JPH04502143A - 癌診断および管理における自己分泌運動性因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 癌診断および管理における自己分泌運動性因子技術分野 本発明は、一般に、癌診断および管理の分野に関する。

より詳細には、本発明は、新規の腫瘍運動性因子および癌診断、予防および治療 への新しいアプローチを工夫する際におけるそれらの利用に関する。

背景技術 細胞運動は、腫瘍細胞が侵入および転移の複雑なカスケードにおける多くの段階 を横断するのに必要である。

かかる段階としては、−次腫瘍から隣接組織への細胞の剥離および爾後の浸潤、 血管壁を通して循環への細胞の移動（血管内異物侵入）、および細胞の二次部位 への血管外遊出が挙げられている。脈管構造の内皮基底膜などの生物学的バリヤ ーを通しての細胞の運動は、走化性機構によって生ずることがある。若干の腫瘍 細胞の生体外走化性に関する研究は、各種の化合物、例えば、補体誘導物質、コ ラーゲンペプチド、ホルミルペプチド、および成る結合組織成分が化学誘引物質 として作用できることを示している。トダロ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１゜Ａｃａ ｄ、Ｓｃ　ｉ　ＵＳＡ、７７　：　５２５８−５２６２゜１９８０）は、転換さ れた細胞用自己分泌成長因子を報告している。各種の他の成長因子も、既知であ る。しかしながら、腫瘍細胞の走化性運動性（指向性）およびケモキネシスの（ ランダム）運動性を制御する自己分泌因子の存在および役割は、従来、既知また は記載されていない。細胞運動は、細胞成長および増殖と異なる細胞挙動の面で あることにここで留意することは重要であることがある。

発明の開示 それゆえ、本発明の目的は、腫瘍細胞の運動性を制御する自己分泌因子（かかる 自己分泌因子をここで「ＡＭＦＪと呼ぶ）を同定し且つ提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ＡＭＦまたはＡＭＦ受容体に特異的な結合親和力を有 する抗体を提供することにある。

本発明のなお更に他の目的は、ヒトにおける転移および腫瘍脈管形成を検出し、 局在化し且つ予測するためのキットを提供することにある。

本発明のなお別の目的は、ヒトにおける転移侵入および癌増殖を予測し、予防し 且つ／または治療するための方法を提供することにある。

本発明の追加の目的は、製薬上許容可能な担体中に腫瘍細胞の運動性を抑制する ためにＡＭＦに対する有効量の中和抗体を含む医薬組成物を提供することにある 。

本発明の各種の他の目的および利点は、本発明の詳細な説明から明らかになるで あろう。

図面の簡単な説明 本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および付随の利点の多くは、添付図 面と共に考慮する時に下記の具体的な説明を読む際により良く理解されるであろ う：第１図はボイデンテストの略図を示し、第２図は（ａ）懸濁された腫瘍細胞 に結合する１２５Ｉ−ＡＭＦのスキャッチャード分析；および（ｂ）精製ＡＭＦ に対する細胞運動の用量応答曲線を示す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の前記目的および各種の他の目的および利点は、下記性質を有するポリペ プチドによって達成される＝（ａ）　Ｅｌｔｌｉ乳動物の細胞によって分泌され 且つ生産的細胞のランダム移動を刺激し、（ｂ）分子量＞３０，０００を有し； 且つ（Ｃ）百日咳毒素によって抑制される。本発明のポリペプチドは、少なくと も一部分または全部でＮ　Ｈ２末端（単一文字コード）またはポリペプチドの活 性フラグメントのＮ　Ｈ２末端で下記アミノ酸配列順序を有することが見出され た： ＤＫＥＬＲＦＲＤＣＴＫＳＬＡＥＡＮＫＫ特に断らない限り、ここで使用するす べての技術的および科学的用語は、当業者によって通常理解される意味と同じ意 味を有する。ここに記載の方法および材料と同様または均等のいかなる方法およ び材料も本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材 料について今や説明する。後述のすべての刊行物は、参照としてここに編入する 。

ヒトＭＤＡ２３１およびＭＤＡ４３５乳癌細胞系をＡＴＣＣから得、１０％ウシ 胎児血清が補給されたダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。

これらのエストロゲン独立細胞系の両方とも、外側尾静脈への５Ｘ１０５個の細 胞を注射してから６週間後に６週齢のＮＩＨヌードマウスの肺に転移を生ずる。

自己分泌運動性因子の単離および精製 ＭＤＡ２３１およびＭＤＡ４３５ヒト乳癌細胞を添加タンパク質の不在下でＤＭ ＥＭ中で６０％コンフルーエンシーに成長する。培地を凍結乾燥し、残渣を蒸留 Ｈ２Ｏ約２ｍｌに溶解する。この溶液をＰＤ−１０（セファデックスＧ２５培地 ）カラムに適用する。最初の２．５ｍｌを捨て、次の４ｍｌを捕集する。流出液 は、低分子量物質から分離されたＡＭＦを含有する。この捕集画分を１０×ホス フ工−ト緩衝食塩水（ＰＢＳ）でｐＨ７，４の０．０２Ｍホスフェート緩衝食塩 水とし、ＰＢＳ中のセファクリルＳ−３００カラムに適用する（カラム源）。Ｐ ＢＳでの溶離は、分子量約５４ＫＤａを有する物質に対応する活性画分を生ずる 。この画分を透析し、２５倍に濃縮する。この物質をｐＨ８，０の５０ｍＭトリ ス−アセテートとし、モノＱ陰イオン交換カラム（源）に適用し、下記修正を施 した線形塩勾配（０〜ＩＭ　ＮａＣ１）で溶離する：ＮａＣ１濃度が０．２５Ｍ に達した時に、前記勾配を取る前に、この濃度を１０分間保持する。ＡＭＦを０ ．３Ｍ〜０．４ＭＮａＣ１画分中で溶離する。活性画分を透析し、小さい容量（ 約０．５ｍ１）に濃縮する。１１１縮物をｐＨ７，４の規定食塩水中の０．０２ Ｍホスフェートとする。これをＰＢＳ中のヘパリンカラムに適用する。カラムは 、ＡＭＦを０．３５Ｍと０．４塩勾配との間で溶離するＮａＣｌの線形勾配（０ ，１５Ｍ〜ＩＭ）で溶離する。

各精製工程後、カラム画分（塩を除去するために透析された）を修正ボイデンチ ェンバー法によって運動性刺激活性に関して検定する。

細胞運動の検定法 運動性の検定は、修正ボイデン（ジグモンド等、エエＥｘｐ、Ｍｅｄ、１３７　 ：　３８７−４１０．　１９７３．）チェソバ−の使用によって達成される。こ れは、孔径約８μを有する微孔性ポリカーボネートフィルターによって水平方向 に分離された２つのウェルからなる装置（第１図）である。運動性刺激薬（また は化学誘引物質）を下部ウェルに入れてフィルターと接触させる。上部ウェルに 約１０６個の細胞／ｍｌの濃度の細胞（例えば、Ａ２０８５黒色腫細胞）の懸濁 液を加える。次いで、チェンバーを３７℃で空気とＣＯ２約５％との雰囲気中で 加湿インキュベーターに約４時間置く。この際に、細胞は重力によってフィルタ ーの上側上に沈積される。しかしながら、若干の細胞（約５〜１０％）は、運動 性刺激薬に応答してフィルターの下側に移動する。細胞の平均直径が孔径よりも 大きいので、エネルギーの消費は、移動時に生じなければならない。培養期間の 終わりに、フィルターを取り外し、固定染色操作に付す。このことは、先ずフィ ルターをメタノール含有溶液に約２分間浸漬し、次いで、エオシン溶液に２分間 浸漬し、次いで、ヘマトキシリン溶液に３分間浸漬することを包含する。その後 、フィルターを水中で洗浄し、上側を上にしつつガラススライド上に置く。上側 上の染色細胞のボタンを乾燥ティッシュペーハーの小片で完全に除去する。次い で、フィルターを通して移動した染色細胞は、明らかになる。これらを約５００ Ｘの倍率で顕微鏡によって計数する。５つの異なる高いパワーフィールドを１つ の接眼レンズにおけるグリッドで可視化し、５つのフィールドにおける細胞を計 数し、平均を２１算する。正の制御／負の制御の比率≧５は、細胞の運動性刺激 薬への正の応答を示す。

ランダムおよび有向（走化性）運動性の測定ランダム運動性の測定は、細胞を固 定濃度の刺激薬にさらし、前記のように移動を測定することによって達成される 。このことは、検定培養前に、等しく増大する濃度の誘引物質を上部ウェルと下 部ウェルとの両方に加えることを包含する。次いで、誘引物質の量の関数として の細胞のランダム移動を測定する。有向移動は、細胞が負勾配（下部ウェルより も上部ウェルにおいて高い濃度）よりも正勾配（」二部ウェルと比較して下部ウ ェルにおいＣ高い濃度の誘引物質）でより良く移動するならば、生ずる。かかる 検定結果を結果の「チーツカ−盤」表に示す（表１）６ランダム連動性は、ＡＭ Ｆに応答するＡ２０５８黒色腫細胞の場合に全く有意であることがわかる。

表１ 上部ウェルにおける運動性因子％ 下部ウ　０　！００　２４４　５１２　４９４エルに　１５　４９４　１０５８ 　８２５　１４６９おける　３０　１７８１　１５５０　２１４４　２６４０運 動性　４５　２８００　２５５０　２２６２　４３Ｇ２囚子０６ 「対角線」は、細胞のランダム移動を示す。下方の三角形は、運動性刺激薬の正 の勾配での細胞の有向移動を示す。

ＡＭＦ誘導運動性に包含される細胞経路の検定材料：Ｌ１−グルタミン（２μｇ ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有し熱不活性化つシ飴児血清１０％ を有するか有していないＤＭＥＭ補給物を市販源、例えば、メロイ・ラボラトリ ーズ・インコーホレーテッド（バージニア州スプリングフィールド）から購入し た。

百［１ｇ毒素およびコレラ毒素をリスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ・イ ンコーホレーテッド（カリフォルニア州ギヤ゛、・ベル）から得た。ホルボール １２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）　、ホルボール１２゜１３−ジ デカノエート（ＰＤＤ）　、カルシウムイオノフオアＡ２３１８７、ジルチアゼ ム、ニフェジピン、ベラパミル、トリフルオベラジン、ロイペプチン、フォルス コリンおよび８−Ｂｒ　ｃＡＭＰは、すべてシグマ・ケミカル・カンパニー（ミ ズーリ州セントルイス）から購入した。１−オレオイル−２−アセチルグリセロ ールをモレキュラー・プローブズ（オレゴン州オイゲン）から購入した。ヌクレ オポア＠（ポリビニルピロリドンを含まない）並びに４８−ウェル走化性チェン バーをニューロ・プローブ・インコーホレーテッド（メリーランド州キャビン・ ジョーン）から購入した。

細胞培養：ヒト黒色腫細胞系Ａ２０５８を前記のトダロ等によって記載のように 維持した。

は（リオッタ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ａ２０５８細胞をタンパク質補給なしにＤＭＥＭに４８時間接種した。分子量カ ットオフ３０，０００ダルトンのセントリコン限外濾過組立体を使用して、培地 を濃縮した。

走化性検定：細胞運動を測定するために使用する検定は、バーバス等（１９８０ 年）、前記のバーバス等（１９８６年）によって記載の技術の修正法であった。

この技術Ａ２０５ｇに従って、黒色腫細胞（全面の約７５〜９０％）をトリプシ ン−ＥＤＴＡで収穫し、室温でウシ胎児血清１０％が補給されたＤＭＥＭに少な くとも１時間回収した。次いで、細胞をウシ血清アルブミン１■／ｍｌを有する ＤＭＥＭに２Ｘ１０６／ｍｌで再懸濁した。検定を、タイプ■コラーゲンが被覆 された８μｍのヌクレオポア膜を有する４８ウエルミクロ走化性チエンバー（前 記バーバス等、１９８０年）で実施した。チェンバーを３７℃で４〜５時間イン キュベーションし、次いで、ディフ・クイック染色剤（アメリカン・サイエンテ ィフィック）を使用して顕色した。細胞ペレットが表面から吹き取られるように 元の細胞側を上にしつつ染色された膜をガラススライド上に置いた。細孔を通し て移動した細胞をガラスと膜との間でトラップし、高いパワーフィールド（５０ ０Ｘ）で光学顕微鏡によって容易に計数できた。未刺激ランダム移動は、有向移 動の＜２０％であった。

走化性検定前または走化性検定時、化学薬品を細胞と同時培養して細胞代謝を変 更するか、ケモキネシス応答を刺激することができた。検定の初めに、化学薬品 も下部チェンバーに加えて走化性ポテンシャルを実証することができた。

ＡＭＦに対するネズミ抗体の産生 精製ＡＭＦタンパク質（１０μｇ）をフロイント完全アジュバントで乳化し、３ Ｃ３Ｈマウスの内証に注射した。２週間後、マウスを０．１ｍｌの容量で尾静脈 に静脈内注射されたＰＢＳ中のＡＭＦ５μｇで補助注射した。

１ケ月後、マウスを放血し、血清を腫瘍細胞運動を抑制する能力に関して試験し た。この検定においては、マウス血清をボイデンチェンバー移動検定におけるＡ ＭＦで予備培養した。ｌ／１０００の希釈度において、マウス血清は、プールし たマウス血清コントロールと比較して腫瘍細胞運動の抑制率９０％を生じた。精 製ＡＭＦタンパク質（１０μｇ）をフロイント完全アジュバントに乳化し、ニニ ージーランドホワイトラビットの背中上の皮下部位に注射した。ブースター注射 液５μｇを６週および１２週で適用した。３ケ月および４ケ月に、ラビットを放 血し、血清を運動性抑制活性に関して試験した。

１／１０００の用量において、免疫血清は、コントロール予備免疫血清と比較し て運動性を壊滅させた。血清を５６℃で３０分間熱不活性化した。

ＡＭＦ純度の測定 単離されたＡＭＦの純度を下記判定基準によって測定した： （ａ）単一の５４ｋＤＡバンドは、技術上周知の標準法によって実施された一次 元および二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で見出された。タンパク質は、 銀染色剤で同定された。

（ｂ）ゲルから切断されたタンパク質バンドは、運動性刺激活性を保持する。

（ｃ　）　Ｎ　Ｈ２末端アミノ酸配列順序（１〜１９）は、各サイクルにおいて １つの種類のアミノ酸残基を示す。

（ｄ）ネズミおよびウサギ抗ＡＭＦ抗体は、ヒト腫瘍ＡＭＦの運動性刺激活性を 遮断する。

前記判定基準に基づいて、本発明の単離ＡＭＦは、実質状純粋であることが見出 された。ここで使用する「実質上」なる用語は、標準技術によって得るためにで きるだけ純粋であることを意味する。

アミノ酸配列順序付は 製造業者によって与えられるトリフルオル酢酸化学を使用して、精製ＡＭＦのエ ドマン分解をアプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスター・シ ティ−）モデル４７０Ａ気相シークエンサーで実施する。フェニルチオヒダント インアミノ酸を、パーキング−エルマーシリーズ３Ｂ　ＨＰＬＣおよび紫外線検 出を使用することによって同定し、定量化した。

百日咳毒素の用量応答および時間経過および運動性に対する効果：百日咳毒素（ ＰＴ）をフラスコ中での一晩の培養のために、検定前の各種の期間の予備培養の ために、または検定開始後の異なる時点でＡ２０５８に加えた。

試験したＰＴ用量は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｕｇ／ｍｌであった。試験され た用量のいずれかにおける細胞生存率は、未処理コントロールにおける生存率（ 〉９０％）に匹敵した。次いで、処理細胞および未処理細胞をＡ２０５８ならし 培地に対する運動性応答に関して試験した。ＤＭＥＭ単独に応答する細胞運動は 、細胞の各処理群の負のコントロールとして包含した。

試験ＦＴ用量のいずれかでの細胞の一晩培養は、細胞運動の有意の抑制を生じた （表２）。０．５〜１．５μｇ／ｍｌの用量での３０分〜２時間の予備培養も、 ５０％よりも高い抑制を生じた。百日咳毒素を検定の初めまたは検定開始後に加 える時には、抑制効果の漸減があった。検定を開始してから１〜２時間後に、Ｐ Ｔは、観察された運動性に対して最小限の効果を有していた。

ＰＴの用量応答は、Ｇ、およびＧｏタンパク質の場合のＰＴの前記抑制量と一致 した。時間経過は、ＰＴを不適当な用量で加えるかＧタンパク質部位を飽和する のに不十分な時間加える時にははるかに減少された抑制を示した。従って、本試 験で得られたデータは、ＡＭＦが細胞を活性化するために６タンパク質を必要と する受容体を通して細胞運動を刺激するという仮説と一致した。

Ｉ　Ｐ’ａｓｅＫ　１３．２ ２　ＤＮＡａｓｅ　２ｇ／ｍｌ　９５．１３　ＲＮＡａｓｅ　１０４ ４　ＰＭＳＦ５ｍＭ　９５．５ ５　ＤＤ７１０ｍＭ　１１．５ ６　加熱１００℃　５．　０ ７　加熱５６℃　９７．２ ８　ｐＨ４，０２０ ９ｐＨ７，４１００ １０ｐＨ１１，０１０１ ００Ａ誘導運動性の百日咳毒素抑制 百日咳毒素の添加 時間（検定開始か　ＡＭＦ誘導運動性 Ｂ　らのｈｒ）　の抑制率 −２，０１００ −１，０９５ −０，５１００ 検定開始＊　０　６２ ＋２．０　０（抑制なし）★＋ ＋３．０　０（抑制なし）★＋ ★ＡＭＦの添加時間 ★＋百日咳毒素は細胞膜を浸透するのに少なくとも１時間必要とし、且つＡＤＰ リボシル化によってＧタンパク質を抑制する。

コレラ毒素用量応答および時間経過二百日咳毒素と対照的にコレラ毒素（ＣＴ） は、第二メツセンジャー、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを産生ずるためにアデニル酸シクラー ゼを刺激するＧ　タンパク質に作用すると考えられる。コレラ毒素を、フラスコ 中での一晩の培養のために、または走化性検定開始前の可変期間の予備培養のた めにＡ２０５８細胞に加えた。コレラ毒素の試験用量は、約０．１〜５０μｇ　 ／　ｍｌであった。試験されたすべての用量においで、細胞生存率は、未処理細 胞の生存率（〉９０％）に匹敵した。次いで、処理細胞および未処理細胞をＡ２ ０５８ならし培地に対する走化性応答に関して試験した。

抑制効果は決して完全ではない（抑制率３０−６０％）が、ＣＴでの一晩の処理 は、Ａ２０５８ならし培地１：対する応答を減少した。細胞を走化性検定の開始 直前の短期間の予備培養のためにコ１ノラ毒素にさらすならば、抑制は、最小限 であった（く５％）。

細胞運動に対するアデニル酸シクラーゼ系に包含される他の薬剤の効果：コレラ ａ素は、アデニル酸シクラーゼを刺激することができる活性配置でＧ　タンパク 質のＡＤＰリボシル化によって作用すると考えられる。

Ａ２０５８細胞運動に対するコレラ毒素の効果が最小限であるので、更に他の試 験を実施して、ｃＡＭＰ経路に作用する他の薬剤が抑制性であるかどうかを測定 した。

フォルスコリンは、媒介Ｇタンパク質を通して作用せずにアデニル酸シクラーゼ を直接刺激する。ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ類似体、８−Ｂｒ　ｃＡＭＰは、そのままの細 胞に入ることができる。両方の化学薬品を、フラスコ中での一晩の培養のために 、または走化性開始前の２時間の予備培養のためにＡ２０５８細胞に加えた。両 方とも、比較できる時間コレラ毒素の抑制と本質上同一である細胞運動の部分抑 制のみを示した。

これらの細胞は血清を含まない培地中で集密的細胞を培養することによって得ら れたならし培地の各種の濃度に対する用量依存方式で応答するので、運動性因子 は、細胞に由来すると結論づけられた。修正ボイデンチェンバー実験で得られた 結果は、本発明の自己分泌因子が走化性（指向性）とケモキネシス性（ランダム に運動性）との両方を有することも実証する。ランダム刺激が有向運動性よりも 約３倍大きいことが見出されたので、細胞は、運動性因子の勾配並びに誘引物質 の高い均一濃度に応答すると結論づけられた。

ゲル濾過およびゲル電気泳動によって測定する時には、本発明の移動刺激物質は 、分子量約５４キロダルトンを有することが見出された。この形態は、活性因子 の前駆物質であってもよい。細胞成分または血清成分は、運動性因子の作用を活 性化または抑制することが可能である。

運動性因子は、連鎖球菌性プロテアーゼへの露出によって不活性化されるが、活 性キモトリプシン由来フラグメントは産生できる（データ示さず）。活性は、沸 騰によって破壊されるが、５６℃への露出時には安定である。

追加的に、活性は、ｐＨ範囲４〜１１に安定である（データ示さず）。これらの 性質は、本発明の自己分泌物質（ＡＭＦ）が各種の既知の成長因子および化学誘 引物質とは異なることを示す。また、既知の成長因子、例えば、ＰＤＧＦ、　α ＴＧＦ、βＴＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、トランスフェリンまたはＦＧＦは、ＡＭＦ を置換または遮断しないことが見出された（データ示さず）。アミノ酸分析は、 ＡＭＦの１９個のアミノ末端アミノ酸の独特の配列順序を示した。わずかに小さ い形態の活性物質も、独特のアミノ末端配列順序を有することが見出された。タ ンパク質データベース検索は、かかる配列順序を有する他のポリペプチドを示し 損なった。

また、ＡＭＦによる運動性誘導は、既知の成長因子または血清因子によって遮断 または置換されないことが見出された。１ｎＭ以下の濃度においては、ＡＭＦは 、乳癌細胞のランダム運動性および有向運動性を顕著に刺激するが、白血球にお ける運動性を誘導し損なう。また、因子は、乳癌細胞および黒色腫細胞によるラ ンダム偽足産生を刺激した。活性ラス腫瘍遺伝子でのトランスフェクション後、 ＡＭＦおよびその受容体は、成る細胞中で１００倍以上に高められる。ヒト乳癌 細胞（正常な胸上皮はそうではない）は、多量のＡＭＦを産生ずる。

ＡＭＦを認識する抗体は、腫瘍細胞生存率を変えずにヒト腫瘍細胞運動性を生体 外で壊滅する。

単離精製自己分泌ポリペプチド腫瘍運動性因子の入手性は、前記運動性因子に対 して特異的な結合親和力を有する抗ＡＭＦ抗体を得ることを可能にする。かかる 抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであることができ且つ 技術上周知の標準技術ルートによって産生される。また、かかる抗体は、好適な 放射性同位体または蛍光体および他のマーカーまたは配位子で標識でき、ヒト組 織または体液中のＡＭＦの検出、定量化および／または局在化に使用できる。更 に、未標識ＡＭＦと一緒の放射能標識ＡＭＦは、ＡＭＦ受容体量を測定するため に標準競争検定で利用できる。受容体量を測定するためのかかる結合検定は、次 の通り実施する。

ＡＭＦ結合検定： 標準バイオ・ラッド酵素ビード法を使用して、精製ＡＭＦを単離する。増大量の 標識ＡＭＦを１００倍過剰の冷競合体の存在または不在下で１００．０００個の Ａ２０５８黒色腫細胞を有する１ｍｌの容量中で培養する。

培養を３７℃で４０分間実施し、細胞結合放射能を遠心分離によって分離する。

ＡＭＦ結合は、８０％特異性結合および約３０，０００個の受容体／細胞での飽 和を示す。標準法に係るスキャッチャード分析は、約０，５ｎＭの範囲内の概算 ｋｄで特異的に結合／遊離の比率と特異的に結合されたＡＭＦとの間の線形関係 を示す。

また、ヒトにおける癌の検出は、本発見によって可能にされ且つ膀胱癌患者から の尿試料を使用して、この目的での人体試料の試験を今や例示する。

膀胱癌の患者からの尿試料を捕集し、１０キロダルトンの排除フィルターを有す る遠心マイクロコンセントレータ−（ＡＭＩＣＯＮ）で処理する。処理された尿 をｐＨ７，５の無菌ホスフェート緩衝食塩水で１０倍の濃度で再構成し、使用す るまで一２０℃で貯蔵する。１〜３のスケールを使用して、腫瘍等級を病理学者 によりて決定する。等級１の腫瘍は最も大きいデイファレンシエーシ町ンを示し 、等級３の腫瘍は最も小さいデイファレンシエーションを示す。膀胱腫瘍をアメ リカン・ジヨイントやコミティーＴＮＮクラシフィケーションに従って段階づけ る。

尿試料の検定： ＡＭＦに応答するいかなる細胞系も使用できるが、好ましい細胞系は、ヒトＭＤ Ａ４３５細胞（ＡＴＣＣ）である。濃縮尿試料を前記のようなミクロウェル移動 チェンバー検定に適用する。各試料をヒト腫瘍ＡＭＦに対して方向づけられた抗 体の添加の有無で一連の希釈度で試験する。ＡＭＦ単位は、抗体によって抑制さ れた試料によって移動するように刺激された腫瘍細胞の割合と記録する。一般に 、８０％よりも高い刺激移動は、約１０μｇ　／　ｍｌの抗体濃度によって抑制 される。

表３に示すように、腎石などの非新生物障害を有するコントロール尿は、有意量 の運動性因子を含有し損なった。膀胱移動上皮癌症例のすべては、尿で正の運動 性応答を示した。最高量の運動性因子産生が、高等級腫瘍または段階Ｄ（転移） ＩＩ瘍を有する患者の尿に見出された。

表３ １　コントロールｋｓ７５　５　０．５２　コントロールｋｓ７６　９　２ ３　Ｃａその場　３２　５ ４　乳頭状ＴＣＣ６４８ ５ＴＣＣ７７４４３ ６ＴＣＣ６９９８１４ ７ＴＣＣ７３１２３３２ ８Ｒｅｃｕｒ　ＴＣＣ７９１３０２２ ９ＴＣＣｎ４８５　１６９　１４ １０　ＴＣＣ■４９１　１０５　８ １１　ＴＣＣｎ５５４　４１　１２ １２　ＴＣＣｍ４５７　７２　６ １３　ＴＣＣｓｔｇＤ５８４　２３４　２５ＴＣＣ−膀胱の移動上皮癌 Ｒｅｃｕｒ　ＴＣＣ−再発ＴＣＣ ＴＣＣＩＩ−等級■ ＴＣＣＩｎ−等級■ ＴＣＣｓｔｇＤ−転移ＴＣＣ ＫＳ−腎石 ＳＥ−標準誤差 勿論、ＡＭＦに対する抗体は、ＡＭＦ活性を遮断または抑制し、それによって、 腫瘍細胞運動に依存する腫瘍侵入または転移増殖を阻ＩＬするために使用できる 。また、かかる中和抗体の入手性は、乳癌、黒色腫などの状態に罹患したものに 有効量のＡＭＦ−抗体を投与してこれらの状態が進行するのを防止することによ って、乳癌、黒色腫などの状態を治療することを可能にする。癌および転移を治 療するための医薬組成物は、腫瘍細胞の運動を抑制するのに有効な量のＡＭＦに 対する中和抗体および生理食塩水、無毒緩衝剤などの製薬上許容可能な担体を単 純に配合することによって調製する。

また、腫瘍攻撃性および／または転移活性を検出するための手段は、（ａ）ＡＭ Ｆに対して特異的な結合親和力を有する抗体；　（ｂ）標識ＡＭＦ　：　（ｃ） 体試料におけるＡＭＦおよび／または受容体活性を測定するためのキットに与え られた抗体およびＡＭＦを利用する試験を実施するための教育材料および未標識 ＡＭＦを含有する別個の容器からなるキットによって今や可能にさせる。

ミクロタイタープレート、ミクロピペット、抗体タイターを読み取る装置などの アクセサリ−は、通例、かかるキットに見出され且つ便宜上本発明のキットに組 み込んでもよい。

要約すると、本発明は、腫瘍細胞侵入を制御する機構を理解するだめの新しい道 具を提供し且つ癌診断および治療のために新しい戦略を開く。上皮細胞は、通常 、侵入挙動を示さない。ここに記載の運動性因子は、正常な白血球の移動に影響 を及ぼさない。それゆえ、本発明に記載の因子を抑制することを目的とする治療 薬は、正常な休止期の組織に対して低い毒性を有しているべきである。腫瘍細胞 の侵入を抑制し且つその場から侵食癌への転移を防止する本発明に従って得られ た薬理学的製剤は、効力ある癌阻止剤であることができる。また、転移が成長す る時に局所的に侵入することが必要であることがあるので、腫瘍侵入の抑制剤は 、確立された転移の成長を防止することができる。更に、かかる薬剤は、腫瘍脈 管形成を抑制することがある。運動性因子またはそれらの受容体に対する抗体は 、組織免疫組織学、ラジオシントゲラフイー、または血清免疫検定によって適用 して転移を局在化し且つ個々の患者における癌攻撃性を予測することができる。

遺伝子製品として、自己分泌運動性因子またはそれらの受容体は、新しい種類の 腫瘍遺伝子を規定する。患者の腫瘍中のこれらの遺伝子の表現水準は、体試料中 のＡＭＦの量を監視することによって重要な診断情報を与えることがある。

勿論、侵入および転移は、癌治療の失敗の主原因である。本発明は、（ａ）予備 侵入病変を検出し且つそれらの進行を防止し；　（ｂ）患者の腫瘍の攻撃性を正 確に予測し、且つ（Ｃ）微小転移巣を同定し且つ根絶するために新しい臨床的戦 略を提供する。腫瘍侵入の少なくとも理解された面の１つは、腫瘍細胞移動であ る。本発明は、腫瘍細胞運動性因子の役割の測定を可能にする。

ここに記載の例および態様は例示の目的のためのものであること、およびそれに 徴しての各種の修正または変更は当業者に示唆されであろうし且つ本願の精神お よび権限および添付請求の範囲の範囲内に包含されるべきであることが理解され る。

浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　１ ＡＭＦスヤヤ′ン尤ヤード ＡＭＦＣＬ台（ｎＭ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．生産的細胞のランダム移動を刺激し、分子量＞３０，０００を有し且つ百日 咳毒素によって抑制されることを特徴とする単離された実質上純粋な哺乳動物の 細胞ポリペプチド。
2. ２．少なくとも一部分次の通り： 【配列があります】 のアミノ酸配列順序をＮＨ２末端で有する、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．請求項１に記載のポリペプチドに対して特異的な結合親和力を有する抗体。
4. ４．悪性腫瘍に罹患したと疑われる宿主に請求項３に記載の有効量の抗体を投与 して腫瘍増殖を抑制することを特徴とする転移性増殖の阻止法。
5. ５．前記悪性腫瘍が、黒色腫、乳癌および膀胱癌である、請求項４に記載の方法 。
6. ６．自己分泌運動性因子（ＡＭＦ）に対して特異的な結合親和力を有する抗体を 含有する容器を具備することを特徴とする体における腫瘍形成性または転移性活 性を検出するためのキット。
7. ７．別個に（ａ）標識ＡＭＦ；（ｂ）未標識ＡＭＦ；および（ｃ）ＡＭＦ−受容 体活性の水準を測定するために体試料で試験を実施するための指図を含有する容 器を具備することを特徴とするＡＭＦ細胞受容体の量を測定するためのキット。
8. ８．癌を有すると疑われる患者からの人体試料をＡＭＦに感受性の細胞系と反応 させ、前記体液によって感受性細胞系中で誘導された運動性を測定することを特 徴とするヒトにおける癌の存在の検出法。
9. ９．前記人体試料によって誘導された運動性を抗ＡＭＦ抗体によって抑制する、 請求項８に記載の方法。
10. １０．前記癌が、ヒトの膀胱癌、乳癌または肺癌である、請求項８に記載の方法 。