示された。

代表的な実験を図１および２に例示する。図１および２から明らかなように、抗 −ＣＤ２８はそれ単独では、ウリジンまたはチミジン取り込みに対して有意な作 用を示さず、また、固定化抗−ＣＤ３　ｍＡｂ　Ｇ１９−４によって誘導される 増殖にも、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン （１ｏｎｏ）が関与した化学的に誘導されるＴ細胞増殖にも増強作用は示さなか った。しかしなから、図２に示すように、抗−ＣＤ２８は両セットの細胞のウリ ジン取り込みを有意に増大させたのである。これに反し、抗−ＣＤ２　ｍＡｂＯ ＫＴＩＩおよび抗−ＣＤ４５　ｍＡｂ９．４を含めた他のモノクローナル抗体は 、抗−ＣＤ３刺激細胞のウリジン取り込みには有意な影響を与えなかった。これ は、抗−ＣＤ２および抗−ＣＤ７モノクローナル抗体がいずれも抗−ＣＤ３刺激 細胞の増殖を有意に増大させたことから、これらの抗体か細胞に対する作用を欠 くことによるものではなかった。別の実験では、他のＴ細胞表面抗原（ＣＤ４． ＣＤ６．ＣＤ７またはＣＤ８）に対するアイソタイプ合致ｍＡｂの結合か、抗− ＣＤ２８で認められた作用を模倣することはなかった。

これらのデータは、活性化Ｔ細胞のＣＤ２８による刺激は独特の表現型を有し、 Ｔ細胞の増殖を直接増大させることなく、定常状態のＴ細胞ＲＮＡへの放射性マ ーカーの取り込み速度を直接増大させるらしいことを確証させるものである。

インの細胞産生には、それらか前もって抗原活性化またはそれと均等な刺激を受 けていない限り、有意を作用を及ぼさないものと考えられた。しかしながら、９ ．３ｍＡｂによるＣＤ２８結合は、抗−ＴＣＲ／ＣＤ３活性化Ｔ細胞かヒトＴ、 ｔＷリンホカインの産生を持続する能力を増強した。この作用を生理学的環境で 試験するため、ｅｘ　ｖｉν０の全血モデルにおいてＴリンパ球の活性化を検討 した。

事実を知らせた上での同意を得た正常被験者から通常の無菌操作によって、５０ 〜ｌ００ｍ１の静脈血を採取した。血液は、防腐剤を含まないヘパリン（Ｓｐｅ ｃｔｒｕｍ。

Ｇａｒｄｅｎｉａ、　ＣＡ）　２５　Ｕ／ｍｌでヘパリン化して、凝血を防止し た。各１０ｍ１のサンプルを１５ｍ１のポリエチレンチューブに取って振動台上 に置き、サンプルの流動と通気を保持した。

リンホカイン遺伝子発現の誘導に対するＣＤ２８刺激の有効性を検定するために は、モデルとしてＴＮＦ−α分子の産生を選択した。この蛋白質の全血中での半 減期が著しく短いからである（約１５分）。上述のようにして単離された全血１ ０ｍ１を、濃度ｌμｇ／ｍｌの可溶性抗−ＣＤ３　ｍＡｂ　ＧＩ９−４もしくは 濃度ｌμｇ／ｍｌの抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３またはその２種の抗体の組合せ とともにインキュベートした。血漿について、１および４時間口に、特定例ＩＩ ＋に記載したようにＴＮＦ−αを検定した。このような実験の一例を表１に示す 。

結果は、ＣＤ３の最大刺激およびＣＤ２８の共刺激によってＴＮＦ−αの産生が 有意に増大することを示している。

０時間　１時間　４時間 抗−ＣＤ３　４．５’　６５．０　２．１抗−ＣＤ２８　４．５’　１．６　３ ．３抗−ＣＤａ＋　抗−ＣＤ２８　４．５’　３５．０　７５．０°静脈血サン プルにモノクローナル抗体を添加する前に測定した値 使用したプロトコールおよびここに記載した結果は、Ｊｕｎｅ、Ｃ，Ｈ，ら、Ｍ ｏ１．　Ｃ６１１Ｂｉｏｌ、、７　：　４４７２〜４４８１（１９８７）に記載 されている。この記載は参考として本明細書に導入する。

Ｊｕｌｉｕｓ　ら、　Ｆｕｒ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　３　：　６　４　５ 　〜６　４　９（１９７３）の記載に従ってナイロンウール濾過で濃縮したＴ細 胞、約５ＸＩＯ’／ウエルを、以下の組合せ：抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３　（ １００ｎｇ／ｍｌ）とＰＭＡ（Ｉ　ｎｇ／ｍｌ）　；または固定化抗−ＣＤ３　 ｍＡｂ　ＧＧ１９−４（２００ｎ／ウエル）：またはＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ ）の刺激剤の存在下にインキュベートした。上記組合せにはまた、Ｗｉｅｓｉｎ ｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ　５６　：４５４〜４６３（１９７９）の 記載に従い、エタノール−Ｔｗｅｅｎ　８０に溶解したシクロスポリン（Ｃ３Ｐ ）（Ｓａｎｄｏｚ、　Ｈａｎｏｖｅｒ、　ＮＪ　）を、力価を４倍ずつ増量して （２５ｎｇ／ｍｌ〜１．６μｇ／ｍｌ）添加した。

３Ｈ−チミジンの取り込みを培養３日に測定し、８個の独立した実験をまとめた 結果を図３に示す。記号をはみ出した線は算術平均±ｌ標準偏差を示している。

培地のみて培養した細胞の増殖は１８５±４０ｃｐｍてあった。

シクロスポリン希釈液単独は細胞の増殖に影響を与えなかった（データは示して いない）。図３から明らかなように、ＣＤ２８誘発Ｔ細胞増殖の場合には、ＰＭ Ａ投与によって達成されるほぼ完全なンクロスボリン耐性を示した。

以下の表３は、平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏ５ｔａｒ、　 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ　）巾約５×１０’細胞／ウェルで、以下の条件： 固定化ｍＡｂＧ１．９−４；または固定化ｍＡｂ　Ｇ１９−４とｍＡｂ９、　３ 　（＋　００μｇ／ｍｌ）　；または固定化ｍＡｂ　Ｇ１９−４とＰＭＡ　（Ｉ 　ｎｇ／ｍｌ）　；またはｍＡｂ９．３　（１００μｇ／ｍｌ）とＰ　ＭＡ　（ ｉ　ｎｇ／ｍｌ）において培養したＣＤ２８″″Ｔ細胞のＣＤ３誘導増殖に対す るシクロスポリン養液中に加えた。３Ｈ−チミジンの取り込みは上述のように培 養３日に測定した。増殖のパーセント阻害は、培地のみまたはシクロスポリン１ ．２μｇ／ｍｌの勇反−σ璽養した　ＣＤ２８”Ｔ細胞間で計算した。シクロス ポリンを添加しないで培養したＣＤ２８”Ｔｍ胞にはシクロスポリン希釈液を加 えた。培地、ＰＭＡ、モノクローナル抗体９．３のみて培養した細胞の１Ｈ−チ ミジンの取り込みはｌ　５０　ｃｐｍ未満てあった。表３に示すように、ＣＤ３ とＣＤ２８の共刺激はＴ細胞増殖のシクロスポリンに対する抵抗性の著しい増大 を生じ、ＰＭＡ存在下におけるＣＤ２８の刺激は、Ｔ細胞増殖のツクロスボリン 抑制を完全に消失させた。固定化抗−ＣＤ３と共に　ＣＤ２８を用いて刺激する と、免疫抑制剤デキサメサゾンによるＴ細胞の増殖抑制にも抵抗性を生じた。

特定例ｖ１［ シクロスポリンの存在下におけるヒｌ−Ｔ、ｌリンホカインの分泌 特定例【【１に記載したように、ＣＤ２８”Ｔ細胞を様様な刺激剤の存在下に培 養した。培養上清を２４時間時に収穫し、前述のように、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α ／ＬＴ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−Ｃ３Ｆについて系列希釈検定を行った。刺激４ ８時間後に、細胞の個々のサンプルを回収し、細胞サイクルの後期（Ｓ十Ｇｔ　 ＋Ｍ）にある細胞の百分率を調へた。

試験プロトコールにシクロスポリン０，６μｇ／ｍＨ加えた場合には、表４（比 較のために特定例Ｉ１１のデータも包含）に示すように、ｍＡｂ９．３とＰＭＡ 、または固定化ｍＡｂ　Ｇ＋９−４とｍＡｔ）９．３；またはＰＭＡとイオノマ イシンとｍＡｂ９．３で刺激した培養液中シクロスポリンの存在下に、ＣＤ２８ １Ｔ細胞はヒトＴ□　１リンホカインを分泌することか見出された。固定化ｍＡ ｂ　Ｇ１９−４；またはＰＭＡとイオノマイシンによって誘導されたヒトＴ、＋ リンホカインの産生は、しかしなから、シクロスポリンの存在下には完全に抑制 された。

特定例Ｖｌｌｌ ＣＤ２８刺激がシクロスポリン抵抗性ヒトＴ、Ｉリンホカインの遺伝子発現なら びに分泌を招来するか否かをさらに検討するため、様々な刺激剤による刺激後の ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの誘導をシクロス ポリンが抑制する能力について試験した。とくに、ＣＤ２８”Ｔ細胞、２ｘｌＯ ’／ｍｌを５％ＦＣ３（ＭＥＤ）と共に完全ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒ ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ　）中で培養した。ＣＤ２８１Ｔ細胞の各サンプ ルをシクロスポリンの存在下または非存在下に、Ｐ　Ｍ　Ａ　（３ｎｇ／ｍｌ） と抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ９．３　（ｌｎｇ／ｍｌ）；または固定化抗−ＣＤ３　 ｍＡｂ　Ｇ１９−４　（ｌμｇ／ウェル）；または固定化ｍＡｂ　Ｇ１９−４　 （ｌμｇ／ウェル）とｍＡｂ９．３（ｌ　ｏｇ／ｍｌ）と共に６時間インキュベ ートした。ＣＤ２８”Ｔ細胞を収穫し、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３ １４　：　３６３〜３６６　（１９８５）に以前に記載されているようにして、 全細胞ＲＮＡを単離し、リポソームＲＮＡに対して同等化した。

い、順次、２２Ｐ標識した、ニックトランスレーション遺伝子特異的プローブと ハイブリダイズさせた。ＩＬ−２プローブは、Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈ，ら、Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、７　：４４７２〜４４８１　（１９８７）記載の １．０ｋｂＰｓｔ　ｌ　ｃＤＮＡフラグメント、ＩＦＮ−７ブローブは、Ｙｏｕ ｎｇら、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、Ｉ３６：４７００〜４７０３（１９８６）記載 の１．Ｏｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　ｃＤＮＡフラグメントとした。ＧＭ−Ｃ３Ｆプロー ブはＷｏｎｇら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８：８１０〜８１５　（１９８５）記載 の７００塩基対ＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　ｃＤＮＡフ１．８５　ｋｂ　Ｅ ｃｏＲＩ　ｃＤＮＡフラグメント、ＩＬ４プローブはＹｏｋｏｔａら、ＰＮＡＳ 　（ＵＳＡ）　、８３　：５８９４〜５８９８　（１９８６）記載の０　、　９ 　ｋｂｘｈｏｌｃＤＮＡフラグメント、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）プローブはＬ ｉｎｄｓｔｅｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、８　：　３８２０〜３ ８２６　（１９８８）記載のＨＬＡ−８７遺伝子からの１．　４　ｋｂ　Ｐｓｔ 　Ｉ　フラグメントとした。ＴＮＦ−（１９８５）記載のように、遺伝子特異的 ３０ヌクレオチドオリゴマーとして合成した。ハイブリダイゼーション後、プロ ットを洗浄し、−７０℃でオートラジオグラフィーに露出した。バンドの濃度の 定量化は、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ８８）の記載に従い、デンシトメトリーで行った。

図４のノーザンプロットに示すように、ｍＡｂ９．３とＰＭＡおよびｍＡｂ９． ３とｍＡｂ　Ｇ１９−４による刺激は、シクロスポリンに対して抵抗性を示すヒ ト７．１リンホカイン遺伝子の発現を生じた。これに反し、ｍＡｂ　Ｇ１９−４ 単独による刺激は、シクロスポリンの存在下に完全に抑制された。

ｍＡｂ９．３のＦ（ａｂ’）＊フラグメントを、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ　、　Ｊ、 　Ａ、ら、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、　１３５　：　２３３１〜２３３６　（１９ ８５）の記載に従って製造した。精製された、エンドトキシンを含まないＦ　（ ａｂ’　）２フラ日２および７に血液５ｍｌを採取し、試験した。

サルの血液からの末梢血リンパ球を特定例１１の記載と同様に、密度勾配遠心分 離によって単離した。ＰＭＡ（ｌｎｇ／ｍｌ）に応答した末梢血液単球細胞の増 殖を処置動物と対照動物（Ｆ　（ａｂ’　）ｔフラグメント処置しない）につい て、特定例ＩＶの記載と同様に、三重に試験した。増殖は３日間の実験の最後の ６時間における２Ｈ−チミジンの取り込みによって測定し、結果を図５に示す。

３回の培養の平均を示す。平均の標準誤差はいずれの点においても２０％未満で あった。図５に示すように、Ｆ　（ａｂ’　）　雪ｍＡｂ　９．３フラグメント によるＣＤ２８の刺激は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＴ細胞の増殖を増大させた。

上述の開示には、ある範囲の修飾、改変または置換が意図されているものである ことを理解すべきである。したがって、以下の請求の範囲は、広く、本発明の精 神および範囲に合致するように解釈するのが適切である。

ＪＨ−ｊ＝ジ：／　（ｃｐｍ　ｘ　１Ｏ−ｒ）ニゴ＝匡＝＝・工・ １Ｈ−ウＶジン６ρｍ　ｘ　７σ−Ｊノニゴ＝匡＝；、己。

ニゴ＝匡＝＝・二・ 二＝＝匡＝＝・二・ 補正書の翻訳文提出書　（曲法組８４条＋７）８）平成　３　年　５　月　２２ 　Ｅ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．活性化Ｔ細胞集団を有する患者に、ＣＤ２８の細胞外ドメインの少なくとも 一部分に対して結合特異性を有するリガンドの治療有効量を投与することにより 、ヒトＴ細胞リンホカイノのｉｎｖｉｖｏレベルを選択的に調節する工程からな る免疫治療方法。
2. ２．調節工程はさらにＣＤ２８経路に対して刺激作用を有するリガンドを選択す る工程からなる「請求項１」記載の方法。
3. ３．調節工程はさらにＣＤ２８経路に対して抑制作用を有するリガンドを選択す る工程からなる「請求項１」記載の方法。
4. ４．Ｔ細胞リンホカインは、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＩＦＮ−７およびＧ Ｍ−ＣＳＦからなる群より選ばれる「請求項１」記載の方法。
5. ５．リガンドは抗−ＣＤ２８抗体の少なくとも一部分からなる「請求項１」記載 の方法。
6. ６．さらに抗−ＣＤ２８抗体を単離する工程からなる「請求項５」記載の方法。
7. ７．抗−ＣＤ２８抗体は、ＰＭＡと共に使用するとｉｎｖｉｔｒｏでシクロスポ リン処理Ｔ細胞の増殖を誘発する特性をもつ抗体である「請求項５」記載の方法 。
8. ８．リガンドはモノクローナル抗体９．３のＦ（ａｂ′）２フラグメントからな る「請求項５」記載の方法。
9. ９．リガンドはモノクローナル抗体９．３のＣＤ２８結合特性を有するモノクロ ーナル抗体からなる「請求項５」記載の方法。
10. １０．リガンドはＫｏｌｔ−２のＣＤ２８結合特性を有するモノクローナル抗体 からなる「請求項５」記載の方法。
11. １１．リガンドはキメラ抗体である「請求項５」記載の方法。
12. １２．抗原へのｉｎｖｉｖｏ曝露によって感作され、それよってＴ細胞の集団が 活性化を受けている患者の、その抗原に特異的なＴ細胞仲介免疫応答を選択に増 強させる免疫治療方法において、 （ａ）ＣＤ２８分子の細胞外ドメインに結合できるＣＤ２８刺激剤を選択し、 （ｂ）その刺激剤をｉｎｖｉｖｏ投与に適した生物学的に適合性のある形態とし て提供し、 （ｃ）その生物学的に適合性のある形態でのその刺激剤を、それが、活性化を受 けているＴ細胞集団の少なくとも一部に結合するのに十分な量、十分な時間投与 する 端工程からなる方法。
13. １３．Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体への抗原の結合によって活性化を受けて いる「請求項１２」記載の方法。
14. １４．ＣＤ２８刺激剤は、ＰＭＡとｉｎｖｉｔｒｏで一緒に使用するとシクロス ポリン処理Ｔ細胞の増殖を誘発する特性をもつ抗−ＣＤ２８抗体の少なくともフ ラグメントからなる「請求項１２」記載の方法。
15. １５．抗原は腫瘍細胞によって産生される「請求項１２」記載の方法。
16. １６．抗原は感染細胞によって産生される「請求項１２」記載の方法。
17. １７．ＣＤ２８刺激剤は抗−ＣＤ２８キメラ抗体の少なくとも一部分である「請 求項１０」記載の方法。
18. １８．抗体はモノクローナル抗体９．３である「請求項１４」記載の方法。
19. １９．抗体はＫｏＩｔ−２のＣＤ２８結合特性を有する「請求項１４」記載の方 法。
20. ２０．フラグメントはＦ（ａｂ′）２フラグメントである「請求項１８」記載の 方法。
21. ２１．免疫が抑制されている患者のＴ細胞仲介免疫応答を増強する方法において 、 （ａ）ＰＭＡと一緒に使用した場合にシクロスポリン処置Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒ ｏ増殖を誘発する特性をもつ抗−ＣＤ２８抗体を提供し、 （ｂ）その抗−ＣＤ２８抗体の少なくとも一部分をＩｎｖｉｖｏ投与に適当な生 物学的に適合性のある形態として提供し、 （ｃ）その抗−ＣＤ２８抗体の少なくとも一部分を生物学的に適合性のある形態 で、免疫抑制されている患者に、Ｔ細胞仲介免疫応答を増大させるのに十分な治 療有効量投与する、 各工程からなる方法。
22. ２２．抗−ＣＤ２８抗体の部分はＣＤ２８の細胞外ドメインに結合する「請求項 ２１」記載の方法。
23. ２３．抗体はモノクローナル抗体９．３のＦ（ａｂ′）２フラグメントからなる 「請求項２２」記載の方法。
24. ２４．抗体はＫｏＩｔ−２のＣＤ２８結合特性を有するモノクローナル抗体から なる「請求項２２」記載の方法。
25. ２５．抗体はキメラ抗体である「請求項２２」記載の方法。
26. ２６．選ばれたＴ細胞リンホカインのヒトＴ細胞集団による細胞産生を実質的に 増大させる方法において、（ａ）ｉｎｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞 の表面の刺激部位への第一のリガンドの結合でその部位をそのＴ細胞集団の少な くとも一部分への刺激が最大になるように刺激することによって活性化し、（ｂ ）ＣＤ２８Ｔ細胞表面分子をそのＣＤ２８分子の細胞外ドメインに対して結合特 異性を有する第二のリガンドと結合させることによってその分子を刺激する、各 工程からなる方法。
27. ２７．第一のリガンドは抗原である「請求項２６」記載の方法。
28. ２８．選ばれたＴ細胞リンホカインはＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＩＦＮ−γ およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選ばれるリンホカインである「請求項２７」 記載の方法。
29. ２９．第二のリガンドは抗体の少なくともフラグメントである「請求項２７」記 載の方法。
30. ３０．抗体はキメラ抗体である「請求項２９」記載の方法。
31. ３１．抗体はモノクローナル抗体である「請求項２９」記載の方法。
32. ３２．モノクローナル抗体はｍＡｂ９．３である「請求項３１」記載の方法。