JPH04502256A - キメラｄｎａ―ｒｎａ触媒活性配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラＤＮＡ−ＲＮＡ触媒活性配列 発明の分野 本発明はＤＮＡ−ＲＮＡ触媒活性分子に関する。特に本発明は例えばＨＩＶ−１ のＲＮＡ塩基配列を切断するのに効果的なキメラＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮ Ａ−ＤＮＡ触媒活性分子に関する。

背景技術 リボザイムは多くのＲＮＡ自己消化反応に介在する構造ＲＮＡ分子である。違っ た二次構造をもつ２つの異なるトランス作用性リボザイム、”／％ンマーヘッド ”および”ヘアビグが明らかにされている。オンコジーンアンドエイズ（１９９ ０）［引用コは次のように述べている：”他に可能な人工的なアプローチはりボ ヌクレオチドの触媒活性中心およびデオキシヌクレオチドの周辺配列を含んだキ メラ分子の開発である。ＲＮＡ触媒活性中心およびＤＮＡ周辺配列からなるキメ ラ触媒は著しい安定性を持ちながら生物学的活性を保持していることもまた想像 される。′ぺｏ　−（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４４：　 ５６５−５６７　（１９９０）は、触媒活性を持ったある種のデオキシリボヌク レオチドとりボオリゴヌクレオチドとの混合物を記載している。実際に治療に有 用なＲＮＡ−ＤＮＡ触媒活性分子はまだ見つかってＬｌない。

発明の要約 本発明はＲＮＡ塩基配列を切断するのに有効なキメラＤＮＡ／ＲＮＡ触媒活性分 子を提供する。本発明は特にＨＩＶ−１のＲＮＡ塩基配列を標的にして切断する ２つの異なったキメラＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ活性触媒分子を 提供する。これらのキメラ分子はＲＮＡ触媒活性中心の周辺のＤＮＡ塩基配列を 含む。ＨＩＶ−１１７）基質ＲＮＡとの相互作用＋ｔＨＩＶ−１，１７）ＲＮＡ とＤＮＡ周スホスホジエステル結合断する。

発明の詳細な説明 一般的には本発明の触媒活性分子はハンマーヘッドあるいはヘアピンリボザイム として機能する。好ましい分子は２つの知られているＲＮＡ触媒活性中心がそれ ぞれの３゛および５゛末端においてＤＮＡ塩基配列を両側に配し、該ＤＮＡの対 応する５°および３゛末端と結合している構造からなる。従ってこれらの分子は 式ＩおよびＩＩにより表される： １、　３’　Ｘ−ＡＡＡＧ−Ｙ−ＡＧＵＡＧＵＣ−Ｚ　５’あるいは Ｉｌ、　３’　Ｘ−ＣＡＡＡＧ−Ｙ−ＡＧＵＡＧＵＣ−Ｚ　５’（式中、Ｘ、Ｙ およびＺはＤＮＡ塩基配列部分であり、ＡＡＡＧ、ＣＡＡＡＧおよびＡＧＵＡＧ ＵＣは触媒ＲＮＡ塩基配列部分である。）周辺のＸおよびＺの各塩基配列部分は 基質の切断部位の付近の適当な位置において基質ＲＮＡとの間に塩基間の相補結 合を起こしうるちのであればどのようなりＮＡ塩基配列でもよい。これらの周辺 配列はホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホ スフェートあるいは類似の成分であってよい。

Ｙは好ましくは式ＩＩＩ： ５’　Ｃ−Ｇ　３゜ −Ｔ −Ｃ −Ｃ Ｇ Ｔ で示される塩基間の相補対にみられるように、ＲＮＡ塩基配列部分の触媒活性に よる基質の切断に必要な様式で自己の内部に相補性結合を形成するＤＮＡ塩基配 列であればどのようなものでもよい。

本発明の触媒活性分子はＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓあるいはＭｉｌ ｌｉｇｅｎで製造されているような市販のＤＮＡ合成機により周知の方法で合成 される。例えば、前記ペローらの文献を参照せよ。

ＸおよびＺの配列は細胞への侵入性、細胞内での標的指向性および触媒の最終的 安定性を高めるためにリガンドによってそれぞれの３°および５°の位置で置換 され得る。そのようなリガンドの非限定的な例示としては、他のヌクレオチド、 蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイドホルモン、およびコレステロールが含まれ る。

本発明の触媒活性分子はリポソーム、欠損ウィルス粒子、ウィルス頭部、および 標準的なりＮＡ／ＲＮＡ　トランスフェクション法を含んだ、周知のおよび入手 可能な送達剤もしくは系により投与されるが、しかしこれらに限定されるもので 第１図はＨＩＶ−１の塩基配列と相補対を形成した本発明の触媒活性分子の一つ を表す。分子のＲＮＡ部分は線で囲まれている。

第２図は他のＨＴＶ−１の塩基配列と相補的な配列をもつ本発明の触媒活性分子 の二つめを表す。分子のＲＮＡ部分は線で囲まれている。

第３図Ａは同等の全ＤＮＡ分子と比較して第１図の触媒活性分子のりポヌクレア ーゼＡによる消化を表す。条件は５ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ緩衝液（ｐＨ１８， ０）　１０μｌ中のオリゴヌクレオチドに２ＸＳＳＣ緩衝液中の市販されている （Ｓｉｇｍａ）膵臓リボヌクレアーゼ１０ユニツトを加えた。ｓ２Ｐで末端ラベ ルされたＤＲＤＲＤあるいはＤＮＡ分子を８Ｍ尿素を含んだ１５％ポリアクリル アミドゲルで電気泳動する前にＲＮａｓｅをサンプルと１０分間インキュベート した。ゲルを１０分間オートラジオグラフ処理して、被照射部分を現像した。

第３図Ｂはチャン（Ｃｈａｎｇ）ら、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ４：　２３−３１　（１９９０）に述べられている条件で行われた第１ 図の触媒活性分子を含む切断反応を表す。

実施例１ 第１図の触媒活性分子はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃで製 造されている自動オリゴヌクレオチド合成機を利用して周知の方法により合成さ れた。

触媒活性分子のりボヌクレアーゼＡによる消化の結果は第３図Ａに示されている 。

上記のようにして、生産された触媒活性分子は、それぞれ６１０ヌクレオチドい られた。要約すると、緩衝液は標的分子およそ１　ｐｍｏｌ、　ＤＮＡあるいは りボザイム３　ｐｍｏｌにつき５ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣｌ、　ｐＨ７，５，１ｍ Ｍ　ＥＤＴ＾、　１０ｍＭ　ＭｇＣｈであった。反応は３７℃において１２時間 行われた。基質はＨＩＶ−１ｇａｇ転写産物を含む６１０ヌクレオチド（Ｓ−６ １０）とＨＩｖ−１ｊＬＡｊＬ転写産物を含む１７２ヌクレオチド（Ｓ−１７２ ）のいずれかである。両方のヌクレオチドともに５゜切断産物を示した。

第３図Ｂにおいて５゛切断産物は両方の転写産物について示されている。標的物 ６１０の３°切断産物はオートラジオグラフィーにおける再現には量的に乏しい ので見えない、しかし３’　Ｐの決定法によりその位置が示される。ネガティブ コントロールとして、ＤＲＤＲＤ配列と等しい塩基配列をもった全ＤＮＡオリゴ ヌクレオチド（Ｄ）を同じ条件で同じ基質を用いてインキュベートしたが、切断 は起こらなかった。

同じ触媒活性分子をもちいたＨＩＶ−１の５’　ＬＴＲスプライス部位の特異的 な切断も起こすことができた。

Ｆｇ（：、　１ＤＲＤＲＤ−１ 蒼 ＦＩＧ、　２　ＤＲＤＲＤ　ｉ２ ＦＩＧ、３Ａ ＤＲＤ　Ｄ ＦＩＧ、　３Ｂ Ｍ　ＤＲＤ　Ｄ −−１−・ 国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の式： ３′Ｘ−ＡＡＡＧ−Ｙ−ＡＧＵＡＡＧＵＣ−Ｚ５′あるいは ３′Ｘ−ＣＡＡＡＧ−Ｙ−ＡＧＵＡＡＧＵＣ−Ｚ５′（式中、ＸおよびＺはリボ ザイムの既知の切断部位と近接した位置において、ＲＮＡ基質と相補対を形成し 得るＤＮＡ塩基配列部分であり、ＡＡＡＧ，ＣＡＡＡＧおよびＡＧＵＡＧＵＣは ＲＮＡ塩基配列部分を表し、Ｙは前記各ＲＮＡ塩基配列部分が前記切断部位にお いて前記ＲＮＡ基質を切断することを可能ならしめる様式で自己の内部で相補対 を形成し得るＤＮＡ塩基配列部分である。）で表される、リボザイム切断部位に おいてＨＩＶ−１のＲＮＡ塩基配列を切断することのできる触媒活性分子。
2. ２．第１図に示された触媒活性分子。
3. ３．第２図に示された触媒活性分子。
4. ４．前記ＲＮＡ塩基配列がＨＩＶ−１の塩基配列である、請求項１に記載の触媒 活性分子。
5. ５．前記ＨＩＶ−１塩基配列が第１図に示されたＨＩＶ−１の塩基配列である、 請求項４に記載の触媒活性分子。
6. ６．ＨＩＶ−１塩基配列が第２図に示されたＨＩＶ−１の塩基配列である、請求 項４に記載の触媒活性分子。
7. ７．ＲＮＡ基質の切断部位周辺の各ＲＮＡ塩基配列と相補対を形成し得る第１お よび第２ＤＮＡ部分に結合しておりさらに前記切断を促進するように自己の内部 で相補対を形成し得る第３のＤＮＡ塩基配列で相互に連結されているいくつかの 触媒活性ＲＮＡ部分をもつ、ＲＮＡ塩基配列を基質として切断することのできる 触媒活性分子。