JPH04502018A - ブタのヘモフィロシス予防ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタのへモフィロシス予防ワクチン 本発明は、ブタのへモフィロシイス（ｈｅｍｏｐｈｉｌｏｓｅ　ｐｏｒｃｉｎｅ ）に対する予防ワクチンと、このワクチン中に含まれる有効成分を得るだめの方 法に関するものである。

ブタの胸膜肺炎（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ　ｄｕ　ｐｏｒｃ）すなわち ヘモフィロシスは深刻な経済的影響を及ぼす地理的に広く分布した病気である。

この病気の顕著な特徴は線維素性胸膜炎（ｐｌｅｕｒｅｓｉｅｆｉｂｒｉｎｅｕ ｓｅ）と出血性肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ　ｈｅ＋ｎｏｒｒａｇｉｑｕｅ）であ る。

この病気の原因となる細菌はへモフィルス［Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　（７クチノ バシラス、　Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）　］プルロニューモニア（ｐｉる 。

１−（、プルロニューモニアの毒性因子は内毒素（リボ多糖、Ｌ　Ｐ　Ｓ　）と 、莢膜（莢膜多糖）と、Ｈ，プルロニューモニアの細胞毒性作用および溶血作用 の原因となる一つまたは数個の毒素の３つである。この毒素は正確には定義され ておらず、これら２つの作用が１つの毒素によるものか、複数の毒素によるもの かも不明である。

この病気の予防のためにブタの飼育環境を衛生的に保つのは回能であるため、ワ クチン接種が考えられてきたが、不活化細菌から製造したワクチンは失敗（予防 効果が低く、ワクチン中に含まれる血清型に特異性があり、無害でない）であっ たため、「サブ−ユニット」型のワクチンが研究されてきた。

しかし、リボ多糖、莢膜多糖および外部膜蛋白からサブユニット型のワクチンを 製造する試みは予防効果が不十分且つ特異的であったため成功しなかった。

回復期のブタの血清中に抗溶血素抗体が存在するというこ々、そして、高度免疫 ウサギの血清が溶血作用と細胞毒性作用に対して中和作用をするということを示 したペンディクセン（Ｂｅｎｄ　１ｘｅｎ）達の研究（ブタの肺マクロファージ 、周辺血液単球および精巣細胞に対するヘモフィルス　プルロニューモニアのの 毒性、Ｉｎｆｅｃｔ。

１ｍｎ＋ｕｍ、１９８１．３３．６７３〜６７６　）やローゼンダール（Ｒｏｓ ｅｎｄａ　ｌ）達の研究（音波処理細菌と無菌培養上澄みによって誘発されるＨ 、プルロニューモニア肺障害−ＩＰＶＳ予稿集、コペンハーゲン、１９８０．２ ２１）から、溶血素（溶血毒素）に興味がもたれてきた。

リーゴード（Ｖａｎ　Ｌｅｅｇｏｅｄ）達は、油状補剤中で製造された血清型９ の毒素をベースとしたワクチンがブタに対する相同毒素の攻撃時に保護をすると いうこきを示した（Ｈ，プルロニューヒト州立大学）。このワクチン接種した動 物は溶血作用と細胞毒作用とを中和する抗体を有している。

これに対して、ヘッセ（Ｒ，Ｈｅ５ｓｅ）達は、補剤なしに加熱によって不活化 した血清型１の細胞毒素をベースとしたワクチンは相同毒素の攻撃時に保護をし ないということ、また、補剤として乳濁液を用いた血清型１の毒素で構成される ワクチンは血清型５による攻撃に対して予防作用がないということを示し、毒素 および不活化細菌を同時に含むワクチンが予防効果があると１９８４年、ＩＰＶ Ｓ、ゲント、ベルギー、１１１頁）。

フレイ（Ｊ、　Ｐｒｅｙ）達は、ある種の血清型、特に血清型１で溶血素を発現 させるためには培地中にＣａ＋＋が存在することが重要であるということを示し た〔アクチッパシラス　ブルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶血素の生化学的特徴と遺伝子学的特徴、 １９８８年、ｒ　ｐｖｓ、リオデジャネイロ、７９頁）。彼達の使用した培地は イソビタレックス　（Ｉ　ｓ。

ＶｉｔａｌｅＸ）とＮＡＤとを添加したＤｏンビア培養液（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　 Ｂｒｏｔｈ）であった。

本発明の目的は、血清型１に対しては効果的な予防ができ、その他のＨ，プルロ ニューモニアの血清型に対しては少なくとも部分的な予防ができ、しかも、極め て無害性が高いブタのへモフィロシスに対するワクチンを提供することにある。

　本発明の他の目的は製造が簡単で、コストが安いワクチンを提供することにあ る。

本発明の提供するブタのへモフィロシスに対する予防ワクチンは、Ｈ、プルロニ ューモニアの細胞毒作用および溶血作用の担体であるＨ、プルロニューモニアの 血清型１の不活化毒素をアナトキシン（ａｎａｔｏｘｉｎｅ）の形で、ワクチン 製造に用いられる賦形剤または何形剤中に含むことを特徴としている。

上記アナトキシンはホルマリンで毒素を不活化して得るのが好ましい。

上記アナトキシンには補剤、特に水酸化アルミニウムを添加するのが好ましい。

上記アナトキシンの最終濃度は５０μｇ／ｍ１であるのが好ましい。

本発明のワクチンは１投与当たりｌＯＯμｇ／ｍ１の割合で投与するのが好まし い。

ワクチンに含まれるアナトキシンは、Ｃａ０とＮＡＤとを添加した培地中で、多 量の毒素を作る血清型１のＨ，プルロニューモニア株の培養液の上澄液を精製し て得るのが好ましい。

本発明の改良型の実施例では、本発明のワクチンが上記定義した血清１のアナト キシン以外に、別の血清型、特に血清型２．３．４．６．８および１２の精製ア ナトキシン、好ましくはホルマリンで十分に不活化した毒素からの精製アナトキ シンを含むことができる。

これらの他の血清型のアナトキシンは、これら血清型の培養液の上澄液を高度に 濃縮・精製して得ることができるが、その他の方法で得ることもでき、特に血清 型２の場合には遺伝子組換えベクターの発現で得ることができる。これらの他の 血清型、例えば血清型２のアナトキシンとは、組換えアナトキシンと、その断片 、変異体および関連するエピトープを有するペプチドの他に、ペプチド合成した ものも含むということは理解できよう。

本発明のワクチン中でのこれら他の血清型のアナトキシンの濃度は約５０μｇ／ ｍｌであり、投与量は血清型１のアナトキシンの量と同じ量であるのが好ましい 。

本発明では、所定の血清型のアナトキシンとは、細胞毒性作用および／または溶 血作用に寄与する培養液の上澄液中の任意のポリペプチドまたは全てのポリペプ チドを意味している。しかし、血清型１の場合には、アナトキシンは溶血素を含 むか、溶血素で構成され、血清型２またはその他の血清型が存在する場合には、 血清型２またはその他の血清型は、細胞毒性作用に関与する約１２０にＤａのポ リペプチドを含むか、このボリペプチドで構成されているのが好ましい。

本発明のワクチンは１回または２回の注射で筋肉内、皮下または皮肉に投与する のが好ましい。

本発明のさらに他の目的は、上記タイプの予防ワクチンを製造するための、血清 型１のＨ，プルロニューモニアに対する細胞毒性作用と溶血作用に関与する毒素 を得る方法にある。

本発明の方法では、」１記毒素を多量に産戊する血清型１のＨ。

プルロニコーモニｒ株を選択し、選択した株を毒素の発現に最適な条件で培養し 、培養液の上澄液を回収し、毒素を抽出・精製し、次いで毒素を不活化する。こ の不活化は適当な公知の方法、特にホル゛Ｊリンを用いて行うことができる。

本発明方法では、選択した株をＣａ−とＮＡＤとを含む下記の３つの培地の１つ で培養することができる：（１）　ブイヨン　クール−セルベーユ（Ｂｏｕｉｌ ！ｏｎ　（：ｏｅｕｒ−Ｃｅｒｖｅｌｌｅ）培地、 （２）ハクト　ニＪｏ　ンヒ゛ア　マウス（Ｂａｃｔｏ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｂ ｒｏｔｈ）培地、 （３）　ウィルギンズーチャルグレン（Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｔｇｒｅｎ）培 地。

以Ｆ、血清型１の毒素を得る方法と、マウスおよびブタでのワクチン接種試験と を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

Ｉ、毒素を得るための方法 血清型１０株として、多量の毒素を生成するという理由で、ショーブ（Ｓｈｏｐ 、　Ｒ，Ｂ、）の、Ｊ、　［、ｘｐ、　Ｍｅｄ、　１１９．１９６４．３５７〜 ３６８頁に記載の株を選択した。

使用する培地はＣａ“とＮＡＤとを含んでいなければならない。特に、ブイヨン 　クールーセルベーユ培地〔ビオメリウ（Ｂｉ。

Ｍｃｒ　１ｅｕｘ）製〕と、バンド　コロンビア　グロス〔ディフコ（Ｄｉｒｃ ｏ）製〕培地と、ウィルキンズーチャルグレン培地を使用するのが好ましい。

本実施例では、］、ＪＯｍＭのＣａＣＬと１５　ｍＭのＮＡＤとを添加したバン ド　コロンビア　ブロス培地を使用した。

培養株の凍結乾燥したサンプルを５ｍｌの培地に導入し、３７℃で１８時間撹拌 する。次いで、ｌｏｏｍ　Ｉの培地に接種し、撹拌下に３７℃で６時間培養する 。

この段階で、］、６　ｍｇ／ｍｌのホルムアルデヒドを添加して、培養液を不活 化する。

次いで、培養液を７０００　ｇで２０分間遠心分離する。４０％の飽和硫酸ｒン モニウムを用いて撹拌下に４℃で３０分間沈澱させて、上澄液を濃縮する。１０ ０００　ｇで１０分間遠心分離した後に得られた沈澱物をＴＮＣ緩衝剤（１０ｍ Ｍ　）リスＩＩｃＩ、９％ＮａＣｌ、ＩＯｍＭＣａＣ］□）中に再溶解する。

毒素を限外濾過（カット限界：　１０．０００　Ｄａ）で濃縮することもできる 。濃縮物は５６℃で１時間半加熱して不活化することができる。

次に、毒素をゲル濾過　５２００　ＨＲ（ファルマシアーＬ　Ｋ　Ｂ　）で２回 の連続的にクロマトグラフにかけて精製する。このゲルの分画範囲は球状蛋白に 対して５０．０００から２５０．０００の間にある。カラムの特徴は以下の通り ニ ゲル容量　１９０　ｍｌ 高さ　９５艶 断面　２ＣＩＩ＋ 付着容積　１０　ｍｌ 流量　２０　ｍｌ／時 溶Ｍ緩衝剤　１０ｍＭトリス）ＩＣ１ ９％　ＮａＣ１ １，０ｍＭ　ＣａＣｌ２ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動プロフィル〔ラエムリ（Ｌａｅｍｌｉ）、バクテリオ ファージＴ４のヘッドの集合時の構造蛋白の分画、ネイチ＋−２２７，１９７０ ，６８０〜６８５　］は分子量１０５　ＫＤａに対応する単一バンドのみを示す （図１）。従って、血清型１の場合には、細胞毒性作用と溶血作用の両方に関与 するのは単一の毒素であると思われる。いずれにせよ、本発明のワクチンは、他 の抗原成分が存在しても、しなくても、分子量１０５　ＫＤａのアナトキシンを 含んでいる。

■、ワクチンの製造 上記方法で得られた精製アナトキシンからワクチンを製造する。アナトキシン配 合は、不活化前の溶血価（約３の溶血価）を基礎に製造するが、他の試験（例え ば、ＥＬＩＳＡ）によって製造することもできる。このアナトキシンに補剤とし てアルミナゲル（０，７ｍｇ／ｍｌ）とホルマリン（１，６ｍｇ／ｍｌ＞を添加 する。

■、マウスへのワクチン接種試験 」１記のワクチンをマウスへワクチン接種試験して評価する。

マウスに皮下注射で初日（ＪＯ）に０．５ｍｌのワクチンを投与した。

２１日（Ｊ２１）には、０．５ｍｌ以下を腹膜組織内にマウス１匹当たり５０％ 致死量の１０投与量を注射して評価した。結果を下記の表１にまとめて示しであ る。

この結果は１０匹の被試験マウスの中で死んだマウスの数で示した。

表１ 攻撃血清型　対照　“アナトキシン”ワクチンこの結果は、本発明ワクチンはマ ウスモデルに記載の全ての血清型に対して異質組織（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｅ） の予防効果を示すことを示し、このことはブタに外挿することができる。

■、ブタへのワクチン接種試験 ２つのグループのＥＯＰＳ子豚（特別な病理的組織のない子豚）を同じ条件で飼 育する。一方のグループには生後８〜１２週間でワクチン接種し、他方のグルー プは対照とした。

生後１４週間目に、２つのグループに血清型９を鼻腔内に接種（１０４菌）して 　試験したく異質組織攻撃）。

結果は表２にまとめて示しである。

表２ この結果は、明らかに本・発明のワクチンの効果を示している。

血清型２のアナトキシンを含むワクチンを製造する場合には、この血清型の株を 上記と同じ条件で培養すればよい。

この場合には、培養液の上澄液を遠心分離し、硫酸アンモニウムで沈澱させて濃 縮し、沈澱物を再溶解し、イオン交換クロマトグラフィ、次いでゲル濾過または ヒドロキシ−アパタイトゲルクロマトグラフィで精製する。精製された毒素の不 活化はホルマリンで行うのが好ましい。

血清型３．４．６．８．１２等の他の血清型の場合には、血清型ｌのアナトキシ ンと同様に行うことができる。

ｌ′５５Ｉｌ！！捌審輻失 一一一一一一一一一一”’　ＰＣＴ／ＰＲ９０１００６８Ｂ１１１．１．ニー　 ＰＣＴ／ＦＲ９０１００６８８国際調査報告 ＦＲ９０００６８８ Ｓ＾　４０８６４

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｈ．プルロニューモニアの細胞毒作用および溶血作用の担体であるＨ．プル ロニューモニアの血清型１の不活化毒素をアナトキシンの形で、ワクチン製造に 用いられる賦形剤または付形剤中に含むことを特徴とするプタのヘモフィロシス に対する予防ワクチン。
2. ２．毒素をホルマリンで不活化されることを特徴とする請求項１に記載のワクチ ン。
3. ３．アナトキシンに水酸化アルミニウムを補剤として加えることを特徴とする請 求項１または２に記載のワクチン。
4. ４．アナトキシンの最終濃度が５０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１ 〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
5. ５．一回当たりの投与量が１００μ８／ｍｌの割合であることを特徴とする請求 項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
6. ６．上記毒素がＣａ＋＋とＮＡＤとを添加した培地中で多量の毒素を産成する血 清型１のＨ．プルロニューモニア株の培養液の上澄液を精製することにより得ら れることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
7. ７．他の血清型２、３、４、６、８および１２から得られる不活化された精製ア ナトキシンをさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の ワクチン。
8. ８．血清型２アナトキシンまたはその変異体またはそれと等価なペプチドが遺伝 的組換えまたはペプチド合成で得られることを特徴とする請求項７に記載のワク チン。
9. ９．上記毒素を多量に産成する血清型１のＨ．プルロニユーモニア株を選択し、 選択した株を毒素の発現に最適な条件で培養し、培養液の上澄液を回収し、毒素 を抽出・精製し、次いで毒素を不活化することを特徴とする請求項１〜８のいず れか一項に記載の予防ワクチンを製造するための血清型１のヘモフィルス（アク チノバシラス）プルロニューモニアの細胞毒性作用と溶血作用の原因となる毒素 を得るための方法。
10. １０．選択した株をＣａ＋＋とＮＡＤとを含むプイヨンクールーセルベーユの培 地で培養することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. １１．選択した株をＣａ＋＋とＮＡＤとを含むバクトコロンピアプロス培地で培 養されることを特徴とする請求項９記載の方法。
12. １２．選択した株をＣａ＋＋とＮＡＤとを含むウィルキンズーチャルグレン培地 で培養されることを特徴とする請求項９記載の方法。