JPH04502611A - コラーゲンの架橋の抑制用化合物および抑制方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲンの架橋の抑制用化合物および抑制方法主所■分団 本発明はひふのコラーゲンの架橋および／またはひふ細胞ＤＮＡの損傷を減少ま たは防止するための方法に関する。特に本発明は老化および／または紫外線照射 に曝露に続に期間のコラーゲンの架橋を減少または防止する性能を有する特定の ジペプチドおよびその類似体の使用に間する０本発明の方法はまた紫外線による ＤＮＡの損傷を減少させるためにも適用できる。

生尻皇宵ｌ 活性酸素種による酸化ストレスおよび組織の損傷はがんおよび老化、を含む多数 の疾患の基礎として示唆されてきた（Ｈａｌｌｉ−ｓｉｅｌｌおよびＧｕｔｔｅ ｒｉｄｇｅ、　１９８５　；　Ｈａｒｓａｎ、　１９８７　；　５ａｕ１等、１ ９８７参照）。

非常に反応性のフリーラジカルの濃度および生成は紫外線によって高められるこ とが知られている。前記反応性種は後でＤＮＡ５ＲＮＡ、たんばく賞および脂質 と反応可能である。前記反応性種および潜在的に損傷を起す種に対する自然の防 御機構が存在することが信じられ、そして老化防止性を持つ多数の分子が組織内 に確認されてきた（たとえばビタミンＥ、カルノシンおよびアスコルビン酸）、 シかしながら、生体内のカルノシンおよびその類憤体の生理的な役割は不明のま まである。

効率的な一重項酸素捕そく助であることに加えて、カルノシンに対して示唆され た他の役割としては、乳酸の中和（Ｄａｖｅｙ。

１９６０）　、ｉキレート剤（Ｂｒｏｓｙｎ、　１９８１）、ミオシン明パン沈 殿トキソイド酵素の活性化因子（ＰａｒｋｅｒおよびＲｉｎｇ、　１９８０）お よび酵素の調節剤（池田等、１９８０）が挙げられる。

哺乳動物の老化の間じゅう成熟したコラーゲンの架橋の量は増加するが、一方未 成熟の減少可能な架橋の数は減少する（Ａｍｅｓ、　１９８３）。他の組織の（ たとえば膣）の架橋の性質は違いうるが、同様の一般的な傾向が存在する（Ａｍ ｅｓ、＋　１９８３；　Ｒａｔｔａｎ等、１９Ｂ２）　、さまざまな種に対する 架橋の量の変化の速度はいろいろな種に対する寿命の相違を反映すると思われる 。たとえば、成熟した架橋ＨＨＬ　（ヒスチジノヒドロキシルシノノールロイシ ン）の量は４０才までヒトのひふで一次的様式で上昇するが、一方子牛のひふで はＨＨＬの量は４才で平坦化、する（Ｋ。

ｈｅｎ等、　１９８８）。架橋は、酸化的に脱アミノされるコラーゲン鎖中の前 駆体リジン（Ｖｉｚｉｏｌｉ等、　１９８３）またはヒドロキシルリシン（Ｂｏ ｌｄｙｒｅｖ等、　１９Ｂ？）から生じる。生成されたアルデヒドはその後類似 の残分と縮合してアルドールを生じるかあるいは隣接するりシンもしくはヒドロ キシルリシン残分と縮合してシッフ系化′合物を生じる。コラーゲンの架橋度は また紫外線によって増大する。このようにコラーゲンの架橋速度とひふおよじ恐 らく他の組織の老化の速度の間には相関がある。

生班度１隻 本発明は、活性化合物と組合せた適切を賦形剤を含む組成物で皮ふを治療するこ とを含んでなり、前記活性化合物がカルノシン、ホモカルノシン、アンセリン、 ３−メチル−し−ヒスチジン、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン、アシルホモカルノ シン、アセチルカルノシン、ヨードカルノシン、ショートカルノシン、硝酸アセ リン、カルベノキシロン力ルノシン、その類似体および前記のものの２種以上の 混合物から選ばれることを特徴とする、皮ふのコラーゲンの架橋および／または 皮ふ細胞のＤＮＡに対する損傷を減少または防止する方法からなる。

本発明の好ましい実施態様において、活性化合物は天然に生じる（たとえばヒト の組織に見出される）カルノシン（ｐ−アラニル−し−ヒスチジン）のような老 化防止化合物である。

目下、活性化合物はカルノシンまたはその組合によるホモカルノシンであること が好ましく、最も好ましくはカルノシンである。

本発明の更に好ましい実施態様において、活性化合物はもう１つの分子に結合さ せられ、その分子は組成物がひふ浸透、ひふ適用および組織吸収に関して改良さ れるようなものである。

この別の分子はアミノ酸またはペプチドであることが好ましい。

本発明の方法は一般にひふへの組成物の局部適用を含むものであるが、しかしな がら、組成物は皮下にもしくは筋肉内に注射でき、または経口的に飲用できる。

組成物中の活性化合物の濃度は投与の径路に依存するものであり、内科医の指示 で行われるが、しかしながら、活性化合物の濃度はたとえばひふクリーム処方物 の−当り１〜１００ｍｇの範囲内であることが予期され、好ましい範囲は３〜２ ０■／ｄである。

本発明の方法は、紫外線または日光に曝らすことによるコラーゲンの架橋を減少 または防止することによって皮ふの老化を低下させるものと信じられる。その方 法はまた紫外線の結果としてのＤＮＡ損傷を防止することができるということを 生じさせるので、本発明の方法は皮ふガンの防止に適用可能性を有する。

本発明に係る化合物は、主文で議論した活性ペプチド分子に加えて、コラーゲン の架橋を阻止または防止できる非ペプチド化合物を含みうる０本発明の組成物中 に都合よく含みうるそのような化合物としてはビリルビン、カロチノイド、マン ニトール、還元グルタミン、セレン、尿酸、ビタミンＡ１ビタミンＣおよびビタ ミンＥが挙げられる。

木溌泗９１沫しＩ江 本発明の本質をさらに明りょうに理解するために、次にその好ましい態様を次の 実施例を参照して記述する。

ス藷開上 二文久及ｊ］ カルノシンのコラーゲン架橋抑制活性の例を表２に示しそしてマウスの皮膚の全 還元可能種に対する紫外線照射の影響を表し一カルノシンはシグマケミカル社（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ−ａｎｙ）またはＢ　Ｄ　Ｈケミカル 社（Ｂ　Ｄ　ＨＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｔｄ、　）から入手した。ＣｈｒｏＩｌｌ ａｒ　ＨＰ　Ｌ　Ｃ等級アセトニトリルをＭａ　Ｉ　Ｉ　１ｎｋｒｏ−ｄｔ　Ａ ｕ５ｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ、　Ｌｔｄ、から得て、すべての溶媒を濾過し使用前 に脱気した。比放射能５０〜７０キユ一リー／ミリモルのＫＢ　（Ｈ’）４をオ ーストラリア原子力委員会を通して、ＣＥ　Ａ　Ｆｒａｎｃｅがら購入した。

皮膚線維芽細胞を５ｗ１ｓｓマウスから得た組織の原始体外移植組織から培養し た。細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養し １０％牛脂児血清（ＧｔｏｓｙｓｔｅＩＩｓ　Ｐｔｙ、　Ｌｔｄ、）を補い第２ 継代と第３継代の間に使用した。皮膚切片もまた新生児５ｗ１ｓｓマウスから得 た。切片はできるだけ多くの皮下物質を切り取り、次の実験手順の前にリン酸塩 緩衝食塩水で簡単にすすぎ落した。すべての試料を紫外線処理に先立ってリン酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のし一力ルノシンのさまざまな濃度中で１時間３７° Ｃでインキュベートした。ホウ水素化物による還元に先立って、試料をＰＢＳ中 ４０°Ｃでよく洗浄し、コラーゲン構造を最小の崩壊に抑えて汚染されているタ ンパク質、グリコプロティン、グリコサミノグリカンを除去した。

皮膚切片および皮膚線維芽細胞の開放皿を２４ワツト殺菌紫外線ランプを使用し て９２０Ｗ／ａｍに３時間さらした。試料は紫外線処理を通して水分を保持した 。

ＫＢ（Ｈ３）４による還元を室温で同種のＰＢＳ緩衝液中１時間試料／ホウ水素 化物の１００：１湿式重量比で行なった。反応を４Ｍ酢酸の添加により停止しｐ Ｈを３．００に下げた。次に試料が可溶性放射能がなくなるまで蒸留水に対して ４°Ｃで透析した。試料を５ｅｑｖａｎａ１等級６Ｎ塩酸中で窒素のもと２２時 間１１０°Ｃで加水分解した。それぞれの試料をその後蒸留水に溶解させる前に 蒸留水からロークリエバポレーターで２度乾燥させた。氷解物をＨＰＬＣの前に ０．５Ｎ　ＮａＯＨで中和した。

ＨＰＬＣをＰ３５００ＨＰ　Ｌ　Ｃポンプ、ＬＣＣ５００プログラマ−を含んで なるハーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　ＨＰ　Ｌ　Ｃ／　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ装置 で、加熱カラム室を使用して行なった。

初めての分離をＢｒｏｗｎｌｅｅｓ　２５ｃｍＸ０．４６ｃｔｎアミノ−３ｐｈ ｅｒｉ　５カラムで３５゛Ｃの温度および１．０ｄ／分の溶離剤流速で行なった 。

カラム寿命を溶媒管路中にＢｒｏｗｎｌｅｅ　４．６Ｘ３０ｎｍアミノー５ｐｈ ｅｒｉ５プレーカラムガードカートリッジ、およびＢｒｏｗｎｌｅｅ１５Ｘ３２ ａｎＡｎｉｏｎ　Ｎｅｅｖｇｖａｒｄを使用することによりかなり延ばした。Ｂ ｒｏ−ｗｎｌｅｅカラムはオーストラリアのＡｃｔｉｖｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃ−ｔｓ　Ｃｏ　Ｐｔｙ、　Ｌｔｄ、により供給された。

勾配系は２種の溶媒から成る。溶媒ＡはｐＨ４，３，１０ｎ＋Ｍリン酸カリウム 緩衝液を含み、そして溶媒Ｂは水で５０：　７　（ｖ／ｖ）に希釈したＨＰＬＣ −等級アセトニトリルを含んでいた。アミノ酸を先行技術と同様な勾配プログラ ムを使用することにより分離しうるが、プログラムを還元したコラーゲン成分の 分離のために修正した。

プログラム１は次の通りであった。すなわち、１．９５％溶媒Ｂで５分間；２． 直線勾配９５％〜７０％溶媒Ｂで１５分間にわたって；３、直線勾配７０％〜５ ０％溶媒Ｂで１５分間にわたって；４．５０％溶媒Ｂで１０分間；５．直線勾配 ５０％〜９５％溶媒Ｂで５分間にわたって。

容積０．５ｄの画分を２０−シンチレーション小瓶中へ直接収集し、Ａｍｅｒｓ ｈａｍ　ＰＣＳ　ＩＩ高能率相化合シンチレート剤５．０戚を添加した。計数を Ｌ　Ｋ　Ｂ　１２１５　Ｒａｃｋ　ｂｅｔａ　Ｕ計器で行なった。

仝−マウスの　の　−口 表土 ■職　紫外線処理　藍Ω肚研り 皮膚切片 皮膚（外面）　１００００ 皮膚（外面）　＋　２４０００ 皮膚（内面）　１１０００ 皮膚（内面）　＋　２７０００ 皮膚細胞 線維芽細胞　１９０００ 線維芽細胞　＋　３８０００ ２■の試料を通常光線または紫外線で２．５時間処理し次にＫＢ（Ｈｚ）ａで還 元し、ＨＰＬＣに先立って加水分解した。

紅 カルノシンによる　悸　コーー゛ン加　の　−ｆｌ　紫外線処理　カルノシン　 ｋ旦Ｕ堕り皮膚切片　１５０００ ＋　２３０００ ＋　＋　１４０００ 皮膚細胞　１４０００ ＋　２００００ ＋　低線量（２ｍＭ）　１４０００ 高線量（１０ｍＭ）　１００００ 試料をカルノシン溶液によって保護しまたは保護なしで表１のように処理した。

実Ｍｉｌ− マウス皮膚線維芽細胞（ＭＤＦ）の１次培養を新生マウス皮膚から分離し、実験 前のわずか４継代にすぎない間ずっとｌＯ％牛脂児血清を加えた高グルコースを 持ってＤＭＥＭ培地中を連続的に通過させた。紫外線露光に先立って、細胞層を ＰＢＳ５０ｄで洗浄して成長培地のすべての痕跡を除去した。ＭＤＦを次に１０ ＋ＩＩＭカルノシンを加えてまたは加えずに１時間３７°ＣでＰＢＳ２５Ｍ１と ともにインキュベートした。すべての手順を外部光線に対し最小露光で行なった 。

インキュベーション期間の終りに複製細胞集団を紫外線に０．２．４または６分 間露光した。照射に続いて細胞単分子層をはがしＰＢＳを含有する遠心分離管へ 移した。遠心分離後上澄を除去し、細胞沈殿物をＰＢＳ３０１ｄ中へ再懸濁した 。すべての試料を次いで３日間４　”Ｃで洗浄した。ＰＢＳを毎日２回取り替え た。

試料を次ににＢ　［３Ｈ］　４で還元し酸加水分解した。加水分解溶液をロータ リーエバポレーターにかけ、中和してＨＰＬＣ分析（Ｓｍｏｌｅｎｓｋｉ等、１ ９８３　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊　Ｊ、　、２１３．５２３〜５３２頁）前に凍結乾燥 した。　０．５Ｗ１のＨＰＬＣ画分を２０ｄシンチレーシヨン小瓶中へ直接収集 し、Ａｍｅｒｓｈａ＋ｍ　Ｐ　ＣＳ　ＩＩ高能率権化合シンチレート剤５ｍを添 加した。計数をＬ　Ｋ　Ｂ　１２１５　Ｐａｃｋ　Ｂｅｔａ■で行なった。これ らの実験結果を第１図〜第６図に示す。

マウス皮膚線維芽細胞をこすり取ってＰＢＳで洗浄した。分離した細胞懸濁液を 次に記述した方法を使用してＨＰＬＣのために処理した。

第１図に示したプロフィルは典型的な非紫外線照射試料（対照）の描写である。

範囲４０〜９０の百分は分離した還元可能なコラーゲン架橋から成る。ピーク高 さの相違は試料中に存在する特定な型の架橋アミノ酸錯体の量の表示である。

第２図に示したプロフィルは紫外Ａ光線に２分間露光後の分離した架橋における 変化を描いている。両分番号５５の主ピークが消失し両分８３〜８７ヘピークの 位置移動があった。

これらの相違は水分子に対する紫外線の作用により生じたフリーラジカルの相互 作用による架橋アミノ酸錯体の変更を表わすものであると推測される。

第３図に示したように紫外Ａ光線に４分間露光俊速元可能な架橋のプロフィルは 画分５５〜７５の範囲の架橋性アミノ酸錯体の大きな増加を示した。

第４図に示したように、紫外線Ａ露光６分後では両分５５〜７５に存在する還元 可能な架橋アミノ酸錯体の含有量に著しい変化があった。これはたぶん両分５５ 〜７５における蓄積を引き起こすより少ない錯体架橋の変更およびことによると フリーラジカルの相互作用による全く新しい架橋の形成の結果である。

第５図はマウス皮膚線維芽細胞を１０ｍＭカルノシンの存在において６分間紫外 線Ａに露光したときに得られた結果を示した。

そこで見られるように第４図に示したものと比較して分離した架橋のプロフィル 中に著しい相違があった。

第６図はＭＤＦ細胞を２分間紫外線Ａにまたは６分間紫外線へのほかに１０ＩＩ ＩＭカルノシンの存在下において露光したとき生ずるプロフィルの比較を示す。

画分５５〜７５からのピークの減少により見られるようにカルノシンが紫外線Ａ の影響からＭＤＦ細胞を保護していることがプロフィルのこの重なりから明白で ある。

肚 １０ｍＭカルノシンが紫外線Ａに露光している間中ＭＤＦを浸す溶液中に存在す るとき、生成した変化した還元可能な架橋の生成に７０％の減少があった。これ をＨＰＬＣプロフィルの様子により例示した。すなわち６分間の紫外線Ａ露光＋ １０１１Ｍカルノシンのプロフィルは２分間紫外線Ａ露光のプロフィルに類似し ていた。

実施１ 、Ａ　ヒ　ＭＲＣ−５ ヒト肺線維芽細胞細胞系統（ＭＲＣ−５）を紫外Ａ光線に露光したときカルノシ ンがヒトコラーゲンに与える保護の程度を実験するために使用した。

線維芽細胞は動物の結合組織の維持のだめの責任がある。それらは積極的に間質 空間中ヘコラーゲンブロベグチドを分泌し、その一部分は結合ｍ織コラーゲンと して細胞外基質中に沈着する。

ＭＤＦ細胞のために使用したものと同様の実験計画案をこれらの実験において使 用したが、紫外線Ａ露光時間を１５分間に増加した。これはＭＤＦ細胞の６分間 紫外線Ａ露光で明白であったコラーゲン架橋の変化を増加させるために行なった 。これらの実験の結果を第７図〜第１０図に示す。

第７図では、ＭＤＦの集団と同様の細胞数でＭＲ（、−５の集団をこすり落とし ＨＰＬＣのために処理した。これらの細胞は紫外線Ａで処理しなかった。すなわ ち一対照であり−そのプロフィルはＭＤＦ細胞により生じたものと同様であった が相違があった。主コラーゲン架橋ピークが両分４０〜９０の範囲にあった。

第８図は１０ｍＭカルノシンの存在においてＭＲＣ−５細胞を１５分間紫紫外光 線に露光したとき得られたＨＰＬＣプロフィルを示す、そのプロフィルは対照（ 第７図）のプロフィルと同様であってカルノシンがない時の１５分間紫外線Ａ露 光（第９図）のものと大きな違いであった。

第９図はＭＲＣ−５細胞を１５分間紫紫外光線に露光したとき生じたプロフィル を示す。画分４０〜９０の範囲は細胞質のコラーゲン中に新たに生じた架橋錯体 の推定上の取り込みが広く増加した兆候である。

第１Ｏ図はＭＲＣ−５対照から、および１０ｎ＋Ｍカルノシンの存在下において １５分間紫外線Ａに露光後のＭＲＣ−５から分離したＨＰＬＣプロフィルの重な りを示す。さらに、２種類のプロフィルの間にはずいぶん類似点がありカルノシ ンがフリーラジカル攻撃作用からコラーゲンを保護していることを示している。

！竹 これらの実験からの結果はまたカルノシンが紫外線Ａ誘起架橋に対してコラーゲ ンを保護するという仮定を支持した。これはＭＲＣ−５対照ＨＰＬＣプロフイル とカルノシンの存在下において１５分間紫外線Ａに露光したＭＲＣ−５細胞のプ ロフィルの間の注目すべき類似点により示された。また、カルノシン不在で紫外 線Ａ露光をしたＭＲＣ−５細胞から得られたプロフィルにおける著しい変化はカ ルノシンが架橋に対するコラーゲンのその保護においてきわめて有効であること を示すものである紫外線Ａ露光時間を１５０％増加したこれらの実験は依然とし て１０ｍＭカルノシンで７０％より大きい保護を照明した。

１差」１工 旦！」」Ｉｔ１狡 等尺性融解はコラーゲンの年令関連変化数を決定するために広く使用されてきた （Ｍｉ　ｔｃｈｅｌ　１およびＲｉｇｂｙ　、　１９７５　ＢＢＡ。

直、５３１〜５４１頁）　、　ＲｏｂｉｎｓおよびＢａ１ｌｅｙ　（１９７５Ｂ ｉｏｃｈｅｍＪ、　１４９．３８１〜３８５頁）はコラーゲン架橋の密度は時間 では一定であるが老化するにつれて生じ、リジンおよびヒドロキシリジンから生 成した不安定な還元可能なアリジミン結合が、年令関連コラーゲン変化を説明す る熱的に安定で、還元不可能な結合に転換するということを提唱した。

等尺性融解のこの方法はどのように紫外線がコラーゲン架橋を変化しうるかを実 験するために使用した。多数の他のコラーゲン老化研究（旧ｔｃｈｅｌ　ｌおよ びＲｉｇｂｙ　、１９７５　ＢＢＡ、３９３．５３１〜５４１頁；　Ｒｉｇｂｙ およびＭｉ　ｔｃｈｅｌ　］、１９７８、ＢＢＡ、５３２．６５〜７０頁および ＢＢＡ、刹［，６２〜６８頁；　Ｒｉｇｂｙなど、１９７７、ＢＢＲＣ，、ｎ孤 ル、４００〜４０５頁）のために使用されてきたラット尾膜をこれらの実験にお いて使用した。

この方法はそのまま年令関連架橋変化の直接測定基準として他の方法以上に多く の利点を有す。本出願は光老化および特に紫外線によるコラーゲン架橋に関連を 持っているので、この方法は時間による紫外線架橋の範囲の定量的測定をするこ とを可能にする。さらに、この方法は紫外線誘起フリーラジカルに対する脚の保 護におけるカルノシンおよび他の酸化防止剤の効果を測定することを可能にする 。

林葺五よＵ立法 等尺性融解の技術を光老化の影響を測定するためにう７）尾朧に適用した。

９０日経過Ｓｐｒａｇｖｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをこれらの実験で使用した。

■坐分蓋 尾を摘出により切除し氷漬けにして作業所へ移動した。脚を次に乾燥を防ぐため に生理食塩水で湿らせた外科用パッド上で注意深く解培した。各々の鍵をその後 測定し半分に切った０尾の上半分を実験用に使用し一方で下部を物理的対照とし て４°Ｃで保存した。

、および　′ 鍵の実験用半分を紫外線露光に先立って２０時間適切な試験溶液中で４°Ｃでイ ンキュベートした。この露光に続いて股をＰＢＳで洗浄し、分析するまで４°Ｃ で保存した。

ひずみ計−５ｈｉｎｋｈｏ変換器型式Ｕ　Ｌ　−１００ｇｍから成る等尺性装置 を増幅器に接続した。ひずみ計に取り付は後試料をＰＢＳを含有するジャケット 式パイレックス浴中に浸漬した。実験の間じゅうその浴をＴａｅａｓｏｎＷ１環 水加熱器で加熱した。温度上昇を測定するためにＦＬＵＫＥ熱電対型弐８０ＴＸ を股取り付は位置の隣の部分へ取り付けた。力および温度の測定をｒｃＩ　ＤＰ ６００２本ペンチヤード記録計で同時に記録した。

分析のための腿を等尺性装置に取り付は前に３ｃｍの標準長さに再切断した。取 り付けた脚を次に２０°ＣのＰＢＳ浴中へ浸漬し、１ｇの張力を適用した。１５ 分間の緩和期間後装置の向きを変えて融解が生じるまで１”Ｃ／分の割合で温度 を上昇した。最終測定を次にチャート記録計から得た。

履架橋における測定可能な変化を生じるために必要な露光時間を測定するために 、時間経過実験を行なった。この実験の結果を第１１図に示す。４本の紫外、Ｉ Ａ管と２本の紫外！Ｂ管から成る光源を使用する１８０分間の露光は再生可能な 結果を与えたことがわかった。この時間は次の実験のために使用した。

カルノシン、ホモカルノシンおよびアンセリンを複製腓を前処理するために使用 した。これらを次に１８０分間紫外１ｉＡＢに露光した。これらの実験からの結 果を第１２図に示す。これらの実験においてカルノシンおよびホモカルノシンは １０ｍＭおよび１００ｍＭで紫外線誘起架橋に対して股を効果的に保護した。一 方アンセリン１０＋ｍＭでは全く保護効果が観察されなかったが、アンセリンは 高温度で保護効果を与えうることが信じられる。（あいにくアンセリンは入手可 能性の欠除のため高濃度での試験はしなかった。） 第１３図は他のジペプチドおよびトリペプチドの１セツトをカルノシンと比較し て紫外線誘起架橋に対して股を保護するための能力を試験したとき得られた結果 を示す。試験したそれらのいずれも紫外線誘起架橋に対して鍵を保護しないこと がわかった。ペプチドの２種類はヒスチジンを含有していたが依然不活性であっ た。これらの結果はカルノシンがたぶん紫外線誘起コラーゲン架橋に対して保護 するためにその酸化防止性によって作用していることを示唆する。

第１４図はグルタチオン１０＋ｗＭ　（ＩＯＧ　Ｓ　Ｈ）に対するＳｍ測定に関 する第１２図からの腿データとの比較を示す。グルタチオンはこの測定方法を使 用するとさらに効果があると思われる。アンセリン（ＩＯＡ）はこの濃度では作 用しない。グルタチオンはこの濃度では生体内でフリーラジカル補そく剤として の作用に有効ではないものであるということを注目することが重要である。

！ｈ 等尺性融解技術を使用するこれらの実験からの結果は、カルノシンが紫外線誘起 コラーゲン架橋に対してラット尾鍵保護において効果的に作用することを決定的 に証明した。また試験した他のジペプチドおよびトリペプチドの結果から、カル ノシン効果は明確でありその酸化防止性のために生じることもまた明白である。

Ｆｒａｃｔｌｏｎ　Ｎｏ。

Ｆｉｇｕｒｅｌ。

Ｆｒａｃｔｌｏｎ　Ｎｏ。

ＨＰＬＣｐｒｏｆｌｌａ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅｄａｒｍａ団ｂｒｏｂｔａｓｔｓ　 ａｆｌｅｒ２’ｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏυＶＡ。

Ｆｉｇｕｒｅ、２゜ ＨＰＬＣｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｆｌｂｒｏｂｌｍｓｔｓ　ａｖｅ ｒ　ａ　４’　ＵＶ　Ａ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ。

Ｆｉｇｕｒｅ　、３゜ Ｆｎｃｔｌｏｎ　Ｎｏ。

Ｆｉｇｕｒｅ、４゜ Ｆｒａｃｌｌｏｎ　Ｎｏ。

Ｆｉｇｕｒｅ、５゜ Ｆｉｇｕｒｅ、６゜ ＦＲＡＣＮｏ。

Ｆｉｇｕｒｅ　、７゜ ＦＲＡＣＮｏ。

Ｆｉｇｕｒｅ、８゜ ＦＲＡＣＮｏ。

Ｆｉｐｕｒｅ、９゜ Ｆｉｇｕｒｅ、１０゜ ＦＩＧＵＲＥ、ｉｔ。

Ｔｈｅ　ｒ＠ｄｕｃｌｌｏｎ　ｏτＬＩＶ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｏｌｌａａｅｎ １６０’ｕＶＡφＢ ｒＸＧＵＲｔ　１２ Ｆｉｇｕｒｅ　、１３゜ １８８°ＵＶＡＢ Ｆ工ＧυＲＥ　１４ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８の規定による補正書）平成３年３月２８日

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．活性化合物と組合せた適切な賦形剤を含む組成物で皮ふを治療することを含 んでなり、前記活性化合物がカルノシン、ホモカルノシン、アンセリン、３−メ チル−Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン、アシルホモカルノシン、 アセチルカルノシン、ヨードカルノシン、ジヨードカルノシン、硝酸アンセリン 、カルベノキシロンカルノシン、その類似体およびその組合せから選ばれること を特徴とする、皮ふのコラーゲンの架橋および／または皮ふ細胞のＤＮＡに対す る損傷を減少または防止する方法。
2. ２．活性化合物がカルノシンまたはホモカルノシンあるいはその組合せである請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．活性化合物がカルノシンである請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．活性化合物がもう１つの分子と結合させられ、該分子は組成物が皮ふ浸透、 皮ふ適用および組織吸収に関して改善させられるようなものである請求の範囲第 １項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。
5. ５．分子がアミノ酸またはペプチドである請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．方法が皮ふへの組成物の局部適用を含む請求の範囲第１項〜第５項のいずれ か１項記載の方法。
7. ７．組成物が、ビリルビン、カロチノイド、マンニトール、還元グルタチオン、 セレン、尿酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびその組合せから選ば れる化合物を含む請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の方法。
8. ８．活性化合物と組合せた適切な賦形剤を含む組成物で皮ふを治療することを含 んでなり、前記活性化合物がカルノシン、ホモカルノシン、アンセリン、３−メ チル−４−ヒスチジン、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン、アシルホモカルノシン、 アセチルカルノシン、ヨードカルノシン、ジヨードカルノシン、硝酸アンセリン 、カルベノキシロンカルノシン、その類似体およびその組合せからなる群から選 ばれることを特徴とする、紫外線に曝すことによる皮ふのコラーゲンの架橋を減 少または防止する方法。
9. ９．活性化合物がカルノシンまたはホモカルノシンあるいはその組合せである請 求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．活性化合物がカルノシンである請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．活性化合物がもう１つの分子と結合させられ、該分子は組成物が皮ふ浸透 、皮ふ適用および組織吸収に関して改善させられるようなものである請求の範囲 第８項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．分子がアミノ酸またはペプチドである請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．方法が皮ふへの化合物の局部適用を含む請求の範囲第８項〜第１２項のい ずれか１項記載の方法。
14. １４．組成物がビリルビン、カロチノイド、マンニトール、還元グルタチオン、 セレン、尿酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびその組合せからなる 群から選ばれる化合物を含む請求の範囲第８項〜第１３項のいずれか１項記載の 方法。