JPH04502277A - ハロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解を促進する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解を促進本発明はハロゲン置換脂肪族炭化 水素の生物分解するための改良された方法、特に、例えばトリクロロエチレン（ ＴＣＥ）のような揮発性塩素置換脂肪族化合物（ＶＣＡ）を汚染場所で生物分解 する方法に係わる。

発明の背景 ハロゲン置換脂肪族炭化水素のトリクロロエチレン（ＴＣＥ）は地下水汚染物質 として最近関心を集めている揮発性塩素置換化合物である。ＴＣＥは発癌性であ り、地下水中にあって生物学的または非生物学的に分解し難い。従来の水処理方 法では地下水から有効にＴＣＥを除去できないことが判明している。曝気除去及 び粒状活性炭またはアンバーソーブ樹脂による吸収を利用して得られる結果は比 較的有効である。これらの方法は現在採用されているＶＣＡ軽減技術である。有 効ではあるが、これらの方法は汚染を別の媒質、即ち、大気（曝気除去）または 固形媒質（吸収）に転嫁するに過ぎず、あらためて危険な廃棄物として処理しな ければならない。本発明は有毒化合物を無毒生成物に変換する方法を提案するも のである。

地下水系中に棲息中の微生物によるＴＣＥ分解能が検討され、嫌気的生物分解の 証拠が報告されている。幾つかの研究は好メタン性の条件下でならＴＣＥが分解 可能であることを示唆している。しかし、分解生成物は同じ（らい有害な代謝産 物、例えばジクロロエチレンや塩化ビニルを含んでいる。汚染された土壌を空気 中のメタンに曝すとＴＣＥが完全に鉱化され、このことはメタンを栄養とする微 生物がＴＣＥを分解できることを示唆している。好メタン微生物によるＴＣＥ分 解については、まずメタンモノオキシゲナーゼによってＴＣＥがエポキシ化され 、次いで非生物学的転位が起こってジクロロ酢酸、ギ酸塩及び−酸化炭素が形成 され、これらがさらにそれぞれ分解されるというメカニズムが考えられる。

他方、ＴＣＥを分解する微生物の純粋培養がＮｅ１ｓｏｎ。

Ｍ、Ｊ、らによってＡｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｅ＋ｏｂｉｏ１．． ５３　：　９４９−９５４　（１９８７）及び＾ｐｌｉｅ＋ｆ　Ｅｎｙｉｒｏｎ 、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　５４　：　６０４−６０６　（１９８８）に報告さ れており、米国特許出願第４４．２１３号の主題ともなっている。

このような純粋培養は芳香族分解性の生物学的経路によってハロゲン置換脂肪族 炭化水素を分解できる微生物を、前記芳香族分解性の生物学的経路が作用し得る 条件下でハロゲン置換脂肪族炭化水素と一緒に培養する生物分解法に利用される 。この方法は結果的にハロゲン置換脂肪族炭化水素を二酸化炭素や無機塩化物の ような無毒生成物に変換する。この方法はハロゲン置換脂肪族炭素水素に汚染さ れた環境の浄化に有用である。浄化システムはバイオ反応器タイプのシステムに この純粋培養を利用する。また、汚染場所にハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解 する芳香族分解性の生物学的経路を発生させるに充分な量の誘発物質を添加する ことにより天然の微生物コミユニティ−または導入された微生物を刺戟してハロ ゲン置換脂肪族炭化水素を分解することも可能である。

しかし、残念ながら分解性の生物学的経路を活性化するために例えばメタンガス や芳香族化合物のような誘発物質を添加しなければならないという条件がこの新 しい発見された純粋培養法の生物分解方式の利用を制約する。

本発明による発見以前には生物分解法に利用される誘発物質は２種類に過ぎなか った。例えばフェノールのような芳香族化合物は誘発物質として有効ではあるが 、それ自体が環境汚染物質であるため汚染場所での使用は制限される。また、現 場使用に適したものとしてメタンガスを誘発物質として利用するアプローチもあ る。ある種の汚染物質の分解には誘発物質として有効であるが、メタンが気体で あるだけに現場に添加するのは一層困難であり、生物分解プロセスの制御を困難 にする。

従って、微生物に対する誘発物質として無毒性の非気体化合物を利用するハロゲ ン置換脂肪族炭化水素の生物分解法を提供するのが本発明の目的である。さらに また、無毒性の非気体化合物を誘発物質として利用して汚染場所でハロゲン置換 脂肪族炭化水素を生物分解する方法を提供することも本発明の目的である。

本発明のその他の目的及び利点は以下の説明から明らかになるであろう。

発明の概要 本発明はオキシゲナーゼによって制御されるパスウェイを誘発してハロゲン置換 脂肪族炭化水素を分解するように微生物を刺戟する無害無毒の非気体誘発物質の 発見に基づいている。このような誘発物質の例としては例えばトリプトファンや 炭素数１０乃至２０の線状アルカンのような芳香族アミノ酸を挙げるこ止ができ る。誘発物質としての芳香族アミノ酸の顕著な長所は天然の無毒性物質であり、 その多くが人間にとって必要な栄養物であるため、規制機関、例えば政府当局に よって汚染場所への直接添加が受け容れられ易いことにある。本発明ではこれら の誘発物質をハロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解促進に利用する。

従って、広義において本発明はハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解できる微生物 を、ハロゲン置換脂肪族炭化水素、及び微生物の生物分解作用を促進する無毒性 の非気体状誘発物質と一緒に培養するハロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解法 を提供するものである。好ましい実施態様としては、培養プロセスが実質的に汚 染場所において行われるようにする。

ハロゲン置換脂肪族炭化水素は例えば塩素化エチレンのような揮発性の塩素化脂 肪族（Ｖ　ＣＡ）炭化水素の形態を取ることがある。本発明の方法は特にトリク ロロエチレン（ＴＣＥ）の生物分解に好適である。本発明の方法は原則として芳 香族分解パスウェイによってハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解できる微生物を 使用する。

好ましい実施例の説明 本発明に使用される誘発物質の利点は培養プロセスが実質的に汚染場所中で進行 すれば最も効果的に達成されるが、この生物分解法を地表のバイオ反応器で行う ことも可能である。簡略化のためには、誘発物質及びターゲット汚染物質を特定 の微生物と一緒に培養するのが好ましい。あるいは本発明の方法に、特定微生物 を誘発物質で刺戟する予備ステップを含めるのも好ましい方法である。刺戟され た微生物を、誘発物質をさらに追加するかまたは追加せずに汚染場所へ添加すれ ばよい。

生物分解の対象となるハロゲン置換脂肪族炭化水素の一例として揮発性塩素化脂 肪族（Ｖ　ＣＡ）炭化水素がある。ＶＣＡの例としてはクロロエタンやクロロエ チレン、例えば、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）　、１．１−ジクロロエチレン 、　ｃｉ＠−１，２−ジクロロエチレン、クロロエチレン（塩化ビニル）などが ある。

本発明に使用される微生物には２つのタイプがある。

即ち、汚染場所へ導入される外来微生物を選択し、変異させ、または遺伝子操作 することにより、芳香族分解性経路によって特定のハロゲン置換脂肪族炭化水素 を分解することができる。あるいは土着微生物、例えば、汚染場所に固有の微生 物フローラを刺戟し、無毒性の非気体状誘発物質を汚染場所に直接添加すること によってハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解することができる。

ターゲットとしてのハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解できる微生物は生物分解 を促進することのできる誘発物質の存在において培養菌を、ターゲットとしての 炭化水素を分解できる微生物のポピユレーションが濃くなるような条件下で増殖 させることにより、混合培養菌から選択することができる。当業者には公知の技 術を利用してポピユレーションの濃い微生物を２次培養することによってこれら 純粋培養菌の分離を行うことができる。

さらに具体的に説明すると、微生物の分離は次のように行う。天然のフローラか ら土壌サンプルを採取する。

誘発物質の存在においてまたは誘発物質が存在しない状態で各サンプルにターゲ ットとしてのハロゲン置換脂肪族炭化水素を添加する。本発明は生物分解に例え ばトリプトファンのような無毒性、非気体状の誘発物質を使用するが、本発明に 有用な微生物をトリプトファン以外の誘発物質、例えばフェノールを使用して分 離し、無毒性誘発物質による刺戟効果についてテストすることも可能である。次 いでサンプルごとに無菌対照と比較しながら炭化水素分解効果について分析する 。ターゲット炭化水素に対して顕著な分解効果を示した。サンプルごとにその部 分標本を寒天平板上で平板培養する。微生物のコロニーを増殖させ、誘発物質の 存在においてまたは誘発物質が存在しない状態においてターゲットとしての脂肪 族炭化水素を分解する能力について各部分標本をテストする。

好ましい実施態様としては、純粋培養菌を使用する。

例えば、（１９８７年４月３０日にＡＴＣＣ５３６１？として＾ｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｋｗｉｌｌｅ、　Ｍ Ｄに保管を託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｒ＋＋＋ｓ　ｃｅｐａｃｉａの菌株である ）菌株Ｇ４を分離し、下記のように使用した。フロリダ州ペンサコラにあって有 機塩素化合物による汚染の歴史を持つＮ！マａ１＾ｉｒ　Ｎａｔｉｏｎ　（ＮＡ Ｓ）の工業廃水処理施設における貯水池から得た水のサンプルをＴＣＥ分解に関 してスクリーニングテストした。サンプルに濃縮原液を加えて基礎塩培地（Ｒ， Ｙ、　５ｔａｉｎｅｒ等、Ｊ、Ｇｅｎ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４３　：１ ５９−２７１　（１９６６））を調製し、３０の１ねじキャップ培養管（１８Ｘ １５０ｍｍ）に５ｍ１部分標木登配分した。注射器によるアクセスを可能にする ためホールキャップによって固定されたテフロン加工ネオプレンゴム隔膜で培養 管をシールした。多管の隔膜を通して注射器により水性原料としてＴ　ＣＥ　（ ５０ｎｍｏｌ）を添加した。多管から得たヘッドスペースのサンプル（２０μｌ ）をＴＣＥ濃度変化に関してガスクロマトグラフィにより周期的に分析した。注 射器、オーブン及び検出器の温度はそれぞれ１００．６０及び３２５℃であった 。キャリヤーガスは水素（１ｍｌ／ｍｉｎ　）　、メークアップガスは９０％ア ルゴン−１０％メタン（検出器を通る流量４５ｍｌ／ｍｉｎ　）であった。

水サンプルはオートクレーブ処理された対照と比較して著しくＴＣＥ濃度を低下 させた。最初のサンプル採取場所から得てフィルタ殺菌またはオートクレーブ殺 菌した水（“ＮＡ３水”）を使用して実験用の基礎塩培地を調製した場合にはこ のサンプルの２次培養菌がＴＣＥを代謝した。ＮＡＳ水サンプル中の何かがＴＣ Ｅの生物分解を促進する誘発物質として作用すると考えられる。そこで以後のＴ ＣＥ代謝テストの培地にＮＡ３水を使用した。コロニー分離のため、水サンプル の部分標本をグルコース培地（基礎塩培地中、グルコース１０ｍＭ、イーストエ キス０．０５％）で平板培養した。得られた分離コロニーを静止期に達するまで グルコース培地で増殖させ、１１ずつをＮＡＳ培地（ＮＡ３水で調製した基礎塩 溶液１０ｍ１に０．０５％イーストエキスを補足したもの）の入ったホイートン 血清びんに添加した。血清びんをテフロン加エネオプレン血清栓及びクリンプキ ャップでシールし、隔膜を通して注射器で水性原料としてのＴＣＥ（５０ｎｍｏ ｆ）を添加した。血清びんのヘッドスペースとの平衡が得られたのち、１．５ｍ ｌのサンプルをこれと等容積のｎ−ペンタンで抽出し、抽出物１．５μｍを上記 条件下でガスクロマトグラフに注入することにより培地中のＴＣＥ濃度変化を測 定した。これとは別の方法として、いわゆる全容抽出法によってテストボトルか らＴＣＥを残らず抽出した。この方法ではサンプル中の総水性容積（通常は１０ １）に相当する量のペンタンを注射器でボトルに添加したのち、充分に混合する 。次いで、ペンタン相の準サンプル１．５ｍｌを注射器で取出し、ガスクロマト グラフィで分析した。この方法は水性相及び気体相の双方に存在するＴＣＥの総 量を測定するものであり、水性相中のＴＣＥとして報告される（μｇ／ｌ）。以 後の実験ではいずれもこの方法によってＴＣＥ代謝をモニターした。

以上のようにしてＴＣＥを分解する純粋培養菌株Ｇ４が得られた。

菌株Ｇ４は非運動性のグラム陰性杆状菌であり、主として対数期に対をなして短 鎖状に増殖する。この微生物はＡＰＩ　Ｒａｐｉｄ　ＮＦＴテストによりシュー ドモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉｉ　）　（表１）と して確定された。菌株Ｇ４はグルコース、ラクテート、サクシネート、アセテー ト、エタノールなど種々の基質上で増殖するが、メタン（培養ヘッドスペースの ５０％まで）またはメタノールでは全く増殖しない。

芳香族分解経路によってハロゲン置換脂肪族炭化水素を分解できるその他の菌株 もＧ４の分離に利用したのと同じ技術で、ただし、ＮＡ３水の代りに後述する誘 発物質のいずれか１つを培地に増加して生物分解を促進することによって天然フ ローラから分離することができる。

ハロゲン置換脂肪族炭化水素を生物分解する代謝経路を刺戟する本発明の無毒性 、非気体状誘発物質は広範囲の酵素特異性を有し、かつ偶然にも揮発性ハロゲン 置換脂肪族炭化水素を分解し得ることが判明したオキシゲナーゼを誘発する物質 を含む。フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンのような芳香族アミノ酸 はこのような誘発物質の例である。また、少なくとも炭素数１０、好ましくは炭 素数１０乃至２０の線状アルカンもオキシゲナーゼを誘発できる無毒性、非気体 状の物質である。

表　１ ＡＰＩ　Ｒａｐｉｄ　ＮＦＴテストによる菌株Ｇ４の同定Ｎｏ２Ｎ２ＴＲＰ　Ｇ ＬＵ　ＡＤＨｔｌＲＡ　ＥＳＣＧＥＬ　ＰＮＰＧ　ＧＬＵ　ＡＲ＾ＭＮＥ−ＭＡ Ｎ　ＮＡＧ　ＭＡＬ　ＧＮＴ　ＣＡＰ　ＡＤＩ　ＭＬＴ　ＣＩＴ　ＰＡＣＯＸ１ グラム：陰性　同定：　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉｘ運動性：非運 動性 分解にモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼを必要とすることが知られて いる有機化合物でポピユレーションを濃くすることにより、Ｇ４について上述し た要領で環境サンプルをスクリーニングすればほかにも適当な微生物を選択する ことができるであろう。前記濃縮ポピユレーション微生物を、菌株Ｇ４の発見に つながったＴＣＥ分解微生物のスクリーニングについて述べたのと同様の要領で ハロゲン置換脂肪族炭化水素分解能力に関してテストすればよい。また、オキシ ゲナーゼを使用して他の有機化合物を分解することが知られている純粋培養菌を ハロゲン置換脂肪族炭化水素分解能力についてテストしてもよい。

本発明を例に基づいて以下に説明するが、これらの例は本発明の範囲を制限する ものではない。

Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４３　：　１５９−２７１　（１９６６）　］ 　）　、シェーキング（２００ｒｐｍ）Ｌながら３０℃で培養菌を増殖させた。

培養菌を１０ｍＭグルコースまたは１０ｍＭサクシネート上に維持した。

誘発される菌株Ｇ４の培養菌を２０ｍＭの乳酸ナトリウム十指示された誘発物質 に接種した５％接種材料から２０時間にわたって増殖させた。実験用の接種材料 としてｌｌ１１１（約１０９細胞）を使用した。

ＴＣＥ分解実験　ＴＣＥ分解実験はＮｅ１ｓｏｎ等が記述している実験（Ａｐｐ ｌ、Ｅｎｕｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ９．５２　：　３８３−３８４（１ ９８６）　）と同様であり、ブチルゴム栓及びクリンプキャップでシールされた ５０ｍ１血清ボトルを使用した。各ボトルにはＭＳＢ、ＴＣＥ及び後述する接種 材料１０ｍ１を注入した。特に指示しない限り、２４時間にわたり２６℃に保温 したのち終了させた。ＴＣＥ分解はペンタン抽出及びガスクロマトグラフィによ るテストボトルの水性相におけるＴＣＥ濃度を測定することによってモニターし た（上記Ｎｅ１ｓｏｎ等の文献（１９８６）を参照）。ＴｃＥはテストボトルの 液相と気相に配分されているから、溶液中のＴＣＥは総ＴＣＥ量に等しくはない 。ただし、溶解しているＴＣＥは添加された総ＴＣＥ量に比例するから信頼すべ きモニタ一方法として利用できる。水性相における検出限界以下の場合、気相中 にＴＣＥは全く残留電極及び０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）（Ｐ７ 緩衝液）で調製したＫＣＩ標準で較正されたモデル９０−０２基準電極で測定し た。

別の方法として、分光測光によって塩化物イオン濃度を測定した（Ｃｂｅｍ、Ｓ ｏｃ、Ｊａｐａｎ、２９　：　８６０−８６４　（１９５６）　）。

塩化物の生成を検出するための実験をＴＣＥ分解実験と同様に行ない、ＴＣＥ２ ００ｎｍｏｌ、フェノール１ｍＭを使用した。ＭＳＢの代りにＰ７緩衝液を使用 し、接種材料としてフェノールによって誘発された菌株Ｇ４の再懸濁培養菌を使 用した。バックグラウンド塩化物の分だけ実験結果を修正した。多数のボトルを 用意し、種々の時点におけるボトルをぎせいにすることによってタイムコース実 験を行なった。

例　１ 芳香族化合物によるＴＣＥ分解の誘発 ２００　ｎｍｏｌのＴＣＥ及び２０ｍＭ乳酸塩で増殖させた菌株Ｇ４の対数期培 養菌１ｍ１（約３Ｘ１０９ＣＦＵ）を使用した。データは３回の実験の平均値上 標準偏差である。

表２中のデータはトルエン、０−クレゾール及びｍ−クレゾールがＴＣＥ分解を 促進し、ｍ−キシレン、安息香酸ナトリウム、及びｐ−クレゾールがＴＣＥ分解 を促進しなかったことを示している。ｍ−キシレンを除いて上記化合物はいずれ も菌株Ｇ４の増殖基質であった。

表　２ 添加化合物　残留ＴＣＥ’ （１ｍＭ）　（μＭ） なし　３．３５±０．２６ フエノール　０．０４±０．Ｏ ｍ−キシレン　３．９２±０．０８ 安息香酸ナトリウム　４，１７±０．２９０−クレゾール　＜０．０２ ｍ−クレゾール　０．０７±０．０９ ｐ−クレゾール　４．０４±０．４５ ａ　２４時間の培養後。無菌接種材料を使用した典型的な対照は３．５μＭのＴ ＣＥを含有した。

ｂ　検出可能な最低レベル。

ＴＣＥが菌株Ｇ４によって分解されると、化学量の無機塩化物が生成した。（そ れぞれが３回ずつの）２組の実験において、２ＱＱｎｍｏｌのＴＣＥから５４± ２０及び５８６±３４ｎｍｏｌの塩化物が生成したが、これはそれぞれＴＣＥ分 子当り２．７及び２．９個の塩化物イオンに相当する。タイムコース実験の結果 は塩化物が３．６ｎｍｏｌ／　ｍｉｎ　（ｒ＝０．９６）の線形速度で生成する ことを示唆した。

これは（塩化物イオン３個／ＴＣＥ分子と仮定して）毎分１．２ｎｍｏｌのＴＣ Ｅが消費されたことを意味する。３時間後に脱塩素が完了し、５時間後に０１− 生成は検出されなかった。

例　３ 菌株Ｇ４によるその他のクロロ脂肪族化合物の転換化合物から塩化物を放出する ことによって各種クロロエチレンを転換する能力について菌株Ｇ４をテストした （表３）。１．１−ジクロロエチレン、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン及び 塩化ビニルは約１個のＣ１／分子を放出することで転換すると考えられる。

表　３ クロロエチレン脱塩素能力に関する菌株Ｇ４のテスト化　合　物　塩化物　塩化 物　理論 生成量　７分子　％ （ｎｍｏｌ） １．１−ジクロロエチレン　４４５±９３　１．５　７４ｃｉｘ−１，２−ジク ロロエチレン　３４４±１５３　１．２　５７塩化ビニル　５０５±４３’　０ ．８　８４Ｉｒａｍｓ−１，２−ジクロロエチレン　６７±５１０．２１１１． １−ジクロロエタン　−１２７±３４　・−０，４−２１１，２−ジクロロエタ ン　９±１２８　０．２　１１．１．１−）ジクロロエタン　−１６±１３８　 −０．１　−３１、　！、　２−　）ジクロロエタン　−１５３±２６　−０． ８　−２１１、１．２．２−テトラクロロエタン　８９±２６　０．６　１５テ トラクロロエチレン　−４６±１０５　−０．３　＝８ａ　バックグラウンドを 差引いた。データは３回の実験の平均値上標準偏差である。６ＱＱｎｍｏｌの塩 化物当量が得られるように化合物を添加した。

ｂ　分光測光によって測定した（Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ、　２９　： １１６０−８６４　（＋９５６））。

例　４ ＴＣＥ代謝能力をテストしたその他の微生物各種の芳香族化合物を分解できる数 種の菌株を、それぞれの芳香族基質の存在においてＴＣＥを代謝する能力につい てテストした（表４）。テストの条件下では僅かに２種類のトルエン利用菌株、 即ち、Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ菌株Ｆ１（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌｒ７．　７　：　２ ６５３−２６６２　（１９６８）　）と菌株Ｂ５（同様の方法で分離）だけがＴ ＣＥを完全に代謝することができた。

これら２種類の菌株は３−メチルカテコールを介してトルエンを分解した。他の トルエン利用菌株Ｐ、　ｐｕｊｉｄａ菌株ｍｔ−２はＴＣＥを代謝しなかった。

この菌株はメチル基を酸化してベンゾエートを形成したのち、二酸化飽和でカテ コールを形成することによってトルエンを分解する。トルエン分解経路を欠（Ｐ 、　ｐｕｌｉｄａ菌株Ｆ１の２つの変異体についてもＴＣＥ代謝能力をテストし た（表５）。分解経路の第１酵素であるトルエン−２，３−ジオキシゲナーゼを 欠（変異体Ｐｐ１０６は明確なＴＣＥ代謝を示さなかったが、分解経路の次の酵 素であるジヒドロジオールデヒドロゲナーゼを欠く変異体Ｐｐ３９Ｄは親菌株と 同様にＴＣＥを代謝した。

表　４ 芳香族化合物を分散する微生物によるＴＣＥ代謝８微　生　物　芳香族基質　残 留ＴＣＥ　（ｎｍｏ　Ｉ）Ｐ、ｐｕｊｉｄａ　ＮＣＩＢ　９８１６　ナフタレン 　０．８１±０，０６Ｂｅｉｉｅｒｉｎｋｉａ　ｓｐ、　ビフェニル　０．６６ ±０．１２Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ　菌株１ｔ−２）ルエン　０．７５±０．１７Ｐ 、ｐｕｊｉｄａ　菌株ＢＳ　）ルエン　＜０．０２Ｐ、　ｐｕｊｉｄａ　菌株Ｆ １トルエン　＜０．０２なし　なし　０．６３±０．０２ ２　接種に使用した培養菌は１０ｍＭグルコース培地で一晩中増殖させ、それぞ れ１ｍｌずつを接種材料として使用した。芳香族基質はＴＣＥ代謝実験において １ｍＭずつ使用した。実験の開始時に５ＱｎｍｏｌのＴＣＥを添加し、２４時間 保温した。

表　５ トルエンを分解できないＰ、　ｐｕｌｉｄａ　Ｆ　１の変異体によるＴＣＥ代謝 １ 菌株　欠如酵素　残留ＴＣＥ（ｎｍｏｌ）親菌株　なし　＜０．０２ Ｐｐ１０６　）ルエンジオキシゲナーゼ　２．９８±０．０９２このＴＣＥ代謝 実験ではフェノールの代りに１ｍＭトルエンを使用した。

例　５ トリプトファンを誘発物質とする菌株Ｇ４によるＴＣＥの生物分解 本発明の好ましい実施例はトリプトファン添加によって微生物による揮発性ハロ ゲン置換脂肪族炭化水素の分解を促進するというものである。具体的には、菌株 Ｇ４の培養菌にトリプトファンを添加するとこの微生物によるＴＣＥ分解が促進 されることが発見された（表６）。

トリプトファンはモル当りの効果ではフェノールに劣るものの、バッチ単位では ８４％にも及ぶＴＣＥ除去率を示した。トリプトファンの濃度を高めるか、また は連続処理を行うことでもっと高い効率が得られるものと考えられる。Ｇ４以外 の自然発生微生物もこれにトリプトファンを作用させることでＴＣＥ分解を促進 できると推測される。従って、汚染場所そのもので分解を進行させるにはトリプ トファンを添加するだけでよい。あるいはまた、菌株Ｇ４または同様の分離微生 物を汚染場所に添加するか、またはバイオ反応器においてトリプトファンと併用 してもよい。

表　６ トリプトファンで刺激した場合の菌株Ｇ４によるＴＣＥ分解 添加化合物　残留ＴＣＥ　無添加％ な　し　１．０８±０．２３　１００．０フエノール１　ｍＭ　Ｏ，０１±０． ００２　１．０トリプトフアン１　ｍＭ　０．６６±０．１２　６０．８トリプ トフアン２ｍＭ　ＯＪ９±０．［１４３６，３トリプトフアン４ｍＭ　（１，１ ７±！１．０５　＋５．４３３回の実験による。データはその平均上標準偏差。

例　６ 菌株Ｇ４及び自然フローラによる低温におけるＴＣＥ分解 汚染場所そのものでの分解は微生物の生物分解作用に最適とされるよりも低い温 度で進行する。菌株Ｇ４はトリプトファンで刺激すれば帯水層における予想温度 でもＴＣＥを分解した（表７）。淡水湖から得た天然フローラもまた、トリプト ファンで刺激した場合上記温度である程度の（添加量の１５％）ＴＣＥを分解し たが、菌株Ｇ４による分解量よりははるかに低かった。

表　７ １５℃における菌株Ｇ４及び天然フローラによるＴＣＥ分解 天然フィシ　トリプトファン　１．９２　±［１，０９８６０フローフ 菌株Ｇ４　）リプトファン　０．０７２±０．０３　３な　し　な　し　２．１ ９　±０．１５　９８１１５℃で４日間保温。ＴＣＥは全容抽出法で測定。実験 開始時のＴＣＥ＝２゜２３±０．１２　（１００％）。

２使用した天然マイクロフローラはワシントン州し・ノドモンドのサマミッシュ 湖から得た水サンプル。この湖水サンプル１００１にＭＳＢ及び２ｍＭフェノー ルを添加し、３日間１５℃に保温したのち、２ｍＭＤＬ−トリプトファンを含有 するＭＳＢ培地１００ｍ１中で５日間この濃縮微生物４ｍｌを２次培養した。

例　７ 模擬帯水層におけるＴＣＥの分解 汚染場所で、芳香族誘発物質なしで菌株Ｇ４を刺激してＴＣＥを分解させる効果 を測定するため、実験室の蓋付きガラス箱の中に模擬砂質帯水層を構成した。帯 水層を流動する流量を線形流量９０　ｃｍ／日に維持したところ、１２時間に１ 回のシステム循環となった。容積流量は１０ｍ１／ｍｉｎ、システム内の液体総 量は８．１リツトルであった。水は１乃至３ｐｐＩＩｌのＴＣＥ汚染物質を含有 したが微生物の生長を支えるための無機栄養物でこの含有率が変動した。微生物 及び誘発物質（トリプトファン）の導入点のｌＱｃｍ上り勾配及び２０ｃｍ下り 勾配（“アクティブゾーン”と呼称）に設けた凹みからのサンプルでＴＣＥをモ ニターした。４ｍＭ）リプトファン／ＭＳ８２００ｍｌ中で一晩増殖させた２Ｘ １０１０ＣＦＵの菌株Ｇ４をＴ＝Ｏにおいて再補給用凹みから導入した。ＤＬ− トリプトファン（Ｃｅｎｔｒａｌ　５ｏ７ａ、　Ｉｎｃ、　）の原液１０ｍＭを ２ｍｌ／ｍｉｎの流量で再補給凹みに供給した。その結果、帯水層で希釈された のちのトリプトファン最終濃度は１．７ｍＭとなる。４日間にわたってＴＣＥ濃 度をモニターした結果、ＴＣＥ濃度の著しい低下が確認された。アクティブゾー ンにおけるＴＣＥ濃度下り勾配はＴＣＥ濃度上り勾配よりも低い７１−９６％で あった（表８）。

表　８ アクティブゾーン通過の前後の模擬帯水層におけるＴＣＥ濃度 ＴＣＥ濃度（ｐｐｍ　） 接種時（＋４時間）　０．６　０．７５　−２０接種後（＋４８時間）　２．２ 　０．６８　７１（＋６０時間）　３．２　０．１４　９６（＋７２時間）　２ ．１　０．２４　８９（＋９６時間）　２．７　０．１１　９６１菌株Ｇ４導入 後の時間。

２誘発物質溶液による希釈分を修正。

内容を明確に理解できるように実施例に基づいて以上に詳述したが、本発明の範 囲を逸脱することなく種々の変更が可能であることはいうまでもない。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ハロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解法において、前記炭化水素をこれを 分解できる微生物と共にかつ前記微生物の生物分解作用を促進する少なくとも１ 種類の無毒性、非気体状誘発物質と共にインキュベートすることを特徴とするハ ロゲン置換脂肪族炭化水素の生物分解法。
2. ２．前記インキュベートが実質的に汚染場所そのものにおいて行われることを特 徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．前記ハロゲン置換脂肪族炭化水素が揮発性塩素化脂肪族（ＶＣＡ）炭化水素 であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. ４．前記ＶＣＡ炭化水素が塩素化エチレンであることを特徴とする請求項３記載 の方法。
5. ５．前記塩素化エチレンがトリクロロエチレン（ＴＣＥ）であることを特徴とす る請求項４記載の方法。
6. ６．前記誘発物質が芳香族アミノ酸であることを特徴とする請求項１記載の方法 。
7. ７．前記アミノ酸がトリプトファンであることを特徴とする請求項６記載の方法 。
8. ８．前記微生物が芳香族炭化水素を分解するバクテリアであることを特徴とする 請求項１記載の方法。
9. ９．前記微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する微生物で あることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. １０．前記微生物がシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉ ｄａ）であることを特徴とする請求項９記載の方法。
11. １１．前記微生物がシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉ ｄａ）Ｆ１であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. １２．前記微生物が菌株Ｇ４であることを特徴とする請求項１記載の方法。
13. １３．前記微生物がシュードモナスセパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐ ａｃｉａ）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
14. １４．前記微生物が土着の微生物であることを特徴とする請求項１記載の方法。