JPH04502151A - ナチュラルキラー細胞刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ナチュラルキラー細胞刺激因子 この発明は、係属中の米国特許出願第０７／２６９９４５号（１９８８年１１万 １０日出［）の一部継続出願である。

この発明は、ナチュラルキラー細胞およびその他の免疫系細胞の機能を刺激する 新規サイトカイン、および該因子を均質な形で入手する方法、ならびに組換え遺 伝子工学手法によってこれを生産する方法に関するものである。

［発明の背景］ ナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞は免疫系で活性なリンパ球のサブセットであり 、ヒト末梢血単核細胞の平均１５％を占める［Ｇ、トリンキエリ、Ｂ、ベルッシ ア、ラボラトリ−・インベスティゲーシコン、５０巻、４８９頁（１９８４年） ］。ヒトＮＫ細胞の同定に使用される表面マーカーは、ＩｇＧ抗体のＰｃ断片へ 低親和性で結合するＦｃ−γ−レセプターＩＩＩまたはＣＤ１６抗原のようなレ セプターである［Ｂ、ペルッシアら、ジャーナル・オプ・イムノロジー、１３３ 巻、１８０頁（１９８４年）１゜ＮＫ細胞は、生体内で腫瘍、腫瘍転移、ウィル ス感染等の防御に重要な役割を演じ、また正常および悪性造血を調節しているこ とが証明されている。

免疫系細胞間のシグナルを伝達する調節タンパク質の系統群が多数確認されてき た。これらの調節分子はサイトカインとして知られている。多くのサイトカイン 類は、造血系および免疫系細胞の増殖、発育、および生物学的活性を調節するこ とが判明した。これらの調節分子は、コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５ＦＳＧ−Ｃ ３Ｆ、Ｍ−Ｃ５Ｆおよび多能性Ｃ３Ｆ、またはインターロイキン−３）、インタ ーロイキン類（Ｉ　Ｌ−１〜ＩＬ−７）、インターフェロン類（σ、βおよびγ ）、腫瘍壊死因子（αおよびβ）、および白血球遊走阻止因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）等 のすべてを含む。これらのサイトカイン類は、骨髄、末梢血、胎児性肝臓、およ びその他のリンパ系または造血系器官由来の標的細胞で広汎な生物活性を示す［ 例えばＧ、ウオング、Ｓ、クラーク、イムノロジー・トウディ、９巻（５）、１ ３７頁（１９８８年）、参照］。

ある種のサイトカイン類の生化学的ならびに生物学的同定、およびその特性決定 は、天然供給源、例えば血液および尿から入手し得る天然に存在する少量の因子 によって妨害される。最近、多数のサイトカイン類が、分子クローニングされ、 異種的に発現され、均質に精製されるようになった［Ｄ、メトカーフ、［ザ・モ レキュラー・バイオロジー・アンド・ファンクションズ・オプ・ザ・グラニュロ サイト・マクロファージ・コロニー・スティミュレーティング・ファクターズ」 、ブラッド、６７巻、（２）、２５７〜２６７頁（１９８６年）］。これらのサ イトカイン類は、γ−インターフェロン、ヒトおよびマウスのＧＭ−Ｃ５Ｆ、ヒ トのＧ−Ｃ３Ｆ、ヒトのＣ３Ｆ−１、およびヒトおよびマウスのＩＬ−３である 。ＧＭ−Ｃ３Ｆ。

Ｇ−Ｃ５Ｆ、ＩＬ−３、およびＩＬ−２等、精製したこれらの因子の畿つかは、 生体内で、造血系および免疫系に調節的作用を表すことが判明した。

その他のタンパク質についても、天然供給源またはその他の入手源から精製する ことによって、免疫応答を刺激し、または増強することができる医薬用として好 適な均質な形で生産する技術上の必要性がなお存在する。

［発明の簡単な要旨］ この発明は、−態様として、他の哺乳動物のタンパク質を実質上含有していない ＮＫＳＦと呼ばれる新規ヒト・ナチュラルキラー細胞刺激因子を提供する。活性 なＮＫＳＦは約７０ｋｄの見掛けの分子量を有する。ＮＫＳＦの精製標品には２ つのポリペプチドの存在が認められ、これらは、結合すると活性なＮＫＳＦを生 成するサブユニットであると予測される。現在のところ、ＮＫＳＦは、大きいサ ブユニットと小さいサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド結合を介し て互いに結合することによって生成したヘテロ２量体である゛と推定される。こ の見掛けのへテロ２量体構造は、２つの個々のサブユニットの結合により、ある いは例えばインスリンの場合のように、単一の前駆体ポリペプチドのタンパク質 分解による切断によって生じるのであろう。あるいはＮＫＳＦの活性型は、大き い方のザブユニットのホモ２量体、または小さい方のサブユニットのホモ２量体 である可能性もある。

活性な約７０〜８０ｋｄのＮＫＳＦは、さらに後記の第１表に示したアミノ酸配 列の全部または一部を含んでいることを特徴とする。

またＮ　Ｋ　Ｓ　Ｆサブユニットの大きい方または小さい方のいずれかの一次配 列には、下記のアミノ酸配列（１文字略記法）の１またはそれ以上が存在する。

カッコ内は確実に同定できなかったアミノ酸を示す。

Ｖ−Ｍ−３−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ （Ａ）−Ｖ−３−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ Ｄ−Ｉ−Ｉ−に−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋ ＮＫＳＦの大きい方のサブユニットポリペプチドは４０ｋｄの見掛けの分子量を 有することを特徴とする。このサブユニットは、さらに下記の配列と同一または 実質上同一のアミノ末端配列を有することを特徴とする。

１−Ｗ−Ｅ−Ｌ−に−に−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ− Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍこの大きい方のポリペプチドは、さらに後記の第１表に示し た長いクローン化配列の全部または一部を含んでいる特徴を存する。

ＮＫＳＦの小さい方のポリペプチドサブユニットは、約３０〜３５ｋｄの見掛け の分子量を有し、さらに下記の配列と同一または実質上同一のアミノ末端配列を 有することを特徴とする。

（Ｘ）−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−（Ｐ）−Ｐ−Ｄ−Ｐ−（ＳまたはＴ）−Ｍ−Ｆ− Ｐ （Ｘ）は小さい方のサブユニット配列の最初の残基を測定できなかったことを表 す。

ＮＫＳＦは、試験管内で、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）によるγ−インター フェロン生産を誘発する生物学的活性を示す。ＮＫＳＦは均質な形で、後に詳述 するようなγ−インターフェロン誘発検定で、１ｍｇ当たりｌＸｌＯ７希釈単位 より大きい比活性を示す特徴を有する。

ＰＢＬｓにおけるγ−インターフェロン誘発活性以外にも、ＮＫＳＦは、下記の ように （１）ＰＢＬｓによる顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ ）誘発検定における生物学的活性、（２）白血病細胞およびｍ瘍由来細胞を致死 させるナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞を活性化する生物学的活性、（３）７（ トヘマグルチニン（Ｐ　ＨＡ　）活性化Ｔリンパ球による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）誘発検定における生物学的活性、（４）末梢血１０２７球のマイトジェン誘起 作用等の生物学的活性を示す。

この発明はもう一つの態様として、ヒトＮＫＳＦポリペプチド、およびヒトＮＫ ＳＦの大きい方のサブユニットポリペプチドおよびヒ）ＮＫＳＦの小さい方のサ ブユニットポリペプチド発現を暗号化しているｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を 提供する。そのような配列は、上記の１またはそれ以上のサブユニットおよびペ プチド配列を暗号化しているヌクレオチド配列を含んでいる。

この発明はまた、発現調節配列と機能的に結合させたＮＫＳＦまたはＮＫＳＦサ ブユニットを暗号化しているＤＮＡ配列を含んでいるベクターを提供する。また この発明は、組換え体ＮＫＳＦまたはその組換え体サブユニットの生産に使用す るため、そのようなベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。

またこの発明は、組換え体ＮＫＳＦタンパク質を提供する。このタンパク質は他 の哺乳動物のタンパク質様物質を含有せず、上記の物理的、生化学的、または生 物学的な活性または形質の１またはそれ以上を含有する、ｌまたはそれ以上の上 記のサブユニットまたはペプチド断片を暗号化しているＤＮＡ配列の存在によっ て特徴付けられる。

この発明のもう一つの態様は、均質または組換え体ＮＫＳＦの治療的有効量、ま たはＮＫＳＦサブユニットの一方または双方、またはそのペプチド断片の１また はそれ以上の有効量を含有してなる医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物 は、γ−インターフェロンおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ産生が昂進している状態が存在す ることに起因するガンおよびその他の疾患状態の処置方法に使用される。すなわ ちこの因子は、一般に造血細胞数またはその活性水準の欠乏を特徴とする疾患の 処置に使用される。

したがってこの発明は、もう一つの態様として、好適な医薬担体とともに、ＮＫ ＳＦ、またはそのサブユニットの一方または双方、またはそのペプチド断片の治 療的有効量を患者に投与することにより、ナチュラルキラー細胞機能の増強によ って効果が期待できるガンおよび／またはその他の病的状態を処置する方法を提 供する。これらの治療方法は、ＮＫＳＦ、またはそのサブユニット、またはその ペプチド断片の１またはそれ以上とともに、少なくとも１種類のその他のサイト カイン、造血促進因子、インターロイキン、成長因子、または抗体の有効量を、 同時または順次に投与することを包含し得る。

この発明はまた、ＮＫＳＦ、またはそのサブユニットを産生ずるヒト細胞系を他 のタンパク質およびポリペプチドと混合することによって、それらの細胞系から 均質なＮＫＳＦ、またはそのサブユニットを生産する方法を提供する。この発明 が提供するこの生産方法は、ＮＫＳＦ、そのサブユニット、またはそのペプチド 断片産生能を有する選ばれた細胞を培養して、ならし培地を得、５段階の基本的 な精製段階を経てこのならし培地を精製することからなる。

この発明は、もう一つの態様として、組換え体ヒトＮＫＳＦタンパク質、そのサ ブユニット、またはそのペプチド断片を生産する新規プロセスにベクターおよび 形質転換細胞を使用する。このプロセスでは、発現ＮＫＳＦタンパク質、そのサ ブユニット、またはそのペプチド断片を暗号化しているＤＮＡ配列で形質転換し た細胞系をその発現調節配列と機能可能に組合わせて培養する。上記のプロセス では、ポリペプチド発現のための宿主細胞として、多数の既知細胞を使用し得る 。現在、好ましい細胞系は、哺乳動物細胞系および細菌細胞である。

この発明のその他の態様および有利性は、以下の好ましい実施態様に関する詳細 な説明を見れば明らかである。

発明の詳細な説明 この発明が提供する新規ヒトナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）は、他 の哺乳動物のタンパク質様物質を実質上伴っていない均質なタンパク質またはタ ンパク質様組成物である。

ナチュラルキラー細胞刺激因子は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で非還元条件下に測定した約７０〜８０　ｋ 、　ｄの見掛けの分子量を有する。この７０〜８０ｋｄのペプチドは、γ−イン ターフェロン誘発検定で有効である。

この７０〜８０ｋｄバンドは、５ＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に４０ｋｄ　（大 きい方のサブユニット）および約３０〜３５ｋｄ　（小さい方のサブユニット） の見掛けの分子量を有する２つの小サブユニットを生じる。どちらのサブユニッ トとも、同一のγ−インターフェロン誘発検定による生物学的活性で、天然の７ ０〜８０ｋｄ種の活性に比較して実質的に低下する。４０ｋｄに低下した種およ び３０〜３５ｋｄに低下した種から、上述のように同定したアミノ末端配列が測 定され、したがって、これらは前記のＮＫＳＦへテロ２量体のサブユニットであ ると考えられる。現在、ＮＫＳＦは、大きい方のサブユニットと小さい方のサブ ユニットがジスルフィド結合したヘテロ２量体であると考えられる。

ＮＫＳＦは、少なくとも一部、陰イオン性の糖タンパク質である。

等電点電気泳動により、ＮＫＳＦの２つの種は４．３および４．８の等電点を有 することが認められる。現在、２つの種は糖鎖形成パターンを異にしているもの と推測される。

Ｎ　Ｋ　Ｓ　Ｆは、まず実施例８で詳細に説明するγ−インターフェロン誘発検 定で生物学的活性を有する特徴を有する。その他の活性としては、ヒト末梢血リ ンパ球によるＧＭ−Ｃ３Ｆ産生誘発能が挙げられる（ＧＭ−Ｃ５Ｆに関する追加 的な情報は、例えば公開されたＰＣＴ出願ＷＯ３６１００６３９参照）。またＮ ＫＳＦは、末梢血Ｔリンパ球に対するレクチンおよびホルボールジエステルのよ うな各種マイトジェンの分裂促進活性に対して増強効果を有し、また活性化され たヒト扁桃Ｂ細胞に対する増殖促進効果を有する。

またＮＫＳＦは、自然細胞障害検定および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）検定 により、試験管内で白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させるＮＫ細胞の機能 を増強することが認められｔ；。

自然細胞障害検定について簡単に付言すれば、ＮＫＳＦの存在でヒト末梢血リン パ球または精製したＮＫ細胞を８〜１８時間インキュベートする。ついで標準的 な５ＩＣｒ−放出検定を用いて、リンパ球およびＮＫ細胞を、白血病細胞系、腫 瘍由来細胞系またはウィルス感染繊維芽細胞のような標的細胞を溶解する細胞溶 解能について検定する。ＮＫＳＦは、ＮＫ細胞細胞障害活性の既知の活性化因子 であるインターフェロン　αおよびＩ　Ｌ−２で得られた成績に匹敵する水準で 、そのような標的細胞を溶解するＮＫ細胞の溶解能を劇的に増強する［例えばＧ 、トリンキエリら、ジャーナル・オプ・エキスペリメンタル・メディシン、１４ ７巻、１３１４頁（１９７８年）、およびＧ、ｌ−リンギエリら、ジャーナル・ オブ・エキスベリメンタル・メディシン、１６０巻、１１４６頁（１９８４年） 、参照１゜ＡＤＣＣ検定では、ＮＫ細胞のＦＣレセプターに対して結合能を有す る抗体（例えばＩｇＧ、、、ＩｇＧ、等）で標的ガン細胞を被覆する。予備的な Ａ　Ｄ　ＣＣ検定で、ＮＫＳＦの存在は、被覆した腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の 細胞致死活性を増強するようである［例えば、Ｌ、Ｍ、ワイナーら、キャンサー ・リサーチ、４８巻、２５６８〜２５７３頁（１９８８年）、Ｐ、ハーゼイら、 キャンサー・リサーチ、４６巻、６０８３〜６０９０頁（１９８８年）、ＡＤＣ Ｃに関する追加的な情報は、Ｃ，Ｊ　、ハンシクら、グロシーデイングズ・オブ ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３ 巻、７８９３〜９７頁（１９８６年）参照］。

ビーズ結合したヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（抗−μ）で刺激しまた正常なヒトＢ細胞 を使用するＢ細胞増殖因子検定にＪりけるＮＫＳＦの予備的な分析で、ＮＫＳＦ は、Ｂ細胞増殖因子活性を示す特徴を有する。この検定で、Ｂ細胞表面上の１ｇ Ｍ免疫グロブリンに対する抗体は、Ｂ細胞を活性化してＢ細胞増殖因子と反応を 起こさせる［Ｃ−Ｔ　Ｋ、ツエンダら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１４ ０巻、２３０５〜２３１１頁（１９８８年）］。そのような抗体は商業的に入手 し得る。

ＮＫＳＦは、リンホカイン混合物を産生ずる商業的に入手可能な細胞系であるヒ ト細胞系ＲＰＭＩ８８６６（ユニバージティー・オブ・ペンシルバニア・セル・ センター）のならし培地で最初に検出された。またこの因子は、他のエプスタイ ン−バーウィルスで形質転換したりンバ芽球様細胞系、またはその他のヒト細胞 系からも生産され得る。天然にＮＫＳＦを産生ずる細胞からこれを得るために採 用する精製技術では、下記の段階を用いる。これらの段階は、例えばＱＡＥゼー タ調製用カートリッジ（ＬＫＢファルマケア社）のようなイオン交換カラムによ る精製を含み、これによってＮＫＳＦタンパク質が陰イオン性であることが分か る。第２の精製段階は、レンチル−レクチンカラムであり、このことは、ＮＫＳ Ｆが少なくとも一部糖タンパク質であることを示している。レンチル−レクチン カラムからの溶出物を、さらにヒドロキシルアパタイトカラムへ通し、つづいて ヘパリン−セファロースカラムおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）モノＱカラムで精製する。

ＲＰＭＩ８８６６から得られたＮＫＳＦは、後段の３つのカラムからそれぞれ単 一のピークとして溶出した。残存する約３７ｋｄのタンパク質混入物を、ゲル濾 過クロマトグラフィー単独または逆層ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィ ーによって除去する。精製して得られた均質なＮＫＳＦを、実施例８に示したγ −インターフェロン誘発検定によって生物学的活性を検定し、１ｍｇ当たり１ｘ １０１希釈単位より大きい比活性を証明した。

すなわち実施例２で詳細に説明するが、ＲＰＭ１８８６６のならし培地、または その他のヒトＮＫＳＦ供給源へ、上記の精製手段を適用することによって均質な ＮＫＳＦを入手し得る。ＲＰＭＩ８８６６細胞系は該因子を自然に産生じ得るが 、細胞系をホルポールジブチレートのようなホルボールエステル類で処理するこ とによって生産水準を増強することができる。細胞は４８時間血清が存在しなく ても、なおＮＫＳＦを他のリンホカインと一緒に産生する。ＲＰＭＩ８８６６　 （実施例１参照）またはその他のＮＫＳＦ供給源細胞の培養方法は、当業界で既 知の方法である。

ＮＫＳＦｌまたはそのサブユニットの一方または双方、またはそのペプチドは、 組換え技術によっても生産し得る。クローン化したＮＫＳＦｌまたはそのサブユ ニットの一方または双方のためのＤＮＡ配列を得るため、均質なポリペプチドの トリプシン消化物を調製する。例えばＮＫＳＦのサブユニットで認められた９種 類のトリプシン消化物では、下記の Ｌ−Ｔ−１−Ｑ−Ｖ Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ Ｖ−Ｍ−５−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ （Ａ）−Ｖ−３−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ Ｎ−Ａ−５−ｌ−３−Ｖ Ｄ−Ｉ　−１−に−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋが同定される。またＮＫＳＦの大きい方 のサブユニットおよび小さい方のサブユニットのアミノ末端配列は前述のように 同定した。

ＮＫＳＦのこれらのトリプシン消化生産物のアミノ酸配列を暗号化している可能 性のあるすべての配列を予測した遺伝暗号を用いて、オリゴヌクレオチドプロー ブを合成する。さらにこれと同じ方法を用いて、上述のように同定したＮＫＳＦ の２つのサブユニットのアミン末端配列からプローブを組立て得る。これらのプ ローブを使用してＮＫＳＦ遺伝子またはサブユニット遺伝子を同定し、ヒトゲノ ムライブラリーを選別することができる。別法として、ＲＰＭＩ８８６６または ＮＫＳＦのその他の細胞供給源からのｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリー を作成し、これをプローブで選別して、ＮＫＳＦポリペプチド、または大きいサ ブユニットおよび小さいサブユニットのポリペプチドを暗号化しているｃＤＮＡ を同定することができる。ｃＤＮＡを同定したら、それらを各種の発現ベクター の任意の一つへ同時導入し、ＮＫＳＦ、または一方または双方のサブユニットの 発現系を作成することができる。

そのような組換え技術を用いることによって、ＮＫＳＦポリペプチド、またはそ の大きいおよび／または小さいサブユニットのポリペプチドを暗号化しているＤ ＮＡ配列を得る。これらの配列はトリプシン消化断片、または前述のようにして 同定したアミノ末端配列の１またはそれ以上を暗号化したＤＮＡ配列を含んでい る。

ｐＮＫ−６と命名したそのようなＮＫＳＦクローンの一つは、少なくとも下記の ＤＮＡおよびアミノ酸配列を有し、大きい方のＮＫＳＦサブユニットの全部また は一部を暗号化している。

第１表 プラスミドｐＮＫ−６でクローン化したこの配列は、受は入れ番号４０５４５の もとに、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１、バ ークローン・ドライブ、ロックヒル、マリ−ランド）へ１９８９年２月３日に寄 託した。追加的なりローン体が得られ、これらが配列決定されれば、ＮＫＳＦの 大きい方のサブユニットおよび、７′または小さい方のサブユニットの配列のカ ルボキシ末端配列を提供することが期待される。

また前記のペプチド配列および大きい方のサブユニットを暗号化しでいるＤＮＡ 配列の対立遺伝的変異体、およびその類似体または誘導体もこの発明に包含され る。

すなわち、この発明は、他の霊長類タンパク質を暗号化しているＤＮＡ配列を全 く伴わず、ＮＫＳＦの大きいサブユニットおよび小さいサブユニ；１１−を含め 、ＮＫＳＦポリペプチドの発現を暗号化している新規ＤＮＡ配列を包含する。こ れらのＤＮＡ配列は、上記の同定されたＤＮＡ、およびペプチド配列、およびそ れらの配列を緊縮ハイブリノド形成条件下ｌこＪＴ、マニアティスら、モレキュ ラー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）、３８７〜３８９頁参照］、、ＤＮＡ 配列へハイブリッド形成した１またはそれ以上を含んでいるＤＮＡ配列である。

そのような緊縮ハイブリッド形成条件の１例を示せば、４ｘｓｓｃで６５°Ｃで ハイブリッド形成し、ついでこれを０．ｌＸ５ＳＣで６５°Ｃで１時間洗浄する 。別の緊縮ハイブリッド形成条件を例示すれば、５０％ホルムアミド中、４×Ｓ ＳＣで４２°Ｃで行う。

また緩和条件下に、その配列へＮＫＳＦまたはそのサブユニットをハイブリッド 形成し、ＮＫＳＦ生物学的特性を有するＮＫＳＦペプチドの発現を暗号化してい るＤＮＡ配列も、新規ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化していＳｏそのような非緊 縮ハイブリッド形成条件の例は、４ＸＳＳＣで５０℃、または３０〜４０％ホル ムアミドで４２°Ｃでハイブリッド形成する。例えばＮＫＳＦの配列と有意な相 同領域（例えば、グリコジル化部位またはジスルフィド結合）を共有し、１また はそれ以上のＮＫＳＦ生物学的特性を有するタンパク質を暗号化しているＤＮＡ 配列は、たとえそのようなりＮＡ配列がＮＫＳＦ配列へ緊縮ハイブリッド形成し ないとしても、明らかにＮＫＳＦポリペグチドを暗号化している。

同様にＮＫＳＦ配列によって暗号化されたＮＫＳＦポリペプチドを暗号化し、た だし遺伝暗号の縮重または対立遺伝的変異体のために、コドン配列を異にするＤ ＮＡ配列（アミノ酸変化をもたらし、またはもたらし得ない種集団に天然に存在 する塩基変化）もまたこの発明に包含される。点突然変異により、あるいは活性 、半減期、または暗号化されたポリペプチドの生産を増強するために誘導された 修飾によって生じたＮＫＳＦのＤＮＡ配列における変異体もまたこの発明に包含 される。

またＮＫＳＦポリペプチドは、既知の通常の化学合成によっても生産し得る。合 成手段によるこの発明のポリペプチドの組立て方法は、当業界で既知の技術であ る。合成的に組立てられたＮＫＳＦポリペプチド配列は、１次、２次、もしくは ３次構造およびコンホーメーション上の特徴をＮＫＳＦポリペプチドと共有して いるから、ＮＫＳＦと共通の生物学的特性を有し得る。すなわち、これらは生物 学的有効物質として、または免疫学的代替物として天然の精製したＮＫＳＦポリ ペプチドの代わりに治療的および免疫学的地理に使用し得る。

また本明細書で提供するＮＫＳＦは、精製した均質な組換え体ＮＫＳＦタンパク 質、またはサブユニットポリペプチドの配列と類似し、ただし天然に修飾され、 または意図的に操作して修飾を加えた配列によって暗号化された因子を含む。

ペプチドまたはＤＮＡ配列における修飾は当業界で既知の技術により実施できる 。ＮＫＳＦ配列における重要な修飾は、暗号配列中の選ばれたアミノ酸残基の置 換、挿入または欠失を含み得る。そのような置換、挿入または欠失のための突然 変異手法は当業界で既知のものである（例えば、米国特許第４５１８５８４号、 参照）。

本明細書で報告するＮＫＳＦポリペプチドまたはサブユニットポリペプチド配列 のその他の特殊な突然変異は、糖鎖結合部位の修飾を含み得る。グリコジル化が 存在せず、または一部だけがグリコジル化された状態は、アスパラギン連鎖した 任意のグリコジル化認識部位または〇一連鎖した炭化水素の付加によって修飾さ れた任意の分子部位のアミノ酸置換または欠失によりもたらされる。アスパラギ ン連鎖したグリコジル化認識部位は、好適な細胞性グリコジル化酵素によって特 異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、ア スパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでＸは通常 任意のアミノ酸である）のいずれかである。グリコジル化認識部位の１番目また は３番目のアミノ酸位置の一方または双方におけるさまざまなアミノ酸置換また は欠失（モして／または２番目の位置のアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプ チド配列に非グリコジル化をもたらす。

そのように変化したヌクレオチド配列を発現すると、その位置でグリコジル化さ れていない変異体が生産される。

ＮＫＳＦ活性の全部または一部を保有していると期待され得るＮＫＳＦまたはそ のサブユニットの配列のその他の類似体または誘導体も、当業者であればこの発 明の報告によって容易に作成し得る。

そのような修飾の１つは、存在するりシン残基へのポリエチレングリコールの付 着、または付着を可能にするりシン残基の通常の技術による配列への挿入であり 得る。そのような修飾もこの発明の範囲に包含される。

この発明はまた、ＮＫＳＦポリペプチドの生産方法を提供する。

この発明の方法は、既知の調節配列の制御下に、サブユニットポリペプチドを含 め、ＮＫＳＦポリペプチドの発現を暗号化しているＤＮＡ配列で形質転換した、 好適な細胞または細胞系の培養を含む。

好適な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または ３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞であり得る。好適な哺乳動物宿主細胞の選択、 および形質転換、培養、増強、選別、および生産物の生産ならびに精製方法は、 当業界で既知のものである［例えば、ゲッシングおよびサムプルツク、ネーチャ ー、２９３巻、６．２０〜６２５頁（１９８１年）、または別法としてカウフマ ンら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、５巻（７）、１７５０ 〜１７５９頁（１９８５年）、またはハウレイら、米国特許第４４１９４４６号 、参照１゜２つの異なったｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で同時発現する方法は、例えば 公開されたＰＣＴ国際特許出＠ＷＯ３８１０８０３５に報告されている。その他 の好適な哺乳動物細胞系は、サルＣＯ３−１細胞系、およびウィスター・インス テイチュート（フィラデルフィア、ペンシルバニア）で最初に開発されたＣｖ− １細胞系である。

同様にこの発明に好適な宿主細胞系として有用なものは、細菌性細胞である。例 えばエシェリキア・コリの多数の株（例えばＨＢＩｏｌ、ＭＣ１０６１，および 後述の実施例に使用した株）は／（イオテクノロジーの分野で宿主として既知の ものである。バうラス・サブチリス、シュードモナス、およびその他の桿菌類等 の多数の株もこの発明に使用し得る。

当業界で既知である酵母細胞の多数の株もこの発明のポリペプチド発現のための 宿主細胞として入手可能である。また所望により、昆虫細胞もこの発明の方法の 宿主細胞として利用し得る［例えば、ミラーら、ジェ不テイソク・エンジニアリ ）・グ、８巻、２７７〜２９８頁（ブレナム・プレス社、１９８６年）、参照１ ゜この発明はまた、新規ＮＫＳＦポリペプチドを発現する方法に使用するベクタ ー類を提供する。これらのベクターは、サブユニットポリペプチドを含め、ＮＫ ＳＦポリペプチドを暗号化している新規Ｎ　Ｋ　Ｓ　ＦのＤＮＡ配列を含んでい る。別法として、前述のように修飾した配列を挿入したベクターもまたこの発明 の実施態様であり、ＮＫＳＦポリペプチドの生産に有用である。この方法に使用 するベクター類も、この発明のＤＮＡ暗号配列と機能的に組合わせて、選ばれた 宿主細胞での複製および発現を指令し得る選ばれた調節配列を含んでいる。

このように細胞供給源から均質に精製され、あるいは組換え技術または合成的に 生産されたＮＫＳＦは、ＮＫ細胞活性の増強またはγ−インターフェロンまたは ＧＭ−Ｃ３Ｆの生体内生産の増大に反応するガンまたはその他の疾患状態を処置 する医療用調製品または医薬製剤として使用し得る。そのような病的状態は、疾 病、放射線照射または薬物投与によって発生し、例えば、白血球減少、細菌まｊ ：はウィルスによる感染、貧血、骨髄移植に伴う免疫細胞または造血細胞欠乏を 含むＢ細胞またはＴ細胞欠乏等が挙げられる。これらのＮＫＳＦポリペプチド組 成物によるガンおよびその他の疾患の治療的処置は、今日入手可能な薬物処置に よって起こる不快な副作用を回避し得る。

またＮＫＳＦのサブユニットポリペプチドの一方または双方、またはそのベゾチ ド断片をそのような医薬製剤に使用することも可能であり得る。

またこの発明のポリペプチド類は、単独または他のサイトカイン類、造血促進因 子類、インターロイキン類、成長因子類、または抗体と組合わせてガンまたはそ の他の疾患状態の処置に使用し得る。

これらの新規ポリペプチド類のその他の用途は、診断または治療的用途のため、 標準的な方法によって生じるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の開 発である。

したがってこの発明のもう一つの態様として、上述の状態を処置するための方法 および治療的組成物を提供する。そのような組成物は、この発明のＮＫＳＦタン パク質またはサブユニットポリペプチドの治療的有効量、またはその断片の治療 的有効量を製薬上許容し得る担体と混合して含有する。この組成物は非経口的に 全身投与することができる。別法として、組成物を静脈内に投与し得る。また所 望により、組成物を皮下投与し得る。全身投与する場合、この発明に使用する治 療的組成物は、発熱物質を含有しない非経口的に許容し得る水溶液形態をとる。

ｐＨ，等張性、安定性等の点を十分考慮したそのような製薬上許容し得るタンパ ク質の溶液製剤は当業界で周知のものである。

上述の状態を処置する方法に組込まれる投与計画は、薬物の作用を修飾する各種 の要素、例えば病状、体重、患者の性別および規定食、感染の重篤度、投与時間 、その他、臨床的な要素を考慮して、主治医により決定される。１日の投与計画 は、一般にＮＫＳＦタンパク質またはそのサブユニットｌ−１０００μｇ１また は体重１ｋｇ当たりタンパク質５０〜５０００単位（１巣位／ｍｌはγ−インタ ーフェロン誘発検定で５０％最大刺激をもたらすタンパク質濃度を表す）である べきである。

またこの発明の治療方法および組成物は、その他のヒトの因子との併用を含み得 る。そのような用途のための代表的なサイトカイン類および造血促進因子類は、 特にＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−２、およびＩＬ−６等’１’アロ　（例えばＰＣＴ公開 ＷＯ３５１０５１２４、ＷＯ３８１００２０６、およびヨーロッパ特許出願第０ １８８８６４号、参照）。ＮＫＳＦ治療に加え得るその他の可能性ある候補は、 ＩＬ−４、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｃ３Ｆ−１％ＧＭ−Ｃ５Ｆ、ＩＬ−３、またはエリスロ ボエチンである。またＢ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、または好酸球分化因子 のような増殖因子類も、ＮＫＳＦと併用するのに有用であり得る。

これと同様に、ＮＫ細胞のＦｃレセプターへの結合能を有する抗体の投与と一緒 にまたはその前に、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットまたはその断片を投与する ことは、腫瘍に対するＡＤＣＣ療法を増強し得る。その場合の投与量は、治療用 組成物中のそのような追加成分の量を考慮して調節すべきである。処置患者の経 過は通常の方法によって監視することができる。

以下に実施例を挙げて、この発明の均質なヒトＮＫＳＦの精製および特性決定、 およびその他の方法および生産物について例示的に説明する。これらの実施例は 発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限定する目的をもつものでは ない。

［実施例１］ 無血清ＲＰＭＩ８８６６細胞のならし培地の調製加熱失活させた５％ウシ胎児血 清（Ｆｅ２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、ヒトＢリンパ芽球様細胞系Ｒ ＰＭＩ８８６６を維持した。無血清ならし培地を調製するには、細胞を洗浄し、 これを１０−’Ｍホルボールー１２−１３−ジブチレート（Ｐ　ｄ　ＢＩＪ）を 含有する無血清ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊しく１０６細胞／ｍｌ）、５％ＣＯ ２気流中で３７°Ｃで４８時間培養した。０．２μｍフィルター［デュラポア（ 商標）親水性カートリッジ型フィルター、ミリポアー社、ベッド７オード、ＭＡ Ｉ濾過によって無細胞上清を回収し、ツイーン−２０およびフェニルメチルスル ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を、それぞれ０．０２％およびＯ，１ｍＭずつ添 加した。ついで細胞ならし培地を、限外濾過カートリッジ（スパイラルーウーン ド、Ｓｌ、アミコン社、ダンバーズ、ＭＡ）を使用して減圧下に５０倍濃縮した 。

【実施例２〕 ＮＫＳＦのならし培地からの精製 下記の方法は、実施例１で報告したＲＰＭＩ８８６６ならし培地から均質なＮＫ ＳＦタンパク質を得るため、現在使用されているものである。

ａ、アニオン交換カートリッジ−クロマトグラフィー粗製の濃縮ならし培地２リ ツトルを、伝導率が６ｍＯｓ／ｃｒｎとなるまで蒸留水で希釈して、ＩＭＩ−リ ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）でｐＨ８に調節し、た。ついで並列に連結し、０． １Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）で流速１５０ｍ１／分で予め平衡化したＱ ＡＥゼータプレプ２５０型カートリッジ（７アルマシア社）５個へ、濃縮物を適 用した。特に説明しない場合、精製に使用したすべての緩衝液は０．０２％ツイ ーン−２０および０．１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有している。カートリッジをＯ，１ Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６，８）３リツトルで洗浄し、ついで０．５ＭＮ ａ、ＣＩを含有するＯ、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６，８）１．５リツト ルで洗浄して、両分３００ｍ１を採取した。ＮＫＳＦ活性を０．５ＭＮａＣ１を 含有する洗浄液で溶出した。

ｂ、レンチル−レクチンセファロース−クロマトグラフィー２回分のＱＡＥゼー タブレプ溶出液から得たＮＫＳＦ含有画分を合わせて、２０ｍＭｔ−リス−ＨＣ ｌ緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化したレンチル−レクチンセファロース４Ｂ（７ アルマシア社）のカラム（２，５Ｘ　ｌ　５ｃｍ）へ直接適用した。平衡化緩衝 液５カラム容量で洗浄したのち、０．２Ｍ　α−メチル−Ｄ−マンノピラノシド （シグマ社）および０．５ＭＮａＣ＋を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　緩Ｗ ｉＨ（ｐＨ７，２）３カラム容量でカラムを溶出した。ＮＫＳＦ活性の約１／２ がカラムに結合し、σ−メチルーＤ−マンノピラノシドで溶出した画分に回収さ れた。

Ｃ，ヒドロギシルアバタイトークロマトグラフィーレンチルーレクチンセ７アロ ース力ラムへ結合したＮＫＳＦ活性プールから濃縮した物質を、０．１ｍＭ　Ｃ ａＣ１，および０．１５ＭＮａＣｌを含有する１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ Ｈ６，８）に対して透析し、Ｏ，１ｍＭ　ＣａＣ１，を含有する１ｍＭリン酸カ リウム緩衝液（ｐＨ６，８）で予め平衡化したバイオゲルＨＴ（バイオラド社） カラム（２Ｘ５ｃｍ）へ適用した。平衡化緩衝液５カラム容量でカラムを洗浄し 、０．１５ＭＮａＣ１を含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）のｌ　ｍ Ｍ　−４００ｍＭ直線濃度勾配置００ｍ１で溶出した。画分４ｍｌを採取し、Ｎ ＫＳＦ活性を試験した。

リン酸カリウム約２００ｍＭ−３００ｍＭの画分て、カラムから単一の活°性ビ ークとして得られた。

ｄ、ヘパリン−セファ０−スークロマトグラフイーバイオゲルＨＴカラムから溶 出しｆ：ＮＫｓＦ含有画分を合わせて２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７ ，２）に対して透析し、ヘパリン−セファ０−ス（ピアス社、ロック７オード、 ＩＬ）カラム（ｌＸｌＯｃｍ）へ適用した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７，２）５カラム容量でカラムを洗浄し、ＩＭＮａＣＩを含有するこれと同 じ緩衝液で溶出した。画分３［１１１を採取し、ＮＫＳＦ活性を測定した。本質 的にすべての活性をヘパリンカラムで結合して、ＩＭ　ＮａＣ１洗浄で回収され た。

ｅ、モノロークロマトグラフィー ヘパリンセファロースカラムからプールした画分を、１％エチレングリコールお よび０．１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する（ｔ；だしツイーン−２０を含有せず）２ ０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６，８）（バッファーＡ）に対して透析し、 ７Ｍ１０メンプランを備えた撹拌セル（アミコン社）で２１１１１に濃縮した。

試料を七ノＱ　（５１５）カラム（ファルマシア社−ＦＰＬＣアバラタス部門） へ適用し、バ・ンフｙ−Ａ（ｐＨ６，８）のＯＭ−ＩＭＮａｃｌ直線濃度勾配溶 液で溶出した。画分０．５ｍｌを採取しＮＫＳＦ活性を試験した。活性は約２２ ０ｍＭ−２７０ｍＭ　ＮａＣ１の両分で単一のピークとして認められた。

ｆ、ゲル濾過クロマトグラフィー モノＱカラムからプールしＮＫＳＦ活性を含有する画分をスピードバンク・コン セントレータ−（サバント社、ファーミングデール、ＮＹ）で１００μｍに濃縮 し、これをＦＰＬＣスーパーローズ１２カラムへ適用した。Ｏ，］、５５ＭＮａ Ｃ１１％エチレングリコール、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する５ＱｍＭリン酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）でクロマトグラフィーを実施した。流速を０　 、６　＋ｎｌ／分とし、両分０．５ｍｌを採取した。約３７ｋｄのタン／（り質 混入物からＮＫＳＦタンパク質（７０ｋ　ｄ）を分離した。

別法として、プールしたモノＱ画分を、上記の（ｆ）段階の前ｌこ逆層ＨＰＬＣ （ｃ８カラム）へ掛けて、活性な７０ｋｄタンノくり質からタンパク質混入物を 分離し得る。

［実施例３１ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ラエムリの方法［Ｕ 、に、ラエムリ、不一チチャー、２２７巻、６８０〜６８５頁（１９７０年）］ にしたがい、１０％アクリルアミド板状ゲル（厚さ０．７５ｍｍ）を使用して５ ＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動ののち、銀染色試薬（バイオラド）を使用 する銀−硝酸塩法によってゲルを染色するか、あるいは２ｍｍのスライスとして これを切り出し、ＲＰＭＩ培地０．５ｍｌで２４°Ｃで４時間溶出して、ＮＫＳ Ｆ活性について検定した。標準タンパク質、ホスホリパーゼｂ（９４ｋｄ）、ウ シ血清アルブミン（６７ｋｄ）、オボアルブミン（４３ｋａ）、カルボニックア ンヒドラーゼ（３０に、ｉ）、大豆トリプシンインヒビター（２０ｋｄ）、およ びラクトアルブミン（１４，４ｋｄ）によって見掛けの分子量を測定した。

ＮＫＳＦ活性の前に溶出する数種の画分て開始し、活性画分を通じてずっと連続 し、ＮＫＳＦ活性ピークの後に溶出する画分て終了するモノＱカラム画分（実施 例２、（ｅ）段階）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元条件）から、２つのタンパ ク質（７０ｋｄおよび３７ｋｄ）の存在が、各種のモノＱ画分におけるＮＫＳＦ 活性の存在と相関していることが判明した。別の非還元ゲルで活性画分を泳動さ せ、７０ｋｄおよび３７ｋｄバンドに対応する領域からタンパク質を溶出して、 ＮＫＳＦ活性を試験した。活性はすべて７０ｋｄ種と対応しており、このタンパ ク質がＮＫＳＦであることが明らかになった。

７０ｋｄ種をゲルから溶出し、クロラミンＴ（シグマ社、セントルイス、ＭＯ） を使用してこれをヨウ素化し、還元剤β−メルカプトエタノールの存在（１０％ ）で２分間沸騰させたのち、別のＳＤＳゲルで再び泳動を行った。これらの条件 下で、７０ｋｄ種は分子量４０ｋｄおよび３０１ｃ　ｄの２つの明瞭なサブユニ ットに分解し、この事実は、天然のＮＫＳＦがこれらのサブユニットポリペプチ ドのジスルフィド結合したヘテロ２量体であり得ることを示している。

あるいはＮＫＳＦは、大きい方のサブユニットまたは小さい方のサブユニットの 集合体によって生成された２量体であり得る。天然の７０ｋｄ　ＮＫＳＦの還元 は、γ−インターフェロンの末梢血リンパ球産生を誘発するＮＫＳＦの誘発能を すべて破壊するようである。

［実施例４］ タンパク質の回収 ＲＰＭ１８８６６の無細胞ならし培地５００リツトルから出発して、モノＱカラ ムからプールした目的の活性画分は、同一ゲルで並行して分析した対照タンパク 質の銀染色強度から算定して、タンパク質約１０μｇを含有していた。この約６ μｇが７０ｋｄ　ＮＫＳＦタンパク質に対応した。算定された７０ｋｄ　ＮＫＳ Ｆの比活性は１ｘ１０７単位／ｍｇであった。標品中のＮＫＳＦ活性の通算回収 率は２％であった。

［実施例５］ ＮＫＳＦタンパク質組成 上記の５ＤＳ−ＰＡＧＥ実施例で報告したように、均質なＮＫＳＦを還元し、ト リプシンで消化した。別法として非還元ＮＫＳＦを逆層ＨＰＬＣカラムから得て 、トリプシンで消化し得る。下記のアミノ酸配列を有する９種類のトリプシン消 化断片を単離した（カッコ内は仮に同定したアミノ酸）。

断片１　−　Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｑ−Ｖ 断片２　−　Ｌ−Ｍ−Ｄ−Ｐ−に 断片３　−　Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ 断片４　−　Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−に 断片５　−　Ｖ−Ｍ−３−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ断片６　−　（Ａ）−Ｖ−５−Ｎ−Ｍ −Ｌ−Ｑ−に断片７　−　Ｎ−Ａ−３−１−５−Ｖ 断片８−　Ｔ−Ｆ−Ｌ−Ｒ 断片９　−　ＤＩ−Ｉ−に−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−ＫＯｋｄ種および３Ｑｋｄ種から 、ＮＫＳＦの各サブユニットのアミン末端のアミノ酸配列を決定した。４０ｋｄ のサブユニットからのアミノ末端配列は、Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−に−に−Ｄ−Ｖ−Ｙ −Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍであった。このア ミノ末端配列、および断片１．３．４．８、および９は、前記の第１表で同定し た大きい方のサブユニットのクローンのアミノ酸配列から誘導されたものである ことが分かった。

３０ｋｄの小さい方のサブユニットからのアミノ末端配列は、下記のように、カ ッコ内のアミノ酸の同定が確定していない、（Ｘ）−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−（Ｐ ）−Ｐ−Ｄ−Ｐ−（Ｓ）−Ｍ−Ｆ−Ｐであった。（Ｘ）は、この配列の最初の残 基が決定できなかったことを表す。

オリゴヌクレオチドのプール、または独特のオリゴヌクレオチドからなるプロー ブを、レーダの方法［Ｒ，レーダ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ ジー、１８３巻（１）、１〜１２頁（１９８５年）］により設計した。オリゴヌ クレオチドグローブは、自動ＤＮＡ合成装置で合成した。

遺伝暗号は縮重するので（１個以上のコドンが同一のアミノ酸を暗号化できる） 、トリプシン処理した断片のアミノ酸配列を暗号化している可能性のすべてのあ るヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドの混合物を合成しなければ ならない。ある種のコドンは、真核遺伝子では希にしか利用されず、またジヌク レオチドＣｐＧの相対頻度は真核性暗号配列では希である理由から［Ｊ、Ｊ、ツ −ルら、ネーチャー、３１２巻、３４２〜３４７頁（１９８４年）参照］、ある 場合には、コドン利用に基づいたプローブ混合物のオリゴヌクレオチド数を減ら すことが可能である。プローブ設計に利用するアミノ酸配列の領域は、できれば 高度に縮重しなコドンを避けることによって選ばれる。オリゴヌクレオチドを自 動ＤＮＡ合成装置で合成し、ついでプローブをポリヌクレオチドキナーゼおよび ”Ｐ−ＡＴＰで放射能標識する。

ついでｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、ＲＰＭＩ８８６６細胞系からポリアデニル化したＲＮ Ａから合成し、これをラムダＺＡＰ　（ストラタジーン・クローニング・システ ムズ社、う・ジョラ、ＣＡ）またはその他、好適なベクターへ確立された手法を 用いて（ツールら、前掲）クローン化した。このライブラリーからの組換え体を 平板接種し、複製ニトロセルロース・レプリカをプレートから作成した。３２ｐ −γ−ＡＴＰでオリゴヌクレオチドをリン酸化し、プローブの鎖長および塩基組 成から予測した温度で、標準的なハイブリッダイゼーション溶液中で１夜、レプ リカへハイブリッド形成した［Ｊ、シンガーーサムら、　プロンーディングズ・ オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・オン・ザ・ｌｌ５Ａ 、８０巻、８０２〜８０６頁（１９８３年）、およびＳ、Ｖ、サグズら、「デベ ロッゾメンタル・バイオロジー・ユージング・ピュアリファイド・ジーンズＪ、 ＩＣＮ−ＵＣＬＡ・シンポジウム・オン・モレキュラー・アンド・セルラー・バ イオロジー、Ｄ、Ｄ、ブラウンおよびＣ，Ｆ、７オツクス編、（アカデミツク社 、ＮＹ）、２３巻、６８３〜６９３頁（１９８１年）参照］。ついでオートラジ オグラフィーに掛けることができる許容し得る水準にバックグラウンド放射能が 低下するまで、フィルターを０．５ＸＳＳＣで同じ温度で洗浄した。別法として 、ハイブリッド形成および洗浄をテトラアルキルアンモニウム塩溶液の存在で実 施し得る［Ｋ、Ａ、ヤコブスら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１６巻、 ４６３７〜４６５０頁（１９８８年）参照］。複製陽性物をプラーク精製した。

ヒトＮＫＳＦを暗号化するのに必要なヌクレオチド配列の一部または全部を含ん でいるクローンが得られた。この方法によって得られたクローンの１つは、前述 のようにＡＴＣＣとして寄託した。

［実施例６］ 組換え体ヒトＮＫＳＦの発現 ＮＫＳＦを生産するため、そのサブユニットを暗号化しているＣＤＮＡを標準的 な分子生物学的な手法により好適な発現ベクターへ移入した。これらの発現ベク ターに関しては、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌発現のための多数の種 類が当業界で既知である。

哺乳動物細胞のそのようなベクターの１つはｐＸＭである［Ｙ、Ｃ。

ヤングら、セル、４７巻、３〜１０頁（１９８６年）１゜このベクターは、ＳＶ ４０複製開始点およびエンハンサ−、アデノウィルス主後期プロモーター、アデ ノウィルス３分節系先導配列のｃ　ＤＮＡコピー、短いハイブリッド介在配列、 ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウィルスＶＡＴ遺伝子を、所望の ｃＤＮＡの高水準発現を哺乳動物細胞で指令する好適な関係で含んでいる［例え ばカウフマン、グロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン ・サイエンシズ・オン・ザ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年） １゜このｐＸＭベクターをエンドヌクレアーゼ酵素ＸｈｏＩで直線化し、続いて ＮＫＳＦの各サブユニット発現の組立て体を生じ得るＸｈｏＩ相補的末端を作り 出す合成オリゴヌクレオチド（コラポレーティブ・リサーチ、レキシントン、Ｍ Ａ］を付加することによって、予め修飾したＮＫＳＦサブユニットを暗号化して いるｃＤＮＡへ、当モル量ずつ別々にライゲーションした。

２つのポリペプチドが２つの異なったｍ　ＲＮ　Ａから誘導されたのであれば、 ２つの異なったｃＤＮＡを同一宿主で同時に発現するか、あるいは異なった宿主 でそれぞれ独立して発現させ、サブユニットを別々に精製しなければならない。

目的の活性ＮＫＳＦは、個々のサブユニットを再生することによって組立てられ る。

もし２つのＮＫＳＦのサブユニットが単一のｍＲＮＡから誘導されたのであれば （すなわち、それらが単一の前駆体ポリペプチドのタンパク質酵素分解切断によ って生じたのであれば）、前述と類似の態様で、ベクターを個々のｃＤＮＡへ等 モル量でライゲーションする。対応するｃＤＮＡは、好適なベクターにより種々 の宿主で発現することができる。

ａ、ＱＪｌｔ乳類細胞発現 以下に説明する検定に使用するＮＫＳＦタンパク質の発現を得るため、個々のサ ブユニットのためのｃＤＮＡ（それらが単一の前駆体から誘導されたものであれ ば、両方のサブユニットを暗号化している単一のｃＤＮＡ）を含んでいるｐＸＭ 組立て体を混合し、例えばこれをＣｏＳ細胞へトランスフェクトする。トランス フェクトしたＣｏＳ細胞からのならし培地は、γ−インターフェロン誘発検定で 測定されるＮＫＳＦ生物学的活性を含有している。

本明細書で報告する哺乳動物細胞発現ベクターは、当業界で既知の技術によって 合成し得る。このベクターの構成（例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ −、ブロモ−ター等）は、既知の方法によって天然供給源からまたは合成によっ て入手し得る［カウフマンら、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー 、１５９巻、５１１〜５２１頁（１９８２年）、およびカウフマン、プロシーデ ィングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・オン・ザ ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年）参照］。代表的な哺乳動物 宿主細胞は、形質転換細胞系をも含め、特に霊長類細胞系およびゲラ歯頚細胞系 である。また正常な２倍体細胞、−次組織および初代外植片の試験管内培養から 誘導された細胞株も好適である。候補となる細胞は、選択遺伝子が優性に作用す る限り、選択遺伝子で遺伝子型的に欠損している必要はない。ベクターＤＮＡの 安定な組込み、および組込んだベクターＤＮＡのその後の増幅には、いずれも通 常の方法により、ＣＨＯ細胞を使用し得る。別法として、ベクターＤＮＡはウシ 乳頭腫ウィルスゲノム［ラスキーら、セル、３６巻、３９１〜４０１頁（１９８ ４年）参照］の全部または一部を含み、安定なエビソーム要素としてＣ１２７マ ウス細胞のような細胞系で実施し得る。その他の好適な哺乳動物細胞系としては 、ヒーラ細胞、ＣＯ３−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、Ｂａ１ｂ −ｃまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３系、ＢＨＫまたはＨＡＫハムスタ ー細胞系等が挙げられるが、これに限定されるものではない。

ＮＫＳＦタンパク質は２量体であるから、２つのサブユニットが異なっている場 合は（例えば大きいサブユニットと小さいサブユニット）、これらを同一宿主で 同時に発現するか、または別々に発現させて、互いに再生し、活性なＮＫＳＦを 生産しなければならない。

然し、もしＮＫＳＦサブユニットが単一のｃＤＮＡによって暗号化されている前 駆体の切断によって生じるのであれば、少なくとも好適なグロテアーゼを含んで いる哺乳動物細胞で、単一のｃＤＮＡを発現させて機能的なＮＫＳＦを生産する ことができる。

２つのサブユニットを哺乳動物細胞で同時に発現することが必要である場合は、 ２つの異なった選別可能な遺伝子またはマーカーを用いて、２つのｃＤＮＡを細 胞へ導入しなければならない。実施例７で報告するように、これは、一方のマー カーとしてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を、他方のマーカーとして アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を使用して、ＣＨＯｍ胞で容易に達成できる 。任意の哺乳動物細胞系で独立的に選別できる２つの遺伝子の任意の組合わせが この目的に有用である。例えばＣＨＯ細胞系でＡＤＡの選別下に、一方のサブユ ニットの発現を独立的に生じさせ、別の細胞系でＤＨＦＲの選別下に、他方のサ ブユニットの発現を生じさせる。２重選別のもとに、細胞系をポリエチレングリ コール中で融合して、両方のサブユニットを発現する安定な系を生産する。別法 として、２つのＤＮＡを同一の細胞へ同時にまたは順次導入し、それによって活 性なＮＫＳＦを発現する系を生産する。

ついで標準的な免疫学的、生物学的、または酵素的な検定によって、生産物の発 現について安定な形質転換体を選別する。ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化してい るＤＮＡおよびｍＲＮＡの存在は、サザンブロツティングおよびＲＮＡブロッテ ィングのような標準的な方法によって検出し得る。ＣＯ３−１サル細胞のような 好適な宿主細胞へ発現ベクターＤＮＡを導入したのちの数日間、ポリペプチドを 暗号化しているＤＮＡの一過性の発現が、培地中のタンパク質活性または免疫検 定によって無選別に測定される。

また当業者であれば、例えば好適な酵素で、対応するプラスミドからＮＫＳＦサ ブユニットのＤＮＡ配列を挿入し、周知の組換え遺伝子工学技術を用いて、ｐＪ Ｌ３およびｐＪＬ４　［ゴーら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、４巻、６４５〜６５３ 頁（１９８５年）１、およびｐＭＴ２　（ｐＭＴ２−ＶＷＦ　で始まる、ＡＴＣ Ｃ＃６７１２２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０　ＯＯ３３参照）］のよう なその他の既知のベクターを使用することにより、ｐＸＭベクターに匹敵し得る その他の哺乳動物の発現ベクターを組立てることができる。両方のＮＫＳＦサブ ユニットとともにこれらのベクターを好適な宿主細胞へ形質転換することによっ て、ＮＫＳＦポリペプチドの発現を生じることができる。

ｂ、細菌発現系 同様に当業者であれば、暗号配列を挟んで隣接する任意の哺乳動物性調°節配列 を除去し、細菌性調節配列を挿入して、細菌細胞により、この発明のＮＫＳＦサ ブユニットを細胞内または細胞外に発現する細菌性ベクターを作り出すことによ って、ＮＫＳＦサブユニットを暗号化している配列を操作することができる。当 業界で既知のように、ＮＫＳＦポリペグチドを暗号化しているＤＮＡをさらに修 飾して、細菌性発現を最適化するさまざまなコドンを含有させ得る。

当業界で既知の方法により、好ましくは成熟ＮＫＳＦサブユニットを暗号化して いる配列を、成熟ＮＫＳＦポリペプチドの細菌発現、分泌およびグロセッシング を可能にする分泌先導ポリペプチドが暗号化されているヌクレオチドへ、枠組み のまま機能的に結合する。

そのような分泌系を使用して、ＮＫＳＦの両方のサブユニットをエシェリキア・ コリで同時発現し、活性なヘテロ２量体の分泌を生じることが期待される。この 方法によって活性なキメラ抗体断片が得られた［例えばビッタ−ら、サイエンス 、２４０巻、１０４１〜１０４３頁（１９８８年）参照］。

別法として、細胞内に発現するベクターを使用して、エシェリキア・コリで２つ の異なったｃＤＮＡから個々のサブユニットを別々に成熟した形で発現し、既知 の方法によりサブユニットを別々に単離し、これを混合して再生する（例えば米 国特許第４５１２９２２号参照）。

どちらの経路を介しても、細菌宿主細胞で発現させた化合物を、ついで回収し、 精製し、モして／または物理化学的、生化学的および／または臨床的な指標につ いて、すべて既知の方法により特性を決定する。

Ｃ０昆虫または酵母細胞発現 同様の操作によって昆虫細胞でＮＫＳＦポリペブチを発現するための昆虫ベクタ ーの組立てが実施できる（例えば公開されたヨーロッパ特許出願第１５５４７６ 号に報告された方法、参照）。ＮＫＳＦサブユニットを単一のｃＤＮＡから誘導 したのであれば、このｃＤＮＡは昆虫細胞で発現され得る。もしそうで１嘘なく 、ＮＫＳＦサブユニットが２つの異なったｃＤＮＡから誘導したのであれば、各 サブユニットを昆虫細胞ベクターへ別々に挿入し、得られた２つのベクターを昆 虫細胞へ同時導入して、生物学的に活性なＮＫＳＦを発現する。

同様に酵母調節配列を使用して酵母ベクターを組立て、酵母細胞で個々のＮＫＳ Ｆサブユニットを同時発現するか、あるいはもし、タンパク質が単一の前駆体か ら誘導されたのであれば、その前駆体を暗号化しているｃＤＮＡを酵母細胞で発 現して、細胞外に分泌される活性なＮＫＳＦへテロ２量体を生産する。別法とし て、個々のサブユニットを酵母で細胞内に発現し、個々のポリペプチドを単離し 、最後に互いに再生して活性なＮＫＳＦを得る（例えば、公開されたＰＣＴ出願 ＷＯ３６１００６３９、およびヨーロッパ特許出願ＥＰ１２３２８９に報告され た方法を参照）。

［実施例７１ 高水準のＮＫＳＦを発現するＣＨ○細胞系の組立てこの発明のＮＫＳＦタンパク 質を哺乳動物細胞から高水準で生産する１つの方法は、個々のＮＫＳＦザブユニ ットを暗号化している２つのｃＤＮＡの多重コピーを含んだ細胞を組立てるか、 または、もしサブユニットが単一ポリペプチドから誘導されるのであれば、ＮＫ ＳＦ前駆体を暗号化しているｃＤＮＡのコピーを含んだ細胞を組立てることを含 む。

後者の場合、細胞が濃度増大するメトトレキセート（ＭＴＸ）を含有するように 、例えばカウフマンおよびシャープの方法により、単−のｃＤＮＡを増幅可能な マーカー（例えばＤＨＦＲ遺伝子）と同時トランスフェクトする［カウフマンお よびシャープ、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー（１９８２年） 、前掲］。

この方法は多数の異なった細胞型に使用できる。

例えばＮＫＳＦ前駆体遺伝子を含んでいるｐＭＸベクター（実施例６）を、この 前駆体遺伝子の発現を可能にする他のプラスミド配列と機能的に組合わせて、ｐ ＡｄＤ２６ＳＶｐＡ３のようなりＨＦＲ発現プラスミド［カウフマン、プロシー ディングズ・オン・ザ。

ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・オン・ザ・ＵＳＡ。

８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年）］と−緒に、リン酸カルシウム共沈お よびトランスフェクションによって、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞ＤＵＫＸ−Ｂ１１ へ導入する。透析したウシ胎児血清によるａ培地における増殖によって、ＤＨＦ ＲＨＦ形質転換体を選別する。生物検定、免疫検定、またはＲＮＡブロッティン グにより、形質転換体をＮＫＳＦ発現について検査し、つぎに陽性プールを、Ｍ ＴＸの濃度増大（０，０２，０，２，１，０，５μＭの段階系列）による増殖の 増幅について選別する［カウフマンら、モレキュラー・セル・バイオロジー、５ 巻、１７５０頁（１９８３年）］。増輻された系をクローン化し、ＮＫＳＦタン パク質発現全発現インターフェロン誘発検定によってモニターする。ＭＴＸ耐性 水準の増大とともにＮＫＳＦ発現が増大することが期待される。

もし２つのＮＫＳＦポリペプチドがそれぞれ別のｍ　ＲＮ　Ａから誘導されるの であれば、それぞれ対応するｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で同時発現する。例えばＤＨ ＦＲおよびＡＤＡのような２種の異なった選別可能なマーカーを使用し得る。ｃ ＤＮＡの一つは、ＮＫＳＦサブユニットの１つを発現するＤＨＦＲ系（例えばベ クターｐＸＭ）を使用して発現し、また単一前駆体ＮＫＳＦタンパク質の際に報 告したように、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ３を使用してＤＨＰＲを発現する。第２の サブユニットもベクターｐＸＭを使用して発現されるが、このマーカーはプラス ミドｐＳＶ２ＡＤＡとの同時トランスフェクトを介して得られ［カウフマンら、 プロシーデイングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ ・オン・ザ・ＵＳＡ。

８３巻、３１３６頁（１９８６年）］、哺乳動物細胞でＡＤＡの発現を指令する 。第２のサブユニットを含んだｐＸＭベクター組立て体を、ｐＳＶ２ＡＤＡと一 緒ｊ：：ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｌ■細胞へトランスフェクトする。ト ランスフェクトされた細胞を２′−デオキシコアオルマイシン（ｄＣＦ）のＯ， ＯＩＰｇ〜４０μｇの段階的に増大する濃度で、増殖について選別する。個々の ｃＤＮＡの発現（一方のサブユニットはｌ細胞系でＤＨＦＲＨＦ下に、他方のサ ブユニットは別の細胞系でＡＤＡ選別下に）を、転写を試験するｍＲＮＡプロッ ティングおよびタンパク質生産を試験する免疫検定の組合わせによって実施する 。最後に、ＡＤＡ選別下にサブユニットの１つを発現する細胞とＤＨＦＲＨＦ下 に他方のサブユニットを発現する細胞とを、当業界で十分確立された方法を用い てポリエチレングリコール中で融合し、ｄＣＦおよびＭＴＸのいずれにも耐性で 、両方のサブユニットを発現する単−細胞系を生産し、生物学的に活性なＮＫＳ Ｆを生産する。

どちらかの薬物の選別下に、どちらかのサブユニットを発現する細胞系を生成す ることもできる。つぎに他方のサブユニットを発現するｃＤＮＡを第２の薬物の 選別下に導入し、両方のサブユニットを同時に発現する細胞を生産し得る（例え ば公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ３８１０８０３！Ｍ）、ＤＨＦＲへ結合した第 １の遺伝子とＡＤＡ遺伝子へ結合した第２の遺伝子を別個に増幅する例示的な報 告を参照）。

また両方のＮＫＳＦサブユニットを発現する２つのｐＭＸ組立て体を、ＤＨＦＲ を発現するプラスミドおよびＡＤＡを発現するプラスミドと混合し得る。両方の 薬物を組合わせた選別を使用して、形質転換体をＮＫＳＦ活性について直接試験 し、ヘテロ２１体を発現する細胞系を得ることができる。

上述の発現系のいずれの場合でも、得られた細胞系を好適な薬物選別によってさ らに増幅し、得られた細胞系を再クローン化して、本明細書で報告するγ−イン ターフェロン誘発検定を使用して発現水準を評価することができる。

［実施例８］ ヒトＮＫＳＦの生物学的活性 下記の検定は、実施例２で報告した均質なＮＫＳＦ、または部分的に精製したＮ ＫＳＦ変異体のいずれかを使用して実施した。分子の組換え変異体は、これらの 同一の検定またはその他の検定でＮＫＳＦの生物学的特性を有することが期待さ れる。

新たに調製したヒト末梢血の単核球細胞（ＰＢＭＣ）　、またはフィトヘマグル チニン（ＰＨＡ）で誘発した芽球をＮＫＳＦとともに培養すると、上溝中に有意 なγ−インターフェロン量が検出される。

さらにＮＫＳＦは、γ−インターフェロン生産誘発においてＩＬ−２、ホルポー ルジブチレート（ＰｄＢｕ）、およびＰＨＡと相乗的に作用する。ノーザンプロ ット分析で、ＮＫＳＦは単独または他の因子と組合わせて、γ−インターフェロ ンｍ　ＲＮ　Ａの蓄積を誘発することが分かった。γ−インターフェロン伝達情 報は、精製したＴ細胞集団およびＮＫ細胞集団のどちらでも見いだされた。タン パク質合成阻害剤シクロへキシミド（ＣＨＸ）とともに前装置したのち、ＮＫＳ Ｆで刺激するとγ−インター７エａンｍＲＮＡの超誘発を生じる。ＨＬＡ−ＤＲ （＋）補助細胞はＴ細胞およびＮＫ細胞にょるγ−インターフェロン産生に必要 である。γ−インターフェロンｍＲＮＡの誘発は、ＰＨＡ芽球のＮＫＳＦ処理後 １時間以内に検出できる。以下にこの検定の詳細を報告する。

ａ、γ−インターフェロン誘発検定 ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）培養におけるγ−インターフェロン（γ−ＩＦ Ｎ）発現誘発によって、ＮＫＳＦ活性を測定した。

この検定では、１０％加熱失活させたＦｅ２を加えたＲＰＭＩ１６４０培地に浮 遊したヒトＰＢＬ　ｓ　（１０’細胞／ｍｌ）　１００　μｌを微量検定プレー ト（Ｕ−ボトム、９６−ウェル、コスタ−社、ケンブリッジ、ＭＡ）で試験試料 １００μｍへ添加し、５％Ｃｏ２気流中、３７°Ｃで１８時間インキュベートし た。試験試料は、精製したＮＫＳＦ、４８時間ホルボールジエステルで刺激した ＲＰＭＩ８８６６細胞から透析した無細胞上清、および組換え体ＩＬ−２（ジェ 不ティック・インスチチュート社、ＰＣＴ出願ＷＯ３５１０５１２４参照）を含 有している。インキュベーションしたのち、各ウェルから無細胞上清１００μｍ を棄て、産生されたγ−ＩＦＮ量を放射＆ｌ疫検定（セントコール・γ−インタ ーフェロン・ラジオイムノアッセイ、セントコール社、マルバーン、ＦＡ）によ り測定した。

１ｍｌ当たりのＮＫＳＦＩ単位は、ＮＫＳＦの至適濃度の存在で生産される最大 γ−ＩＦＮ量の１／２を生産するのに必要な濃度である。

各ウェルで生産されるγ−Ｉ　Ｆ　Ｎ量と培養内のＮＫＳＦ量との間にはプラス の相関がある。

γ−ＩＦＮ以外にも、ＮＫＳＦは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＧＭ−Ｃ３Ｆ８よび 腫瘍壊死因子生産を誘発する。上述のようにこれらのサイトカイン生産の検定を 実施し、上溝をサイトカイン類の存在について特異的な生物学的検定または放射 線免疫検定によって検定した［カチュリら、ジャーナル・オン・エキスペリメン タル・メジシン、１６５巻、１５８１−１５９４頁（１９８７年）］。別法とし て、サイトカイン遺伝子の誘発はＮＫＳＦ処理しｊ；リンパ球内の３種のサイト カインのｍ　ＲＮ　Ａ転写物の蓄積を評価することによって測定する。リンパ球 をＮＫＳＦと４〜１８時間培養し、確立された方法によってＲＮＡを抽出し、ア ガロースゲル電気泳動によって分画し、ニトロセルロースでプロットし、３ｆｆ Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブで、γ−ＩＦＮＳＧＭ−Ｃ５Ｆ、または腫瘍壊死因子 遺伝子に対して形質転換する（ノーザンブロッティング）、形質転換の程度はオ ートラジオグラフィーおよびデンシトメトリーによって測定する。

ＮＫＳＦは、精製したヒトＮＫ細胞からのγ−ＩＦＮおよびＴＮＦ生産を誘発す る。（ａ）のγ−インターフェロン誘発検定で報告した検定では、ＮＫ細胞は２ つの作用機構によって各種の標的細胞を溶解することができる。１つの作用機構 は、特異的な感作なしに白血病細胞系および固形腫瘍由来細胞系、ウィルス感染 細胞、およびある場合には、正常細胞を含む各種の標的細胞を一過性に溶解する 。第２の作用機構はＡＤＣＣである。予備的な根拠から、ＮＫＳＦは、ＮＫ細胞 のＦｃレセプターへ結合可能なＦｃ部分をＩｇＧ抗体で被覆した標的細胞を、一 層効率的に溶解するＮＫ細胞の細胞溶解能を増強し得ることが判明した。

ｂ、ＮＫ検定 ＮＫＳＦによるＮＫ細胞の一過性細胞障害性の増強を検定するため、ＰＢＬｓま たは精製したＮＫ細胞（５ＸｌＯ’細胞／ｍｌ）を１０％加熱失活させたＦＣＳ を加えたＲＰＭ１１６４０培地で、ＮＫＳＦの各種希釈度の存在で１８時間イン キュベートする。ついでＰＢＬｓを洗浄し、Ｕ−ボトム微量滴定板の１０’″’ Ｃｒ−標識した標的細胞へ、ＰＢＬｓを、ｌ：１〜１００：１のＰＢＬ−標的細 胞比で添加する（最終容量２００μｌ）。４時間後、プレートを遠心し、無細胞 上清を採取して、細胞からの５ｒＣｒ−標識の放出によって標的細胞の溶解を評 価する。標的細胞として悪性造血細胞系（即ち、Ｋ２Ｏ２、ダウディ、Ｕ９３７ 、ＨＬ−６０、ＭＬ３、モルト４、ジャーカット、ＴＨＰ−１）　、固形腫瘍由 来細胞系（横絞筋肉腫、黒色腫）、および正常な包皮由来繊維芽細胞株について 検定を行うと、ＮＫＳＦはＮＫ細胞の細胞障害性を数倍増大する。ＮＫＳＦによ るＮＫ細胞性細胞障害性の増強は、γ−ＩＦＮ、腫瘍壊死因子またはＩＬ−２の 産生による２次的なものではなく、ＮＫＳＦで処理したＰＢＬによって生じたも のである。細胞障害性検定、ＮＫ細胞の精製方法、およびサイトカインによって 増強されたＮＫ細胞を介する増強の定量的な評価については、Ｇ、トリンキエリ ら、ジャーナル・オン・エキスペリメンタル・メジシン、１４７巻、１３１４頁 （１９７８年）、Ｇ、トリンキエリら、ジャーナル・オン・エキスペリメンタル ・メジシン、１６０巻、１１４７頁（１９８４年）、およびＢ、ベルッシアら、 ナチュラル・イミユニティ−・アンド・セル・グロウス・レギュレーション、６ 巻、１７１−１８８頁（１９８７年）］に詳細に報告されている。

ｃ、ＡＤＣＣ検定 標準的な抗体依存性細胞障害性の検定における予備的な成績で、この発明の部分 的に精製したＮＫＳＦは、抗体被覆した腫瘍標的細胞のＮＫ細胞致死作用を投与 量に比例した形で増強することが判明した。ＮＫ細胞のＦｃレセプターへ結合し 得る抗体に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ反応は、ＮＫＳＦの添加によって増強され る。

ｄ、ＮＫＳＦの助マイトジェン効果 １０％加熱失活させたヒ１−ＡＢ血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌ でＰＢＬｓ　（０，５Ｘ１０″／ｍｌ）を培養する。３日後および６日後に、Ｐ ＢＬｓを３Ｈ−チミジンで６時間パルスし、スカトロン・セル・ハーベスタ−を 使用してガラスフィルターに細胞を採取し、バラカード・トリカーブ・ベータ・ カウンターを使用する液体シンチレーションにより細胞内の３Ｈ−チミジンを計 数することにより、ＤＮＡ合成（増殖）を評価する。ＮＫＳＦは、それ自身によ るＰＢＬ増殖効果はごく僅かであるが、フィトヘマグルチニンとの培養６日目お よびホルボールジエステルｔこはＰＤＢｕ　１０−’）との培養３日目および６ 日目でいずれも強いマイトジェン誘起効果を示す。細胞周期分析は、ロンドンら による免疫蛍光染色［ロンドンら、ジャーナル・オン・イムノロジー、１３７巻 、３８４５頁（１９８６年）］をＤＮＡ染色と組合わせた手技を使用するフロー サイトメトリー（サイトフルオログラフ５０Ｈ１オルト・ダイアグノスティック ス社）によって実施する。この分析から、ＮＫＳＦのマイトジェン誘起効果によ って影響されたＰＢＬｓはＴ細胞のＣＤ４またはＣＤ８でいずれも陽性であるこ とが判明した。

ｅ．ＧＭ−ＣＳＦ誘発検定 ヒトＰＢＬｓの培養でＧＭ−ＣＳＦ発現の誘発を測定した。この検定で、１０％ 加熱失活させたＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊したヒトＰＢＬｓ　 （１０−’細胞／ｍｌ）　ｌ　Ｏ　Ｏ，ｕｌを、微量滴定板（Ｕ−ボトム、９６ −ウェル、コスタ−社、ケンブリッジ、ＭＡ）で試験試料１００μｌへ添加し、 ５％ＣＯ２気流中で３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション 後、各ウェルから無細胞上清１００μｌを棄て、異なったエピトープを認識する ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する２種のマウスモノクローナル抗体（３／８、２０．５ および２／３．Ｌジエネテイツクス・インスチチュート社より提供）を使用する 酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、産生されたＧＭ−ＣＳＦ量を測 定した。組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ　（ジエネテイツクス・インスチチュート社 ）を標準とじて使用して、この検定の検出限界は５０ｐｇ／ｍｌであった。

この発明を実施することによって、多数の修飾および変更を当業者へもたらすこ とが期待される。

国際調査報告 １＋、＊＋ｎｏ拳＋ｊ１＾”””””’ＰＣＴ／ＵＳＥｔ９１０５０２７国際調 査報告 ＰＣＴ／ＩＪｓ　Ｂ９１０５０２７ ＳＡ　３２８９４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．他のタンパク質様物質を実質上伴わないナチュラルキラー細胞刺激因子タン パク質。 ２．第１表と同一または実質上同一のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列またはその 断片を含んでなる請求項１に記載のタンパク質。 ３．約４０ｋｄの見掛けの分子量を有し、【配列があります】の配列と同一また は実質上同一のアミノ末端配列を有するサブユニットを含んでなる請求項１に記 載のタンパク質。 ４．約３０〜３５ｋｄの見掛けの分子量を有し、【配列があります】（Ｐまたは Ｘ）【配列があります】（ＳまたはＸ）【配列があります】（ここで、Ｘは任意 アミノ酸である）の配列と同一または実質上同一のアミノ末端配列を有するサブ ユニットを含んでなる請求項１に記載のタンパク質。 ５．化学的に 【配列があります】 および 【配列があります】（ＰまたはＸ）【配列があります】（ＳまたはＸ）【配列が あります】（ここで、Ｘは任意アミノ酸である） からなるアミノ酸配列の１またはそれ以上を含んでいる請求項１に記載のタンパ ク質。 ６．生物学的に、γ−インターフェロン誘発検定で１ｍｇ当たり１×１０７希釈 単位より大きい比活性を有する請求項１に記載のタンパク質。 ７．（１）ＳＤＳ　ＰＡＧＥで、非還元条件下に約７０〜８０ｋｄの見掛けの分 子量、 （２）ＳＤＳ　ＰＡＧＥで、還元条件下に約４０ｋｄの見掛けの分子量を有する サブユニット、 （３）ＳＤＳ　ＰＡＧＥで、還元条件下に約３０〜３５ｋｄの見掛けの分子量を 有するサブユニット、 （４）等電点ゲル電気泳動で４．３の等電点、（５）等電点ゲル電気泳動で４． ８の等電点、（６）ヒドロキシルアバタイトカラムから単一のピークとして溶出 、 （７）ヘパリン−セファロースカラムから単一のピークとして溶出、 （８）ＦＰＬＣモノＱカラムから単一のピークとして溶出、（９）ＰＢＬｓによ るγ−インターフェロン誘発検定における生物学的活性、 （１０）ＰＢＬｓによるＧＭ−ＣＳＦ誘発検定における生物学的活性、 （１１）白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させる活性化ＮＫ細胞における生 物学的活性、 （１２）ＰＨＡ活性化Ｔリンパ球を使用する腫瘍壊死因子誘発検定における生物 学的活性、 （１３）末梢血Ｔリンパ球に対するマイトジェン作用誘起活性からなる１または それ以上の特徴を有する請求項１に記載のタンパク質。 ８．ＲＰＭ１８８６６から得たならし培地をＱＡＥゼータ調製用カートリッジ、 レンチルレクチンカラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、ヘパリンセファロー スカラム、および高速タンパク質液体クロマトグラフィー・モノＱカラムを通し て順次精製し、後段のカラムからＮＫＳＦが単一ピークとして溶出することによ って生産された請求項１に記載のタンパク質。 ９．ＮＫＳＦの発現を暗号化し、発現調節配列と機能可能に組合せたｃＤＮＡで 形質転換した細胞系を培養することによって生産された請求項１に記載のタンパ ク質。 １０．サブユニットが 【配列があります】 からなるアミノ末端配列と同一または実質上同一の配列またはその断片を含んで いる請求項３に記載のタンパク質。 １１．ＲＰＭＩ８８６６から得たならし培地を、ＱＡＥゼータ調製用カートリッ ジ、レンチルレクチンカラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、ヘパリンセファ ロースカラム、および高速タンパク質液体クロマトグラフィー・モノ−Ｑカラム を通して順次精製し、ここでＮＫＳＦが後段のカラムから単一ピークとして溶出 されることからなる均質なＮＫＳＦの生産方法。 １２．モノＱカラムの溶出物をさらにゲル濾過クロマトグラフィーに掛けること からなる請求項１１に記載の方法。 １３．所望によりゲル濾過クロマトグラフィーの前に逆層ＨＰＬＣ精製を含む請 求項１１に記載の方法。 １４．ＮＫＳＦまたはそのサブユニットの発現を発現調節配列と機能的に組合わ せて暗号化しているｃＤＮＡ配列で形質転換した細胞系を培養することを含むＮ ＫＳＦまたはそのサブユニットを生産する方法。 １５．【配列があります】 【配列があります】 および 【配列があります】（ＰまたはＸ）【配列があります】（ＳまたはＸまたはＴ） 【配列があります】（ここでＸは任意のアミノ酸である） で示されるアミノ酸配列の１またはそれ以上を暗号化しているヌクレオチド塩基 配列を含んでなるＮＫＳＦまたはそのサブユニットを暗号化しているＤＮＡ配列 。 １６．【配列があります】 で示されるヌクレオチド塩基またはその断片と同一または実質上同一な配列を含 んでなる請求項１５に記載のＤＮＡ配列。 １７．【配列があります】 で示されるアミノ酸配列と同一または実質上同一のアミノ酸配列またはその断片 を暗号化しているヌクレオチド配列を含んでなる請求項１５に記載のＤＮＡ配列 。 １８．発現調節配列と機能可能に組合わせた請求項１５に記載のＤＮＡ配列で形 質転換された細胞。 １９．哺乳動物細胞または細菌細胞からなる請求項１８に記載の細胞。 ２０．γ−インターフェロン誘発検定でポリペプチド１ｍｇ当たり１×１０７希 釈単位より大きい比活性を有する均質なＮＫＳＦ。 ２１．ＮＫＳＦまたはそのサブユニットの治療的有効量を製薬上許容し得る有効 な担体に含有してなる医薬組成物。 ２２．サイトカイン、造血促進因子、または成長因子の治療的有効量を追加的に さらに含有してなる請求項２１に記載の組成物。 ２３．上記のサイトカインがＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６からなる群か ら選ばれたものである請求項２１に記載の組成物。 ２４．請求項１５に記載のＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドベクター。 ２５．ＮＫＳＦまたはそのサブユニットの有効量を患者へ投与することからなる ガンの処置方法。 ２６．ＮＫＳＦとともに少なくともさらに１種の造血促進因子、サイトカイン、 成長因子、またはＮＫ細胞のＦｃ部分へ結合し得る抗体の有効量を同時にまたは 順次に投与することを含む請求項２５に記載の方法。 ２７．造血促進因子がＩＬ−１、ＩＬ−２、またはＩＬ−６である請求項２５に 記載の方法。