JPH04502101A - ヒト・ラミニン結合タンパク質をコードする完全な長さのｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ヒト・ラミニン結合タンパク質をコードする完全な長さのここに記載される発明 は、国立衛生研究所によって認知された許可番号ＰＯＩ　ＣＡ４４７０４、ＰＯ Ｉ　ＣＡ２２４２７およびＲＯＩ　０Ｍ３８３１８の下での研究の途中でなされ た。

関連出願の相互参照 この出願は、１９８８年８月３１日に出願された米国特許出願０７／２３８．９ ５５の一部継続出願である。

技術分野 この発明は、広くはヒト・ラミニン結合タンパク質に関し、特には、ヒト結腸癌 由来のヒト・ラミニン結合タンパク質をコードする完全な長さのｃ　ＤＮＡ　（ １”ｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ）およびそれらの分子クローニングに係る 。

背景技術 結腸癌は、ヒトにおける癌による死亡の主要な原因の一つである。米国において は、１９８８年には、１４０，０００件をこえる新しい結腸癌患者が見込まれて いる。これらのうちの７０，０００をこえる患者が、この疾患で死亡するであろ う。現在の診断技術は、手術による有効な制御を確実なものとするのに十分な早 期には、患者の半分も発見できない。特に、はとんど分化していない結腸癌を有 する患者については、検出およびモニタリングは困難である。これは、そのよう な悪性疾患は、非常に、および適度に分化した結腸癌にしばしば有用なマーカー である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現することが、一般に、はとんどないからで ある。

正常結腸上皮細胞の腫瘍状態への変換および分子レベルでの結腸癌細胞の分化に ついては、はとんど知られていない。

１００をこえるヒト結腸癌由来細胞株が確立されている。これらの細胞株がヒト 結腸上皮起源の共通の特性を共有するにもかかわらず、それらの分化の起源、分 化の程度、ヌードマウスにおける腫瘍形成性、誘発された腫瘍の組織学、転位能 力、および培養における変換したフェノタイプが全く異なることがある。それら は、潜在的に、新しいマーカーを解明するための豊富な源である。

ラミニンは多種の生物学的プロセスに関与している。結腸癌に最も関連して、ラ ミニンは細胞接着、形態形成、分裂、分化および転位につながる。ラミニンは、 基底膜の主要な成分である。ラミニンは、Ａ鎖（Ｍｒ　４００，０００）　、Ｂ ｌ鎖（Ｍｒ２１０．０００　）およびＢ２鎖（Ｍｒ　２００，０００）の３本の ポリペプチド鎖からなる十字架状構造の巨大糖タンパク質である。これは、正常 および腫瘍細胞の基底膜への固着を仲介する。

細胞固着活性を存する、Ｂ１鎖からのラミニンのタンパク分解断片およびペンタ ペプチドＴ　ｒｙ−１１ｅ−に　Ｉ　ｙ−３ｅ　ｒ−Ａ　ｒｇが同定されている 。イワモトらは、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３８．１１３２−１１３４（１９８７ ）において、このペンタペプチドが、マウスにおいてメラノーマの転位を阻害す るように見えることを報告している塩ラミニンの多くの効果が、８７　ＫＤａの ラミニン受容体、すなわち細胞表面糖タンパク質を通して仲介されることか示さ れている。

１９８６年１月２１日にリオッタ（Ｌｉｏｔｔａ）らに発行された米国特許４． ５６５．７８９は、ラミニン受容体の単離および特定の面の特徴付けを開示して いる。

ウェワ（Ｗｅｗｅｒ　）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳ Ａ）、８３．７１３７−７１４１　（１９８Ｂ）は、ヒト・ラミニン受容体の２ Ｈ５エピトープのヌクレオチドおよび仮定上のアミノ酸配列の他に、ラミニン受 容体ｃＤＮＡの単離を開示している。

近年、さらに２つのラミニン受容体が、ｌ８ＫＤａおよび１１０ＫＤａの分子集 団として同定されている（Ｋｌｅｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ　）　、１２８２−１２８８頁、８５巻（ １９００）　、および５ａａｌｈｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ　）　、６４５７−６４６１頁（１９８７）。

発明の要約 この発明は、第３図に示す配列を実質的に含む、ヒト結腸癌細胞由来の完全な長 さのヒト・ラミニン結合タンパク質ｃＤＮＡ配列を目的とする。これはまた、第 ３図に示すヌクレオチド番号１６２から始まりヌクレオチド番号８２９で終わる 配列に実質的に相当する下位配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ　）に関する。

別の面においては、この発明は、ヒト・ラミニン結合タンパク質をコードする組 換えクローンにも関する。

別の態様においては、この発明は、いずれかの配列によってコードされたラミニ ン結合タンパク質および上述のｃＤＮＡのラミニン結合タンパク質をコードする 、実質的に単離されたＤＮＡに関する。

また、患者における癌の存在を検出する方法、および患者における癌の存在を検 出するための試薬に関する。

図面の簡単な説明 第１図は、手術により得られたヒト結腸癌および隣接する正常上皮からのＲＮＡ と３種のプラスミドからの３２ｐ−標識ｃＤＮＡインサートとのプロット−ハイ ブリダイゼーションを示す図。レーン１．３．５は正常ヒト結腸上皮からの、レ ーン２．４．６は結腸癌からの全ＲＮＡを用いた。レーン１．２は８−２Ｖと、 レーン３．４は３−４−丁と、レーン５．６は１−４Ｅとハイブリダイズしてい る。矢印はハイブリダイズした主要なｍＲＮＡを示し、それぞれ１．２　ｋｂ　 、１．７　ｋｂおよび０．７　ｋｂである。

第２図は、２０種のヒト結腸癌細胞株からのＲＮＡと８−２ｖプラスミドからの ３２ｐ−標？ｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートとのプロット−ハイブリダイゼーシ ョンを示す図。レーン１はＨＴ２９からの、２はＣＸ−１からの、３はＲＣＡか らの、４はＣＣＬ２２２からの、５はＣＣＬ２２０．１からの、６はＣＣＬ２２ ８からの、７はＨＣＴ１１６ｂからの、８はＨＴＢ３９からの、９はクローンＡ からの、１０はクローンＤからの、Ｊ］は）ＵＰ］０１からの、１２はＣＣＬ２ ２９からの、１３はｃ＋ｙからの、１４はＭｏ５ｅｒからの、１５はＣＣＬ２３ ３からの、１６はＣＣＬ２２４からの、１７はＣＣＬ２３７からの、１８はＣＬ Ｉ８７からの、１９はＣＣＬ２２７からの、および２０はＣＣＬ２３４からのＲ ＮＡを用いた。矢印は１．２　ｋｂの、ハイブリダイズした主要なｍＲＮＡを示 す。

第３図は、Ｊ−９λｇｔｌＯファージからの完全な長さのｃＤＮＡインサートの ヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を示す図。８−２ｖインサート の全ての配列は、実質的に、ここに示された配列中に位置する（ヌクレオチド番 号１６２ないし８２９）。関心のある配列には下線を引いた。

第４図は、第３図に示す推定アミノ酸配列のハイド。バシー・プＯットｃｈｙｔ ｉｒｏｐａｔｔ＋ｙ　ｐｌｏｔ　）を示す図。

第５図および第６図は、ヒト食道、頚部、十二指腸、肺、前立腺癌およびヒト・ メラノーマ細胞株において１．２　ＫｂｍＲＮＡの有意レベルの表現を示す種々 のヒト癌細胞株がら単離された全ＲＮＡの、ノーザンプロットを示す図。

第７図は、ウサギ網状赤血球からのラミニン結合遺伝子のイン・ビトロ翻訳生成 物がラミニン・セファロース・カラムに結合し、ラミニン結合タンパク質イン・ ビトロ翻訳生成物の分子量かＳＤＳ　ＰＡＧＥに対して４５　ｋｄタンパク質と して移動することを示す図。

寄託の報告 １、　Ｊ〜９と命名した組換えクローンを、ブタペスト条約の下に、１９８８年 ８月３０日付でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に 寄託し、ＡＴＣＣ受付番号４０４８９を受けた。

２、８−２Ｖと命名した組換えクローンを、ブタベスト条約の下に、１９８８年 ８月３０日付テＡＴＣＣ＋：寄託し、ＡＴＣＣ受付番号４０４９０を受けた。

別に定義しない限りは、ここで使用される技術もしくは科学用語は、この発明が 属する技術分野の当業者によって普通に理解される意味と同じ意味を有する。こ こで言及される刊行物は、参考としてこれに組み込まれる。

「〜由来の」という用語は、配列が同じタンパク質または穏やかな置換、添加も しくは除去を受けた機能的等価物をコードすることを意味する。

「実質的に精製された」という用語は、特定のゲノムにおいて通常連携している 他の細胞成分を含まずに合成されている、もしくは、天然に産するものであるな らば、単離されていることを意味する。

ｃＤＮＡライブラリーは、ヒト結腸癌細胞株から構築した。

これらのライブラリーは、結腸癌においてより豊富なｍＲＮＡとハイブリダイズ する特定のクローンについてスクリーニングを行なった。以下に説明する組換え クローン８−２■におけるｃＤＮＡインサートとのハイブリダイゼーションによ って、１．２　ｋｂ　ｍＲＮＡを同定した。このｍＲＮＡは、ヒト結腸癌におい て、隣接する正常結腸上皮よりも約９倍豊富であった。この１．２　ｋｂ　ｍＲ ＮＡのｃＤＮＡは、実質的に第３図に示す配列を含む、最初の、完全な長さのヒ ト結腸癌細胞由来ヒト・ラミニン結合タンパク質ｃＤＮＡ配列であるように、思 われる。

１種以上のヌクレオチド・トリブレットが同じアミノ酸をコードすることができ 、退化コードの存在によりヌクレオチド配列において変化が生じ得ることは理解 されている。このため、第３図に示すヌクレオチド配列に変化か生じることかあ り、これもこの発明の範囲に含まれる。

８−２■プラスミドの同定。ヒト結腸癌において正常な対応細胞よりも豊富に存 在する細胞性ｍＲＮＡを探索するために、はとんど分化していないヒト結腸癌細 胞株、クローンＡから単離したポリ（Ａ）＋ｍ　ＲＮ　Ａを用いて、プラスミド ｐＢＲ３２２にｃＤＮＡライブラリーを構築した。最初にスクリーニングは、１ ．５００のプラスミドを、高度に分化したヒト結腸癌細胞株であるＣＸ−１の他 にクローンＡのｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡとハイブリダイズさせることによ り行なった。大部分のプラスミドが、２種の間で等しくもしくはより多いＣＸ− １のものとハイブリダイズしたのに対して、ＣＸ−１よりもクローンＡからのｃ ＤＮＡとより多くハイブリダイズしたという理由で、１０個のプラスミドを研究 した。次に、これらのプラスミドのｃＤＮＡインサートを、ＲＮＡゲルのプロッ ト−ハイブリダイゼーションによる同一患者の正常ヒト結腸上皮組織および結腸 癌の間のｍＲＮＡレベルの比較に用いた。プラスミドの１つ、８−２Ｖは、隣接 する正常上皮よりも癌細胞により豊富に存在する１、２　ｋｂ　ｍＲＮＡとハイ ブリダイズした（第１図）。癌細胞および正常組織からの等量の全ＲＮＡを比較 した。密度計測による分析は、このｍＲＮＡのレベルが正常上皮よりも癌細胞に おいて約９倍高いことを示唆した。比較のために、同一のＲＮＡの対を別の２種 のプラスミドからのｃＤＮＡインサートとハイブリダイズさせた。プラスミド１ −４Ｅは、癌細胞よりも正常結腸上皮にはるかに多量に存在する０、７　ｋｂ　 ｍＲＮＡとハイブリダイズした。これに対して、プラスミド３−４Ｗは２つの間 に等しく豊富に存在する１、７　ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイズした。これらの 結果は、８−２■のｃＤＮＡインサートとハイブリダイズした１、２　ｋｂ　ｍ ＲＮＡが、結腸癌細胞の正常結腸上皮からの識別に有用なポリペプチドをコード する能力を有していることを示唆した。

種々の細胞株からの全ＲＮＡと８−２ＶｃＤＮＡインサートとのプロット・ハイ ブリダイゼーション結腸癌細胞に存在する、８−２■とハイブリダイズする１、 ２ｋｂｍＲＮＡの増加したレベル、特にほとんど分化していない細胞によるその 表現が一般的な現象かどうかを調査するために、２０のヒト結腸癌細胞株（上述 ）を、等量の全ＲＮＡと３２ｐ−標識プローブとのプロット・ハイブリダイゼー ションにより試験した。第２図は、高度に分化した、ムチン産生直腸腺腫細胞株 であるＣＣＬ２３４を除いて、試験した全てのヒト結腸癌細胞株が本質的にこの ｍＲＮＡの重大なレベルを発現することを示している。はとんど分化していない 全ての細胞株（ＣＣＬ２２０．ｌ、　ＨＣＴｌ１６ｂ　、クローンＡおよびＭＩ ＰＩＯＩ　）が高度の発現レベルを有し、より低いレベルでしか発現しないもの が高度に分化している（　ＣＣＬ２３３およびＧＬＹ、両者は高ＣＥＡ産生体で ある）傾向にあるが、この１．２　ｋｂ　ｍＲＮＡのレベルと分化の程度との間 の相関は明らかではなかった。等しい全ＲＮＡに基づくと、結腸癌細胞株のこの １．２　ｋｂ　ｍＲＮＡのレベルは、第１図に示す結腸癌の外科的組織と同じ範 囲にあった。

８−２ＶｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列８−２■プラスミドのｃＤＮＡ インサートは、第３図においてヌクレオチド番号１６２から始まりヌクレオチド 番号８２９で終了する配列に実質的に相当するｅｅｇ　ｂｐを有していた。ＤＮ Ａ配列データベースのコンピュータ検索により、８−２■が約３４９ヌクレオチ ドの配列を含むことが明らかになった。この配列は、ウェブらが報告したヒト・ ラミニン受容体の部分ｃＤＡＮ配列を有している。２Ｈ５モノクローナル抗体は 、イムノプロットにおいてラミニン受容体と結合し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて生 成ラミニン受容体と反応し、細胞膜もしくは原形質膜のいずれかへのラミニンの 結合を妨げ、かつラミニンに富む羊膜基底膜への細胞の付着をブロックすること が知られている。この抗体によって認識されるエピトープか、推定アミノ酸配列 に存在する。さらに、予想されたポリペプチドは、ラミニン介在細胞固着を阻害 するポリクローナル抗体によって認識される２０個のアミノ酸配列（Ｐｒｏ−Ｔ ｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａ 　ｌ　ａ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｔ　ｒｐ−８ｅｒ−Ａ　Ｉ　ａ− Ａ　ｌ　ａ−o　ｒｏ− Ｔｈｒ−Ａｌａ　）を含む。考え合わせると、８−２ＶｃＤＮＡとハイブリダイ ズする１、２　ｋＢ　ｍＲＮＡの生成物がラミニンと結合することもまた、非常 に起こり得ることであるように思われる。

分子クローニングおよび８−２ＶｃＤＮＡインサートとハイブリダイズする１、 ２　ｋｂ　ｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡの配列次に、８−２Ｖの３２ｐ−標識ｃ ＤＮＡインサートを、ヒト結腸癌細胞株であるｅｘ−ｉのｍＲＮＡから作成した λｇｔｌ。

ｃＤＮＡライブラリーからのより長いインサートを有するｃＤＮＡのクローニン グに用いた。ｃＤＮＡの１つ、Ｊ−９が約１　ｋｂのインサートを有していた。

このインサートのｃＤＮＡ配列は、実質的に、第３図に示すものと同じである。

クローンＡ細胞株からの８−２ＶｃＤＮＡ配列は、このｃ　ＤＮＡ配列内に完全 に位置している。このため、２Ｈ５モノクローナル抗体によって認識される抗原 性ドメインおよびラミニン受容体とのラミニンの結合をブロックするポリクロー ナル抗体によって認識されるＣ−末端２０−アミノ酸は、３種の異なる源、ヒト 調静脈内皮細胞、クローンＡおよびＣＸ−１からの同一のヌクレオチド配列を有 している。コンピュータ支援分析により、示されるように、最初のＡＴＧから始 まりＴＡＡで終了するオーブン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）か明らかに なった。このＯＲＦに先立って、−１８位にインフレーム停止コドン、および最 初のＡＴＧの直前にＡＮＮが存在する。ポリアデノシンリン酸化のためのシグナ ル配列も存在する。

推定アミノ酸配列 このＯＲＦは、約２９５アミノ酸残基の３２．８１７　Ｄａポリペプチドをコー ドすることができる。実質的に第３図に示すような推定アミノ酸配列は、いくつ かの興味ある特徴を明らかにした。Ｎ−末端においては、多くの細胞表面タンパ ク質について報告されている、小胞体に侵入するための先導シグナル配列が見出 されていない。バイトロバシー・プロットにより、Ｎ−末端の２／３が、シグナ ル配列として機能し、もしくは膜固定を付与し得る疎水性断片を有する。Ｎ一連 結糖付加についてのＡｓｎ−ＸＡＡ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　）に対する意見の一致 した配列は存在しない。単に、１４アミノ酸残基によって分離された２つのＣｙ ｓがあるだけである。アミノ酸残基２２５の後には、アルギニンもしくはりシン は見出されていない。このため、このポリペプチドをトリプシンによって完全に 分解すると、７０−アミノ酸、陽性荷電残基を持たない強酸性ポリペプチドであ るＣ−末端ドメイン（１３のアスパラギンおよびグルタミン残基）になるはずで ある。

通常の配列は、以前に注目された（Ｗｅｗｅｒ、Ｕ、Ｍ、、Ｌｉｏｔｔａ。

Ｌ、Ａ、、Ｊａｙｅ、Ｍ、　、Ｒｉｃｃａ、Ｇ、Ａ、、叶ｏｈａｎ、％／、Ｎ６ 、ＣＩａｙｓ＋＋＋ｉｔｈ、Ａ。

Ｐｌ、Ｒａｏ、Ｃ，Ｎ、、Ｗｉｒｔｈ、Ｐ、、Ｃｏｌ　ｉｇａｎ、Ｊ、Ｅ、、Ａ ｌｂｒａｃｈｔｓｅｎ、Ｒ，、Ｍｕｄｒｙｊ、Ｍ、および５ｏｂｅ１．Ｍ、Ｅ、 （１９８Ｂ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８３．７］３７−７１４１　）　２ツのＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−８ｅ ｒ−Ａ！ａ−Ｘ−Ｐｒｏの繰返しく２Ｂ４−２７１および２７３−２８０　（★ ）第３図）；２つのＡ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｘ−Ｘ−Ａ　ｌ　ａ の繰返しく９１−９６および２１Ｂ−２２１（Ａ）第３図）；３つのＬｙｓ−Ｇ 　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕの繰返しく１１−１３．２１２−２１４および２２４−２ ２６）であって、そのうちの２つはＬｙｓ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇｌｎ− Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｕ　（２１２−２１９）およびＬｙｓ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉ　 ｕ−Ｘ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｘ−Ｇｌｕ　（２２４−２３０）に存在する；２つのＡｓ ｐ（Ｇ：Ｉｕ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃ；Ｉｕ（Ａｓｐ）−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｔｙｒ− Ｌｙｓ（Ａｒｇ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａｓｐ（Ｇｌｕ）の繰返しく３１−４４および １９６−２０９　（：　）第３図）；１つの対称的な配列Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒ ｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　（１７３−１７１１ｉ　（ｏ　）第３図）を含む 。

８−２ｖと命名された組換えクローンのｃＤＮＡインサートとハイブリダイズす るｌ’、２　ｋｂ　ｍＲＮＡの増加したレベルは、はとんど分化していない、お よび高度に分化したヒト結腸癌細胞株の両者で検出された。現在、はとんど分化 していないヒト結腸癌細胞に対するマーカーが必要とされている。これは、これ らの細胞が、癌胎児性抗原をほとんど発現しないためである。ラミニン結合タン パク質をコードする１、２　ｋｂｍＲＮＡは、ラミニンとの相互作用を基にして 、はとんど分化していないものおよび高度に分化したもののいずれに対しても結 腸癌細胞を正常結腸上皮細胞から識別することかできる。

第５図および第６図は、ヒト食道、頚部、十二指腸、肺、前立腺癌およびヒト・ メラノーマ細胞株の１．２　Ｋｂ　ｍＲＮＡの発現が重大なレベルにあることを 示している。

第５図は、種々のヒト癌細胞株から単離した全ＲＮＡのノーザンプロットを示す 。全ＲＮＡ　（１５ｕｇ／レーン）を１．０％アガロース／ホルムアルデヒドゲ ルについて分離し、ニトロセルロースフィルタに転写し、およびラミニン結合タ ンパク質をコードするクローン８−２ｖからの３２ｐ−標識ｃＤＮＡインサート を用いて探査した。レーン１ないし６は、以下の癌細胞株から単離されたＲＮＡ を含む。１はＣＥ８１Ｔ、　２はＣＥ４８Ｔ、３はＨＩＤ（１，２および３はヒ ト食道癌細胞）、４はＨＴＢ３４ＭＳ７５１．５はＨＴＢ３５ＳｉＨａ、　６は ＨｅＬａ　（４，５および６はヒト頚部癌細胞）である。矢印の頭はハイブリダ イズした１２　ｋｂ　ＲＮＡを示す。

第６図もまた、種々のヒト癌細胞株から単離された全ＲＮＡのノーザンプロット を示す。全ＲＮＡ　（１５ｕｇ／レーン）を１．０％アガロース／ホルムアルデ ヒドケルについて分離し、ニトロセルロースフィルタに転写し、ラミニン結合タ ンパク質をコードするクローン８−２■からの３２Ｐ−標識ｃＤＮＡインサート を用いて探索した。レーン１ないし６は、以下の癌細胞法から単離されたＲＮＡ を含む。１はＴ２４．２はＥＪ（１および２はヒト膀胱腺腫）、３はａｘ−１， ４はＣＣＩ、２１８１１１ｉＤｒ　（３および４はヒト結腸腺腫）、５はヒト十 二指腸腺腫である１ＩＴＢ４０ＨｕＴｕ８０．６はＣＣＬ１８Ａ５４９．７は０ ＡＴ４．８はＣａ！ｕ　（６，７および８はヒト肺癌細胞）、９はＡ２０５８　 （ヒトメラノーマ）、１０はＣＲＬ１４３５ＰＣ−３（ヒト前立腺腺腫）である 。矢印の頭は、１．２　ｋｂ　ＲＮＡのハイブリダイズした種を示す。

タンパク質レベルにおいて、第７図は、ラミニン結合タンパク質遺伝子のイン・ ビトロ翻訳生成物が、ラミニン・セファロース・カラムに結合するタンパク質で あって、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにおいて４５　ｋ（ｊのタンパク質として現われるこ とを示している。第７図において、ラミニ：／結合タンパク質遺伝子のイン・ビ トロ翻訳生成物は、ウサギ網状赤血球溶解質から得た。

レーン２に示すように、ラミニン結合タンパク質イン・ビトロ翻訳生成物の分子 量は、４５　ｋｄのタンパク質のように５ＤＳＰＡＧＥ上を移動した。レーン］ は、この特定のウサギ網状赤血球溶解質バッチのイン・ビトロ翻訳に対する！・ ・ツクグランド対照である。このイン・ビトロ翻訳生成物を、ラミニン・セファ ロース・アフィニティ・カラムに通した。より長く洗浄した後、５０＋＋＋Ｍ） リスｐＨ８，０で緩衝した０、５　Ｍ　ＮａＣΩを用いて、４５　ｋｄバンドの タンパク質を溶出した（レーン３）。

ラミニン受容体は、侵入およびそれに続く転位の促進を容易にする、ラミニンに よる血管基底膜との腫瘍細胞の最初の相互作用に深く関わっていることか示唆さ れている。結腸癌細胞におけるこのｍＲＮＡの増加したレベルは、正常上皮細胞 と比較したときに、癌細胞のラミニン受容体の発現が増加する傾向にあるという 事前の観察と一致するであろう。結腸癌を含む、非常に悪性でほとんど分化して いないヒト癌細胞は、免疫ペルオキシダーゼ染色により、高度に分化したものよ りも高いレベルの細胞質ラミニン受容体を発現することが示されている。さらに 、ラミニン受容体によって識別されるラミニン由来ペンタペプチドにより、動物 モデル系におけるメラノーマの転位の阻害が示されている。ラミニンおよびその 受容体の間に介在する相互作用が、結腸癌の転位を妨げることは可能である。

このｍＲＮＡのサイズは、ウエワらによって前に記載されたラミニン受容体の１ ．７　ｋｂ　ｍＲＮＡよりも有意に小さい。

ここに記載されるｃＤＮＡにおけるＯＲＦは、ラミニン１体に対して記載された ８７　ｋＤａタンパク質よりはるかに小さい３２．８１７　Ｄａのポリペプチド を満足するに過ぎないであろう。

しかしながら、報告されたラミニン受容体の全ての部分ｃＤＮＡ配列がここに記 載されるＯＲＦに含まれるので、１．２　ｋｂｍＲＮＡの産生物は、それか６７ 　ｋＤａのラミニン受容体でなければ、おそらくラミニン結合タンパク質である 。この１．２ｋｂｍＲＮＡの産生物がラミニン結合タンパク質に違いないという ことは、６７　ＫＤａラミニン受容体のエピトープのコーディング領域がここに 報告される配列中に全て介在するという事実によって強く支持される。このエピ トープは、ラミニンとその受容体との結合をブロックするモアツクローナル抗体 、２Ｉ（５によって認識されるものである。さらに１．ラミニン介在細胞固着を 妨げるポリクローナル抗体によって識別されるＣ−末端２０−アミノ酸合成ペプ チドもまた、この配列のＣ−末端に存在する。

すでに異なる分子集団を有する３種のラミニン受容体か報告されている（Ｋｌｅ ｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｉ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、１２８２ −１２８８頁、８５巻（１，９８８）およびＳｍａｌｈｅｉｓｅｒら、Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ｔＪｓＡ）　、６４５７−６４６１頁、８４巻 （１９８７）　）ので、全ての受容体が共通の配列を共融しているのかどうかか 関心の的である。ここに示されるＲＮＡゲルのプロットーノλイブリダイセーシ ョンのほとんとが１．２　ｋｂの顕著なノ１ンドを示すが、より大きなサイズの 少数のノ１ンドが存在する。これらのバンドか他のラミニン受容体に関連するの かどうかは、さらに調査を必要とする。さらに、ヒト食道癌ｉ１１胞の８−２〜 ′ｃＤＮＡと強くハイブリダイズする５、５　ｋｂ　ｍＲＮＡか同定されている 。

第３図の推定アミノ酸配列は、いくつかの興味深い特徴を示した。九“−末端に おいては、多くの細胞表面タンパク質で報告されている、小胞体に侵入するだめ の先導シグナル配列か見出されていない。他の膜タンパク質と同様の明らかな膜 内外（ｔｒａｎｓ＋＋＋ｅｍｂｒａｎｅ　）　’？＋Ｒ域、もしくは両親媒性α −ヘリックスは存在しない。このアミノ酸配列かラミニン受容体の１つであるな らば、それは別の道によって膜と連携しているのであろう。バイトロバシー・プ ロットによると、分子のＮ−末端２／３は、シグナル配列として機能し、もしく は膜固定を付与するであろう疎水性断片を含む。例えば、膜との関連を付与する であろう　１９−アミノ酸断片の一部として、高度に疎水性の配列Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−１１８−ｖａ　ｌ−Ａ　１ ａ−１１ｅが存在する。他の潜在的な膜固定の断片は、多くの疎水性残基を有す るＮ−末端１５−３０残基である。しかしながら、ラミニン受容体が膜固定にミ リスチン酸もしくはバルミチン酸を用いることも可能である。Ｎ一連結筒付加の 意見の一致した配列Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ　（Ｔｈｒ　）は存在しない。潜在的な 〇一連連結付付加ための２４　Ｔｈｒおよび１４　Ｓｅｒが存在する。

３１１４　オヨび１９Ｂ−２０９位（７）　Ａｓｐ（Ｇｌｕ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ ｌｕ（Ａｓｐ）−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ　（Ａ　ｒｇ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ −Ａｓｐ　（Ｇ　Ｉ　ｕ）は注目に値する繰返しである。２つのシスティンによ って側面で接する】４０アミノ酸ストレツチを連結ドメインと考えるならば、２ つの隣接ドメインは各々この繰返し配列の１つを有するであろう。これら２つの 隣接ドメインのそれぞれには、別の繰返し、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ−Ｘ− Ａｌａ−Ｘ（−）−Ｔｈｒがある。

残基２２５の後のＣ−末端は、１３個のアスパラギンおよびグルタミン残基を有 し、リジンもしくはアルギニン残基を持たない７０−アミノ酸断片を含む。この トリプシン耐性、強酸性ドメインは、ラミニン結合タンパク質を特徴付けている 。この７０−アミノ酸ドメイン中には５つのＡｓｐ（Ｇｌｕ）−Ｔｒｐ−８ｅｒ （Ｔｈｒ）の繰返しか存在し、その内の２つはほぼ縦並びの繰返しＴｈｒ−Ｇｌ ｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｙ−８ｅｒ−＾１ａ−Ｘ−Ｐｒｏ中に存在する。

別の面においては、この発明は、患者の癌細胞を検出するための試薬および方法 に関する。この方法は、上述のｃＤＮＡ配列の１つを有する標識ｃＤＮＡプロー ブを供給し、このプローブを患者からの組織もしくは体液試料にさらし、および ハイブリダイゼーションのための反応をモニタリングすること含む。ハイブリダ イゼーション選択技術は、Ｍａｎｉａｔｊｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に記載されている。

有用な標識には、放射性核種、例えば３２ｐ、３Ｈ１もしくはＩ４０、酵素、蛍 光体、化学発光化合物、色素体もしくは発色基のような、ハイブリダイゼーショ ンに続いて検出可能な成分が含まれる。これらの標識は、当業者に通常知られて いる技法を用いてプローブに直接もしくは間接的に結合させることができる。ま た、特異的な標識抗体を用いてプローブを同定することも、この分野の技術の範 囲内である。

以下の実施例は、この発明を例示する。

ニューイングランド・デアコネス（Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ　）病院の外科部門から 、初期ヒト結腸癌細胞および隣接する正常結腸組織の外科的な検体を得た。手術 の直後に、正常結腸上皮を解剖顕微鏡下で筋肉および結合組織から分離し、液体 窒素中に置いた（　１ｖｅｒｓｅｎ、Ｐ、Ｌ、、Ｍａｔａｌ、Ｅ、およびＨｉｎ ｅｓ、Ｒ，Ｎ、（１９８７）　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ　５．５２１　、５２ ３　）　ｏ　ＤＬＤ−１のサブクローンである、ヒト結腸癌細胞株クローンＡお よびクローンＤはり、Ｄｅｘｔｅｒ　（デュポン社）から、ＭＩＰＩＯＩはＮ、 ＺａｌＴｌｃｈｅｃｋ（マロリー研究所（Ｍａｌｌｏｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　）　）から、ＣＸ−１はＳ、Ｂｅｒｎａｌ　（ダナーファーバー癌研究所ＣＤ ａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｅｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から、ＲＣＡ　５ ＨＣＴ１１８ｂ　、　ＧｌｙおよびＭｏ５ｅｒはＭ、Ｂｒａｔｔａｉｎ　（ペイ ロー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　） から、）ｌＴ２９、ＣＬ１８７　、ＣＣＬ２２［１，１、ＣＣＬ２２２、ＣＣ’ Ｌ２２４、ＣＣＬ２２７、ＣＣＬ２２８、ＣＣＬ２２９、ＣＣＬ２３３、ＣＣＬ ２３４、ＣＣＬ２３７およびＨＴＢ３９はアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクションからえた。これらの細胞株は全てよく特徴付ｌすられ、文書で裏付け られており、かつヒト結腸起源である。全ての細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｈ Ａ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）および１％ＮｕｔｒｉｄｏｍａＮＳ　（Ｂｏｅｈ ｒｆｎｇｅｒ）で補われた５０％ダルベツコ修飾イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）お よび５０％ＰＰＭＩ　１６４０　ＭＥＤＩＩＪＭ　（ＧＩＢＣＯ）において、５ ％ＣＯ２および湿度１００％で、３７℃で増殖させた。

ＲＮＡの調製 培養細胞からの全細胞ＲＮＡを、コックスＣｃｏｘ、Ｒ，Ａ、　（１９８６）　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、　１２．１２０−１２９　）およびストロ−マン らＣ３ｔｒｏｈｔａａｎ、Ｒ，Ｃ６、Ｍｏ５ｓ、Ｐ、Ｓ、　、Ｅａｓｔｗｏｏｄ 、Ｊ、Ｍ、および５ｐｅｃｔｏｒ、Ｄ、（１９７７）　Ｃｅ１ｌ　１０．２８５ −２７３　）の方法によって単離した。外科的な検体からの全細胞ＲＮＡを、チ ルブラインら（Ｃｈｉｒｇｗｆｎ、Ｊ、Ｍ、　、Ｐｒｙｚｂｙｌａ、Ａ、Ｅ、　 、ＭａｃＤｏｒｍｄ、Ｒ，Ｊ、およびＲｕｔｔｅｒ、Ｗ、Ｊ、　（１９７９）　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１ｇ、５２９４−５２９９　＞　に従って調製した 。グアニジンイソチオシアネートを用いる抽出の前に、液体窒素の存在下で、正 常およびｆｔｉ瘍組織組織り潰して砂様粒子にした。

９８Ｒ３２２クローンＡ　ｃＤＮＡライブラリーの構築クローンＡ細胞からのポ リ　（Ａ）”ＲＮＡを、ハフら（Ｈａｆｆ、Ｌ、Ａ、およびＢｏｇｏｒａｄ、Ｌ 、（１９７Ｂ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５．４１１０−４１１５　）が記載した ように、ポリ（Ｕ）−セファデックス・カラムを２回用いることにより精製した 。第１のｃ　ＤＮＡ鎖をオリゴ−ｄＴをプライマーとして用いてＡ　Ｍ　Ｖ逆転 写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ）により 合成し、第２の鎖をウィッケンスら（Ｗｉｃｋｅｎｓ、Ｍ、Ｐ、、Ｂｕｅｌ　Ｉ 　、Ｇ、Ｎ、およびＳｃｈ　ｉ　ｍｋｅ、ｌ？、Ｔ、（１９７８）　Ｊ、ＢＩｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３．２４８３−２４９５　）に従ってＤＮＡポリメラーゼ Ｉを用いて調製した。ｃＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、ｄＣＴＰで尾を付 け、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ａ−５０カラムによって分画した。４００　ｂｐより大き いｄＣ−足付ｃＤＮＡ　（ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ　ｃＤＮＡ）のみをプールし、Ｐ ＳｔＩ分解ポリ（Ｇ）−尾骨ｐＢＲ３２２プラスミドにアニールした。ダガート ら（Ｄａｇｅｒｔ、Ｍ、およびＥｈｒｌｉｃｈ、Ｓ、Ｄ、（１９７９）　Ｇｅｎ ｅ　６．２３−２８）に従って、大腸菌ＨＢＩＯ１の形質転換を行なった。この ライブラリーの複雑度は約５Ｘ１０４クローン／　；ｔｇ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａてあ った。

プラスミドｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング形質転換した大腸菌の個々の コロニーをマスター・アガ〜・プレートおよびテトラサイタリンを含有する２つ の別のフィルター・プレートに移した（ＭａｎｊａＬｊｓ、Ｔ、　、Ｆｒｊｔｓ ｃｈ、Ｅ、Ｆ。

および５ａｒＱｂｒｏｏｋ、Ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ３）ｌ、ＮＹ　）　）。

これらのコロニーをグリッド・パターンに配置した。３つの全てのプレート上の 各々のコロニーの同じ位置に描線した。

ニトロセルロースフィルター上のコロニーをアルカリで溶菌し、固定した。クロ ーンＡもしくはＣＸ−１のポリ　（Ａ）“ＲＮＡから生成【、た、３２ｐ−標識 した第１のｃＤＮＡ鎖をコロニー・ハイブリダイゼーションに用いた。総計１， ５００のコロニーをスクリーニングした。

ＲＮＡゲル　プロット−ハイブリダイゼーション組織および培養細胞から抽出し た全ＲＮＡ　（１５ｕｇ）をホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルにおい て電気泳動させ、シード（Ｓｅｅｄ、Ｂ、（１９８２）　Ｇｅｎｅｔ、Ｅｎｇ、 　４．９ｌ−１０２）に従ってＧｅｎｅＳｃ、ｒｅｅｎＰＩｕｓ　（デュポン社 ）に移した。アルカリ性溶菌およびＣｓＣΩ勾配遠心により組換えプラスミドを 調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、およびＳａｍ ｂｒｏｏｋｌ　。

（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　、　Ｃ８Ｈ、ＮＹ）　）　ｏ　プラスミドＤＮＡを精製し、ＰｓｔＩで 分解した。電気泳動の後、ｃＤＮＡインサートを、ＬＩＤ／Ｘフィルター・シリ ンジ（Ｘｙｄｅｘ　）を用いて溶出し、フェノール／クロロホルムで抽８し、エ タノール沈殿により濃縮し、およびＴＥ緩衝液に懸濁した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｐ、およびＳａｍｂｒｏｏｋｌ、　（１９８２） 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、 　Ｃ８Ｈ、ＮＹ：ｌ　）　、　−１−ツクトランスレーション処理３２ｐ−標識 ｃＤＮＡインサートをＧｅｎｅＳｃｒｃｅｎＰＩｕｓ上のプロットのハイブリダ イゼーションに用いた。濃度計測の読取りは、ＬＫＢ　ＵｌｔｒｏＳｅａｎ　Ｘ Ｉ、レーサー濃度計ＣＬＫＢ　）を用いて行なった。

ＣＸ−１ｃＤＮＡ　λｇｔｌｏファージ・ライブラリーの構築ヒト結腸癌細胞株 ＣＸ−１をグアニジニウムチオンアネ−１・を用いて抽出することにより、全Ｒ ＮＡを単離した。ポリ（Ａ）−ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・アフィ ニティ・カラムを用いて選択した。

（ａ）第１鎖合成、第１鎖ｃＤＮＡの合成は、５０ｍＭ）リス−）ＫＣｆ７　、 　ｐＨ８，３，５０ｒｎＭ　ＫＣｆ）　、　６　ａ＋Ｍ　ＭｇＣｆ）　７．１０ 　ｍＭ　Ｄ　Ｔｒ、０．５　ｍＭ　ｄＮ　Ｔ　Ｐ、オリゴ（ｃｌＴ）　１２−１ ８５Ｄ１１ｇ／ｍｌ、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡ　１（］１１１ｇのＲＮＡ　１００ ａ／ｍｌ、およびニワトリ逆転写酵素］００ｔ）μ／ｍｌを含む反応（体積２０ ０ｕρ）において、４２°ＣＦ１．５時間行なった。放射性ヌクレオチドで標識 されたｃＤＮＡの頻発二ノキングを最小にするために、第１鎖合成の主反応では 放射性標識はしていない。標識は、上記と同様の成分と、コレニ加Ｋ（、［”Ｐ コ　ｄｃＴＰ（比活性　：３０００Ｃｉ　／μモル）１０７１ｃｉを含む取込み 反応をモニターするためにのみ、別のチューブで行なった。この反応は、ＳＤＳ およびＥＤＴＡをそれぞれ最夛冬り農度ｆ）　、　４９ｏおよび１０　ｍＭとな るように添加することにより終了させた。ｊＦＷられた生成物は、フ、ｆｆ−ノ ールおよびクロロホルム／′イソアミルアルコール（２４７′ｌ）で抽出し、Ｇ −５０セフアデツクスの５ｍｌ勾ラムについてクロマトグラフィを行なって取込 まれていない三リン酸ヌクレオチドを除去した。空隙容積のｃＤＮＡ分画をプー ルし１、エタノール沈殿により濃縮しメ、；。エタノール沈殿ｃＤＮＡに取込ま れた放射活性を基にして、添加ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ　］Ｉ！ｇ当り第１鎖ｃ ＤＮＡ約０．１■が生成した。

（ｂ）第２鎖合成：第１鎖反応からのｃ　Ｄ　Ｎ　ＡぺＬノットを水に溶解し、 第２鎖合成を、第１鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｏ，５−１，Ｏｌ！ｇ、２０ｍＭ　トリ ス−ＨＣ４１％、　ｐＨ７，５、１００ｎＭ）ｌ　ＫＣｆ、５　ｍＭ　ＭｇＣΩ ２．１０　［１１Ｍ　ＤＴＴ、　１０　ｍＭ　（Ｎ）］４）　２８０４．５０ｊ ！ｇ／ｍ、９Ｂ　ＳＡ　（ヌクレアーゼ非含有）、１５０ｇＭＢ−＼ＡＤ　）ｔ 　／　ｒｎｌ　ＲＮ　ａｓｅＨ１５０μ／−大腸菌ＤＮＡリガーゼ、４０ＭＭｄ ＮＴＰ、２０μＣｉＣ”Ｐ］　ｄＣＴＰ　（比活性：　３０００Ｃｉ　／μモル ）、および２５０μ／ｌＩｌρＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを含む反応（体積４０ ０μｇ）において行なった。１５℃′で一晩インキュベートシ、０．４９゜ＳＤ ＳおよびｌＯｍＭＥＤＴＡを用いて終了させた。取込まれていない三リン酸ヌク レオチドからの二本鎖ｃＤＮＡの生成は、上に記述したセファデックスＧ−５０ カラム・クロマトグラフィにより達成した。ポリ　（Ａ）”ＲＮＡからのｃｊｓ −ｃＤＮＡのおおよその収率は１ｂ−２０９ｏてあった。

（Ｃ）フィルインｕｉｌｌ−ｉｎ　）およびメチル化反応：λｇｔ１．０ベクタ ーのＥｃｏＲＩサイトへの完全な長さのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインザートのクローニン グにおいては、鈍端（ｂｔｕ口ｔ−ｅｎｄｓｄ　）ＥｅｏＲＩ　リンカ−の適合 のために鈍端ｃＤＮＡを生成させ、メチル化によりｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの内部Ｅｃｏ Ｒ１ザイトを保護する必要かある。フィルイン反応は、３０ｎ＋Ｍ）リス・アセ 云−ト、ｐＨ７，８、Ｇｏ　ｍＭ　Ｋ−アセテート、　１０　ｍＭ　ＭｇＣΩ２ 、０．２　ｍＭ　ＤＴＴ　、０．１ｍｇ／　ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ　、０．１．ｚ／ ｍｌ　ＲＮ　ａｓ　ｃ　Ａ　、１−００　μ　／ｍ１ＲＮａｓｅ　Ｈ，５０ＭＭ 　Ｂ−ＮＡＤ　、２５０Ｉｌ／ｍｌ　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡリガ＝ゼ、３０［１１ １λ、１ｄＮＴＰおよび５００μ／ｍ１Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを含む反応（体 積８０μρ）において、３７℃で３０分間行なった。ｃＤＮＡをエタノール沈殿 により回収し１、続いて、５０ＩＩＭトリスー　ＫＣｆ、ｐｔｌ　８．０．５　 ｍＭ　ＥＤＴＡ、５　ｍＭ　ＤＴＴ。

０．１　ｍＭ　Ｎａ−アセテート、５０ＭＭＳ−アデノシルーメチオニン、およ び１０００μ／ｍｌ　ＥｃｏＲＩメチラーゼを含有する緩衝液中におい′Ｃ，メ チル化を３７℃で３０分間行なった。二のｃＤＮＡをエタノール沈殿により回収 し１続いて、５０ｎ＋Ｍ）リス・ＫＣｆ、ｐｏ８．ｏ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ 　ｍＭ　ＤＴＴ、０．］、　］ｍＭ＼ａ−アセデーーート５０ＭＭＳ−アデノシ ルーメチオニン、および１０００μ／’ｍｌ　ＥｃｏＲＩメチラーゼを含有する 緩衝液中において、メチル化を３７℃で１時間行な・った。

（ｄ）　ＥｃｏＲ１リンカ−・のｃＤＮＡへの連結：ｃＤＮＡに９＄部ＥｃｏＲ Ｉサイトを生成させるために、ｃＤＮＡ分画の５−リン酸化ＥｅｏＲＩリンカ− （０，５に／′ｍｌ）の鈍端連結を、（票準うイゲーション緩汁ｊｆ夜（５０ｍ Ｍ！・リス・）ＫＣｆ、ｐＨ７，６、１０１ＴＩ１０１ＴＩ！　２．２０　ｍＭ 　Ｄ　Ｔ　Ｔ　）中において、ｉ　ｎＭＭ　ＡＴＰ、　Ｔ２ＯＮ　Ａすθ−セ２ Ｑ　Ｏ：Ｌ＝・７・１・の存合二下で、１５°Ｃて一晩行なつｊ二。

（ｅ）［ミｅｏＲｌエン・トヌクｂアーゼをＩＴＪいｔ：　Ｅｃｏｌ？！連ｆ３ ｃＤＮＡの分解：上述の連結生成物をｔＥｃｏＲＩエードヌクレア−セを用いて 分解［７、ｃ　Ｄ　Ｎ−Ａの外部ＥｃｏＲＩサイトを露出させた。

この分解反応は、標準ＥｅｏＲＩ緩衝液（１００ｍＭ　ｌ〜リス・Ｉ［Ω、ｐｔ （７，５，１００ｎＭ　’Ｊａ（Ｉ！　、５　ｍＭ　ＭｇＣΩ２）中に、ｃＤＮ Ａｏ、１−０，５■当り　ＥｃｏＲＩエレドヌクレアーゼ５０−１００ユニツト を倉む。３７℃で４−８時間インキュヘートを行ない、その後６８℃で１５勺間 加熱することにより、ＥｃｏＲＩ酵素を不活性化した。

（ｆ）ＣＬ、−４ＢカラムクロマトグラフィによるＥｃｏＲＩ７３解ｃＤＮＡの 解裂ＤＮＡサイズ分画：　ＣＬ−４Ｂ−セファロースカラムを用いて、ＥｃｏＲ Ｉ−分解ｃＤＮＡを精製し、ｃＤＮＡクローニングのために所望のサイズを選択 した。二〇カラム精製の目的は、（ｉ）ｃＤＮＡのベクターＤＮＡへの効果的な 連結を妨げる過剰のポリマーリンカ−および／または分解リンカ−（通常２００ ｂｐ未満のサイズ）からＣＤ　Ｎ　Ａを＃Ｆｉ離し、および回収し７、（ｉｉ） 特定のベクターへのクローニングの前にサイズによってｃＤＮＡを分画する二と である。ＣＬ−４Ｂ−２００セフアロース樹脂を５−ピペットに用意し、カラム 緩衝液（１０１ＩＩＭトリス−ＫＣｆ、ｐＨ８，０，６００ｍＭ＼ａＣΩ、　］ −ｍＭＥＤＴＡ。

および０．Ｉ％ザルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　）て平衡にした。カラム緩衝 液０．３−にＥｅｏＲＩ−分解ｃ　Ｄ　Ｎ−Ａ試＋４を添加し、２０の１００μ ρ分画を集めた。各分画の放射活性を検査し２．１９６アガロ一スケル士でサイ ズを分析［−２た。λ　ｇｔｔｏベクターに全相（胞１　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブ ラリーを構築ずろ我々の１］的のために、５００１）りより大きいｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａを選択し２、プールした。次いで、回収したｃＤＮＡをエタノール沈殿で濃縮 し、少ユの１０　ｍＭトリス・ＩＩｃΩ、ｐＨ７，５／　ｌ　ＩＩＩＭ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ−Ａ緩衝液に溶解した。

（ｇ）選択（またｃＤＮＡインナートのλｇｔ］０ベクター・＼の連結：ｃＤＮ Ａライブラリーのλｇｔ、ｌＯヘクターへのクローニングは、ＥｃｏＲｌ−分解 、勺ラム精製およびづイズ選択ｃＤＮ　Ａインサートを、予めＥＣ，ｏＲＩ開裂 および５°−悦リン酸化したλｇｔｌＯアームに連結することにより達成した。

この連結反応（１０ＡＬｉ）は、ベクターＤＮＡ、０．１−０．５ｔ！ｇインサ ートｃＤＮＡ、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ、Ｔ４リガーゼ１−１０ユニツトを標準ライゲ ーション緩衝液に含んでいる。１５℃で一晩インキユベートした。

ファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングプラスミド８−２ｖからの３２ ｐ−標識ｃＤＮＡインサートをＣＸ−１λｇｔｌＯライブラリーのスクリーニン グに用いた（Ｈａｎｊａｔｉｓ、Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、およびＳａ ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、　（１９８２）　Ｈｏｔｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏ！ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　ＣＳＨ５ＮＹ）　）　ｏ約１０，００ ０のプラークのスクリーニングを行なった。

ＤＮＡ配列決定 Ｍ１３ジデオキシオリゴヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法（Ｓａｎ ｇｅｒ、Ｆ、　、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、およびＣｏｕ　ｌ　ｓｏｎ　、　Ａ　、 　Ｒ。

（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４．５４８３−５４ ８７　）を用いた。

Ｍ１３ユニバーサル・プライマーまたは下記配列を有する特別に合成した１７− 塩基オリゴヌクレオチドを用いて、８−２ｖおよび」−９の両インサートを順に 配列した。

＃　１　”　ＣＴＧＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡ”’＃　２２″ＴＧＧＣＣＡ ＧＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡ２３’　（相補鎖）＃　３６４７ＣＴＣＣＴにＣＴＣ； ＡＧＡＡＧＧＣＡ６６３＃４６９’　ＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡ６８ ’　（相補鎖）Ｍ１３は二ニー・イングランド・バイオラブ（Ｎｅ警Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ）からの、およびシクエナーゼ・シーフェンシング・キット （Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ）はユナイテッド０ステ ート・バイオケミカル（Ｌｌｎｊｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｊｏｅｈｅｍｊｃａ ｌ　）からのものである。合成オリゴヌクレオチドはイー・ラインヘルツ（Ｅ、 Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ）研究所（ダナー７７−バー癌研究所）ノヒー・エッチ・セイ ヤー（Ｐ、Ｈ，５ａｙｅｒ　）の好意によるものである。

コンピュータ支援配列解析は、分子生物学コンピュータ・リサーチ・リソース／ ノナ−ファーバー癌研究所の／Ｘ−バード公衆衛生学校（Ｈａｒｖａｒｄ　５ｃ ｈｏｏｌ　ｏｆ’　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　）において行なった。

８−２Ｖ　Ｂ−４Ｗ　＋−４Ｅ １２３４５６７８９１ｏｌｌ　１２１３１４１５１６１７１８１９２０ＦＩＧ、 ２ ｅＪＪ　ｈ：５　ｔ−１ＣＣＪｃ　？ｌｌＩ　（Ｊｃ　ｕａ　＜ｗ　＜ｙＱ　＝ 避　ｂ３　乏２２芝　に＝　乏芝　６コ　足兵　旨８ＩＪ−１（Ｊ＞　１−ＩＩ −Ｉ　Ｃｌ喝　（り、−１　（ＪＩＪ　ＣＪＯリフ　（≧［−ＩｌａｏＰ４＜＞ 　ｕ−＋　ｈｍ　ＬＩＪ：　（Ｊｋ−？Φ　Ｑ−Ｃ：ｌ＞　ａａ　ｈｈ　ａ＜　 ａ＞　ベト　Ｑ山　（Ｊ−Ｑ口ｈａ、？＞　ＣＪｃ　ｌ−１−１ｈｆ６　＜飄　 ０α　Ｑ−〇哨西２８６　シ＝　暮ε　８；　８已　き浣　８ズ　乏ご？ｊ　（ ）　ＣＪ＞　？ａｌ　（ｊｏＩ　ＥｓＱ　ｌｌ−１１−＋　Ｅ−１Φ　ＯＣむ３ 　号３８＄　知＝　淀に　８記　足ε　セ＝　乏芝ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３５９５ 国際調査報告 ＵＳ　８９０３５９５ ＳＡ　３１０１４

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に第３図に示す配列を含む、ヒト結腸癌細胞由来の、完全な長さのヒ ト・ラミニン結合タンパク質ｃＤＮＡ配列。
2. ２．第３図において、ヌクレオチド番号１６２で始まり、ヌクレオチド番号８２ ９で終了する配列に実質的に相当する請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ配列の 下位配列。
3. ３．第３図において、ヌクレオチド番号１で始まり、ヌクレオチド４３で終了す る配列に実質的に相当する請求の範囲第１項に記載のｃＤＮＡ配列の下位配列。
4. ４．ＡＴＣＣ受付番号４０４８９を持つ、Ｊ−９と命名された組換えクローン。
5. ５．ＡＴＣＣ受付番号４０４９０を持つ、８−２Ｖと命名された組換えクローン 。
6. ６．請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の配列によってコードされる ラミニン結合タンパク質。
7. ７．請求の範囲第６項に記載のラミニン結合タンパク質をコードする、実質的に 精製されたＤＮＡ配列。
8. ８．患者における癌細胞の存在を検出する方法であって、ａ．請求の範囲第１項 、第２項または第３項に記載のｃＤＮＡ配列を有する標識ｃＤＮＡプローブを供 給し、ｂ．該プローブを患者からの組織または体液試料にさらし、および ｃ．ハイブリダイゼーションのための工程ｂの反応をモニターすることを具備す る方法。
9. ９．癌細胞が結腸癌細胞である請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．患者における癌細胞の存在を検出するための試薬であって、請求の範囲第 １項、第２項または第３項に記載のｃＤＮＡ配列を有する標識ｃＤＮＡプローブ を含む試薬。