JPH04502104A - Ｌ―フェニルアセチルカルビノール（ｐａｃ）の製造方法，その方法に使用するための固定化された細胞マス及びその細胞マスを調製するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｗ 本発明＋！、１−エフェドリン及びｄ−プソイドエフェドリンの製造において中 間体として有用であるフェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の製造方法に関 する。本発明はまた、フェニルアセチルカルビノールの製造に使用するために特 に適合された固定化細胞及びその固定化細胞を供給するための方法にも関する。

プソイドエフェドリン及びエフェドリンは２種の主な医薬である。プソイドエフ ェドリンは鼻のうっ血除去薬として有用であり、そしてせき及びくしやみ用カプ セル、重用薬物、算用スプレー、算用ドロップ及びアレルギー及び枯草熱用医薬 における成分として見出される。エフェドリンは局部的な算用うっ血除去薬、シ ョックの温和な形のための処置（ＣＮＳ刺激剤）及び気管支拡張剤として有用で ある。

Ｌ−エフェドリンは、多くの植物種に見出される天然の生成物である。Ｌ−エフ ェドリンは、アルカリによる初期処理、続く有機溶媒による抽出により乾燥せし められた植物材料から得られる。ｄ−プソイドエフェドリンもまた天然に見出さ れるが、それは、Ｗｅｌｓｈ転位より１−エフェドリンから高収率で容易に得ら れる。

Ｌ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）は、１−エフェドリンの合成にお けるキー中間体である。Ｂｒｅｗｅｒの酵素にょるＬ−（−）フェニルアセチル カルビノールへのベンズアルデヒドの転換は、Ｎｅｗｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｈｉｒ ｓｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、、　１１５　：２８２〜３１．０（１９２１ ）により初めに記載されている。より詳しくは、ベンズアルデヒドば、次のよ・ うにして、発酵性酵母によ／’）　Ｌ　−（−）　’フェニルアセチルカルビノ ールに転換され得る二ＰＡＣを製造するためにベンズアルデヒドの酵母転換及び ｌ−エフェドリンを製造するためにＰＡＣの化学的転換の組合せは、アメリカ特 許第１，９５６，９５０号に記載される。ＰＡＣは次のようにして光学的に純粋 なし一エフニドリンにメチルアミンによる化学的還元アミノ化により転換され得 る二次に、ｌ−エフェドリンは、次のようにして高収率でｄ−ブソイドエフェド リンに転換され得る：高収率及び高純度でＬ−（−）フェニルアセチルカルビノ ールを形成するために酵母によるベンズアルデヒドの微生物学的転換は合成路の 商業的操作のために重要なものであることがこの反応スケムから明らかである。

酵母からのＰＡＣの製造のだめの従来の方法は、糖蜜、ビール麦芽汁、ＭｇＳＯ ４及び他の塩を５．５〜６．０のｐｔｉで含む培地への酵母の添加を包含する。

初めの短期間の撹拌及び通気の後、アセトアルデヒド及びベンズアルデヒドの混 合物を一部添加する。約７．５ｇ／ＬのＰＡＣの最終濃度が、５〜１０時間の連 続した撹拌及び通気で得られる。ｂｒｅｗｅｒ又はｂａｋｅｒの酵母により、ベ ンジルアルコールは常に共同生成物として観察される。ベンズアルデヒド基材の ＰＡＣの報告された最高の収率は約７３％である。残るベンズアルデヒドはアル コールに転換される。アセトアルデヒドはＰＡＣ製造のために必須ではないが、 しかしこの化合物の添加は、ＰＡＣの最高収率を達成するために必要とされる。

発酵性酵母によるＰＡＣの合成に関する文献のほとんどは収率の最適化を論じる 。高レベルの酵母が比較的低レベルのＰＡＣを得るために必要とされる一般的な 合意が存在する。

人手できる文献は１、ＰＡＣへのベンズアルデヒドの現在の酵母転換法は不十分 であり、そして酵母生産性は低いことを示唆する。酵母は、ＰＡＣ産生が基質及 び最終生成物への高められた暴露により低下するので、多量では使用され得ない 。

さらに、現在の酵母転換は発酵流体に低濃度のＰＡＣのみを供給する。これば、 多量の工程体積及び群って多量の抽出溶媒を必要と１７で、そして、゛これば労 力及び商業的操作乙こおけ１５効用費用に対しご逆に影響を及ぼず。

さらに、ベンズアル′ｊ′し１′からのＰ　Ａ　Ｃの収率は、所望しない副生成 物である１、ペン・プルアルコールをＬ４するためφこアルコールデｉごドロゲ ナーゼ乙：二よろ−、ンズアルデヒドのＭＨＩＸ還九の結果とし７て低められる 。試験され、たＰＡＣ産生株のずべては、べ）・ジルアルコールを生成する。

従−て、ベンズアルデヒドの酵母転換によりＰ　Ａ　Ｃを製造−Ｊ−るための改 良された方法のための必要性が当業界びニオ、ンいて存在する。−（・の方法は 、これまで、よりも発酵べ１体にＦ゛、へＣのより高い酵１す生産性及び、より 高いＭ犬種６を付与する。さらム丁、ベル竺フルアルコール・へ、の−＼ン【ア ルー′−；−″ｌ−ドの触媒還元ハ１ρイＩ／」二されるはずである。

ざと１月−（７）−要ヤリ 本発明は、ペンズアルデ（−ドの酵母転換ｃ：、ζるＰＡＣの生成のだめの改良 された方法を（、！供づ゛ることによ−１、τ当業界？、二おけるこれらの必要 性を満たすことが目的である。本発明の方法は、現在の方法におけるよりも発酵 流体にＰＡＣのより高い酵母生産性及びより高い濃度の獲得を可能にする。さら に、本発明の方法は、副生成物として低い又は実質的に検出できない量のベンジ ルアルコールを獲得しながら、ＰＡＣの生成庖可能にする。

より詳しくは、本発明は１．−フェニルアセチルカルビノール（Ｆ’ＡＣ）の生 成方法を提供し、ここで前記方法は、ＰＡＣ生成の闇、゛、；２ルデヒド阻害に 対して耐性を示す突然変異酵母株の非生存細胞から実質的に成る固定化された細 胞マスを供給する（ことを含んで成る。その細胞は内因性ビルベートデ力ルボキ ミ゛・ラーゼを含む。その細胞”７スにおける細胞は壁を有ｊ７、そして隣接す る壁は化学的に架橋されている。細胞マスにおける細胞壁の少なくとも一部が、 反応体への細胞マスの透過性を高めるために変性される。ベンズアルデヒド及び ビルベ−１−の源が、Ｌ−フェニルアセチルカルピノ・〜ルを生成するために固 定された細胞マスの存在下で水性培地において反応甘し、められる。その水性培 地は、ベンズアルデヒドのために非阻古性水混和性有機溶媒である補助溶媒を含 む。その補助溶媒は、補助溶媒なしに行なわれる類似する反応にわたってＰＡＣ 形成の速度を早め、そして発酵、反応の水性培地におけるＰ、へＣの濃度を高め るのに十分な量で使用される。生成物は、所望乙こより細胞マスから分離され得 る。

本発明は、ＰＡＣの生成のための類似する方法を提供し１．１′″、、二で固定 化された細胞マスにおける突然変異酵母株はｉヱ；ｉｏｗ（古７ｙ−−ｔ−ンｅ 　’ｙ　７　Ｉ　Ｐ−２１８０−１＾−８ｐａである。水性培地におけるベンズ アルデヒド及びピルベートの源が、突然変異酵母を含む固定細胞マスの存在下で 反応せしめられる。

ＰＡＣはベンズアルデヒドの転換からの生成物として分離され得る。

さらに、本発明は、Ｌ−フェニルアセチルカルビノールへのベンズアルデヒドの 転換のための細胞マスを供給する。その細胞マスは、ＰＡＣ産生の間６．アルデ ヒド阻害に対する耐性を示す突然変異酵母株の非生存性細胞から実質的に成る。

その細胞は内因性ピルベートデカルボキシラーゼを含む。細胞マスにおける細胞 は細胞壁を有し、そして隣接する細胞の壁はポリアゼチジンにより化学的に架橋 されている。細胞壁の少なくとも一部が、反応体への細胞マスの透過性を高める ために変性される。

最後に、本発明は、本発明の細胞マスを調製するための方法を提供する。この方 法は、ＰＡＣ産生の間、アルデヒド阻害に対する耐性を示す突然変異酵母株の細 胞を供給することを含んで成る。その細胞は細胞壁を有し、そして内因性ピルベ ートデカルボキシラーゼを含む。細胞は、架橋された細胞の自立マスを形成する ために隣接する細胞の壁を化学的に架橋するための量及び条件下でポリアゼチジ ンと混合される。

ポリアゼチジンの量及び架橋の条件は、細胞マスが基質及び生成物に対して透過 性であるような量及び条件である。

図面の簡単な説明 本発明は次の図面により十分に理解されるであろう：第１Ａ図は、ポリアゼチジ ンと架橋されたＳ、セレビシアエ酵母細胞の電子顕微鏡写真（３６０ｘ）であり 、そして第１Ｂ図はその細胞の一部の拡大写真（１８０ｏｘ）であり；第２及び ３図は、本発明の固定された細胞を用いてのＰＡＣ形成に対する補助溶媒の効果 を示し；そして第４図は、ＰＡＣのバッチ及びカラム生成法を図的に示す。

まししＩ　の晋己 本発明の方法は、高収率でＬ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）を生成 するために適合される。略語“Ｐ　Ａ　Ｃ”は、Ｌ−（−）フェニルアセチルカ ルビノールとして固定されるフェニルアセチルカルビノールの立体特異的形を言 及するために使用される。名称Ｌ−（−）フェニルアセチルカルビノールは、名 称１−フェニルアセチルカルビノールと交換可能的に使用され、そして両名称は “ＰＡＣ”として略される。

ＰＡＣはベンズアルデヒド及びピルベートの転換により調製される。“ピルベー ト″は、成分として言及される場合、その従来の感覚で使用される。

ベンズアルデヒド及びピルベートの転換は、微生物の突然変異株により本発明の 方法で行なわれる。本発明において使用される場合、用語“突然変異体°°は、 親株とその子孫との間の遺伝子型に差異が存在する親機生物のすべての子孫を包 含することを意味する。その用語はまた、遺伝子型の差異を伴って又は伴わない で親株から異なった表現型が存在する子孫を包含することも意味する。もちろん 、その用語はさらに、親株からの遺伝子型及び表現型の両者に差異を示す子孫を 包含する。

さらに詳しくは、本発明の方法は、ピルビン酸及びベンズアルデヒドをＬ−フェ ニルアセチルカルビノールを効果的に転換する酵母微生物の突然変異体により行 なわれる。この転換に使用される微生物の種は内因性ピルベートデカルボキシラ ーゼを含む。本明細書に使用される場合、略語”ＰＤＣａｓｅ”とは、ピルベー トデカルボキシラーゼ酵素を意味する。適切な微生物の例は、世じ昌欠三」？仁 丸２２　セレビシアエ及び左ｌ乏ｌ　フラレリの突然変異体である。

ピルベートデカルボキシラーゼはＰＡＣへのベンズアルデヒドの転換を触媒する 。この酵素はまた、ピルベートをアセトアルデヒドに転換することができる。ア セトアルデヒドの形成は、ベンズアルデヒドからのＰＡＣの収率の低下の明らか な原因である酵素を阻害すると思われる。

本発明は、アルデヒド阻害に対して耐性を有する突然変異株を利用する。これに よれば、親株に比べて、反応培地におけるＰＡＣの濃度により明らかなようにベ ンズアルデヒドの転換における突然変異株の活性の阻害の低下が存在することを 意味する。反応培地におけるＰＡＣの濃度は、同一の条件下で行なわれる２種の 発酵が比較される場合、親株による場合よりも突然変異株による場合により高い 。本発明の好ましい態様において、突然変異株は、親株よりもベンズアルデヒド からアセトアルデヒド及びベンジルアルコールをほとんど生成しない。

突然変異酵母細胞は固定化された細胞のマスを形成するために架橋され、これは バイオリアクターを形成するために反応容器に添加され得る。ＰＡＣを生成する 方法において固定された細胞を調製するための技法及び固定された細胞の使用が 記載されるであろう。突然変異株を製造するための方法の説明が次に提供される 。

１、　された　マスの言　Ｉ 従来のＰＡＣ合成方法は個々のバッチ反応のために新しく増殖された細胞の使用 を包含する。反応の完結後（たとえば生成物阻害による合成停止）、古い細胞を 捨て、そしてＰＣＡ生成物を精製する。さらに、従来の方法を用いる場合、細胞 はそれらの生存性を維持するために特別に処理されるべきである。たとえば、温 度調節、ｐＨ調節及び低ベンズアルデヒド濃度の維持が通常臨界である。

本発明において、内因性ピルベートデカルボキシラーゼを含む突然変異酵母細胞 を、固定された細胞マスを形成するために架橋する。ＰＡＣ産生の触媒として内 因性ピルベートデカルボキシラーゼを含む固定する全体の細胞は、触媒の拡張さ れ且つ連続的な使用を可能にする。さらに、損なわれていないＰＤＣａｓｅを有 する固定化細胞の多量のバッチが調製され、そして次での使用のために貯蔵され 得る。生存細胞又は単離されたＰＤＣａｓｅＯ代わりに、非生存性の完全な細胞 の固定化及び使用はまた、その固定化された細胞は破壊されるべきでなく、そし てその酵素は使用のために精製される必要がないので、相当の費用を節約する。

細胞をお互い架橋することにより、高価な不活性物理的支持体が必要とされない 。さらに、このＢ様で架橋された触媒は、適切な取扱い特性（すなわち１以上の 密度、流動性及びケークの欠乏）を有し、そしてまた、バッチ及びカラム操作の 両者において容易に保持されるほど十分に大きい。

内因性ピルベートデカルボキシラーゼを含む多くの種類の酵母細胞系が本発明の 実施において使用され得る。サツカロマイセス　セレビシアエ（Ｓ、セレビシア エ）及び−表２’ｆ２Ｌヱプ之票剣二乙九Ｕ）の多くの突然変異種が高い活性の ＰＡＣ生産体として培養されて来た。これらの突然変異体は下記にひじょうに詳 しく説明される。これらの突然変異体の使用は本発明の好ましい態様である。さ らに、多くの細菌細胞系が試験されており、これらの多くは本発明の目的のため の適切な野生型ＰＡＣ生産体である。

細胞は、商標Ｐｏ１ｙｃｕｐとしてＨｅｒｃｕｌｅｓ、　Ｉｎｃ、から市販され ているポリアゼチジンと架橋され得る。固定化方法に使用するための適切なポリ アゼチジンの好ましい形は、下記に示される構造を有する： この多官能ポリマーはＰｏ１ｙｃｕｐ　１７２として入手できる。

ポリアゼチジンの他の形は、たとえばＰｏ１ｙｃｕｐ　２００２及びＰｏ１ｙｃ ｕｐ　１８８３であり、これらはＰｏ１ｙｃｕｐ　１７２と同じように反応する と思われる。一般的に、細胞の外側のエンベロープにおける官能基に共有結合す ることができるいづれかの化学的反応性ポリマーが許容できる。他の架橋剤、た とえばグルタルアルデヒドが示唆され、そして満足するものであるが、ポリアゼ チジンは、それが一般的に卓越したバイオマス保持性を提供し、そして磨耗に対 してより耐性であるので、好ましい。細胞を架橋するためへのポリアゼチジン及 び他のポリマー材料の使用は、アメリカ特許第４．４３６．８１３号に記載され ており、この開示は、引用により本明細書に組込まれる。

細胞は、ポリアゼチジンにより細胞ペーストを調製することによって固定され得 る。細胞ペーストは一般的に、乾量に基づいて約５重量％〜約２５重量％及び好 ましくは約８重量％〜約１５重量％のポリアゼチジンを含む。典型的には、細胞 ペーストは、乾量に基づいて約２重量％〜約４０重量％の細胞、及び好ましくは 約１０重量％〜約３０重量％の細胞を含む。細胞及びポリアゼチジンは、細胞ペ ーストに約１：０．２〜約１：３、好ましくは約１：０．５〜約１：１の重量比 で組合される。

その得られる混合物は乾燥せしめられ得る。

本発明の好ましい固定化技法は、典型的には２４乾量％での細胞ペストと１２乾 量％でのポリアゼチジンとを１：０．５（細胞ペースト：ポリアゼチジン）の比 で混合し、そしてその得られたポリマー混合物を室温でトレー上で空気乾燥せし めることを包含する。

本発明の他の態様においては、細胞が、種々の物理的な支持体、たとえば砂、粉 砕されたブロック、イオン交換樹脂、セラミックビーズ、ガラスピーズ、ゼオラ イト及び珪藻上上でポリアゼチジンと架橋され得る。費用を考えると、細胞対細 胞の架橋が細胞対不活性物理的支持体の架橋よりも好ましい。

得られる架橋された細胞の自立マスは、架橋された細胞を含んで成る自由に流れ る粒子を形成するために大きさを小さくされる。より詳しくは４、架橋された細 胞はナイフ−ミルで粉砕され、そして０．５〜１．０価の篩に通される。大きな 粒子はミルを通して再び循環され得る。得られる調製物は触媒ビーズの形で存在 する。この態様で調製された触媒ビーズは、約−２０°Ｃ〜約４°Ｃの温度で貯 蔵され得る。

他の態様においては、細胞、水及びポリアゼチジンを含むスラリーがより厚いフ ィルムを形成するために注がれ、そして次に細かく粉砕され得る。この方法は通 常、多孔性内部を暴露し、それによって反応体及び生成物の両者の固定化された 細胞中への及びそれからの拡散を改良する。

触媒ビーズ調製物の走査電子顕微鏡写真は、酵母細胞がポリアゼチジンと重合架 橋することによって堅く充填されていることを示す。その固定化方法は、薄フィ ルムの形で細胞の架橋をもたらし、これは１２以下に切断され得る。第１Ａ図は ３６０×倍率での充填を示す。第１Ｂ図においては、個々の細胞が１８００　Ｘ の倍率で示されている。細胞の配列は、断片がかどから削り取られたプレートの 縁に比べて、プレートの表面上では異なっているように思われる。触媒の内部部 分（チップの縁で見られる）は、より網状であり、そして多孔性であるように思 える。この特徴は、フィルムの表面と内部部分との間の乾燥における差異による ものであると思われる。

固定化された細胞マスが調製された後、そのマスは反応容器に充填される。その 容器が満たされていない場合、適切な保持手段が、固定相に細胞を保持するため にその容器に挿入され得る。

２、　ヒ　れた　マス　いてのＰＡＣの′１′告　法生存細胞を用いてのＰＡＣ の従来の製造方法においては、ピルベートが外因性グルコースから生成される。

この従来の方法は次のものにより特徴づけられる：（１）遅められた反応速度； （２）生成物への基質の良好でない転換効率；（３）競争反応による所望しない 生成物の形成；（４）生成及び精製の容易さを妨げる、細胞増殖のために必要な 多くの培地成分の包含；及び （５）ベンズアルデヒドは細胞に対して毒性である場合、細胞生存性の維持。

これらの問題は、本発明の方法により回避される。損なわれていないピルベート デカルボキシラーゼを有する非生存性固定化細胞を用いることによって、ＰＡＣ の前駆体、すなわちとルベート及びベンズアルデヒドが触媒に容易に供給され得 る。

上記のようにして調製された固定化細胞を含む細胞マスは、水性反応培地におい てＰＡＣを生成するために使用され得る。

本発明の方法は、突然変異株の含浸細胞を含む従来のバイオリアクター中で及び 実質的に酸素欠乏又は嫌気性条件下で行なわれる。細胞マス中の細胞は非生存性 であるので、反応器に栄養培地又は同化可能な炭素源を添加する必要はない。

ＰＡＣを調製するための簡単化された方法が第４図に示される。

第４図に関しては、バッチＰＡＣ反応が図の上部に示されている。従来の実験用 フラスコ２が、反応培地、たとえば２０ＣＣの反応緩衝液及びバイオマス及び生 成物の産生のための適切な基質を含む培地により供給され得る。約０．２ｇの細 胞（乾量）又は同等の細胞乾量の本発明の固定化された細胞マスが反応培地に含 まれ得る。フラスコは室温で急速に振盪され、そしてＰＡＣがその反応培地から 回収され得る。

第４図の下部に関しては、カラムＰＡＣ法が記載されている。カラム６は、約１ ｇの本発明の固定化された細胞マス８により充填される。その得られた充填層カ ラムは、溜め１４から反応培地１２をポンプ１０により供給される。溜め１４か ら充填層６への反応培地の流速は、典型的には、１ｇの固定化された細胞マス８ を含む充填層のために約７〜１０ｄ／時である。

溜め１４における反応培地１２は、適切な緩衝液及び反応のための基質を含む。

溜め１４は磁気撹拌プレート１６上に配置され、これは溜めにおける磁気撹拌子 １８を回転せしめる。カラム６からのＰＡＣ生成物は両分コレクター２０　、２ ２　、２４及び２６に集められる。典型的には、５ｄの画分が集められるであろ う。

より一般的には、ＰＡＣ生成は、本発明の固定化細胞マスにより又は本発明の細 胞マスが移動することができる条件下で行なわれる。反応は、バッチ反応器又は 連続反応器で行なわれる。バッチ反応器が使用される場合、反応はトルーバッチ （ｔｒｕｅ　ｂａｔｃｈ）又は供給バッチシステムで行なわれる。本発明の細胞 マスを含む機械的に撹拌される発酵器又は固定層又は流体層がバッチ発酵のため に使用される。連続発酵は、固定化細胞反応器、たとえば固定層反応器又は流体 層反応器で行なわれ得る。ケモスタット、タワー発酵器又は連続撹拌タンク反応 器もまた、連続バイオリアクターとして使用され得る。

本発明の方法の実施に使用されるベンズアルデヒドは一般的に市販の材料の工業 又は医薬銘柄である。ピルベートは、ピルビン酸又は非毒性で水溶性のその塩の 工業又は医薬銘柄に由来する。非毒性アルカリ金属の塩、たとえばピルビン酸ナ トリウムが好ましい。

ピルベート及びベンズアルデヒドは、細胞マスじゆうに均質の分散性を確保する ために十分な乱流が存在する場合、その反応に個々に添加され得る。本発明の好 ましい態様において、ピルベート及びベンズアルデヒドは水性培地に一緒に混合 され、そしてその得られる組成物が反応に添加される。

反応の開始で、反応培地中のベンズアルデヒドの濃度は一般的に約５ｇ／Ｌ〜約 ２０ｇ／Ｌ、好ましくは約１２ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌである。同様に、反応培地 中のピルベートの濃度は、反応の開始で、約５　ｇ／Ｌ〜約２０　ｇ　／　Ｌ、 好ましくは約１２ｇ／Ｌ〜約１５　ｇ　／　Ｌである。

反応の開始での反応培地中のベンズアルデヒド：ピルベートの重量比は、一般的 に約０．５：１〜約２：１、好ましくは約１：１〜約１．２：１であろう。

本発明のＰＡＣ反応を包含するほとんどの化学的転換の主要目的は、生成物形成 の憂い割合及びできるだけ高い生成物の最終濃度を達成することである。より高 い転換速度及びより高い最終生成物濃度は、反応培地に一定の有機溶媒を導入す ることによって達成され得ることが見出された。有機溶媒は水混和性化合物又は ベンズアルデヒドが発酵温度で２５ｍＭ以上の程度に可溶性である化合物の混合 物である。有機溶媒はまた、非阻害性であり；すなわち有機溶媒は、発酵培地に おけるＰＡＣ形成の速度又は程度又はＰＡＣの安定性に悪影響を与えない。これ らの基準を満たす有機溶媒又は溶媒の混合物は、本明細書においては、°“補助 溶媒′”として言及される。

多くの種類のアルコールがこの目的のために使用され得る。

たとえば脂肪族アルコール、たとえばメタノール、エタノール、プロパツール及 びブタノールが補助溶媒として使用され得る。

より詳しくは、第２図は、補助溶媒を伴って及び伴わないで、ベンズアルデヒド のレベルを高めることによるＰＡＣ生成の速度及び程度を示す。たった２５ｍＭ のベンズアルデヒドを用いて及び補助溶媒を用いないでの発酵に由来する曲ｇＡ と、２５ｍＭのベンズアルデヒド及び補助溶媒として２０重量％のエタノールに より実施される発酵に由来する曲線Ｂとの比較は、ＰＡＣ形成の速度が補助溶媒 により実質的に高まることを示す。生成されるＰＡＣの量は、反応期間の最後で 類似する上昇を示した。曲線Ｂと曲線Ｃとの比較は、ＰＡＣ形成の速度及び量の 追加の上昇が、補助溶媒としてエタノール２０重量％を用いながら、ベンズアル デヒドの濃度を２５ｍＭから１００ｍＭに高めることによって達成され得ること を示す。第２図に示されるような補助溶媒の効果は刺激作用の１つである。２０ ％のエタノールは、２５ｍＭ４ｆどの低いベンズアルデヒドの濃度でさえ、ＰＡ Ｃ生成を刺激した。

エタノール及び他の一価溶媒の他に、短い鎖及び長い鎖のポリオールもまた、補 助溶媒として使用され得る。典型的な短鎖のポリオールはエチレングリコール及 びグリセロールである。第３図に示されるように、これらの溶媒の両者は、ＰＡ Ｃ成分を刺激することが見出された。特に、第３図は、２２０ｍＭのベンズアル デヒド及び３７．５％（ｗ／ｖ）の補助溶媒を用いて（ジメチルスルホキシド（ ＤＭＳＯ）は含まない）、２２°Ｃ及びｐＨ６で水性反応培地において微生物Ｓ 、セレビシアエＰ２１８０−ＬＡ−８ｐａの新鮮な細胞により行なわれる別々の バッチ発酵におけるＰＡＣ生成の速度及び程度を示す。補助溶媒が使用されない 発酵に比べて、補助溶媒としてエチレングリコール及びグリセロールが使用され る場合、ＰＡＣ生成の速度及び量の実質的な上昇が存在した。

補助溶媒として適切である長鎖ポリオールの典型的な例は、２００〜８００の分 子量を有するポリエチレングリコールポリマーである。より特定には、第３図に 示されるように、約２００（ＰＥＧ２００）、　６００（ＰＥＧ６００）、　１ ０００（ＰＥＧ１０００）、　３３５０（ＰＥＧ３３５０）及ヒ８０００（ＰＥ Ｇ８０００）の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）補助溶媒すべ ては、補助溶媒なしに行なわれた発酵に比べてＰＡＣ生成を刺激した。他の分子 量のポリエチレングリコール補助溶媒も使用され得ることが理解されるであろう 。

ジメチルスルホキシド及び短鎖アルコール、たとえばエタノール及びメタノール は、ＰＡＣ形成の速度及び程度がこれらの補助溶媒なしに行なわれる発酵にわた って高められても、ＰＤＣａｓｅ酵素の安定性に対して有害な効果を示すことが できる。

ＰＥＧ−１０００及び他のポリエチレングリコール補助溶媒はＰＤＣａｓｅ活性 を阻害しない。グリセロールは適切な補助溶媒であるが、ＰＥＧ−１０００はグ リセロールよりも安価であり、そしてより少量で十分である。

補助溶媒は、補助溶媒なしに（但し他の条件は同じである）行なわれるバッチ発 酵反応に比べて、バッチ発酵反応の水性培地におけるＰＡＣの形成速度を早め、 そしてＰＡＣの濃度を高めるのに十分な量で使用される。補助溶媒は一般的に、 約２重量％〜約５０重量％、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の水性培地 を含んで成る。これらの濃度は、水性発酵培地におけるベンズアルデヒドの濃度 が発酵温度で水におけるベンズアルデヒドの溶解性限界を越えるであろうことを 確保するであろう。低分子量のポリエチレングリコール補助溶媒は、相当する結 果を達成するためには、多量必要とされる。高分子量ポリマーは、高い溶解性を 付与するが、しかしそれらは通常、高価である。溶液中、２０％（−／ν）での ポリエチレングリコール−１０００が好ましい補助溶媒である。

本発明のＰＡＣ生成法は、適度な温度範囲にわたって行なわれる。その温度は一 般的に約１５″Ｃ〜約３０°Ｃ１好ましくは約２０″Ｃ〜約２２°Ｃである。最 適反応温度は、使用される微生物に依存し、そして最適温度は最少の実験により 決定され得る。

本発明の工程はまた、培養培地において適度なｐＨ値の範囲にわたって行なわれ 得る。そのｐＨは一般的に約５〜約８、好ましくは約６〜約６．５であり、そし ていずれにせよ、ＰＤＣａｓｅの変性又はベンズアルデヒドの転換の阻害を回避 するようなｐＨである。

発酵器は広範囲の細胞濃度にわたって作動され、そして最適濃度は過度の実験を 伴わないで決定され得る。前で記載したように、細胞濃度は、反応に対して主要 な挙動を有するように思われない。その値の実際の範囲は一般的にその方法の経 済性に依存するであろう。

反応培地中のＰＡＣの濃度は、生成物の回収の費用を減じるために最大にされる べきである。本発明の方法は、反応培地において少なくとも約１０　ｇ　／　Ｌ のＰＡＣ濃度で、及び好ましくは約２０″Ｃ〜約１５ｇ／Ｌの濃度で行なわれ得 る。

本発明の方法は、バッチ（回分）又は連続基調で行なわれ得る。連続反応による ＰＡＣの生成のためには、微生物がカラムに置かれ、そして標準反応混合物がそ のカラム上に送られる。酵素ＰＤＣａｓｅのための補因子であるチアミンピロホ スフェート（ＴＰＰ）が、たとえば０．１ｍＭの濃度で標準反応混合物に含まれ 得る。カラム流出液の両分を集め、そしてＰ　Ａ、　Ｃの存在について定量サン プリングする。

ＰＡＣは、従来の技法を用いて反応培地から回収され得る。

たとえば、懸濁細胞は、濾過、遠心分離又は沈降により反応培地における液相か ら回収され得る。その得られる液相はさらに、ＰＡＣ溶液を１４４１するために 処理され得る。ＰＡＣは、溶媒抽出によりその溶液から除去され得る。

ＰＡＣは、ＮｅｕｂｅｒＨ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、　１２８　：　６１０（１ ９２２）の方法に従って精製され得る。その精製された生成物のＧＣ／ＭＳプロ フィールは、１５０の分子量を有する親ピークを示す。反応の生成物はまた、正 しい光学的異性体、すなわちＬ−フェニルアセチルカルビノールであることが旋 光針より測定される。

メチルアミンとの反応によるエフェドリンへの転換が行なわれ、そしてその結果 は実証された。

本発明の方法は、副生成物としてより少ない量のヘンシルアルコールを含みなが ら、発酵培地にＰＡＣのより高い濃度の獲得を可能にする。たとえば、本発明の 方法は、約Ｏ重量％〜約１重量％及び好ましくは約Ｏ重世％〜約０．２重量％の ベンジルアルコールを生成する。より低い濃度のベンジルアルコールが、もちろ ん好ましい。なぜならば、ＰＡＣ収率が高められ、そして発酵培地からのＰＡＣ の回収の費用が減じられるからである。

本発明の方法が本発明の細胞マスにより行なわれる場合、より高い酵母生産性が 得られることがまた見出された。特に、酵母生産性は典型的には、本発明の細胞 マスによれば、約１〜約２ｇのＰＡＣ／　ｇ細胞／時及び好ましくは約１．５〜 約２ｇのＰＡＣ／　ｇ細胞／時である。

１−１　された″然・　による　生　のｉ、′Ｉ突然変異は、内因性ピルベート デカルボキシラーゼを含む酵母微生物、たとえばサツカロマイセス　セレビシア エ又は左／ンＬ　フラレリの種から選択された微生物において誘発され得る。得 られた突然変異体は、アセトアルデヒド阻害に対する耐性を有するコロニーを形 成する条件下でアセトアルデヒドの存在下で培養される。

突然変異誘発された微生物がアセトアルデヒドの存在下で培養される場合に得ら れるコロニーからの細胞を単離し、そしてベンズアルデヒド及びピルベートと共 に発酵の際でのＰＡＣの収率について試験する。細胞はまた、アセトアルデヒド 又はベンジルアルコールもしくは両者の収率について試験される。従って、高レ ベルでＰＡＣを生成し、そして低レベルでアセトアルデヒド又はベンジルアルコ ールを生成する酵母細胞を選択し、そして親株に比べて改良された収率でのＰＡ Ｃの生成のためにこれらの微生物を使用することが可能である。商業的な操作に おいての高い収率でのＰＡＣの生成は特に、生成の費用が減じられるであろうか ら、好都合である。

より詳しくは、突然変異は、メチルニトロソグアニジンを用いて、野生型（ＷＴ ）の半数体株であるＳ、セレビシアエＰ−２１８０−ＩＡに誘発された。多くの 突然変異体を、上記方法を用いてピルベートアルデヒドに対する耐性について選 択した。

Ｓ、セレビシアエＰ−２１８０−ＩＡ−８ｐａとして同定された突然変異株は、 野生型（ＷＴ）株Ｐ−２１８０−ＩＡよりもＰＡＣの生成において実質的により 有効であった。突然変異体−８ｐａの改良された性能は、アルデヒドによるＰＣ Ｄａｓｅの阻害における低下の結果であると思われる。

突然変異体Ｐ−２１８０−ＩＡ−８ｐａ及び他の突然変異株を供給するために使 用される方法の詳細な説明は、Ｄｏｎａｌｄ　Ｌ、　Ｈｅｅｆｎｅｒ。

Ｒｏｂｅｒｔ　Ｊ、　５ｅｅｌｙ、　Ｒｏｂｅｒｔν、Ｈａｇｅｔｓａｎ＋旧ｃ ｈａｅｌ　Ｊ、　Ｙａｒｕｓ及び５ａｌｌｙ　Ａ、　５ｕｌｌｉｒａｎにより１ ９８８年１０月２１日に出願され、そして“フェニルアセチルカルビノール（Ｐ ＡＣ）の製造方法、その方法に使用するための微生物及びその微生物を調製する ための方法”の標題を有するアメリカ特許出願第０７／２６１，０１０号に包含 される。この出願の全開示は、本明細書における引例に依存し、そしてその引例 により組込まれる。

本発明は次の例によりより明確に理解され、ここですべての部、割合、百分率及 び比は、特にことわらない限り重量によってである。

■ 突然変異体Ｓ、セレビシアエＰ−２１８０−ＩＡ−８ｐａ細胞を、５０　ｇ　／ ｌのグルコースを含む複合培地を有する２５０リットル発酵器中で急速に撹拌し ながら増殖した。０Ｄ＝３０で、空気添加を８１／分におさえ、そして培地の酸 素消耗を可能にした。

ＯＤ及びグルコースを走査し、そしてグルコースを、収穫の前、２５ｇ／βに落 した。細胞は、収穫の前、数時間（２〜６時）、嫌気性条件下での代謝を可能に されるべきであり、そしてグルコースは約１〜２ｇ／！以下に落とすべきでない 。

収穫するためには、培養物は氷に含浸された冷却コイルを通してポンプで送られ 、そして細胞は遠心分離により除かれた。細胞ペースト（２４乾量％）を、ポリ アゼチジン（１２乾量％）と共に１：０．５（細胞ペースト：ポリアゼチジン） の比で混合し、そして室温で一晩、テフロン被覆のトレー上で乾燥せしめた。細 胞／ポリアゼチジンスラリーを、０．２〜０．３ｇ／Ｃｌ１ｌ領域の割合で乾燥 トレー上に注いだ。これは、最終乾燥シートに適切な厚さを付与し、これは、ナ イフミルにより粉砕される場合、乾燥表面の上部及び底部に対立するものとして 十分な量のコアー又は縁を暴露した。その縁は、その上部又は底部よりも相当に 多孔性であるように思われた。

乾燥されたシートはトレーから剥離され、そしてナイフミルで粉砕された。標準 の篩トレーを用いて、０．５〜１．０ｍｍの篩にかけた。大きな粒子は、ナイフ ミルを通して再び循環した。合計１．６　ｋｇの触媒を回収した。その得られた 触媒ビーズを４°Ｃで乾燥貯蔵した。

触媒のカラムを通しての１回の通過において、その材料は、０．０７５ｋｇ　Ｐ ＡＣ／ｋｇ細胞／時の初期比活性（ＳＡ）。、２５１ＴＩＭの初期ＰＡＣ濃度及 び約１１日の半減期を示した。

バッチ研究がまた、反応緩衝液２０ｃｃ中、触媒（Ｔ−８６１９３）　１ｇを用 いて行なわれた。バッチ漸進曲線は、最大の生成物濃度が約２時間で５６ｍＭで あることを示した。

要約すれば、本発明はベンズアルデヒドのＰＡＣへの転換のための効果的な方法 を提供する。ＰＡＣのための本発明の細胞マスの生産性は高い。さらに、形質転 換の間、アセトアルデヒドの形成を滅じながら、反応培地に比較的高い濃度のＰ ＡＣを得ることが可能である。さらに、本発明の方法は、所望しない副生成物と してベンジルアルコールをほとんど生成しない。

ＦＩＧ、　ｊＡ ＦＩＧ、　ｊＢ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ 国際調査報告 −一１７＾帥−＃Ｉ噂ｌＩＭ、ＰＣ丁／υＳ！！９７０４４２　ｒ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｌ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）の製造方法であって、 （Ａ）ＰＡＣ生成の間、アルデヒド阻害に対する耐性を示す突然変異酵母株の非 生存細胞から実質的に成る固定化された細胞マスを供給し、ここで前記細胞は内 因性ピルベートデカルボキシラーゼを含み、そして前記細胞マス中の細胞は細胞 壁を有し、そして隣接する細胞の壁は化学的に架橋されており、そして細胞マス 中の細胞壁の少なくとも一部は反応体への細胞マスの透過性を高めるために変性 され；そして（Ｂ）ＰＡＣを住成するために固定化された細胞マスの存在下で水 性培地中においてベンズアルデヒド及びピルベート源を反応せしめることを含ん で成り； ここで前記水性培地は、補助溶媒なしに行なわれる類似する反応よりも水性培地 においてＰＡＣの形成速度及びＰＡＣの濃度を高めるのに十分な量で、ベンズア ルデヒドのための非阻害性水混和性有機溶媒である補助溶媒を含むことを特徴と する方法。 ２．前記細胞マスが、ポリアゼチジンにより架橋された細胞から成る自由に流動 する粒子から実質的に成る請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記粒子が約１ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーンを通過し、そしてそ の粒子は約０．５ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーン上では保持される請求 の範囲第２項記載の方法。 ４．前記補助溶媒がポリオールである請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前記ポリオールが約２００〜約８０００の分子量を有するポリエチレングリ コールである請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記補助溶媒が前記水性培地中に約２重量％〜約５０％（ｗ／ｖ）含まれる 請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記補助溶媒が前記水性培地中に約１０重量％〜約３０％（ｗ／ｖ）含まれ る請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記補助溶媒が約１０００の分子量を有するポリエチレングリコールである 請求の範囲第１項記載の方法。 ９．Ｌ−フェニルアセチルカルピノール（ＰＡＣ）の製造方法であって、 （Ａ）ＰＡＣ生成の間、アルデヒドに対する耐性を示す突然変異酵母株サッカロ マイセスセレビシアエＰ−２１８０−１Ａ−８ｐａの非生存細胞から実質的に成 る固定化された細胞マスを供給し、ここで前記細胞は内因性ビルベートデカルボ キシラーゼを含み、そして前記細胞マス中の細胞は細胞壁を有し、そして隣接す る細胞の壁は化学的に架橋されており、そして細胞壁の一部が破壊され、細胞中 のビルベートデカルボキシラーゼを暴露し；そして （Ｂ）ＰＡＣを生成するために固定化された細胞マスの存在下で水性培地中にお いてベンズアルデヒド及びビルベート源を反応せしめることを含んで成る方法。 １０．前記水性培地が、補助溶媒なしに行なわれる類似する反応よりも水性培地 においてＰＡＣの形成速度及びＰＡＣの濃度を高めるのに十分な量で、ベンズア ルデヒドのための補助溶媒を含む請求の範囲第９項記載の方法。 １１。前記細胞マスが、ポリアゼチジンにより架橋された細胞から成る自由に流 動する粒子から実質的に成る請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．前記粒子が約１ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーンを通過し、そして その粒子は約０．５ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーン上では保持される請 求の範囲第１１項記載の方法。 １３．前記有機溶媒が約２００〜約８０００の分子量を有するポリエチレングリ コールである請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．ベンズアルデヒドのＬ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）への転 換のための細胞マスであって、ＰＡＣ生成の間、アルデヒド阻害に対する耐性を 示す突然変異酵母株の非生存細胞から実質的に成り、ここで前記細胞は内因性ビ ルベートデカルボキシラーゼを含み、そして前記細胞マス中の細胞は細胞壁を有 し、そして隣接する細胞の壁は化学的に架橋されており、そして細胞壁の少なく とも一部は反応体への細胞マスの透過性を高めるために変性されていることを特 徴細胞マス。 １５．前記細胞マスがポリアゼチジンにより架橋された細胞から成る自由に流動 する粒子から実質的に成る請求の範囲第１４項記載の細胞マス。 １６．前記粒子が約１ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーンを通過し、そして その粒子は約０．５ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーン上では保持される請 求の範囲第１５項記載の細胞マス。 １７前記酵母株が突然変異株サッカロマイセスセレビシアエＰ−２１８０−１Ａ −８ｐａである請求の範囲第１６項記載の細胞マス。 １８．ベンズアルデヒドのＬ−フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）への転 換のための細胞マスの調製方法であって：（Ａ）ＰＡＣ生成の間、アルデヒド阻 害に対する耐性を示す突然変異酵母株の細胞を供給し、ここで前記細胞は細胞壁 を有し、そして内因性ビルベートデカルボキシラーゼを含み；（Ｂ）架橋された 細胞の自立マスを形成するために隣接する細胞の壁を化学的に架橋するのに適し た量及び条件下で前記細胞とポリアゼチジンとを混合し；そして（Ｃ）反応体へ の細胞マスの透過性を高めるために前記細胞マス中の細胞壁の一部を変性するこ とを含んで成る方法。 １９．酵母細胞のペーストをポリアゼチジンのペーストと共に混合し、そして得 られる混合物を乾燥せしめる請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．前記ポリアゼチジンペーストがポリアゼチジン約５重量％〜約２５重量％ （乾量）を含む請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１．前記ポリアゼチジンペーストがポリアゼチジン約８重量％〜約１５重量％ （乾量）を含む請求の範囲第１８項記載の方法。 ２２．前記細胞ペーストが約２重量％〜約４０重量％（乾量）の量で細胞を含む 請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．前記細胞ペーストが約１０重量％〜約３０重量％（乾量）の量で細胞を含 む請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４．前記細胞及びポリアゼチジンがペーストに約１：０．２〜約１：３の重量 比で混合される請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５．前記細胞及びポリアゼチジンがペーストに約１：０．５〜約１：１の重量 比で混合される請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６．前記架橋された細胞の自立マスを、架橋された細胞を含んで成る粒子を形 成するために細かくする請求の範囲第１８項記載の方法。 ２７．前記粒子が約１ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーンを通過し、そして その粒子は約０．５ｍｍのメッシュ開口を有するスクリーン上では保持される請 求の範囲第２６項記載の方法。 ２８．前記突然変異酵母がサッカロマイセスセレビシアエＰ−２１８０−１Ａ− ８ｐａである請求の範囲第２６項記載の方法。