JPH04502516A - 電気泳動法及び電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は電気泳動に関する。より特定的には、本発明は冷却を調整した電気泳動 の使用に関する。さらに特定的には、本発明はバッチ法及び連続法の両者で、溶 液内の化学成分を分離する方法及び装置に関連する。

先行する出願 本発明４１９８９年１１月１４日出願の米国特許出願０７／４０７．１７３号の 部分継続出願である。

発明の背景 最近、難しい分離、特に溶液中の有機物質に関する分離の方法として電気泳動の 評判が高くなっている。従って、生化学的用途では、例えば電気泳動手法を使用 して有機化合物例えばペプチド、蛋白質、核酸、抗体等を含有する溶液内で分離 することができる。これらの手法では、一般的に管を有するカラムを使用し、こ の管を充填し、電荷をかけて溶液の成分を荷電させ、その電荷或はその電気泳動 移動能に基づき分離することを含んでいる。このような分離法を記載している典 型的な特許は米国特許第３．５３３．９３５号明細書である。

同様に、電気泳動分離を実施する目的で、毛細管の使用も試みられた。これらの 方法では、管内で分離を行う。このような操作の幕型例は米国特許第３．６２０ ．９０号及び第３．９４１．６７１１号明細書に記載されている。

より大きな規模で電気泳動分離を実施する際の深刻な問題の１つは、電気泳動実 施中の電解質を充填した管を通過する電流により発生する熱の問題である。これ には、特別の冷却法が必要であり、冷却に伴う問題及び冷却を実施するためのシ ステムについては米国特許第４．１７７、　Ｎ０号明細書に記載されている。

対流を克服するために、ゲル及び多孔性の膜のような種々の抗対流媒質が使用さ れている。

この分野では、配列した個々の管内にゲルを使用することによりゲル電気泳動を 使用している。一般に、これらの方法はバッチ的性質を持ち、典型的な方法は米 国特許第４．７４７．９１９号に示されている。

ＰＣＴ国際出願第７９００．９４２号では、電気泳動分離中に対流を防ぎ、液が 流線的に流れるように多孔性の膜を使用している。

しかし、抗対流性媒質を使用すると冷却が非効率的になり、困難になる。このた め、本ＰＣＴ出願に示すように、一般的には分離する液体を電気泳動チャンバの 外側から冷却する。

電気泳動の実施に成功し、この方法で多数の成分を含有する溶液を分離できこと が先行技術から示されているが、この技術を連続相操作に転用して、所与溶液の 成分を連続的に回収して連続分離の実施を可能にすることは困難であった。さら に、従来技術の規模拡大に際しては、かなりの発熱に効率的に対処しなけばなら ないという大きな一問題に直面する。対処しなければ、電気泳動チャンバ内で対 流流れが発生するために分離の試みは無効となろう。さらに、感熱性の生化学的 成分を含有する溶液の場合には、これらの成分が破壊されてしまう可能性がある 。

従って、分離が可能であり、しかも、大量の物質の分離に規模を拡大したときで さえ熱を容易に除去できる電気泳動システムが必要とされている。また、バッチ 及び連続の両方の電気泳動分離から熱を効果的に除去する必要もある。効果的に 、そして容易な方法で実施されるとよい。

発明の概要 本発明によると、電気泳動分離の実施に使用するために適した装置を提供する。

この装置は構築が容易で、分離中に適切に熱を除去できるため、この方法をバッ チまたは連続的に効率よ〈実施することができる。さらに、本発明は、電気泳動 する液体混合物の分離成分を連続的に除去し、従って成分を別々に、連続的に収 集できるシステムを提供する。最後に、本装置及び方法により、熱の除去が不適 切であるための存寄な作用を受けることなく、任意所望の実施幅まで電気泳動機 器の規模を拡大できる。

ゲル電気泳動は生化学及び分子生物学の基本的な分離法の１つであることが知ら れているが、熱散逸の問題から規模の拡大が困難である。本発明はこの問題を克 服した。

本発明方法は、緊密に充填した複数の中空ファイバを含有するチャンバに分離す べき溶液を通す過程を含んでいる。各ファイバ間に間隙空間ができるようにファ イバを充填する。この空間は、十分な圧力またはポンプ圧をかけることにより液 体がチャンバを流れるに十分なものである。次に、チャンバ内での対流流れの形 成を防止するまたは最少にとどめるに十分な速度で、分離すべき液体をチャンバ の一端から他端に向けてポンプで注入しまたは通過させる。また、ファイバを充 填した反応チャンバに溶液を流入させ、成分の電気泳動移動能の差により溶液を 分離するのに十分な電圧勾配で電流を反応チャンバに供給する手段も存在する。

また、中空ファイバの中に熱交換液を導入して、電気泳動分離中にチャンバを持 続的に冷却する手段も提供する。分離する物質の修飾緩衝溶液は、各流中に分離 する物質を含むこれら溶液を導入することにより、または半透性の壁を使用して ファイバを作成し、冷却剤及びｐＨ調整剤として緩衝溶液を加えることにより冷 却中空ファイバを介して提供され、等電点電気泳動を実施することもできる。本 発明のこの実施態様の中空ファイバは冷却及び抗対流の両機能を果たす。

図面の簡単な説明 ここで、本発明を添付図面を参照して説明する。

第１図は、本発明の原理に従って実施する電気泳動法の概略図を示し、方法を明 確にするために冷却管及び電極を拡大しており； 第２図は、本明細書に記載の電気泳動の実施への使用が適している装置の平面図 を示し； 第３図は、第２図の線３−３に沿った第２図の断面図であり；第４図は、本発明 の好適実施態様の断面図であり；第５図は、第４図の！５−５に沿った断面図で あり、いくつかの部品は分けて記載しており； 第６図は、第５図の部分の部分的な分解組立断面図であり：第７図は、第４図の 詳細な平面図であり、部分的に断面図も示し； 第８図は、５層の管の分離ベッドを示す管、メツシュ及びファイバの配列の模式 図であり； 第９図は、ゲル電気泳動装置の平面図であり；第１０図及び第１１図は、第４図 から第８図の装置を使用して得た結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明 第１図を見ると、電気泳動チャンバが示されており、一般に１で示される。チャ ンバの頂部にはヘッダー３があり、ヘッダーは図の左側に矢印４で示す注入口を 有している。複数の中空ファイバ２はヘッダー３に接続し、連絡しており、デバ イス底部の収集チャンバ５まで続いている。これらのファイバ２は広く離して示 しているが、これは単に説明のためである。実際には、本明細書Ｍ２図の検討の 際に当業者に明かなように、これらのファイバは互いにかなり近接している。電 気泳動チャンバｌは図示したようにチャンバの各側にアノード６及びカソード７ も具備しており、処理すべき溶液は矢印９で示すように図の頂部から底部へ中空 ファイバ２の間隙でできた間隙状の空間を通りデバイスを横切って流れる。収集 チャンバ５には出口１１がある。緩衝溶液の平面的な流れも矢印１２．１３．１ ４及び１５で示されており、これは溶液Ａ、Ｂ及びＣと接触する。ＡＳＢ及びＣ 溶液及び緩衝溶液がチャンバを頂部から底部へと通過するにつれ、電気泳動の実 施に必要な電導性が付与される。矢印１２から１５で示される方向に沿って種々 のｐＨ値の緩衝溶液を注入することにより、チャンバを横切る　ｐＨ勾配を得る ことができ、等電点電気泳動に必要な条件が得られる。

本システムに従う方法の実施では、分離すべき物質を含有する溶液を、矢印！２ ．　Ｈ，１４及び１５で流れる緩衝溶液と共に第１図に示す導入点９から導入す る。溶液は全てチャンバに持続的に供給する。チャンバ内では、デバイスｌを横 切ってアノード６とカソード７の間にかけた適切な電圧で電流を導入し、溶液を 通すと、混合物である溶液Ａ、Ｂ及びＣが分離し始める。次に、成分は出口１６ ．１７及び１８で連続的にカラムから除去される。

ここで第２図を見ると、電気泳動システムが示されており、これを一般に２０と 示す。このシステムはチャンバ２３及び流体注入口２２とを有する容器２Ｉがあ る。チャンバ２３を横断して複数の中空分配管２４がある。これらの管２４は第 ２の容器２６を通過した後電気泳動チャンバ２５まで続き、容器２６には注入管 ２７がある。

注入管２７は容器２６内にある内部チャンバ２９まで続き、容器２６は緊密に充 填された複数の中空の毛細管またはファイバ３θとも接続しており、ファイバ３ Ｇはチャンバ２９内に１つの開放端３１を、第３の容器３８のチャンバ３７内に 他の開放端３２を有している。注入管２８は全ての管２４と同様にチャンバ２５ まで続いており、従って分離すべき成分の混合物は管２８を介してチャンバ２５ 内の共通の流れに注入することができる。

注入口２７を介して導入された冷却液は、第２図のチャンバ３８の頂部に示す出 口４０で電気泳動チャンバ２５から除去される。注入口２２を介して導入された 流体または溶液はチャンバ２５に入り、管２８で導入した成分混合物と共にチャ ンバ２５を通り、電気泳動チャンバ２５の出口に示した放出口４１まで行く。第 ３図からより明確に判るように、管２２を介して導入され中空管２４を通る緩衝 溶液は電気泳動チャンバ２５内の中空ファイバ３０上の点で終って去される。電 気泳動システム２Ｇの電気泳動チャンバ２５には成分を電気泳動分離するために 十分な電圧をかけるためのアノード４３とカソード４４もある。

一般に、第２図の装置の操作では、ｐＨ１ｌ整に通常使用されている任意慣用の 緩衝であってよい使用すべき緩衝溶液は注入口２２から導入し、中空管２４を介 して図示したファイバ３０の近接する電気泳動チャンバ２５へと入る。注入口２ ２及び管２４を介して供給される緩衝溶液は十分な圧力またはポンプ圧で通過し 、チャンバ２５に発生する乱流を最小限にとどめながら、電気泳動チャンバ２５ の一端から他端へと毛細管３０の間隙に接触してまたはその間を持続的に溶液を 通過させることができる。分離すべき溶液を管２８でチャンバ２５に導入し、緩 衝溶液と同様にチャンバ２５の一端から他端へ中空ファイバ３０でできた間隙空 間を通す。

チャンバ２５を通過中の溶液にアノード４３とカソード４４の間にかけた直流電 圧をかけ、各成分の電気泳動移動能の差により物質を各成分に分離する。アノー ド４３とカソード４４を横切って電圧をかけ、チャンバ２５を電流が流れると、 チャンバ２５に導入した溶液の成分はチャンバの幅を横切って分離する。電気泳 動移動能に従って分離された成分は効率的に成分流に分離される。

分離される溶液が中空ファイバ３Ｇの間隙に沿って通過するにつれ、冷却液は注 入管２７を介して中空ファイバ３０の注入側の端３１に導入され、中空管の長軸 に沿って連続的に中空ファイバの開放端３２から容器３８のチャンバ３７にまで 流入する。このことにより、分離すべき溶液がチャンバ２５を通過するに従って 起こる電気泳動分離により発生する熱を効率よく除去し、熱交換流体は出口４０ を介して連続的に除去される。このように、ファイバ３０を介する冷却液の導入 と通過及び出口４０からの除去が連続的に起こるため、チャンバに連続的に調整 した温度で冷却溶液が入る。それにより、発熱は制御され、温度調整システムに より溶液が通過する間のデバイスの過熱がなくなる。電気泳動チャンバ２５の出 口側の端では、多数の中空管４１がチャンバ２５を越えて存在し、６管には注入 口４５があり、そこを通して分離した成分が図示した６管のいくつかに入る。チ ャンバ２５の出口側の端では管４Ｉの注入口４５が供給溶液から分離した成分を 受け取る。

次に、分離成分は対応の管４１から除去される。

冷却に使用した中空ファイバは任意慣用の直径でよい。好ましくは、直径１５− ５１１０　ミクロンのファイバを使用する。ファイバの内部は中空である。好適 様式では、中空のポリマーファイバを使用する。

中空シリカまたは中空のガラスファイバのような無機ファイバもこの目的に適し ている。この方法に使用する中空ガラスファイバの例は、米国特許第３．５１０ ．３９３号、より最近では米国特許第４．７３５．６４２号に記載されており、 後者は中空ガラスファイバの形成に使用できる種々のガラスについても詳細に記 載して冷却ファイバ３Ｇとして好ましい有機ファイバの例はポリマー例えば、ポ リエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン テレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、テトラフルオロエチレン（登録 商標Ｔｒｔｌｏｎ）及び中空ファイバを作成できる他の同様のポリマーである。

冷却ファイバ３０の外側及び間の間隙に十分な空間を提供するには、通常、丸い ファイバ３０自体を充填すれば十分であろう。

しかし、所望であれば、スペーサがファイバ層の間の流体流に対し透過性であれ ば、スペーサの使用に依存することもできる。

これらスペーサはチャンバ２５の厚さもしくは幅方向または所望であれば両方向 でファイバの間にあってよい。この目的に好適な物質は布、マット、スクリム、 メツシュ、フィラメント、膜、紙等である。

電極４３及び４４は通常チャンバ２５内にあり、電極表面とチャンバ内容物の間 に透過膜（図示せず）を有している。電極を連続的に溶液で洗って周囲の液体か ら電解産物を除去できる手段（図示せず）も具備する。これは当業者には一般的 な慣行である。本発明に従って成分に分離できる溶液は多種で数多くあり、一般 に、溶液中に含有される物質及びその電気泳動移動能に基づく分離能により種々 の電圧の使用を決定する。

本発明の電気泳動分離を実施する溶液に電流をかけるときには、使用する最低電 圧は溶液を含有するチャンバにかけたときに所与の溶液を分離する電圧である。

使用可能な最大電圧は安全性の要因から決定され、本質的には分離自体には無関 係である。一般に、電極間の距離１ｃｌｎ当り５０〜２０Ｇボルトの電圧（電圧 勾配）を使用する。ｆｅｌｌ当り　１００ボルトの電圧勾配が好適であることが 判っており、はとんどの溶液を適切に分離でき、安全性のリスクが最少であるた めにほとんどの分離に使用されて実　施　例 本発明の原理を調べるために、プレキシガラス製の４つの平垣なチャンバからな る、第２図に示す形状と同様のモデルを構築した。本実施例の緩衝溶液及び冷却 液としては両方とも水道水を使用し、注入口２７及び２２から導入した。アマラ ンス（赤色染料）と青色の食用色素の混合水溶液（紫色）を混合物として使用し 、注入口２Ｂから供給した。内・径０．０３５インチ、外径０、０９フインチの 直径のスパゲツティ型のＴｓｌｌｏｎ管を管２４及び４１として使用した。電気 泳動チャンバ２５、は４．５　ｘ　２ｘＯ，１２５インチの大きさであった。電 極は不テンレス鋼メツシュ製であった。

電極はグラスウールの濾紙で中心チｔンバ内の溶液と分けた。

実験中は電極は洗わなかった。テスト中、電気泳動チャンバ２５の２インチの椙 で電極４３と４４の間に６００ボルトの電圧をかけ、チャンバを禅る冷却流体の 流寝はＩＯＧｍｌ／時間であった。冷却管３０は１．外径０．４フインチ、内径 ０．０−３．５インチの直径のＴｅ１ｌｏｎ製中空フアイバであった。電圧をか け、冷却管を操作すると、混合物の紫色の帯は３つの重なり合った帯に分離され た。アノード側には赤０帯・カソード側にはｉｌ宣帯が形成され・中間には薄く なった紫の帯があった。テスト中に注入口２７がらの水の供給を放声に切って、 冷、却を停止すると、中間の帯がはっきりしてきて、冷却管の間に空気またｊよ 蒸気の泡が出現した。触ると、電気泳動チャンバは温かかった。管３０内に冷却 剤を連続的に流して混合物を冷却している間は、青と赤の画分は容易に分離され 、放出口４１から赤の画分と青の両分が別々に連続的に収集された。

本発明は多々変更することができる。従って、第２図のデバイスを使用して、電 気泳動チャンバ２５にｐＨ勾配を使用することにより分離を増強できる。例えば 、種々のｐＨ値の緩衝溶液を個々に管２４の注入口に導入することができる。こ の場合、管２４の各々に種々のｐＨの各緩衝溶液を直接供給するであろうから、 チャンバ２３、枠２１及び注入口２２は必要なくなる。蛋白質のような両性物質 は例えば陰イオン性の基と陽イオン性の基の両者を含有している。通常、このよ うな蛋白質は電気泳動的（等電点）に移動しない、Ｈを有しよう。従って、装置 を横切る　ｐＨを断片的に調整すると、対照として種々のｐＨの多数の緩衝溶液 を使用することにより電極間に確立されたｐＨ勾配に沿って各成分の電気泳動域 を集中させることができる。例えば、勾配に沿ったある点で、１つの成分が移動 能を持たないために分離され、このようにして、等電点電気泳動で、チャンバを 横切って所与のｐＨ勾配を確立することにより、１つの成分を電気泳動チャンバ 内の狭い帯に集中さ゛せ、そこから除去することができる。

ｐＨ勾配確立のもう１つの変法では、膜特性を付与する調整された多孔性を有す る半透性または多孔性の有機ファイバまたは中空ガラスで中空ファイバ３０を形 成できる。これらの特性を有するファイバを使用すると、緩衝溶液を注入口３１ を介してファイ／＜３０内に導入でき、ファイバは冷却、管として及びファイバ 表面に沿って通過するにつれ分離される溶液中にチャンバを横断してｐＨ勾配を 確立するイオン源として機能しよう。また、各ファイバに種々のｐＨ値の緩衝溶 液を供給できる。

最後に、所望、に応じて・、、第２図の装置を変更して、電極４３及び４４を移 動させ、チャンバ２５の端部においてバッチ法を実施することもできる、。従っ て、例えば、電極４３をチャンバ２５の注入側の端に、電極、４４を放串口、側 の端に置１くことができた。この場合、溶液はす１ベニ、注入０．２２及び管２ ４を介してチャンバ２５に供給されるため、別の注入口２８は必要ない。連続的 に冷却されるであろうグ、分離すべ、き溶液はバッ、チ式吟注入しよう。電気泳 動チャンバの断面＋ｔ、、　！意所望の形状で、あってよく、例えば円であ以下 、第４図〜第９図に示す好適実施態様について説明する。

この実施態様は好酸しくはボリカーボネー）ヘプラスチックから構成される。

特に、第４図は主チャンバの縦断面図、第５図は第４図の５−５線における主チ ャンバを電極チャンバと共に示した断面図、第６図は主チャンバ及び電極チャン バのアセンブリの詳紺図である。第７図は組み立てたシステムの平面図であり、 第８図は分離ベッドにおけるメツシュ９１、管束６３及び糸９２の相互配置を示 す。

第４図は水入口管６２を備える入口水チャンバ６１と、水出口管７０を備える出 口水チャンバ６９とを示す、これらは第７図にも示す。

電極チャンバ８１−１及び８１−２は多孔質膜７７−１及び７７−２により主チ ャンバから分離されている（第４図〜第７図参照）。

膜７７−１及び７７−２はチャンバ６６とチャンバ８１−１及び８１−２との間 のガス交換を阻止する。電極チャンバは各々ガスゲット７８及び例えば合成プラ スチックのスライドオンロック８２を介して主チャンバ６６に連結されている（ 第６図）、シたがって、膜７７−１及び７７−２とメツシュ電極７５−１及び７ ５−２とは容易に検査及び交換することができる。を極７５−１及び７５−２は 夫々電極チャンバ８１−１及び８１−２の内側に配置されている（第７図に示す ように電極７５−１はチャンバ８１−１に配置されている）。

電極７５−１及び７５−２は管７４（第７図の頂部及び底部）の間で夫々チャン バ８１−１及び８１−２の長さを延長している。

電極（第５図〜第７図）は好ましくはステンレス鋼メツシュスクリーンから構成 され、好ましくは電場がより均質になるように電場に垂直に配置されている。各 電極７５−１及び７５−２は管７９（第５図及び第７図）に収容されたワイヤ８ ０（各電極につき１本ずつ）を介してソケット８３に接続されている。

電極に電力を供給するために電カケーブル（図示せず）が電源（図示せず）に接 続されている。

を極チャンバ８１−１及び８１−２は電解産物を取り出すすすぎ用電解液のため の入口及び出ロア４（第５図〜第７図）を有する。

主チヤンバ６６中の冷却管６３（第４図及び第７（２１には１本のみ示す）はＴ ｅｆｌｏｎ（登録商標）メツシュを介して相互に整列及びｔＩｉ間されており、 したがって個々の管の間にほぼ等しい距離を有する分離ベッドの規則的構造を形 成する。メツシュの面は主チャンバ６６の面に平行である。

第８図はメツシュと管束との交互配置構造を示す、主チャンバ６６は好ましくは ６層のメツシュ（全体として６７で示す）の間に配置された５層の管束を有する 。メツシュ９１と管束６３とは細いポリマー糸９３で相互に厭じ合わされている 。

主チャンバ６６は、主チャンバに垂直に配置されたキャリＬ　アチャンバ７１（ 第４図）を備える。

キャリア入口チャンバは異なる組成のキャリア電解質を注入するための５つの入 ロア２（第４図には１つだけを示す）を有する。

キャリア電解質は主チャンバ６６に入ると流れの方向を直角に変える。注入チャ ンバ７１から主チャンバ６６への遷移部は流れの均等性をより良好にするために 曲線状である（第４図）。

主チャンバは４つのサンプル注入ボート（管）６８（第４図及び第７図）を有す る。注入管はチャンバの２分の１に配置される。

サンプルはサンプル注入管６８に挿入される針（図示せず）を介して注入される 。針の先端は主チヤンバ内の冷却管とステーとの間に挿通される０通例として、 ただ１つの注入点が使用される。数個の注入点を使用すると、分離ベッドを通し てサンプル注入位置を変えることができる。

主チャンバは両側に有孔プレート７３（第５図〜第７図）を有する。孔７６（第 ５図及び第６図）は主チャンバと電極チャンバとの間の電気接触を実現する。腹 ７７は有孔プレート７３とガスゲット７８との間に配置されている。ガスケット の反対側は電極チャンバにより押圧される。

主チャンバは、好ましくはＴｅｆｌｏｎ（登録商標）管束から構成される４４個 の出口管アレー６５（第４図及び第７図）を有する。主チヤンバ内の流れは出口 管に入ると直角に方向を変える。主チャンバから出口管への遷移部は好ましくは 曲線状である。主チャンバの直後で出口管は平坦なプラスチックゲース６４（第 ４図）の内側で相互にシールされている。ケース６４の外側で出口６５は相互に 連結されていない、出口管は分配プレート（図示せず）で終端している。

分離ベッドは好ましくは各層３０本の毛細管からなるＴｅｆｌｏｎ（登録商標） 軽量璧管東９２、サイズ２８の５層から構成される。管束寸法は例えば１．Ｄ、 　０．０１５インチ、ＭＯ，００６インチである０層はＴｅｔｃｏ（登録商標＞ ｔｒａｍメツシュ、Ｆｌｕｏｒｔｅｘ（登録面ＩＩ）ＥＴＦＥ　９−５９０／４ ７により分離され、５ｔｒｅｎ（登録商標）釣糸０．００８インチで相互に綴じ 合わされている。メツシュのパラメータはメツシュ開口５９０１Ｉｚ（０，０２ ３２インチ）、開口面Ｗｔ４７％、メツシュ数２９．５／インチ、糸０．Ｄ、２ ７ｈａ、繊維厚さ４２５μｌである。

ベッド寸法は例えば１／４ｘ２６／８ｘ４１層２インチである。

主チャンバと電極チャンバとは好ましくは、長手方向に　□切断されたＴｅｆｌ ｏｎ（登録商標）管０．Ｄ、３７８インチから構成されるスナップオンロックに より平坦な表面の間で圧縮されるＭＣＩナイロン膜及び軟質ゴムガスケットによ り分離されている。

サンプル混合物は先端位置を調節可能な針を介して注入される。

４４個の出口管（６５）はｉ蓋壁Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）管、サイズ２４．１ ．０．０．２２、壁０．００６インチから構成される。出口管は相互に接触する 。出口管は２つのプラスチック壁の間でシリコーンゴムでシールされている。

第４図〜第８図に示す装置を使用して２種のタンパク質（例えばシトクロムＣと ミオグロビン）の分離を実施した。

出発混合物を次のように調製した。ウシシトクロムＣＯ３５ｇ及びウマミオグロ ビン０．５ｇを、ｐ＋１８．１、導電率１５９ｐ＋ｏｈｏ／ｃ＋＋＋の０．１２ ５ｇ＃　Ｋ２ＨＰＯ４１００ｚ１に溶解させた。

次の溶液を煽動ポンプにより第４図〜第８図のシステムに吸引した。

八、キャリア出口管を通る流れ（アノードからカソードに向かって番号を付けた ）は、 ＃１．１ｙ＃のＫＨｚＰＯ−Ｌｏｌｌｌと１ｇ／ｌのＮａ２５ｏ、　ｐＨ４，０ ９９０ｍｊ！どの混合物、 ＃２．３及び４．０．１２５ｇ／ｌのＫＨ，ＰＯ４，ｐＨ８，１、＃５．０．２ ５ｇ／ｌのＫＨ，Ｐｏ、１００１１．１ｇ／ｌのＮａ１ＳＯ＜９００１１及び４ ．５ｇ／ｌのＮａＯＨ，ｐＨ１０，７２０ｉｐの混合物でとした。

５つのチャネルを通る合計流量は３．３７ｚ１／＋ａｉｎとした。

８９両電極チャンバ内の電解質は１９／１のＮａｚＳＯ−とした。

２つの電極チャンバを流れる合計流量は２ｚ１７ｍｉｎとした。

Ｃ，サンプルの流量は０．１７ｚｆ／ｍ１ｎ（１０ｚ１／ｈｒ）とした、この流 Ｉは０．１ｇ／ｈｒのタンパク質処理ｌに対応する。

４００■及び０．０５＾で分離を行った。

冷却水の温度は９，３℃、入口と出口との間の水温差は１１／ｍｉｎの流量で０ ．６℃とした。

混合物の成分を顆次分離した。　４０のフラクションを収集し、そのうち３６の フラクションをＶａｒｉａｎ　５５００クロマトグラフを用いてＨＰＬＣにより 分析した。

分析条件で、シトクロムＣビークは約１５．８分の保持時間で現れる。２つのミ オグロビンビークは約１８．７分及び２２．９分で観察される。

シトクロムＣレベルはフラクション１３〜３９で検出された。

ただし、著しく高いレベルはフラクション２１〜３６で検出される。ミオグロビ ンはフラクション９〜３１で検出され、著しく高いレベルはフラクション１１〜 １８で検出される。これらの結果を第１０図にプロットする。

各フラクション中の各タンパク質の純度を定量するために、約１５．８分のシト クロムＣビーク及び約１８．７分のミオグロビンビークを使用してシトクロムＣ 及びミオグロビンの面積百分率を決定した。これらの結果を第１１図にプロット する。

９９面積％よりも高い純度のミオグロビンはフラクション９〜１８で検出された 。９９面積％よりも高い純度のシトクロムＣはフラクション２５〜３９で検出さ れた。第１１図に示すように、これは高純度ミオグロビンの非常に高い回収率と 高純度シトクロムＣのやや高い回収率とを示す、シトクロムＣの回収率は等電点 電気泳動又は他の方法を使用することにより改良され得る。

ゲル媒体中でバッチ式に分離を実施する目的で、主チャンバの内部スペースにア ガロースゲル、ポリアクリルアミド等のようなゲルを充填してもよい、ゲルは化 学的又は熱変化により固化する液体前駆物質として周知の手順により導入する。

第４図の装置を変形し、第９図に示すように混合物を注入し成分を取り出すため の手段を設けてもよい。

特に、第９図は本発明にしたがってバッチ式に使用するためのゲル電気泳動用装 置の縦断面水平面図である。横断面のの形状は矩形であり得る。

装置は数層の冷却管からなるアレー１０９を有する。第９図は管の１層のみを示 す、これらの管は２つのコレクタチャンバ１０７及び１２０と共に熱交換器を形 成する。装置は冷却水の入口１１６及び出口１０５を備える。２つのシール１０ ８はコレクタチャンバ１０７及び１２０を管１０９間の間隙スペースがら分離す る１間隙スペースは第５図〜第７図の膜７７に票似の！１１４及び１２４により 電極チャンバ１０２及び１１１から分離される。

別の組の類似の膜１１８及び１２１は混合物を注入するための狭い注入チャンバ １２３と、分離した成分を取り出すための同様の収集チャンバ１１９とを形成す る。

装置は頂部のＭ（図示せず）をとるとゲルの液体前駆物質を充填される。前駆物 質は時間と共に固化する。

収集チャンバ、注入チャンバ及び電極チャンバは好ましくは同一の設計を有して おり、成分の移動方向に依存して互換可能に使用することができる。注入チャン バは装置の中央に配置され得、２つの収集チャンバは側部に配置され得る。

例えば混合物は入口１２２及び出口１０６を通って装填され得、成分は入口１１ ７及び出口１１０を通って適当な溶液で洗浄することにより収集され得る。

電極チャンバ１０２及び１１１は電極１０３及び１１３を収容する。

電極チャンバは、電極を適当な電解質ですすぎ、電解産物を取り出すために入口 １０１及び１１５と出口１０４及び１１２とを有する。

管１０９は第４図〜第８図と同様に特殊手段で相互に離間及び整列され得、又は シール１０８により定位置に保持され得る。

、ｌｌ　１２１及び１１４間の全間隙スペースは注入及び収集チャンバ１１９及 び１２３を除いてゲルを充填すべきである。　ＭＩＩｓ、１１４．１２１及び１ ２４はゲルが固化する前に液化ゲルがチャンバ１０２．１１１．１１９及び１２ ３に侵入するのを阻止する。

分離過程において、成分は電場中を種々の移動度で注入チャンバから収集チャン バに移動しており、種々の時刻で収集チャンバから溶出する。

Ｍ１１４，１１８．１２１及び１２４は非導電性多孔質材ｆｌ（例えばセルロー スアセテート、ナイロン、セラミック等）から形成され得る。透析膜もこの目的 に適切である。

−ｉに、本発明の電気泳動分離では３つの選択された方向、即ち ＾、電流の方向 Ｂ、緩ｔｒ液の流れの方向（ゲル電気泳動を除く）Ｃ１冷却液の流れの方向 が存在する。

第４図〜第８図に示す好適実施邪様によると、冷却液の流れとＭ新液の流れは平 行であり、電流はこれらの両方に垂直である。

一方、本発明にしたがって３方向の別の相互方向付けも可能である０例えば、３ 方向全部を相互に垂直に配置し、したがって冷却管が主チャンバの２つの広いほ うの壁を貫通するように構成することもできる。好適実施悪様の利点は、チャン バの透明壁を通して分離過程を容易に監視できるという点である。これに対して 、前記変形例はＭＳ液の流れの方向を変えずに１１１％液入口及び出口の設計を 簡単にすることができる。

以上、特定の実施悪様について本発明を説明したが、請求の範囲に該当する限り 本発明は上記説明に限定されないものと理解されたい。

ＦＩＧ、　１ ΦＦつ →プ 特表平４−５０２５１６　（１１） ＦＩＧ５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ　９ イ ａ１ 国際調査報告

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．溶液から成分を分離するために溶液中で電気泳動分離を実施する方法であっ て、緊密に充填した複数の中空ファイバを収容するチャンバに溶液を導入する段 階と、溶液をチャンバ内で流動させる段階と、溶液が中空ファイバ間を通ってチ ャンバの入口からチャンバの出口ヘ自由に流動できるように十分な間隙スペース をファイバの外側のファイバ相互間に設ける段階と、分離を実施しながら中空フ ァイバの内側に冷却流体を通す段階と、チャンバ及び溶液に電流を流し、溶液中 の成分を別個の成分に分離する段階と、分離した成分を入口から離れた点でチャ ンバから取り出す段階とを含む方法。
2. ２．分離中に溶液及び冷却流体をチャンバ中に連続的に供給し、成分を連続的に 取り出す請求項１に記載の方法。
3. ３．中空ファイバが有機ファイバ、無機ファイバ及びその混合物から構成される 群から選択される請求項１に記載の方法。
4. ４．中空ファイバが有機ファイバ、無機ファイバ又はその混合物から構成される 群から選択される請求項２に記載の方法。
5. ５．中空ファイバが有機ファイバである請求項３に記載の方法。
6. ６．中空ファイバが無機ファイバである請求項３に記載の方法。
7. ７．中空ファイバが有機ファイバである請求項４に記載の方法。
8. ８．中空ファイバが無機ファイバである請求項４に記載の方法。
9. ９．チャンバ内の間隙スペースを通る溶液の流れに対して実質的に垂直な方向に 電流を流す請求項１に記載の方法。
10. １０．チャンバ内の間隙スペースを通る溶液の流れに対して実質的に垂直な方向 に電流を流す請求項２に記載の方法。
11. １１．チャンバ内の間隙スペースを通る溶液の流れに対して実質的に垂直な方向 に電流を流す請求項３に記載の方法。
12. １２．チャンバ内の間隙スペースを通る溶液の流れに対して実質的に垂直な方向 に電流を流す請求項４に記載の方法。
13. １３．分離すべき２種以上の有機物質を含有する溶液中の有機成分を相互に分離 する方法であって、分離すべき溶液を入口から分離チャンバに供給する段階と、 溶液をチャンバの入口端部から出口端部に流動させる段階と、チャンバを通る溶 液の流れに実質的に平行となるように整列された主軸を有する緊密に充填された 複数の中空ファイバ管をチャンバ内の溶液の流路に沿って設ける段階と、チャン バ内の中空ファイバ中に一端から他端に向かって熱交換流体を流動させる段階と 、溶液の成分をチャンバ内の流路で相互に分離させるに十分な電流及び電圧で溶 液に連続的に電流を流しながら、ファイバの表面及びファイバ間の間隙スペース に沿って溶液を通過させる段階と、チャンバの出口端部でこうして別々の流れと して分離した溶液からの成分を回収する段階とを含む方法。
14. １４．溶液が緩衝液である請求項１３に記載の方法。
15. １５．溶液の流路に実質的に垂直な方向にチャンバに電流を流す請求項１３に記 載の方法。
16. １６．中空ファイバが有機ファイバ、無機ファイバ又はその混合物から構成され る群から選択される請求項１３に記載の方法。
17. １７．中空ファイバが有機ファイバ、無機ファイバ及びその混合物から構成され る群から選択される請求項１４に記載の方法。
18. １８．中空ファイバが有機ファイバ、無機ファイバ及びその混合物から構成され る群から選択される請求項１５に記載の方法。
19. １９．中空ファイバが有機ファイバである請求項１６に記載の方法。
20. ２０．中空ファイバが無機ファイバである請求項１６に記載の方法。
21. ２１．中空ファイバがグラスファイバである請求項１６に記載の方法。
22. ２２．中空ファイバが有機ファイバである請求項１７に記載の方法。
23. ２３．中空ファイバが無機ファイバである請求項１７に記載の方法。
24. ２４．中空ファイバがグラスファイバである請求項１７に記載の方法。
25. ２５．中空ファイバが有機ファイバである請求項１８に記載の方法。
26. ２６．中空ファイバが無機ファイバである請求項１８に記載の方法。
27. ２７．中空ファイバがグラスファイバである請求項１８に記載の方法。
28. ２８．電気泳動分離を実施するためのシステムであって、チャンバに電流を流す ためにチャンバの両側に配置されたアノード及びカソードを有する電気泳動用チ ャンバと、該チャンバに充填され且つ該チャンバを貫通しており、入口及び出口 を有する複数の中空ファイバと、該ファイバ中に流体を導入するための手段と、 該チャンバの一端に配置されており、分離すべき溶液を導入するための手段と、 溶液を複数の流れとしてチャンバの他端から取り出すための手段とを備えており 、ファイバの充填は、充填によりファイバ間に形成される間隙を通って分離すべ き溶液をチャンバの一端から他端に流動させるために十分なスペースをファイバ 相互間に提供するように調整されるシステム。
29. ２９．ファイバ間には該チャンバを横切る水平方向にスペーサが配置されており 、該スペーサは流体の流れに対して透過性である請求項２８に記載のシステム。
30. ３０．ファイバ間にはチャンバ内の垂直方向にスペーサが配置されており、該ス ペーサは流体の流れに対して透過性である請求項２８に記載のシステム。
31. ３１．ファイバ間にはチャンバ内の水平及び垂直方向にスペーサが配置されてお り、該スペーサは流体の流れに対して透過性である請求項２８に記載のシステム 。
32. ３２．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項２９に記載のシステム。
33. ３３．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項３０に記載のシステム。
34. ３４．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項３１に記載のシステム。
35. ３５．ファイバが１０〜５００μｍの外径を有する請求項２８に記載のシステム 。
36. ３６．該チャンバがファイバ間の間隙に第２の流体を導入するための手段を備え る請求項２８に記載のシステム。
37. ３７．溶液中の成分を電気泳動により分離する方法であって、緊密に充填された 複数の中空ファイバを収容するチャンバに分離すべき溶液を通す供給する段階と 、中空ファイバの主軸に沿ってファイバの外側のファイバ間の間隙スペースに分 離すべき溶液を複数の流れとして流動させる段階と、分離を実施しながら、中空 ファイバの内側に冷却流体を通す段階と、チャンバを通過して分離を受ける複数 の流れの各々に異なるｐＨ値の緩衝溶液の各個の流れを送り、チャンバを横切る 流れにｐＨ勾配を設定する段階と、設定したｐＨ勾配を通して最低移動度の成分 を単離し、狭い溶液バンドに集中させながら、チャンバに電流を流し、チャンバ のアノード及びカソード側ヘ向かう電気泳動移動度に基づいて溶液の成分を分離 する段階と、こうして別々の流れとして分離された成分を取り出す段階とを含む 方法。
38. ３８．チャンバ内に配置され且つ膜壁を有する中空ファイバに緩衝溶液を供給す る段階を含む請求項３７に記載の方法。
39. ３９．電気泳動を使用して溶液を分離する方法であって、分離すべき溶液をチャ ンバ中に供給する段階と、分離中に中空ファイバ内を流れる分離すべき流体の複 数の通路をファイバ間の間隙に設けるように、半透性壁を有する細長い中空ファ イバをチャンバに充填する段階と、冷却流体を緩衝液とし、中空ファイバの壁を 通って被分離溶液に送られるにしたがい、チャンバを横切って異なるｐＨ値を提 供し、チャンバ内にｐＨ勾配を提供する段階と、分離される溶液の成分を別々の 流れとして分離して収集できるように十分な電圧でチャンバに電流を導入する段 階とを含む方法。
40. ４０．相互に整列且つ離間された複数の中空ファイバと、該ファイバに流体を導 入するための手段とを備えており、ファイバの充填が充填によりファイバ間に形 成される間隙内を分離すべき溶液が流動するに十分なスペースをファイバ相互間 に提供するように調整される電気泳動分離ベッド。
41. ４１．ファイバ間には該ベッドを横切る水平方向にスペーサが配置されており、 該スペーサが流体の流れに対して透過性である請求項４０に記載のベッド。
42. ４２．ファイバ間にはベッド内の垂直方向にスペーサが配置されており、該スペ ーサが流体の流れに対して透過性である請求項４０に記載のシステム。
43. ４３．ファイバ間にはベッド内の水平及び垂直方向にスペーサが配置されており 、該スペーサが流体の流れに対して透過性である請求項４０に記載のシステム。
44. ４４．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項４１に記載のシステム。
45. ４５．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項４２に記載のシステム。
46. ４６．スペーサがクロス、マット、スクリム、メッシュ、フィラメント、透析膜 及び紙から構成される群から選択される請求項４３に記載のシステム。
47. ４７．ファイバが１０〜５００μｍの外径を有する請求項４０に記載のシステム 。
48. ４８．チャンバ内で中空ファイバの主軸に沿って溶液を流動させる請求項１に記 載の方法。
49. ４９．中空ファイバ間の間隙スペースに溶液を導入し、チャンバに充填後、該溶 液をゲル化させ、ゲル中で電気泳動分離を行う請求項１に記載の方法。
50. ５０．チャンバが混合物を導入し、入口及び出口を有するコンパートメントを通 って成分を取り出すための手段を有しており、該コンパートメントがゲルを収容 せずに液体を自由に流動できるように多孔質膜によりゲルから分離されている請 求項４９に記載の方法。
51. ５１．中空ファイバが該ファイバの充填構造を横切る電気伝導を妨げることなく 相互に接触できるように粗状又は波状の外側表面を有する請求項１に記載の方法 。