JPH04502769A - オンコスタチンｍを使用したヒト内皮細胞増殖およびエフェクター機能の制御法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オンコスタチンＭを使用したヒト内皮細胞増殖およびエフェクター機能の制御法 １、序論 本発明はヒト内皮細胞増殖およびエフェクター機能の制御への、最近発見された サイトカインであるオンコスタチン（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）　Ｍの使用、およ び血管内皮が関連する種々のヒトの血管系、新生物系、および免疫系障害の治療 へのその使用に関する。本発明の方法には成熟、ハイブリッド、修飾、または先 端切断された形態のオンコスタチンＭならびにオンコスタチン間類似体の使用が 包含される。本発明はかかる化合物の効力を種々のインビトロアッセイ系を用い て評価している実施例によって記載される。

２、発明の背景 ２、Ｊ、主要組織適合抗原系の発現および免疫応答との関係 主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）の表面発現タンパク質は免疫反応の開始およびエ フェクター機能に不可欠である。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパー）による免疫機能の 開始は、クラスＩ［ＭＨＣ抗原提示を必要とすると思われ、一方ＣＤ８＋Ｔ細胞 （細胞障害性Ｔリンパ球すなわちＣＴＬ）による細胞障害性エフェクター機能は クラスＩ　ＭＨＣ抗原提示を必要とすると思われる。ＭＨＣタンパク質の細胞表 面発現はヒト自己免疫およびアロ免疫疾患と相関することが知られている（Ｆｅ ｌｄｍａｎら、Ｉｎｔｅｒｒｅｒｏｎ　９ニア５−９０．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ　１９８７）　Ｏ例えば甲状腺炎、糖尿病、多発性硬化症、全身紅斑 性狼癒、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、血管炎、胆汁性肝硬変および 免疫関連皮膚障害、ならびにクラスＩおよびクラスＩ［ＭＨＣ抗原レベルの異常 な増加を含む大多数のヒト自己免疫疾患における組繊細胞。クラス■抗原を通常 発現しない細胞（例えば繊維芽細胞および内皮細胞）がこのクラスの抗原を発現 し始めると、それらはＣＴＬによる溶解および破壊の免疫反応標的となる（Ｐｏ ｂｅｒら、１９８３、　Ｎａｔｕｒｅ３０５：　７２６）。

多くの細胞型上のＭＭＣ抗原発現は広く種々のサイトカインの調節制御下にある 。マクロファージ、皮膚繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、甲状腺細胞、星状細胞 、Ｂ小島細胞、平滑筋細胞、１９２３球、内皮細胞および多くの癌細胞のような 細胞はクラスＩＩ　ＭＨＣ抗原発現のためにはサイトカインによる誘導を必要と する（Ｒｅｖｅｌおよび５ｃｈａｔｔｎｅｒ、　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｖ　ａ ｎｄ　ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅ　２２３−２３３．　Ｗｉｌｅｙ　 １９８７）。インターフェロンファミリーのメンバーはＭＨＣ発現のアップレギ ュレーションに主に関連しており、そして全ての種類のインターフェロンはクラ スエ発現を増強すると思われ、ＩＦＮ−γが最もよく研究されており、この点に おいて最も強力である。さらに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β） として知られる細胞毒素はＩＦＮ−β２の誘導を介して繊維芽細胞のクラスＩ発 現を増強する能力を示している（Ｍａｙら、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：８９５７）。ＪＦＮ−αおよびＩＦ Ｎ−βによるクラス■抗原の誘導は通常有意ではないが、ＩＦＮ−γは遺伝子レ ベルにおけるクラス■分子の有効な誘導物質である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８ ４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８１：　４９１７） 。いくつかのサイトカインはＭＨＣ抗原発現の誘導においてＩＦＮ−γと相乗作 用すると思われる。例えばＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは、クラス■抗原のＩＦ Ｎ−γ媒介誘導に影響を与えることなく内皮細胞上でクラスＩ抗原の発現に対し ＩＦＮ−７と相乗的に作用する（Ｌａｐｉｅｒｒｅら、１９８８．　Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６７　：　７９４）。

細胞表面上のＭ）ＪＣ抗原の発現レベルはその抗原提示能力の決定要因であるＣ Ｍａｔｉｓら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　６０９０）。したがって免疫寛容閾値 を越えるＭ）ＩＣ抗原の過剰発現と干渉または拮抗する化合物は、例えば自己免 疫疾患の進行を遅らせるかまたは停止させるにおいて治療上の有用性を有しうる 。臓器移植の場合、ドナーのＭＨＣ抗原の発現レベルは拒絶反応の激しさの重要 な決定要因である（Ｆｅｒｒｙら、１９８７゜Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ 　４４：　４９９）。腫瘍細胞増殖因子β（ＴＧＦ−β）はクラス■発現に影響 することなくヒトミエローマ細胞および末梢血液単核細胞上におけるＩＦＮ−γ 誘導クラス■発現レベルを阻害することが示されている（Ｃｚａｒｎｉｅｃｋｉ 　ら、１９８８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４０＋　４２１７）。

２．１．２．内皮細胞のＭＨＣ抗原発現：同種移植拒絶との関係 血管内皮細胞は同種移植拒絶の過程において中心的役割を果す。組織拒絶の免疫 組織学的研究によると、ＭＨＣ不適合の心臓または皮膚由来の血管内皮細胞は拒 絶過程の早期において高レベルのクラスＩ［ＭＨＣ抗原を発現することが示され ている（Ｄｅ　Ｗａａｌら、１９８８３．　Ｎａｔｕｒｅ３０３：　４２６−４ ２９；　ＭｉｌｔｏｎおよびＦａｂｒｅ、１９８５．　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１６１：　９８−１１２）　、その初期において、同種移植の免疫拒 絶はレシピエンドＴ細胞とドナー臓器血管構造との相互作用を包含する。すなわ ち他の細胞は拒絶が進行するにつれて関与してくる。臓器移植においては内皮は 、その内皮細胞表面のドナーＨＬＡ抗原を認識する宿主Ｔ細胞による攻撃の最初 の標的となるドナーの組織である。血管内皮を通したＴ細胞浸潤は４段階過程と して記載されている。すなわち認識、付着、活性化、および同種活性化されたＴ 細胞の血管壁貫通である＜Ｆｕｎｇら、１９８６．　Ｈｕｍａｎ　Ｉｒ＋ｎｎｕ ｎｏ）、　】６：　１８２）　。活性化されたＴ細胞はドナー内皮の表面上にお けるクラスＩＩ　ＨＬＡ抗原の発現を刺激するものであるガンマ−インターフェ ロン（ＩＦＮ−γ）を産生し、それによりドナー内皮がさらに免疫原性のある状 態へと変換される。クラスＩ抗原の発現増大はがンマーＩＦＮおよびＴＮＦｓに よる誘導からも生じ、細胞障害性Ｔ　ＩＪンパ球と相互作用して内皮に対する標 的機能をおそらく増大する。拒絶された腎臓移植片の初期のバイオプシーにおい ては、クラスＩ　ＨＬＡＬＡ抗原する特異性を有するＴ細胞が主である。拒絶が 進行するにつれて、クラスＩＩ　ＨＬＡ抗原特異的なＴ細胞が優勢となる（Ｚｅ ｅｖｉら、１９８６．　Ｔｒａｎ−ｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４１：　６２０） 。同様の結果が心臓移植においてもみられる。同種免疫応答の程度、および最終 的拒絶はクラスＩおよびクラスＩ［ＨＬＡ分子の両方の発現の如何により、そし てそれらの発現レベルのたとえわずかな減少でも実質的に結果の改善をもたらす 。

内皮細胞はインビトロにおけるサイトカインのＭＨＣ発現の調節を研究するため のよいモデルを提供する。

なぜならこれらの細胞は主要組織から容易に入手でき、サイトカインでの処理後 抗原提示細胞として機能することが知られているからである。培養したヒト調帯 内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は正常な培養条件下でクラス■抗原を構成的に発現する がクラスＩ［ＭＢＣ（ＨＬＡ）抗原は発現しない。アルファおよびベータインタ ーフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）ならびにアルファおよびベータ腫瘍壊死 因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）はクラスＩ［ｔ（ＬＡレベルに影響することな く　ＨＵＶＥＣにおけるクラスＩ　Ｈｌ、Ａ発現レベルを高める（Ｃｏｌｌｉｎ ｓら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　 ３８：　４４６；　Ｐｏｂｅｒら、１９８７．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８： 　３３１９）。ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）だけがクラス■およびＩ ［ＨＬＡ発現の両方をアップレギュレートする能力を７　示す（Ｇｅｐｐｅｒｔ およびＬｉｐｓｋｙ、　１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：　３７５ ０）。ＨＵＶＥＣをサイトカモン処理するとｔ（ＬＡ抗原の定常状態ＲＮＡレベ ルの増大ならびに細胞表面発現の増大を生じる（Ｃｏｆｆｉｎｓら、１９８６． 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　３８：　４４６）。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βはＩＦＮ〜γ−媒介ク ラス■誘導に影響することなくＩＦＮ−γと相乗的に作用してクラスＩ　Ｍ）ｆ ｃ発現を増強させる（ｔ、ａｐｉｅｒｒｅら、１９８８、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、　１６７：　７９４）。これとは対照的に、ｒＦＮ−αもＩＦＮ−βもＩ ＦＮ−γと相乗してクラスＩ発現を増強させることはないが、両者はＩＦＮ−γ 媒介クラス■発現の誘導を阻害する。

２．２．繊維素溶解および血栓症における内皮の役割血管系の止血は血管、血液 の形成された要素例えば単球および血小板、および種々の血液凝固タンパク質の 間の相互作用の機能である。凝固タンパク質における異常は出血および血栓溶解 性障害を生じつる。血栓症は、例えば関節硬化症および冠状動脈心疾患の発病に おける主要な構成要素である（Ｇａｄｊｕｓｅｋら、１９８６゜Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、　１０３：　４２９）。

血栓の溶解はセリンプロテアーゼ、プラスミンによる凝血塊構成要素フィブリン の分解に決定的に依存する。プラスミンは、ふたつのプラスミノーゲンアクチベ ーターすなわち組織型プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）およびウロ キナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）によりその不活性な前 駆体、プラスミノーゲンから生成される。血管内皮細胞は血管床の内腔表面をお おいそしてｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡならびにそれらの多重分子形態物を分泌しく Ｂｏｏｙｓｅら、１９８８゜Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　１５１ ２９）そして局所的に沈積したフィブリンの特異的な分解に能動的に関与すると 考えられる。

プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンおよびプラスミンは全てフ ィブリン分子に結合する。

興味深いことに、ｕ−ＰＡでなく　ｔ−ＰＡが最大触媒効率にとっての補助因子 としてフィブリンを必要とし、このことはｔ−ＰＡの主要な生理学的機能は内皮 細胞により媒介された繊維素溶解をモジュレーションすることであろうことを示 唆している（Ｃａｍｉｏｌｏら、１９７１．　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ。

Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ−１３８：　２７７１）　。フィブリン凝血塊に 対する繊維素溶解が局在化することは、ＰＡインヒビター（ＦＡＩ）によりさら に制御される。ＦＡＩ−１、すなわち血漿および血清中にみられる主要なインヒ ビターは１対１複合体を形成することによりｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡを不活性化 しそして繊維素溶解の調節に重要な役割を果たす（ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋら、１ ９８４．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：　１４９１４）。

したがって、細胞外で発現された内皮細胞媒介繊維素溶解活性レベルがＰＡとＦ ＡＩ−１との間の最終的な均衡を表す。

内皮細胞によるＰＡおよびＰＡＩ−１両者の合成および放出はホルモンおよびサ イトカインによりある程度調節される。塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ） はウシ毛細血管内皮細胞のｕ−ＰＡおよびｔ−ＰＡの発現を刺激する（Ｓａｋｓ ｅｌａら、１９８７．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５：　９５７）　。こ れはＰＡ合成を阻害するがＦＡＩ−１の合成および分泌を促進する腫瘍細胞増殖 因子β（ＴＧＦ−β）により拮抗される作用である（Ｌａｉｈｏら、　１９８７ ．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１７４６７；　５ａｋｓｅｌａら、 １９８７．　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１０５：　９５７）。

また炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１は繊維素溶解インヒビターと して特徴づけられる。なぜならそれらはＦＡＩ−１の合成および分泌を増幅する からである（Ｎａｃｈｍａｎら、１９８６．　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６３： 　１５４５）。

インビトロ研究から得られた証拠では、内皮が血栓の過程を調節するのに活発な 役割を果すことが示される。内皮は正常な条件下において抗血栓溶解表現型を維 持しそして４つの既知メカニズムすなわちトロンビンの不活性化、トロンビン発 現の阻害、血小板付着および凝集の阻害、および繊維素溶解によりインビボでの 血栓形成を阻害する（ＷａｌｌｉｓおよびＨａｒｌａｎ、　１９８６゜Ｐａｔｈ ｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　Ｒｅｓ、　５：　７３−１０３）　、三 つの血栓溶解性薬剤が現在広く使用されている。すなわち、ストレプトキナーゼ 、ウロキナーゼおよび組換えｔ−ＰＡである。これらの作用剤は循環しているプ ラスミノーゲンをプラスミンに転換し、このものが次に血栓中のフィブリン成分 を溶解する。ｔ−ＰＡは補助因子としてフィブリンを必要とするので、ｔ−ＰＡ の作用がフィブリン凝血塊に向けられるというある種の利点を有するが、ストレ プトキナーゼおよびウロキナーゼと同様にｔ−ＰＡは止血枠が最も必要とされる 場合でもそれらを可溶化しうる。急性心筋梗塞患者に利用された短期間に、を− ＰＡは全身性出血性合併症を含む有害な副作用を示している。したがって血栓溶 解を増強するのにより特異的で制御可能な手段が所望される。

２．３．血管形成 血管形成または新血管形成は内皮細胞による新しい血管形成の過程であり、傷口 治癒、排卵、月経および胎盤形成期間を除いて正常な生理学的条件下では成人に はまれである。血管形成の天然に存在するインデューサーおよびインヒビター間 の均衡は普通阻害的影響の方に決まる。血管形成はしばしば糖尿病性網膜症、新 血管性緑内障、リウマチ様関節炎、血管腫および癌のような疾患と関連している （Ｆｏｌｋ−ｍａｎ、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　 ５８３−５９６．　Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅら、Ｅｄｓ、、ＬｅｕｖｅｎＬｌｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）。腫瘍は内皮細胞を活性化し、引きつ ける種々の因子を生成しくＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、　１９８ ７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２）そして結果として生じる活発な血管形成 はそれらの継続的成長および転移に絶対に必要である（ＦｏｌｋｍａｎおよびＣ ｏｔｒａｎ、　１９７６、１ｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　１ ６：２０７）。

血管形成と関連した、生命を危険にさらす疾患のもうひとつの形態はヒト免疫不 全ウィルスｌ型感染患者（Ｆｒｉｅｄｍａｎ−Ｋｅｉｎら、１９８２．　Ａｎｎ 、Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、９６：６９３）および免疫抑制療法を受けている患者（Ｇ ｒｅｅｎｆ　１ｅｌｄら、１９８６、　Ｊ、　Ｒｈｅｍａｔｏｌ、　１３：　６ ３７）に生ずるカボジ肉腫（ＫＳ）である。ＫＳ病変は高度に血管形成された出 血組織パターンにより特色づけられる。その腫瘍は内皮起源であると考えられる （Ｍａｃｈｅｒ、　１９８８．　Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＲｅｐｏｒｔ　１ ０３：　２４６）。後天性免疫不全病（ＡＩＤＳ）の患者から単離されたＫＳ細 胞はマウスに強い血管形成反応を生じ、特色のあるＫＳ病変を生じる（Ｓａｌａ ｈｕ−ｄｄｉｎら、１９８８、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：　４３０）　ｏまたＫ Ｓ細胞は培養した内皮細胞に分裂促進作用を存する因子を分泌する。かかる疾患 における病的血管形成を制御する化合物の治療上の利点から、新血管形成に対す る効果的なインヒビターを探究する道が開かれる。抗炎症剤（Ｐｏｌ−ｖｅｒｉ ｎｉおよびＮｏｖａｋ、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、１４０：９０）、血管形成抑制性ステロイド（Ｉｎｇｂｅｒ ら、１９８６゜Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１１９：　１７６８）、胎盤ＲＮＡア ーゼインヒビター　（ＳｈａｐｉｒｏおよびＶａｌｌｅｅ、　１９８７．　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　２２３８）、ならびに基質合成および統一性に影響 する種々の化合物（ＩｎｇｂｅｒおよびＦｏｌｋｍａｎ、　１９８８゜Ｌａｂ、 Ｉｎｖｅｓｔ、　５９：　４４）のような新血管形成を阻害する多数の化合物が 確認されている。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βを含むある種のサイ トカインも血管形成抑制活性を示し、それらの全てが強力　な血管形成促進剤で ある塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）に対する培養内皮細胞の増殖応答を 阻止することが示されている（Ｂｏｌｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉ ｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ、１１９−１２４．　ＲｉｆｋｉｎおよびＫｌａｇｓ−ｂｒｕｎ編、Ｃ ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）　ｏ　しかしなが ら、これらのサイトカインをウサギ角膜新面管形成アッセイで検査した場合、そ れらは、血管形成因子の放出に関与する炎症性白血球に及ぼすこれらのサイトカ インの化学走性作用から生じると考えられる応答である、血管形成性活性を示し た（Ｆｒｅｔｅｒ−３ｃｈｒｏｄｅｒら、１９８７．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　５２７）　。もうひとつ のサイトカインであるインターロイキン１　（ＩＬ−１）もまたウサギの目の前 房モデルにおいて血管形成特性を示し、炎症性応答ならびに白血球浸潤を開始す る（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ。

１９８９、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４：１５３． 　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）。

腫瘍誘導血管形成は悪性腫瘍組織をウサギ角膜中に置くことにより示すことがで き、そこでは血管増殖は輪部血管から始まり腫瘍異種片の方へ移動する。Ｃｈａ ｋｒａｖａｒ　ｔ　ｉおよびＭａｉｔｒａはこのモデルにおいて、活性化された リンパ球を含有する腸間膜リンパ節の一片を腫瘍移植片とともに置くことにより 血管増殖を阻害できることを見い出した（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔ　ｉおよびＭａ ｉｔｒａ、　１９８３゜Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　３９：　５４２）。Ｔ細胞の 天然の産生物であるオンコスタチンＭがこの研究で観察された阻害に関与してい る可能性がある。

２．４．内皮細胞におけるインターロイキン６の発現および免疫応答および血管 形成との関連 インターロイキン６　（ＩＬ−６）は９年以上も前に同定されたが、その機能的 多様性はやつと最近になって評価されている。ＩＬ−６は細胞増殖、造血および 免疫系の発達、および感染および創傷に対する宿主の応答を調節するサイトカイ ンネットワークにおいて突出した位地を占める（Ｓｅｈｇａｌら、１９８７．５ ｃｉｅｎｃｅ　２３５：　７３１）。例えば、ＩＬ−６はＴおよびＢリンパ球の 増殖および分化を促進できる（Ｇａｒｍａｎら、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、、８４：　７６９；　Ｔａｋａｉら、　１９８８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１４０：５０８）。さらに、ＩＬ−６はヒト内皮細胞の増殖を阻害すること が報告されており（Ｍａｙら、１９８９．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　１５９：　９９１）そしてそれにより血管形成過程に 拮抗することが予想されよう。

３３発明の要約 内皮細胞の免疫原性、繊維素溶解活性、増殖およびサイトカイン合成を制御する オンコスタチンＭの使用を記載する。天然源から精製されたオンコスタチンＭ、 組換えオンコスタチンＭまたは化学的合成法により調製されたオンコスタチンＭ が使用できる。本発明は、インビトロアッセイを使用し、いくつかの種類の細胞 におよぼすオンコスタチンＭの種々の作用を測定する実施例によって記載される 。

本発明をそれが包含する治療上の効用の種々の分野に従って説明するために小分 割する。第１に本発明は内皮組織免疫原性、すなわち同種移植臓器の拒絶および ある種の自己免疫疾患の進行に関与する第１のエレメントを軽減するためのオン コスタチンＭの使用に関する。本発明のこの観点については、インビトロでヒト 内皮細胞表面上のＭＭＣ抗原の発現を阻害するオンコスタチンＭの能力が示され る実施例により説明する。

オンコスタチンＭはＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αにより刺激されたクラス■およ びクラスＭ　ＨＬＡ抗原の発現に実質的に拮抗でき、そして内皮細胞におよぼす 作用に特異性があると思われる。第２に、本発明は血管系の正常な機能を維持す るのに生命線的事象である血管内皮の繊維素溶解表現型を誘導および／または維 持するためのオンコスタチンＭの使用に関する。本発明のこの観点については、 血管内細胞プラスミノーゲンアクチベーター活性を刺激して、生物活性プラスミ ンのレベルを増大させるオンコスタチンＭの能力が示される実施例により説明す る。出願人らは、オンコスタチンＭが活性プラスミノーゲンアクチベーター分子 の発現を特異的に誘導しそして／またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒ ビターの発現および／または機能を阻害することを示す。第三に、本発明は癌を 包含する生命をおびやかす多くの疾患の病理における頚著な構成要素である、血 管形成の過程を阻害するためのオンコスタチンＭの使用に関する。本発明のこの 観点については、血管形成性因子による細胞分裂促進性刺激に応答した内皮細胞 増殖を阻害するオンコスタチンＭの能力が示される実施例により説明する。第四 に、本発明は内皮細胞における多面型サイトカインであるインターロイキン６の 合成を誘導するためのオンコスタチンＭの使用に関する。本発明のこの観点につ いては、オンコスタチンＭで処理したヒト内皮細胞中のＩＬ−６ｍＲＮＡおよび タンパク質の増幅が記載される実施例により説明する。内皮細胞形態、白血球付 着および白血球の化学定性におよぼすオンコスタチンＭの作用もまた記載する。

４、図面の説明 第１図、　ＩＦＮ−γにより誘導された内皮細胞ＨＬＡ抗原発現におよぼすオン コスタチンＭおよびＴＧＦ−βの相乗的阻害作用。オンコスタチンＭ（）；ＴＧ Ｆ−β（）；オンコスタチンＭ　＋　ＴＧＦ−β（）。Ａ：クラスＩＨＬＡ抗原 発現におよぼす作用。Ｂ：クラスＩＩ　ＨＬＡ−ＤＲ抗原発現におよぼす作用。

第２図、Ｉ（ＵＶＥＣ上のオンコスタチンＭレセプター結合：飽和曲線、スカッ チャードブロットおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフ（差し込み図）。

データは下記６．２．４項記載のようにして得られ、まとめられた。

第３図、内皮細胞に対するＰＡ活性の誘導に関するオンコスタチン間作用の特異 性。ＢＡＥＣを１０ｎＭ組換えオンコスタチンＭ　（Ｍａｌｉｋら、１９８９． 　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、。

印刷中）９組換えＴＮＦ−ａ　（ＡｍＧｅｎ）および組換えＴＧＦ−β（Ｇｅｎ ｔｒｙら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、７：　３４１８−３ ４２７）で７２時間処理した。細胞関連ＰＡ活性は下記７．１．２項記載のよう にして測定した。

第４図、内皮細胞ＰＡ活性のオンコスタチンＭ刺激に関する有効薬量範囲。ＢＡ ＥＣを種々の濃度の（Ａ）天然型オンコスタチンＭ　（Ｚａｒｌｉｎｇら、１９ ８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｃ！、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　３８：　９７３９−９７４３）および（Ｂ） 組換えオンコスタチンＭで処理した。細胞関連活性は下記７．１゜２項記載のよ うにして測定した。

第５図、オンコスタチンＭレセプター結合飽和曲線。

ＢＡＥＣに結合したオンコスタチンＭの量を、用いた量に対してプロットし、Ｂ ＡＥＣ上のオンコスタチンＭレセプターの飽和可能性質を示す。結合条件は下記 ７．１．３項に記載されるとおりである。

第６図、ＢＡＥＣオンコスタチンＭレセプター結合データのスカッチャードブロ ット。結合条件は下記７．１．３項記載のとおりである。プロットは下記７．２ ．２項記載のようにして分析した。

第７図、オンコスタチンＭによる内皮細胞増殖の阻害。ＢＡＥＣｓを１０％ＦＢ Ｓ　（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補添した最少必須培地、ＭＥＭ／Ｆ−１０（１：　１ ）を有する２４ウ工ル組織培養プレートで集密となるまで培養した。血清含有培 地を取り除き、単層をダルベツコのＰＢＳで２回洗浄しそして新鮮な無血清ＭＥ Ｍ／Ｆ−１０でとりかえた。三通りずつのウェルを種々の投与量のオンコスタチ ン間単独（・）または５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと組み合せて（０）処理した。３ ７℃で３日間インキュベーションしたのち細胞数を血球計による計測により測定 した。オンコスタチンＭの濃度が０での細胞数の相異はｂＦＧＦに対するこれら の細胞の細胞分裂応答を示す。

第８図、オンコスタチンＭによるウシ大動脈内皮細胞増殖の阻害。オンコスタチ ンＭの増殖阻害作用は下記８．１項記載のようにして定量された。オンコスタチ ン間処理から生じた細胞数の減少は増殖阻害％としてプロットされる（〔未処理 細胞の数／ウェルー処理細胞の数／ウェル〕を未処理細胞の数／ウェルで割った ものＸ　１００）。

第９図、下記８．１項記載のＤＮＡ合成アッセイの阻害により測定された、ウシ 胎児心臓内皮細胞のｂＦＧＦにより誘導された増殖の阻害。とり込まれた放射能 のオンコスタチン間処理による低下は増殖阻害％としてプロットされる（〔未処 理細胞のＣＰＭ−処理細胞のＣＰＭ）を未処理細胞のＣＰＭで割算したちのＸ１ ００）。

第１０図、　ＢＡＥＣにおよぼすオンコスタチンＭの形態学的作用を示すもので ある、未処理ＢＡＢＣ（Ａ図）およびオンコスタチンＭで処理してＢＡＥＣ（Ｂ 図）の顕微鏡写真。４００ｐＭオンコスタチンＭに４８時間さらした後、細胞単 層の形態学的変化を検査した。顕微鏡写真は２５０×倍率にて撮影した。

第１１図、オンコスタチン間処理によるウシ大動脈内皮細胞への白血球付着の刺 激。細胞は下記９．２項記載のようにして処理した。リンパ芽球結合は５ケ所の 無作為に選んだ高倍率視野で観察される細胞数を平均することにより定量した。

黒塗りの棒グラフは未処理細胞へのリンパ芽球の付着を示し、交叉線の入った棒 グラフはオンコスタチン間処理細胞への付着を示す。

第１２図、刺激されたヒト調帯静脈内皮細胞からのＩＬ−６の時間依存性放出。

集密培養物をｌｏｏｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭで処理したもの（）および処 理してないもの（）。馴化培地の三組の２００μ１分量を指示された時間間隔で 取り出し、ＩＬ−６の濃度を下記１０．１゜３項記載のようにしてＥＬＩＳＡに より測定した（ｎｇ／ｍｌにより表す）。これらのアッセイにおける標準誤差は ２％であった。

第１３図、刺激されたヒト屓帯靜脈内皮細胞からのＩＬ＝６の用量依存性放出。

集密培養物を種々の用量の組換えオンコスタチンＭで７２時間処理した。馴化培 地の三組の２００μ！分量を取り出し、ＩＬ−６の濃度をＥＬＩＳＡにより測定 した。ｎｇ単位で放出されたＩＬ−６の量を１０６細胞に対して標準化した。

第１４図、刺激を受けたヒト調帯静脈内皮細胞中のＩＬ−６ｍＲＮＡ転写物の発 現。細胞を１１００ｎ／ｍｌの組換えオンコスタチンＭに６時間さらした。次に ５ｎｇの全細胞ＲＮＡを下記１０．１．４項記載のようにしてノーザンプロット により分析した。レーンｌ：陽性対照ＲＮＡ　、レーン２：未処理ＨＵＶＥｃ　 ＲＮＡ　；　レーン３　：　ｔンコスタチンＭ処理ＨＵＶＥＣＲＮＡ。

５、発明の詳細な説明 本発明は内皮細胞の増殖およびエフェクター機能を制御する方法、およびオンコ スタチンＭを用いるヒト血管性、免疫性および細胞増殖障害の治療法に関する。

本発明は一部はオンコスタチンＭか内皮細胞に対する種々の生物学的作用を媒介 するという発見に基づいている。本発明を、哺乳動物細胞のおよぼすオンコスタ チンＭの種々の生物学的作用をインビトロアッセイ系を用いて測定する実施例に より記載する。ここに明らかにされ記載されているオンコスタチンＭにより媒介 される生物学的作用の臨床上の意味はヒト血管医学、免疫学および癌に関するオ ンコスタチンＭの広範囲な治療上の用途を包含でき、ここに詳細に記載または示 唆されていないすべてのかかる用途は本発明の範囲内にある。

ヒト腫瘍細胞系におよほすその阻害作用に関し初めに同定されたオンコスタチン Ｍはホルボール１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）誘導ヒト組織法リン パ腫細胞（Ｚａｒｌｉｎｇら、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３：　９７３９−９７４３）および活性化Ｔリンパ球（Ｂｒ ｏｗｎら、１９８７、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９：　２９７７−２９８３ ）から初めて単離された。その分子はＭｒ＝　２８．０００の単一のポリペプチ ド鎖からなる熱および酸に安定なタンパク質である。天然に存在する他の増殖調 節因子と同様に、オンコスタチンＭは種々の生物学的活性を示す。増殖阻害はい くつかの、しかし全てではないヒト腫瘍細胞系で観察される。それとは対照的に ヒト包皮繊維芽細胞またはＷＩ−３８細胞のようないくつかの正常な繊維芽細胞 の増殖はオンコスタチンＭにさらすことにより刺激される（Ｚａｒｌｉｎｇら、 １９８６．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８３：９７３ ９−９７４３）オンコスタチンＭの遺伝子はクローン化および配列決定されてお り、そして組換えオンコスタチンＭの活性形態が哺乳動物細胞中で最近発現され ている（係属中の米国出願第１４４．５７４号、１９８８年１月１５日出願、そ の全体がここに参考としてとり込まれる。）。

シグナルペプチドの切断ののち成熟形態物は２２８アミノ酸を含有する糖タンパ ク質であり、そのうち５個はシスティン残基である。このタンパク質は極度に親 水性の高いカルボキシ末端ドメインを有する。オンコスタチンＭは他の既知サイ トカインと構造的に関連しないが、そのｍＲＮＡはその３゛未翻訳末端にＡＬＩ に富んだ領域を含有する。オンコスタチン間メツセージにおけるこの領域は多く のサイトカイン、リンフ才力インおよび他の成長調節分子と相同であり、このこ とは遺伝子発現を調節する共通の様式を示唆している。オンコスタチンＭの細胞 レセプターが種々の哺乳動物細胞で見出されている。主要なオンコスタチンＭレ セプター分子はＭｒ　＝　１５０．０００−１６０．０００を育する特異的なタ ンパク質である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６４：　６５２８−６５３２）。

本発明に従い、オンコスタチンＭは生物活性オンコスタチンＭを合成する種々の 細胞源、例えば天然にオンコスタチンＭを生成する細胞および才ンコスタチンＭ の合成および／または分泌を指示できる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクショ ンされた細胞から当業上よく知られた技術により得ることができる。別法として 、オンコスタチンＭは固相ペプチド合成を包含するが、それに限定されない化学 的合成方法により合成できる。

オンコスタチンＭの製法は、１９８８年１月１５日出願の係属中の米国出願第１ ４４．５７４号（これは１９８７年５月４日出願の米国出願第０４６．８４６号 の一部継続出願であり、そしてこの後者は１９８６年１１月２６日出願の米国出 願第９３５、２８３号の一部継続出願であり、そしてこの後者は１９８５年１２ 月２０日出願の米国出願第８１１．２３５号の一部継続出願である。）に記載さ れている。これら文献のそれぞれはその全体がここに参考としてとり込まれる。

本発明方法の実施においては、任意の方法により得られたオンコスタチンＭの使 用、ならびに所望の活性を保持する修飾されるかまたは先端切断されたオンコス タチン分子およびオンコスタチン間類似体の使用が本発明の範囲内にある。この 点に関して、オンコスタチンＭの第一次構造における変化ならびにさらに上のレ ベルの構造機構における変化、アミノ酸残基を結合する共有結合の種類、および ／またはオンコスタチンＭの末端基への基の付加は本発明の範囲内である。例え ば、本発明に従い使用されるオンコスタチン間分子は、例えば欠失、付加および 置換を包含する分子の機能性を保存するサイレント変化を生ずるものである、ア ミノ酸配列における保存的または非保存的変化を包含しうる。かかる変化したオ ンコスタチン間分子は、その使用にある種の利点が得られる場合に望ましくあろ う。ここに用いられている保存的置換はオンコスタチンＭの配列内の１個または それ以上のアミノ酸を同様の極性および疎水性／親水性の特徴を有し、機能的に 等価の分子を生じる他のアミノ酸と置換することを必要としよう。かかる保存的 置換には下記の群のアミノ酸内での置換が包含されるがそれらに限定されない。

すなわちグリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン 酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、 アルギニン：フェニルアラニン、チロシン：およびメチオニン、ノルロイシン。

本発明のもうひとつの実施態様においては、オンコスタチンＭを担体分子と結合 できる。例えばオンコスタチンＭは内皮細胞または特定の抗原を発現する細胞に オンコスタチンＭの標的輸送を可能にする何らか他の細胞表面抗原に対して特異 的である抗体分子に共有結合されよう。同様に、オンコスタチンＭは他の“標的 ねらい”分子例えばホルモン、成長因子、サイトカイン等に結合されつる。この 方法においては、オンコスタチン間分子は使用目的に関して選択された特定のオ ンコスタチン間分子のレセプターを発現しないかも知れない細胞により取り込ま れるように変化させることができよう。かかる結合法は当業上よく知られており 、そして例えば交叉結合剤、シッフ塩基形成、アミド結合、ペプチド結合、スル フイツト結合等の使用が包含される。

記載を容易にするために、本発明はその主要な側面に関して広く分類することが できる。詳細には（１）免疫性をモジュレートし、（２）プラスミノーゲンアク チベーターおよび繊維素溶解活性を増強し、そして（３）血管形成を制御するた めのオンコスタチンＭの使用。これらの分類は記載目的のためにのみなされたも のであって決して明細書または添付の請求の範囲の範囲を限定または制限するも のではない。

５．１．免疫モジュレータ−としてのオンコスタチンＭ本発明のひとつの側面は ヒト自己免疫および同種免疫疾患の治療における免疫モジュレータ−としてのオ ンコスタチンＭの使用に関する。この点に関して出願人らは、６項およびそれ以 下に記載されるような一連の実験を通して、オンコスタチンＭかインビトロでヒ ト内皮細胞の表面上におけるクラスエおよびＩＩ　ＨＬＡ抗原の発現を阻害しう ることを発見した。したがって、オンコスタチンＭはヘルパーおよび／またはエ フェクターＴＩ、ｌンパ球に対する内皮組織の免疫原性を低下させることに使用 できよう。

５　、１．１．臓器移植におけるオンコスタチンＭの使用クラス１分子は細胞障 害性Ｔリンパ球の最初の標的と思われるので、クラス１発現の低下は強い第２次 応答の開始を予防または阻害することが予測されよう。

恐らくさらに重要なことには、内皮細胞上におけるクラス■発現を阻害すること は抗原特異的なガンマインターフェロン分泌性ヘルパーＴリンパ球の漸増を阻止 でき、従って免疫応答の進展を妨害できるであろう。

本発明の特別の実施態様においては、好適な薬理学的担体中に製剤化されたオン コスタチンＭの有効量を含有する化合物は、ＨＬＡ抗原の発現および移植の拒絶 を阻害または予防するために、局所的または全身的注射を包含するがそれらに限 定されない任意の適切な経路により腎臓、心臓および肺移植受容者のような臓器 移植受容者に投与されつる。さらに、オンコスタチンＭはインビボでの投与に先 だち担体または標的ねらい分子に結合させおよび／またはリポソーム、マイクロ カプセルおよび放出制御調製物中にとり込むことができる。下記の６項に記載さ れるもののような一連の実験を通して、クラスＩおよびｎ　ＭＨＣ抗原の内皮細 胞発現、特にガンマインタフェロンおよび腫瘍壊死因子−アルファ刺激による発 現力用−５０ｎｇ／ｍｌ濃度のオンコスタチンＭにより特異的に拮抗されること を出願人らは測定している。例えば５ｎｇ／ｍｌの濃度でオンコスタチンＭはｒ ＦＮ−γ刺激によるクラス■抗原の発現を５１％そしてＴＮＦ−α刺激による発 現を卓越して１４１％阻害した。

ＩＦＮ−γによるクラス■抗原の発現誘導は８４％も阻害された。ＴＧＦ−βの ような相乗的サイトカインと組み合せて使用すると、低濃度のオンコスタチンＭ で強い阻害作用を生ずるのに有効であった。さらに、出願人らの研究データはオ ンコスタチンＭが単球／マクロファージ系統の細胞のクラスＩまたはクラスＩＩ 　ＨＬＡ抗原発現を阻害できないことを示唆している。したがってオンコスタチ ンＭの使用はシクロスポリンＡのよりよい代替物を提供しうる。同種移植移植術 に使用される現在主要な免疫抑制剤であるシクロスポリンへの広範な作用は一般 的にＴリンパ球増殖の阻害から生じる。オンコスタチンＭはＴ細胞増殖に対し同 様の作用を及ぼさない。

本発明のこの側面によれば、オンコスタチンＭはドナー臓器を移植レシピエンド か受け入れる可能性を高めるために、単独でまたは１種またはそれ以上の他のサ イトカイン、成長因子、またはＴＧＦ−β、シクロスポリンＡおよびフルチコス テロイドを包含するがそれらに限定されない免疫抑制剤と組み合せて使用するこ とができる。出願人らは、この点においてＴＧＦ−βがオンコスタチンＭと相乗 的に作用して、ＩＦＮ−γの刺激による内皮細胞上のＨＬＡ抗原の発現を強く阻 害することを観察している。はんの５０１）ｇｎａｒｌのオンコスタチンＭを０ 、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βと組み合せると、クラス■抗原発現が５０％近く低 下して（下記６．２．２項）。さらに、ＩＦＮ−γ刺激によるクラス■抗原の発 現は０．５ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭおよび１　ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの 組み合せにより８０％阻害された。

５　、１．２．内皮細胞からのサイトカインの合成および分泌を誘導させるため のオンコスタチンＭの使用 出願人らはオンコスタチンＭが内皮細胞に少なくともインターロイキン６および ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む生物活性サイトカインを合成し分泌するように誘導できるこ とを判定している。ヒト内皮細胞からのインターロイキン６の合成および分泌に およぼすオンコスタチンＭの作用は時間および用量の両方に依存する。下記の１ ０項にさらに十分に記載されるように、オンコスタチンＭで処理した培養ヒト澗 帯静脈内皮細胞は生物活性インターロイキン６　（ＩＬ−６）の分泌レベルを増 大させることで速やかに応答する。さらに出願人らは、オンコスタチンＭで処理 した内皮細胞がＩＬ−６特異的ｍＲＮＡレベルの増大を示すので、上記作用は転 写レベルで誘導されると判定している。したがって、ＩＬ−６の産生増大が所望 される場合、オンコスタチンＭはヒト内皮細胞に対してＩＬ−６誘導剤として使 用できる。ＩＬ−６の合成および分泌は循環系にオンコスタチンＭを導入するこ とにより全身的に誘導できるしまたは局所投与、注射またはオンコスタチンＭと 直接結合した標的特異的化合物の使用を包含するがそれらに限定されない画業上 知られた方法を用いて特定の組織を標的とすることができる。

５．２．血管内皮に繊維素溶解表現型を誘導するためのオンコスタチンＭの使用 本発明のもうひとつの側面は、内皮の構成的アンチトロンボゲン性表現型と誘導 可能な凝血促進性表現型の間の均衡をアンチトロンボゲン表現型に有利になるよ うにシフトおよび／または維持するためのオンコスタチンＭの使用に関する。下 記の７項で記載される結果は、オンコスタチンＭがインビトロで内皮細胞のＰＡ 活性の発現を劇的にしかも特異的に刺激して、生物活性プラスミンレベルの上昇 を生じることを示す。これらの所見は、オンコスタチンＭが内皮細胞媒介繊維素 溶解の誘導を高めるのに有用であろうことを示唆する。

（本頁以下余白） 内皮細胞が一般に血栓形成を阻害すること、およびこの作用は４種の異なる経路 （そのうちのひとつは繊維素溶解である）により媒介されることは知られている 。内皮細胞はプラスミノーゲンアクチベーターの放出を通じて繊維素溶解に能動 的に関与する。従ってオンコスタチンＭは血栓性心臓血管疾患の治療に有用であ ろう。例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、またはｔ−ＰＡで治療して いる急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者は血栓再発の可能性を低下させるためにオンコ スタチンＭで同時および／または継続的治療により恩恵を受けつる。また内皮表 面をより繊維素溶解性表現型の方にシフトさせるオンコスタチンＭの能力は深部 静脈血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓塞栓症、溶血性尿毒症症候群および血栓性 血小板減少性紫斑病のような種々の他の播種性血管向凝固（ＤＩＣ）症候群の治 療に有用でありうる。好適な薬理学的担体中に製剤化されたオンコスタチンＭの 有効量を注射、注入および選択性カテーテル法を包含するがそれらに限定されな い任意の適切な経路によりインビボ投与できる。さらに、オンコスタチンＭをイ ンビボでの投与に先立ち担体または標的ねらい分子に結合させ、および／または リポソーム、マイクロカプセルおよび放出制御製剤中にとり込むことかできる。

オンコスタチン組成物がＰＡを刺激して繊維素溶解または他の重要なＰＡ活性焦 点を生ずる能力は、ここの７項およびそれ以下に記載されるＰＡ活性アッセイの ようなインビトロアッセイ系を用いて容易に検査できる。

修飾されたオンコスタチン間分子またはオンコスタチン間類似体の機能的同等性 および／または効力増大も同様に評価できる。内皮細胞に及ぼすオンコスタチン 間化合物の作用を検査することに加えて、他の種類の細胞がオンコスタチンＭの ＰＡ活性誘導特性に対するそれらの応答性に関してアッセイできる。

５．３．血管形成を制御するためのオンコスタチンＭの使用 本発明のさらにもうひとつの側面は癌を包含するがそれに限定されない病的血管 形成状況における、新車管形成を阻害するためのオンコスタチンＭの使用に関す る。出願人らはオンコスタチン間化合物が下記８項に記載されるそれらのような 、オンコスタチンＭか増殖性刺激（すなわちｂＦＧＦ）に対する内皮細胞の応答 を阻止することを示すものであるインビトロ研究の結果に基づき、かかる条件下 において新車管形成を強力に阻害しうると考える。さらに、血管形成を阻害する 他のサイトカインとは異なり、オンコスタチンＭは単球−マクロファージ（下記 ９項）に対する化学走性はなく、したがって白血球漸増に及ぼす二次的作用を介 してインビボで血管形成を開始することはなさそうである。

オンコスタチンＭはカボジ肉腫（ＫＳ）の治療に有用でありうる。ＫＳは内皮細 胞に由来すると思われ（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔ ｈｏｌ、　３９：　７４２；　Ｍａｃｈｅｒ、１９８８゜Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａ ｌｔｈ　Ｒｅｐｏｒｔ　１０３：　２４６）、したがってオンコスタチンＭの抗 増殖作用を受けやすい。同様に、オンコスタチンＭはまた、例えば糖尿病性網膜 症、緑内障、血管腫および種々の癌を包含する血管形成に関連した多くの他の疾 患の治療にも有用でありうる。本発明の詳細な実施態様においては、好適な薬理 学的担体中に製剤化された有効量のオンコスタチンＭを含有する化合物は、疾患 の新車管形成および進行を阻害するために注射、局所投与を包含するがそれらに 限定されない任意の適切な経路により、血管形成に関連した疾患を患う患者に投 与できる。さらに、インビボ投与に先だちオンコスタチンＭを担体または標的ね らい分子と結合させおよび／またはりポソーブ、マイクロカプセルおよび放出制 御調製物中にとり込むことかできる。新車管形成を阻害するオンコスタチン間組 成物の能力はここの８項およびそれ以下に記載される増殖阻害および化学走性ア ッセイのようなインビトロアッセイ系を用いて評価できる。修飾されたオンコス タチン間分子またはオンコスタチン間類似体の機能的同等性および／または効力 増大も同様に評価できる。

６、実施例：インビトロでのオンコスタチンＭによる内皮細胞ＨＬＡ抗原発現の モジュレーション 以下に記載されるインビトロ実験は、特に、オンコスタチンＭが単球−マクロフ ァージではなくヒト内皮細胞上のサイトカイン刺激によるクラスエおよびクラス ＩＩ　ＨＬＡ抗原の発現を阻害すること、およびＴＧＦ−βがオンコスタチンＭ と相乗作用してこの阻害作用を生ずることを示す。

６．１．材料および方法 ６　、１．１．内皮細胞培養物 ヒト調帯静脈内皮細胞（ＨＬＩＶＥＣ）を記載（Ｗａｌｌら、１９７８゜Ｊ、　 Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９６：　２０３）されているようにして慣帯静 脈から単離した。細胞はコラ−ゲナーゼとともに継代培養しそしてゼチラン塗布 したプラスチック容器で、５０μｇ／ｒＩＬｌヘパリンおよび組換えＥＣＧ５　 （Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）で置換したＣ５−１限定無血清培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓ ｔｅｍｓ、　Ｋｉｒ−ｋｌａｎｄ、　ＷＡ）中で集密となるまで増殖させた。細 胞には実験の少なくとも１２時間前には新しい未補添培地を与えた。

６．１．２．免疫染色 いくつかのフルオレセイン標識モノクローナル抗体（ＭＡｂ）をクラスＩおよび クラスＩＩ　ＨＬＡ抗原の検出に使用した。すなわちＨＩＤＥ　（Ｇｌａｄｓｔ ｏｎｅら、ＨｉＳｔＯＣＯｍｐａｔａ−ｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ、　４２ ９．　Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｅｄ、、　１９８４）をクラスＩ　ＨＬＡ抗原の検出に 使用した。ＤＲ特異的抗体、　ＶＣｌ２（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅら、１９８２．　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９：　１２３５）をク ラスＩＩ　Ｈｌ、Ａ−ＤＲ抗原の検出に使用した；抗体３３．１をＨＬＡ−ＤＱ 抗原の検出に使用し、それはＧ、Ｍａｒｔｉ（Ｍａｒｔｉら、１９８３．　Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５８：　１９２４−１９８３）により提供された；　 ＨＢＩＯａをクラスＩＩ　Ｈｌ、Ａ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ抗原の検出に使用 し、それは叶、　Ｅ、　Ｃ１ａｒｋ（ＲｅｇｉｏｎａｌＰｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ａｔ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ。

５ｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ）により提供された。

６　、１．３．定量的抗原アッセイ 細胞表面ＨＬＡ抗原の発現は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）分析（Ｂａｓ ｈａｍおよびＭｅｒｉｇａｎ、　１９８３．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３０：　１４９２）を改変し実質的には記載（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅら、１９８ ２、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：　１２ ３５−３９）のようにして測定した。要約すると、試料当り５Ｘ１０’細胞を免 疫染色しそしてＨＬＡ抗原発現をＦＡＣＳアナライザーを使用して間接的免疫蛍 光により定量した。ＭＡｂを各段階で４５分間インキュベートした。試料集団を 平均チャンネル蛍光により４０対数法で比較し、そして適当な場合は直線状蛍光 相当価を換算により得た。

６．１．４．サイトカイン 組換えオンコスタチンＭを記載（Ｍａｌｉｋら、１９８９゜Ｍｏ１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）のように調製し、組換えＴＧＦ−βをＧ ｅｎｔｒｙら、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：　３４１ ８）記載のように調製し、組換えＩＰＮ−γおよびＴＮＦ−αをＡｍｇｅｎ　Ｉ ｎｃ、より購入した。天然型オンコスタチンＭは（Ｚａｒｌｉｎｇ　ら、１９８ ６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ３８：　９７３ ７）に記載されるようにして調製した。

６．１．５．オンコスタチン間レセプターアッセイ高度に精製されたヒト組換え オンコスタチンＭをｌ０Ｄｏ−ＧＥＮ法により（Ｆｒａｋｅｒおよび５ｐｅｃｋ 、　１９７８．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　８０：　８４９）比活性５２μＣｉ ／　ｉｔ　ｇとなるまで放射性標識した。ラジオレセプターアッセイを２４ウ工 ル組織培養プレー）（１０’細胞／ウエル）で増殖させＨＵＶＥＣの集密単層に ついてｉｎ　５ｉｔｕで二通りで行った。単層を結合緩衝液（ダルベツコＭＥＭ ＋０．１％ウシ血清アルブミン＋１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）ではじめに２回洗浄し 、次に１　ｎｇ／−の放射性標識オンコスタチンＭおよび種々の量の未標識オン コスタチンＭを含有する結合緩衝液２５０μｌを単層に加えた。細胞を定常状態 結合を維持するために２３°Ｃで３時間インキュベートした（Ｌｉｎｓｌｅｙら 、１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：　４２８２）　。インキュ ベーション期間に続いて、細胞を冷結合緩衝液で洗浄しそしてｌＮＮａＯＨ中で 可溶化した。放射能をガンマ分光光度計で検出しそしてデータをスカッチャード の方法（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、　１９４９．　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。

５１：　６６０）によりプロットした。非特異的結合は４００倍モル過剰の未標 識オンコスタチンＭの存在下に測定した。

６．２．結果 ６．２．１．オンコスタチンＭはヒト内皮細胞上のサイトカイン刺激によるＨＬ Ａ抗原発現を阻害する他のサイトカインによるＨＵＶＥＣＭＨＣ抗原発現の調節 をモジュレートするオンコスタチンＭの能力を上記材料および方法で記載される 間接免疫蛍光およびＦＡＣＳ定量により評価した。第１表は種々のサイトカイン のＨＵＶＥＣＨＬＡ抗原発現におよぼす作用を示す。１００Ｕ／ｍｌの濃度で、 ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両者はクラスＩ抗原の発現に有意に影響を与え、 発現をそれぞれ５倍および２倍増幅した。さらに、ＩＦＮ−γはクラス■抗原発 現を６倍以上増幅した。それとは対照的に、ＴＧＦ−βもオンコスタチンＭもク ラスＩまたはクラス■発現を増幅できなかった。

（本頁以下余白） Ｈ［ＪＶＥＣＨＬＡ抗原の発現におよぼす種々のサイトカインの作用 （対照／ＩｇＧ）　（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）　（ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ）ＩＦＮ− Ｇ、１０００／ｍｌ　２．４　２００　１８．６ＴＮＦ−ａ、１００Ｕ／ｍｌ　 ２．６　９１　３．７ＴＧＦ−β、５０ｎｇ／ｍｌ　２．４　３７　２．７オン ：ＩＭ、　５０ｎｇ／ｍｌ　２．４　２９　３．１１値は直線状蛍光相当価で表 す 第■表はサイトカイン誘導によるクラスＩおよびクラス■抗原の発現におよほす 種々の濃度のオンコスタチンＭの作用を示す。オンコスタチンＭはＩＦＮ−γお よびＴＮＦ−α刺激によるＨＬＡ抗原の発現に用量依存様式で拮抗した。５ｎｇ ／ｍｌの濃度でオンコスタチンＭはＩＦＮ−γ刺激によるクラスＩ　ＨＬＡ−Ａ 、　Ｂ、　Ｃ抗原発現を５１％そしてＴＮＦ−α刺激による発現を１４１％阻害 した。ＩＦＮ−γによるクラスＩＩ　ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ抗原の誘 導は、５０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭて、それぞれ８４％および７２％阻害 された。これらの結果は、オンコスタチンＭがインビボて内皮細胞の免疫原性を ダウンモジュレートするのに有用でありうることを強く示している。

サイトカイン誘導ＨＬＡ抗原の発現におよぼすオンコスタチンＭの作用 ＪＰＮ−ｇ、１００［Ｊ／ｍｌ　１１３　２１　３＋オン：１Ｍ、０．０５ｎｇ ／ｍｌ　１１９　１９　−＋オン：＋Ｍ、０．５ｎｇ／ｍｌ　８０　１１　−＋ オンコＭ、５．Ｏｎｇ／ｍｌ　１７　７　−十オン：＋Ｍ、５０．Ｏｎｇ／ｍｌ 　−５８な　し　７１ ＴＮＦ−ａ、１００ＬＩ／ｍｌ　１２５十オン：＋Ｍ、０．０５ｎｇ／ｍｌ　１ ２５十オンコＭ、０．５ｎｇ／ｍｌ　７６ 十オンコＭ、５．Ｏｎｇ／ｍｌ　４９ １値は直線状蛍光相当価で表す ６　、２．２．オンコスタチンＭおよびＴＧＦ−βの相乗作用ＩＦＮ−γ処理内 皮細胞におよぼすオンコスタチンＭ、ＴＧＦ−β、およびオンコスタチンＭ／Ｔ ＧＦ−βの作用を、ＴＧＦ−βおよびオンコスタチン間間に相乗作用が存在する か否かを決定するために評価し比較した。これらの実験の結果を第１図に示す。

ＴＧＦ−β単独ではＩＦＮ−γ刺激によるクラスＩ　ＨＬＡ−Ａ、　Ｂ、　Ｃま たはクラスＩＩ　ＨＬＡ−ＤＲ抗原のいずれかの発現の阻害に関しても弱い能力 しか示さない。しかしながら、最適量以下のオンコスタチンＭはＴＣＰ−βと組 み合わせた場合クラスＩおよびクラス■抗原の発現の相乗的拮抗を生じた。例え ば、５０ｐｇ／ｍｌのオンコスタチンＭおよび０．５　ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β の組合せはクラスＩ抗原発現の４９％阻害を生ずるが、一方同じ濃度のオンコス タチンＭまたはＴＧＦ−βで別々に処理してもそれぞれ７％および１５％阻害し か生じなかった（第１Ａ図）。同様に、０．５　ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ およびｌｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの組み合せはクラスＩＩ　ＨＬＡ−ＤＲ発現の ８０％阻害を生じたが、これらの濃度で別個に処理しても１３％（オンコスタチ ンＭ）および２６％（ＴＧＦ−β）の阻害しか生じなかった（第１Ｂ図）。

したかって、クラスＩおよびクラス■抗原発現の両方の阻害に関しては、相乗効 果は推測される加算効果より約２倍大きいことが観察され、このことはＴＧＦ〜 βおよびオンコスタチンＭの両方を含有する組成物が特に育用であろうことを示 している。

６．２．３．　ＨＬＡ発現に及はすオンコスタチンＭ作用の組織特異性 ＨＬＡＬＡ抗原発現ぼすオンコスタチンＭの阻害作用が内皮細胞に特異的である か否かを調査するために、単球およびマクロファージ様細胞上のサイトカイン誘 導クラスＩＩ　ＭＨＣ抗原発現に対しオンコスタチンＭが拮抗する能力を測定し た。

ヒト単球をフィコールグラジェントを用いて血液から単離しそしてプラスチック 培養皿に付着させた。細胞を材料および方法の項に記載のようにしてクラス■抗 原についてアッセイした。細胞はクラスＩＩ　ＨＬＡ抗原の基準レベルを上昇さ せるために１００および２５０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで処理しそして平行培養物 も５ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭで処理した。３日間のインキュベーション後 、細胞をフルオレセイン標識抗体で染色し、そしＦＡＣ３定量により分析した。

結果はオンコスタチンＭがクラスｎ　ＨＬＡＬＡ抗原発現準レベルまたはサイト カイン誘導レベルのいずれにも全く作用しないことを示している。

もうひとつの実験においては、マウスマクロファージ様細胞系（Ｗｅｈｉ−３細 胞）におけるクラスＩＩ　ＭＨＣ抗原発現に及ぼす１−１０ｎｇ／ｍｌの組換え オンコスタチンＭの作用を同様に調査した。クラス■抗原発現はこれらの細胞に おいてＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αにより強く誘導される（ＣｈａｎｇおよびＬ ｅｅ、　１９６８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７：　２８５３）。同様に、 ヒト単球の場合、オンコスタチンＭはこれらの細胞におけるクラスＩ［１（ＬＡ 抗原発現の基準レベルにもサイトカイン誘導レベルにも全く作用を及ぼさなかっ た。

これらの結果はオンコスタチンＭが単球／マクロファージ系の細胞のクラスｎ　 ＨＬＡ抗原の発現を阻害できないことを示唆しているので、オンコスタチンＭは シクロスポリンＡ１コルチコステロイド、およびシクロホスファミドのような他 の化合物により誘導された広域免疫抑制作用に対して治療上より特異的な代替物 を提供できよう。

６．２．４．　ＨＵＶＥＣ上のオンコスタチン間レセプターの高レベル発現 ＨＵＶＥＣを２４ウ工ル組織培養皿で集密になるまで培養しそして上記６．１． ５項記載のようにしてラジオレセプターアッセイを行った。第２図はＨＬＩＶＥ ＣへのオンコスタチンＭの結合を飽和曲線およびスカッチャードプロット（挿入 図）に示す。結合は飽和可能であり、スカッチャードブロフトはＨＵＶＥＣ上の 少なくとも２種類の細胞表面結合部位の存在を示す曲線等混線（ｃｕｒｖｉ　Ｎ ｎｅａｒｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す（下記７．２２項で、同様の結果がウシ内皮 細胞で得られた）。２部位モデルにより分析すると、細胞当り全濃度３８０．０ ００オンコスタチンＭレセプター結合部位が計算され、これらは１．７００の高 親和性部位（Ｋｄ＝　５．６　ｐＭ）および３７８．３００の低親和性部位（Ｋ ｄ＝　８．５　ｎＭ）からなる。半最大レセプター占有は２ｎｇ／ｍｌ　（６７ ｐＭ）で起り、これはサイトカイン誘導ＨＬＡ抗原発現のオンコスタチンＭによ る阻害のＥＤＳ。と相関する（上記６．２．１項）。これらのヒト内皮細胞はウ シ内皮細胞より約１０倍多いオンコスタチン間レセプターを発現すると思われる （下記７．２．２項）。

ＨＬＩＶＥＣ上のオンコスタチン間レセプターを１２８１−オンコスタチンＭを そのレセプターに化学的に交差結合させそしてその複合体の構造的特性を記載（ Ｌｉｎｓｌｅｙら、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：　 ４２８２−４２８９）のようにしてポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する ことによりさらに特性決定した。第２図のオートラジオグラフに示されるように 、交差結合リガンド−レセプター複合体は還元条件下の６％５ＤＳ−ＰＡＧＥで 顕著な１８０、０００分子量のバンド（レーン３）として移動した。

結合期間中に４００倍モル過剰の未標識オンコスタチンＭを包含させると、この バンド（レーン４）と関連する放射能を特異的に競合し負かした。それゆえ、出 願人らはヒト内皮細胞上のオンコスタチン間レセプターはウシ内皮細胞上のオン コスタチン間レセプター、ならびに非内皮起源（レーン１および２）のヒト細胞 上のオンコスタチン間レセプターと構造および機能が類似していると結論する。

７、実施例ニオンコスタチンＭによる大動脈内皮細胞の繊維素溶解活性の誘導 以下に記載の実験はオンコスタチンＭがインビトロで内皮細胞関連繊維素溶解を 誘導することを示す。

７．１．材料および方法 ７．１．１．細胞培養 ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を記載（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　１９７８゜Ｉｎ 　Ｖｉｔｒｏ　４：　９６６−９８０）のようにして調製しそして以下のように 培養した。ＢＡＥＣを１０％ウシ胎児血清を補添した最少必須培地（ＭＥＭ／Ｆ −１０１：　１）を含有する２４ウ工ル組織培養プレー）（４Ｘ１０’細胞）中 で集密となるまで３７°Ｃで増殖させた。血清含有培地を取り除き、単層をダル ベツコの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２回洗いそして新鮮な無血清ＭＥＭ／Ｆ− １０で置きかえ、次に細胞をサイトカインで処理しそしてプラスミノーゲンアク チベーター活性についてアッセイした。プラスミノーゲンアクチベータ−（ＰＡ ）活性の測定は、９５％Ｃ０ｚ−空気雰囲気中３７°Ｃでサイトカインと７２時 間インキュベーション後に行った。細胞生存度はトリバンブルー色素排除により 測定して９８％以上であった。細胞数は血球計計測により測定した。

７．１’、２．プラスミノーゲンアクチベーター活性アッセイ プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）は、フィブリン分子を直接切断する作 用をする活性プロテアーゼであるプラスミンへのプラスミノーゲンの転換を触媒 する。下記アッセイではＰＡによる活性化の基質としてプラスミノーゲンを使用 しそしてその活性化は合成ペプチドに及ぼす生じた繊維素溶解活用を検出するこ とにより測定する。

ＢＡＥＣを種々のサイトカインで処理した後、馴化培地を取り出しそして以後分 析のために一７０℃にて保存した。単層をＰＢＳで２度洗浄しそして２一段階酵 素アッセイを用いて細胞関連ＰＡ活性を検査した（Ｓｅａｒｌｓ、　１９８０、 　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０７：　６４）　ｏ要約すると、二組 みのウェルを３００μｍの無血清培地中の飽和量のプラスミノーゲン基質と３７ °Ｃにて１時間インキュベートした。続いて同量の合成色原体ペプチド、Ｈ−Ｄ −ｖａｌ−１ｅｕ−Ｉｙｓ−ｐ−ＮＡ　（Ｋａｂｉ　Ｖｉｒｔｕｍ、　Ｓｗｅｄ ｅｎ）を２１０ｍＭリジン緩衝液ｐＨ８，９中１ｍｇ／ｍｌで加えそして細胞を さらに２時間までインキュベートした。合成ペプチドはプラスミンにより認識さ れ、切断されるフィブリン分子の配列を含有する。プラスミンによるタンパク分 解的切断によりペプチドからｐ−ニトロアニリンが放出され、これを分光光度計 により検出できる。したがって、アッセイは合成ペプチドのプラスミノーゲン依 存性溶解を測定することによりプラスミノーゲンアクチベーター活性の変化を測 定するよう設計されている。

酵素活性は遊離されたｐ−ニトロアニリンを分光光度計を用いて４０５１ｍで測 定することにより定量し、そして細胞試料と平行して行われた０、　０２５プラ ウ（Ｐｌｏｕｇｈ）単位の精製ｕＰＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）標準物と比較す ることにより検量した。光学濃度（ＯＤ）値を細胞数に対し標準化しそして１０ ’細胞当りの相対的ＰＡ活性として表わした。

ＢＡＥＣにより分泌されたＰＡ活性レベルを測定するためには、馴化培地を解凍 し、遠心により清澄化し、そして２００μｌ分量ずつを上記のようにして分析し た。

７　、１．３．オンコスタチン間レセプターアッセイ高度精製されたヒトオンコ スタチンＭをｌ０ＤＯ−ＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒおよび５ｐｅｃｋ、　１９７８ ．　ＢＢＲＣ８０：　８４９）により５２μＣｉ／μｇの比活性となるまで放射 性標識した。ラジオレセプターアッセイは二組の２４−ウェル組織培養プレー） （４’Ｘ１０’細胞／ウエル）で増殖させた集密単層ＢＡＥＣにｉｎ　５ｉｔＵ で行った。単層をはじめに結合緩衝液（ダルベツコのＭＥＭ＋０．１％ウシ血清 アルブミン＋１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）で２回洗浄し、そして次にｌｏｇ／ｍｌの 放射性標識オンコスタチンＭおよび種々の量の未標識オンコスタチンＭを含有す る２５０μｌの結合緩衝液を単層に加えた。細胞を定常状態結合を維持するため に２３°Ｃで３時間インキュベートした（Ｌｉｎｓｌｅｙ　ら、１９８９．　Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：　４２８２）。インキュベーション期間に続 いて、細胞を冷結合緩衝液で洗浄しそしてｌＮＮａＯＨ中に可溶化した。放射能 をガンマ分光光度計により検出しそしてデータをスカッチャード法（Ｓｃａｔｃ ｈａｒｄ、　１９４９、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　５１： 　６６０）によりブロー）トした。非特異的結合は４００倍モル過剰の未標識オ ンコスタチンＭの存在下に測定した。

７．２．結果 ７．２．１．オンコスタチンＭによるプラスミノーゲンアクチベーター活性の特 異的刺激 オンコスタチンＭが内皮細胞媒介繊維素溶解活性の調節に及ぼす作用を測定する ために、プラスミノーゲンの生物活性プラスミンへの変換を触媒しうるブラスミ ノーゲルアクチベーター（ＰＡ）の合成を誘導するオンコスタチンＭの能力を調 査した。生物活性プラスミンレベルの相当する増大を生ずるＰＡレベルの上昇は 、オンコスタチンＭ処理ＢＡＥＣ上ならびに処理細胞上清中で検出された。

第１表に示される結果は、オンコスタチンＭがＰＡ活性の発現を劇的にかつ特異 的に刺激することを示している。オンコスタチン間処理細胞から収集した馴化培 地は未処理細胞からの馴化培地より１２倍以上多いＰＡ活性を示した。さらに、 オンコスタチンＭは合成ペプチドを直接切断しつるプロテアーゼよりむしろプラ スミノーゲン依存性繊維素溶解活性を特異的に誘導した。

すなわちプラスミノーゲン基質を含有するオンコスタチン間処理細胞からの馴化 培地は、処理された馴化培地単独より７６倍多い活性を生じた。これらの結果は オンコスタチンＭが活性プラスミノーゲンアクチベーター分子の合成および／ま たは分泌を誘導し、および／またはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ ー（ＰＡＩ、１およびＰＡＩ２）の発現または機能を阻害することを示している 。

（本頁以下余白） オンコスタチンＭによるＰＡ活性の刺激試験試料　ＯＤ４゜。

新たなＭＥＭ／Ｆ−１０（７）み　０．００５新たなＭＥＭ／Ｆ−１０＋　Ｕ− ＰＡ　０．００４プラスミノーゲン単独　ｏ、　ｏｏ。

プラスミノーゲン＋ｕ−ＰＡ　Ｑ、　１８０未処理ＢＡＥＣ単独から（７）ＣＭ 　２０．００２未処理ＢＡＥＣ＋プラスミノーゲンからのＣＭ　０．０８０オン コスタチンＭ処理ＢＡＥＣ単独からのＣＭ　０．０１３オンコスタチンＭ処理Ｂ ＡＥＣ ＋プラスミノーゲンからのＣＭ　Ｏ，９８５１ＢＡＥＣ（３ＸＩＯ’細胞）を９ ００ｐＭオンコスタチンＭで２７時間処理し、培地に放出されたプラスミノーゲ ン依存性タンパク分解活性レベルを７．１．２項記載のようにして測定した。

２　馴化培地 どの形態のプラスミノーゲンアクチベーター活性がオンコスタチンＭ処理（ｔ− ＰＡまたはｕ−ＰＡ）により刺激されうるか確認するために、ＢＡＥＣを、細胞 関連活性を測定するに先立ち中和性抗ｕ−ＰＡモノクローナル抗体とブレインキ ュベートした。細胞を新たな無血清培地中で２回洗浄し、そして全量３００μｆ 中３０　ｔｔ　ｇ／ｍｌの抗Ｕ−ＰＡ抗体（精製ＭＡｂ４ＢＩＤ８−３．１　； 　ＧｌａｄｓｔｏｎｅおよびＥｎｇｈａｒｔ。

原稿準備中）の存在または非存在下て２３°Ｃて１時間インキュベートした。イ ンキュベーションに続いて細胞を再び洗浄しそしてＰＡ活性を上記材料および方 法に記載のようにしてアッセイした。２．７ｎＭオンコスタチンＭて７２時間処 理した細胞は抗体とのブレインキュベーションなしではＯＤ、。、が５．５１、 抗体とのブレインキュベーション後で５２％減少の２．６５を示した。したかっ て、オンコスタチンＭはｕ−ＰＡ発現の有意な増大およびおそらくはｔ−ＰＡ発 現の増加も惹起すると思われる。

ＭＭＣ抗原の誘導に関して存在するように、ＰＡのオンコスタチン間誘導におい ては高度の組織特異性が存在する。単核血液細胞をｌＯｎｇ／ｍ１までの濃度の オンコスタチンＭと１−２日間インキュベートした場合、ＰＡ活性の変化は全く みられない。

他のサイトカインをそれがＰＡ活性の細胞表面発現に影響を与える能力について 検査した。１０ｎＭオンコスタチンＭによる細胞関連ＰＡ活性の３倍刺激が観察 されたのとは対照的に、検査した他のサイトカインのどれもこの活性を刺激でき なかった（第３図）。事実、等モル濃度のＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βはＰＡ活 性をそれぞれ５６％および９５％減少させた。同様に、別の実験において、１３ ｐＭのインターロイキン−１（ＩＬ−１）はＰＡ活性を６２％減少させた。

組換えオンコスタチンＭのＰＡ活性に及ぼす作用も測定しそして天然分子に観察 される作用と比較した。第４図は組換えオンコスタチンＭが天然オンコスタチン Ｍと同じ用量範囲においてＰＡ活性を刺激し、両調製物は同一の効力を示す２１ ７ｐＭまたは６．５　ｎｇ／ｍｌのＥＤ、、を生ずることを示している。

７　、２．２．オンコスタチンＭのＢＡＢＣ細胞表面レセプし−ＢＡＥＣを上記 ７．１．３項記載のようにしてオンコスタチン間細胞表面レセプターの存在に関 して分析した。競合結合実験を飽和に近い条件で行った（第５図）。スカッチャ ードプロット分析では、第６図に示される曲線等混線により示されるようにＢＡ ＥＣ上に少なくとも２種の細胞表面結合部位の存在が示された。２部位モデルに より分析した場合、ＢＡＥＣは全レセプター濃度３０、０００部位／細胞を有す ることが判明し、そのうち４９５は高親和性種（Ｋｄ＝　５．８　ｐＭ）に相当 しそして２９．５０５は低親和性種（Ｋｄ＝　１．　ＯｎＭ）に相当する。半最 大レセプター占有は２ｎｇ／ｍｌ　（６７ｐＭ）オンコスタチンＭて起った。Ｐ Ａ活性の最大刺激（９０％）は約８０％レセプター占有に等しい３０ｎｇ／ｍ１ オンコスタチンＭを必要とし、このことは低親和性／高能力結合部位がオンコス タチンＭかＰＡ活性を刺激するメカニズムに関与している可能性かあることを示 唆している。

８、実施例：内皮細胞に及はすオンコスタチンＭの抗増殖作用 ここで記載される研究は、オンコスタチンＭが単球に方向性のある移動性化学定 性を誘導することなくインビトロで血清およびｂＦＧＦ誘導による内皮細胞増殖 を阻害することを示す。

８．１．増殖阻害アッセイ オンコスタチンＭによる内皮細胞増殖の阻害を測定するためにふたつの方法、細 胞定量および放射性標識ヌクレオチドのＤＮＡへのとり込み、が用いられた。

細胞定量アッセイのためには、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、１０％ウシ 胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補添した最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ）を含有する ９６ウ工ル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中に低密度（Ｉ　Ｘ　１０’細胞 ／ウエル）で加えた。３７℃での４時間インキュベーションに続き、三組のウェ ルを漸増濃度のオンコスタチンＭで処理しそしてさらに７２時間インキュベート した。単層を０．２５％トリプシンで処理しそしてウェル当りの細胞の総数を血 球計を用いて定量した。

放射性標識ヌクレオチドのＤＮＡへのとり込みを測定するためには、ウシ胎児心 臓内皮（ＢＨＥ）細胞（ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＲＬ　１３９５）を、ｌＯ％ＦＢＳ　（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補添したＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）を含有する９６ウ工ル組織培養プレー）　（Ｆａｌｃｏｎ）に低 密度（Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ウエル）で加えた。３７°Ｃで４時間のインキュベ ーションに続き、三組のウェルをｂＦＧＦ単独でまたは漸増濃度のオンコスタチ ンＭと組み合せて処理した。３７℃で４８時間インキュベーション後、ウェルを ５−　［”ＩＩ−ヨード−２′−デオキシウリジンの０．０５　ｕ　Ｃｉ（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）で処理し、さらに２４時間インキュベートした。単層をＰＢＳで 洗浄し、９５％エタノール中で固定し、風乾し、そしてとり込まれた放射能を２ ００μ！のｌＮＮａＯＨに可溶化した。ＤＮＡ合成は、活発に増殖する細胞のＤ ＮＡ中にとり込まれた放射性標識ヌクレオチドの量を定量することにより測定し た。７２時間の処理ののち、未標識細胞をトリプシン処理しそして血球計を用い て計数し、結果をＤＮＡ合成の観察されたレベルと比較した。

８．２．単球化学走性アッセイ ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコールグラジェント分離を用いて血液 から調製し、化学走性アッセイに使用した。このアッセイは４８ウエルミクロ化 学定性チエンバー（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ；　Ｃａｂｉｎ　Ｊｏｈｎ、　ＭＤ ）中でポリ（ビニル　ピロリドン）不合ポリカーボネート８μｍフィルター（Ｎ ｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　；　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、　ＣＡ）中で行 われた。要約すると、下のチェンバーは懸濁した（１０６細胞／ｍｌ）　５５μ ｌ　ＰＢＭＣで満たした。組み立てられたチェンバーを５％ＣＯ２／９ｓ％空気 を含んだ湿度調節雰囲気中３７°Ｃで３時間インキュベートした。フィルターの 反対側に移動した細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ法（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；　ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、ＩＬ）によ り染色し、そして無作為に選択した５ケ所の視野において高倍率の光学顕微鏡に より単球特有の染色を示す細胞の数を数えた。推定上の化学誘引物質に応答した 単球移動を高倍率視野（ＨＰＦ）　、ｎ　＝　５、当りの単球の平均数として表 わした。化学走性トリペプチド、ｆＭＥＴ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｓｉｇｍａ；　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）への応答を最大と見なした。

８．３．結果 血管形成は内皮細胞が血管形成性刺激に応答して移動し増殖することを必要とす る。ＢＡＥＣの集密培養物は単層の飽和密度を増大させることによりｂＦＧＦに 応答する。集密になるまで増殖した場合、ＢＡＥＣは４−５ＸｉＯ’細胞／ウエ ルの濃度で密度休止した。５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにさらすことにより、これら の細胞のそれ以上の分裂か誘導され、８−１０Ｘ　１０’細胞／ウエルの密度に 達した。

オンコスタチンＭがｂＦＧＦ刺激による内皮細胞増殖を阻止することにより抗増 殖剤として作用しうるか否か判定するために、ＢＡＥＣの集密培養物をオンコス タチンＭの存在または非存在下にｂＦＧＦにさらした。第７図に示されるように 、オンコスタチンＭはｂＦＧＦの分裂促進作用を用量依存性様式で阻止する。細 胞増殖は低濃度のオンコスタチンＭ、　ＥＤｓｏ＝０．４　ｎｇ／　ｍｌまたは １００Ｍ、により阻害された。

オンコスタチンＭの抗増殖作用に対して低密度のＢＡＥＣか影響されやすいこと は上記８，１項記載のようにしてアッセイされ、第８図に示される。オンコスタ チンＭの非存在下において、最初Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ウエルで播かれた培養物 は７２時間のインキュベーション後に８×１０４細胞／ウエルの密度に達した。

これと対照的に、オンコスタチンＭの存在下で増殖した場合、低密度ＢＡＥＣは １０％血清の分裂促進作用に応答せず、当初の細胞密度（ＨＤ６゜＝１９ｐＭ） のままであった。

ウシ心臓から単離され、その増殖を維持するのにｂＦＧＦを絶対に必要とするも うひとつの内皮細胞系、ＢＨＥ　、のオンコスタチンＭに対する感受性を上記８ ．１項に記載されるようにしてアッセイした。第９図は、オンコスタチンＭが、 これらの細胞のｂＦＧＦ依存性増殖を用量依存性様式（ＨＤ、。＝１６ｐＭ）で 阻害することを示す。ＤＮＡ標識化に加えて、細胞数を測定した。ｂＦＧＦ単独 の存在下において細胞密度は、１．８Ｘ　１０２細胞／ウエルから３．８Ｘ１０ ’細胞／ウエルに増加し、そしてオンコスタチンＭといっしょではＩ　Ｘ　１０ ”細胞／ウェルのままであった。

インビボで血管形成性質を示すある種のサイトカインは注射部位に単球−マクロ ファージを引きつけることを示している。単球−マクロファージは血管形成因子 の産生および放出により新車管形成を誘導すると現在考えられている（Ｔｈａｋ ｒａｌら、１９７９．　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ。

２６＋　４３０）。単球の化学定性応答を刺激するサイトカインの能力により、 インビボで血管形成を誘導するサイトカインの能力を予測できる。オンコスタチ ンＭを上記８．２項に記載のアッセイを用いて化学定性を刺激するその能力に関 して評価した。第■表に示される結果は、ＩＬ−１（Ｌｕｇｅｒら、１９８３． 　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１＋　８１６）、ＴＮＦ−ａ　（Ｍｉｎｇら、１９ ８７．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８＋　１４６９）およびＴＧＦ−β（Ｗａ ｈｌら、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、 に関して報告された化学走性活性とは異なり、オンコスタチンは単球に方向性の ある移動化学走性を誘導しないことを示している。ＰＢＭＣ調製物からの単球は 刺激されて多孔性の膜壁を通り強力な化学誘引物質ｆＭＥＴ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅを 含有するチェンバーの方向に移動したか、それとは対照的にオンコスタチンＭの みを含有するチェンバーは細胞移動に全く影響しなかった。

（本頁以下余白） 単球化学定性におよぼすオンコスタチンＭの作用下方の区分への添加物　単球の 数／ｈｌ）ｆＭＥＭ／Ｆ−１０培地　６±３ ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、　１０〜７Ｍ８３±４オンコスタチンＭ、　５０ｎ ｇ／ｍｌ　６±２９、実施例ニオンコスタチンＭにより誘導された内皮細胞上の 形態変化の特性決定 下記の研究はウシ内皮細胞においてインビトロでオンコスタチンＭにより誘導さ れた形態学的影響を特性決定する。

９．１．細胞培養 ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を上記７．１．１項記載のようにして培養した 。

９．２．白血球付着アッセイ ＢＡＥＣを１０％ウシ胎児血清の存在下グラススライドチェンバー（Ｌａｂ−Ｔ ｅｋ；　ＮＵＮＣＩｎｃ、）て集密となるまで培養した。培養物を７．１．１項 記載のようにして無血清培地に換え、１．７ｎＭのオンコスタチンＭで処理し、 そして２４−４８時間インキュベートした。インキュベーションに続き細胞単層 を新たな無血清培地で３回洗浄した。

続いて、５Ｘ１０’植物凝集素活性化非付着白血球を含有する２５０μβの無血 清培地をチェンバーに添加しそして２３°Ｃで６０分間インキュベートして細胞 −細胞相互作用をさせた（白血球はプラスチック表面上ヒト末梢血液単核細胞か ら３７°Ｃで７２時間インキュベーション後に調製した）。非付着白血球は新し い無血清培地で単層を３回洗浄することにより取り除いた。次にＢＡＥＣを固定 し、染色しくＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ　Ｉ）ｒｏｃｅｄｕｒｅ；　Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）そして白血球結合（主にリンパ芽球 ）を顕微鏡で検査した。リンパ芽球結合は無作為に選択した５ケ所の高倍率視野 で観察される細胞数を平均することにより定量した。

９．３．オンコスタチンＭはＢＡＥＣに形態学的変化を誘導する。

第１０図の顕微鏡写真はＢＡＥＣに及ぼすオンコスタチンＭの形態学的作用を示 す。オンコスタチンＭはＢＡＥＣ単層構造の変化を誘導する。すなわち代表的な “玉石”パターンの細胞列が失われそしてより広い細胞間間隔を有する長く延び た細胞により置き換わっている。観察される細胞間の“引っ込み”はオンコスタ チンＭが内皮細胞表面性質の変化を誘導することを意味する。

内皮細胞表面は同定されたそして仮定上の細胞間付着分子によって種々の白血球 に優先的に結合することが示されている（ＣｏｔｒａｎおよびＰｏｂｅｒ、　Ｅ ｎｄｏｔｈｅｌｊａｌＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ 　Ｄｉｓｅａｓｅ；　Ｓｉｍｏｎｅｓｅｃｕａｎｄ　Ｓｉｍｏｎｅｓｃｕ、　Ｅ ｄｓ、、　１９８８）。リンパ球付着は内皮細胞の誘導可能な性質であることか 知られている。それゆえオンコスタチン間処理に続いてＢＡＥＣの白血球付着性 質を調査した。結果は、オンコスタチンＭか時間依存性様式でＢＡＥＣ単層表面 へのヒト白血球の付着を誘導することを示す（第１１図）。

オンコスタチンＭが白血球付着を誘導するメカニズムを調査するために、ＢＡＥ Ｃをオンコスタチン間処理に先立ち、細胞間付着分子１　（ｆｃＡＭ−１）に特 異的なモノクローナル抗体（ＬＢ−２，２０μｇ／ｍｌ；　ｔｈｅ　Ｒｅｇｉｏ ｎａｌ　ＰｒｉｍａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈｃｅｎｔｅｒ　ａｔ　Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　５ｅａｔｔｌｅ。

ＷＡのＤｒ、　Ｅ、　Ａ、　Ｃ１ａｒｋにより提供された）とブレインキュベー トした。抗ＩＣＡＭ−Ｉ　ＭＡｂとのブレインキュベーションにより、白血球付 着の６２％減少を生じた。このことはオンコスタチンＭがＩＣＡＭ−１のような 異型細胞間付着分子の発現をアップレギュレートすることにより白血球付着を誘 導することを示唆している。オンコスタチンＭのこの作用はＩＬ〜１、ＩＦＮ− γ、ＴＮＦ−αおよびリボ多糖体（これらも他の白血球サブセットによる付着を 増大させる）で得られた観察を考慮すると他の白血球サブセットおよび内皮細胞 型におよぶ可能性かある（Ｍａｋｇｏｂｅら、１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄｏｎ）　３５１：　８６；　Ｄｕｓｔｉｎａｎｄ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９ ８８．　Ｊ、Ｃｅ月、Ｂｉｏｌ、１０７：　３２１）。

１０、ヒト内皮細胞におけるオンコスタチン間誘導によるインターロイキン６合 成の刺激 １０．１．材料および方法 １０、１．１．　ヒト調帯静脈内皮細胞の調製ヒ）Ｊｌｌｆ帯靜脈内皮細胞（Ｈ ＵＶＥＣ）の第一継代培養物をＷａｌｌら、１９７８．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、　９６＋　２０３の方法に従い調製されたＣｅ１ｌ　Ｓｙｓｔｅ ｍｓ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ　ＷＡ）から得た。

細胞をコラゲナーゼと継代培養しそしてヘパリンおよび組換えＥＣＧＳ（Ｂｉｏ ｎｅｔｉｃｓ）を置換したＣ３−１限定無血清培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ ）中ゼラチン被覆プラスチック容器で集密となるまで増殖させた。細胞には実験 の少なくとも１２時間前に新しい未補添培地を与えた。

１０、１．２．増殖阻害アッセイ 乳癌細胞系、ＺＲ−７５−３０、をｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ（ｃａｔａｌ ｏｇ　＃ＣＲＬ　１５０４）から得た。細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏ ｎｅ）を補添したダルベツコ最少必須培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。細胞を ９６ウ工ル組織培養プレー）　（Ｆａｌｃｏｎ）中にｌＸｌ０’細胞１５０μＩ ！／ウエルで入れた。３７°Ｃで４時間インキュベーションした後、細胞を試験 試料で３通りで処理した。

４８時間のインキュベーションの後、細胞を０．０５μＣｉの５−［”’Ｉ］ヨ ードー２゛デオキシウリジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する培地５０μ！で処 理し、さらに２４時間インキュベートシた。単層をＰＢＳで洗浄し、９５％メン トールで固定し、風乾し、そしてとり込まれた放射能を２００μｌのＩ　Ｎ　Ｎ ａＯＨ中に可溶化した。ＤＮＡ合成は放射性標識したヌクレオチドが活発に増殖 する細胞のＤＮＡ中にとり込まれる量を定量することにより測定した。７２時間 の処理の後、未標識細胞をトリプシン処理しそして血球針を用いて計数した。放 射能の量はウェル中の細胞総数に正比例していることが示される。

１０、１．３．　ヒト調帯静脈内皮細胞から放出されたＩＬ−６の定量的測定 組織培養培地、血清、および他の液体中のヒトｒＬ−６の定量的測定のための“ サンドイッチ”酵素結合イムノソルベントアッセイ、ＥＬＩＳＡ、はＲｅ５ｅａ ｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｉａ−ｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｍｉｎｎｅａｐ ｏｌｉｓ、　ＭＮ）から商業的に得、彼らの推奨した操作に従い行った。要約す ると、ルー６特異的モノクローナル抗体を被覆したマクイロタイタープレートウ エルに試料をピペットで入れ、そしてもしＩＬ−６があればそれが固定化された 抗体に結合される。

すべての未結合試料タンパク質を洗浄除去後、ｒＬ−６特異的な酵素結合ポリク ローナル抗体をウェルに加えて、第１回目のインキュベーション中に結合したす べてのＩＬ−６に結合される。すべての未結合抗体−酵素試薬を取り除くだめの 洗浄の後、基質溶液をウェルに加え、最初の段階で結合したＩＬ−６の量に比例 して発色させる。

色を分光光度計で４０５ｎＭにて監視しそして標準曲線のＩＬ−６の既知量の値 と比較する。個別の試料を二通りずつ操作し、±２％の標準誤差である。ＩＬ− ６の最小検出可能量は３．５　ｐｇ／ｍｌであった。

１０、１．４、ヒト調帯静脈内皮細胞からの細胞性総ＲＮＡの調製およびノーザ ンプロット 細胞性総ＲＮＡはヒトａ帯静脈内皮細胞をグアニジウムイソチオシアネート中に 溶解させ続いてセシウムクロライド遠心によりＲＮＡを回収することにより単離 した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）　ｏ次に５μｇ／試料を６％ ホルムアルデヒドを含有する１、２％のアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜 （Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）にプロットしてノーザンプロット分 析した。肺癌細胞系、Ｈ２９８１からのＲＮＡをＩＬ−６発現の陽性対照として 用いた。

５０％ホルムアミド、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，０，５ｘ　ｓｓｃ、１ ００１ｔ　ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ５ＩＯＸデンハード溶液および標識した ｒＬ−６エキソン特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ｃａｔａｌｏｇ　＃ＢＰ Ｒ３２，Ｉ？ｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、 　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）の５Ｘ１０’−１０’ｄｐｍ／μｇ／ｍｌ を含有する溶液中３７°Ｃでハイブリダイゼーションを行った。この特別のプロ ーブはＩＬ−６遺伝子の４個の別々のエキソン領域に特異的であり、そしてＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼおよびＲｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｊａｇｎｏｓｔｉ ｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓにより推奨されたｒ　−”　”Ｐ−ＡＴＰｆｆ識操作を用い て５′−末端を４．２　ｘ　１０’ｄｐｍ／μｇの比活性まで標識した。ハイブ リダイゼーション完了後、膜を６ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中３０°Ｃで２０分 間洗浄した。続いて膜を増感スクリーンを用いてＸ線フィルムに一７０℃で４８ 時間露出させた。

１０、２．結果 １０、２．１．オンコスタチンＭにより刺激された内皮細胞からのＩＬ−６生物 活性：ヒト乳癌細胞増殖の阻害 ヒト調帯静脈内皮細胞（）ＩＵＶＢＣ）の集密培養物を１１００ｎ／ｍｌの組換 えオンコスタチンＭを用いておよび用いずして７２時間処理した。馴化培地を収 集し、遠心により清澄化しそして使用まで一２０°Ｃで保存した。組換えオンコ スタチンＭ、組換えＩＬ−６、未処理ＨＵＶＥＣからの馴化培地、オンコスタチ ン間処理ＨＵＶＥＣからの馴化培地、および抗ＩＬ−６中和性抗体と３７℃で１ 時間ブレインキュベートし、オンコスタチン間処理したＨＵＶＥＣからの馴化培 地、での処理に続きヒト乳癌細胞、ＺＲ−７５−３０、の増殖を上記１０．１． ３項に記載の増殖阻害アッセイを用いて監視した。この実験の結果を第Ｖ表に示 す。

組換えオンコスタチンＭはＺＲ−７５−３０細胞の増殖に何ら存意な阻害作用を 示さなかったが（１４％）、一方ｌＯ倍低い量の組換えＩＬ−６はこの点におい て高度に活性であった（８８％）。これらの結果は、ＺＲ−７５−３０細胞かＩ Ｌ−６によるよりもオンコスタチンＭによる増殖阻害にかなり感度が低いことを 示している。ＨＵＶＥＣ馴化培地（１：　４０希釈）もまたＺＲ−７５−３０細 胞の増殖を阻害するのに効果がなく　（８％）、一方オンコスタチンＭ処理ＨＵ ＶＥＣ（１：　４０希釈）からの馴化培地は劇的な増殖阻害作用（７０％）を示 した。この結果は、オンコスタチン間処理が、オンコスタチンＭとは対照的に乳 癌細胞の増殖に対して直接阻害作用するものであるＨＬＩＶＥＣからの腫瘍細胞 サプレッサー分子の放出を刺激することを示す。オンコスタチン間処理ＨＵＶＥ Ｃからの馴化培地をＩＬ−６に対する中和性抗体（抗ＩＬ−６）とブレインキュ ベートした場合、試料の阻害活性は完全に阻止される。

したがって、オンコスタチンＭにより誘導された腫瘍細胞サプレッサー分子は免 疫学的にＩＬ−６と同一である。

（本頁以下余白） ＺＲ−７５−３０乳癌細胞に対するＩＬ−６の生物活性１試　料　［１２Ｊｌ− ＩＵｄＲとり込み　阻害％培地のみ　１１．８５２＋／−３２４ｃｐｍ　Ｏオン コＭ、２５ｎｇ／ｍ１　１０，０８８＋／−５２７１４ＩＬ−６，２，５ｎｇ／ ｍ１　１，４６７＋／−８６８８ＣＭのみ　１０．８５５＋／−５８ オンコＭ／ＣＭ　３．７０３＋／−１６２７０オンコＭ／ＣＭ十抗ＩＬ−６１０ ，８９２＋／−２０７８１、ＺＲ−７５−３０細胞を１０％ウシ胎児血清の存在 下７２時間処理した。細胞増殖を上記１０．１．２項に従い測定し、阻害パーセ ントとして表に示す（培地のみのｃｐｍ−試料のｃｐｍ／培地のみのｃｐｍ）　 Ｘ　１００ｏ馴化培地（ＣＭ）はバイオアッセイにおける血清希釈を最小限に抑 えるために１：４０に希釈した。抗ＩＬ−６は２５μｇ／ｍｌ濃度で使用した。

１０、２．２．内皮細胞のＩＬ−６活性のオンコスタチンＭによる刺激に関する 時間および用量要件 Ｈ［ＪＶＥＣからの馴化培地（ＣＭ）の一部分を１１００ｎ／ｍ！オンコスタチ ンＭでの処理に続く種々の時間間隔で採取した。上記１０．１．３項記載のＥＬ ＩＳＡ法を利用して試料のＩＬ−６含量を測定した。第１２図に示されているよ うに、ＩＬ−６レベルの上昇は処理２時間後に早くも観察され、そして最大レベ ルに達することなく２４時間の間中続いた。８時間後までにはＨＬＩＶＥＣ培地 中のＩＬ−６濃度は０．８ｎｇ／ｍｌから１．８　ｎｇ／ｍｌに、そして２４時 間後までには２７ｎｇ／ｍｌまで上昇した。これらの速度はオンコスタチン間処 理に対するＨＵＶＥＣによる速やかな応答を示す。

第１３図は処理７２時間後に測定した場合のＨＵＶＥＣに及ぼすオンコスタチン Ｍの用量依存性作用を示し、その時点においてＣＭのＩＬ−６含量は１０ｎｇ／ 　１０’細胞から１１０ｎｇ／１０６細胞まで上昇した（〉１０倍）。オンコス タチンＭの有効量は０．１ｎＭ（３ｎｇ／ｍｌ）から１０ｎＭ（３００ｎｇ／　 ｍｌ）の範囲であり、半最大応答ＥＤ、。は１１５−３０ｎ／ｍｌであった。

それゆえオンコスタチンＭは時間および用量依存性様式の両方でＨＵＶＥＣから の免疫反応性ＩＬ−６分子の放出を刺激する。

１０、２．３．オンコスタチンＭにより誘導されたヒト調帯静脈内皮細胞のＩＬ −６ｍＲＮＡの発現ＨＵＶＥＣを１１００ｎ／ｍｌの組換えオンコスタチンＭを 用いておよび用いずして処理しモして３７°Ｃで６時間インキュベートした。細 胞を洗浄し、可溶化しそしてその全ＲＮＡを上記１０．１．４項記載のようにし て抽出した。ヒト肺癌細胞系Ｈ２９８１の全ＲＮＡを抽出しそしてＩＬ−６ｍＲ ＮＡ発現の陽性対照として用いた。上記１０．１．４項記載のようにして行われ たノーザンプロット分析は、オンコスタチンＭがＩＬ−６ｍＲＮＡレベルを有意 に増幅することを示す（第１４図）。第１４図のレーン１は陽性対照細胞系Ｈ２ ９８１で見られる１、　４Ｋｂ　ｍＲＮＡ種を示す。第１４図のレーン２は未処 理ＨＵＶＥＣの低い構成的ＩＬ−６ｍＲＮＡ発現を示す。

レーン３はオンコスタチンＭ処理後のＩＬ−６ｍＲＮＡ転写物の有意な増幅を示 す（５倍）。それゆえ、オンコスタチンＭはＨＵＶＥＣにおいてより高レベルの ＩＬ−６ｍＲＮＡ発現を誘導し、従ってオンコスタチン間処理ＨＵＶＥＣのＣＭ にＩＬ−６レベル増大が観察されることに関する分子メカニズムを提供する。

本発明は、ここに開示された態様に限定されるものではなく、これらは本発明の 一観点のひとつの説明として意図されそして機能的に等価なものすへてか本発明 の範囲内である。事実、ここに示され記載されたものに加え本発明の種々の改変 がこれまでの記載から当業者には明らかであろう。かかる改変は添付の請求の範 囲内にあることが意図される。

サイトカイン濃度　ｎｇ／ｍ１ ＦＩＧ、　ＩＡ サイトカイン濃度ｎｇ／ｍ１ ＦＩＧ、ＩＢ 結合　１モル　７１０６細胞 相対的　ＰＡ　活性　ｏｏ４０５ 結合、ｆモル／１０６　細胞 増殖阻害　％ 増殖阻害　％ １Ｌ−６放出 国際調査報告 １１１＋＊＋ハ１１間シ０１１Ａｅ９−ｃａＩ＋ｌ５Ｎ−ＬｐＬ−〒ｔ＋＋＜６ ｎ／ｎ＋Ｏｎフ一一“−１＾ｐ□”””　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１９０７ｆ’ｃ Ｔ／ＵＳ９０１０１９０７ ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ　Ｔｏ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／：’１０ＶＸ、　０ｂｓｅｒｖ ａｔｉｏｎｓ　Ｗｈｅｒｅ　Ｕｎｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｓ　Ｌ ａｃｋｉｎｇ：Ｇｒｏｕｐ　ｖＴ、　Ｃｌａｉｍ８４７−５３．　ｄｒａｗｎ　 ｒ、ｏ　ａ　ｍ＠ｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｋａｐｏｓｉ’ｓ

Claims (61)

【特許請求の範囲】
1. １．内皮細胞上のＭＨＣ抗原の発現を抑制するに有効な量のオンコスタチンＭを 用いて内皮組織を処理することを含んでなる、内皮組織免疫原性を阻害する方法 。
2. ２．ＭＨＣ抗原がクラスＩＨＬＡ抗原からなる請求の範囲１記載の方法。
3. ３．ＭＨＣ抗原がクラスＩＩＨＬＡ抗原からなる請求の範囲１記載の方法。
4. ４．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求の 範囲１記載の方法。
5. ５．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲１記載の方法。
6. ６．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲１記載の方法。
7. ７．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲１記載の方法 。
8. ８．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲１記載の 方法。
9. ９．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲１ 記載の方法。
10. １０．オンコスタチンＭを内皮細胞関連プラスミノーゲンアクチベーター活性を 刺激するに有効な量で個体に投与することを含んでなる、プラスミン活性を増大 させる方法。
11. １１．オンコスタチンＭを内皮細胞関連プラスミノーゲンアクチベーター活性を 刺激するに有効な量で個体に投与することを含んでなる、繊維素溶解を誘導する 方法。
12. １２．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求 の範囲１０または１１記載の方法。
13. １３．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲１０または１１ 記載の方法。
14. １４．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲１０または１１ 記載の方法。
15. １５．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲１０または １１記載の方法。
16. １６．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲１０ま たは１１記載の方法。
17. １７．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲 １０または１１記載の方法。
18. １８．オンコスタチンＭを内皮細胞増殖を阻害するに有効な量で個体に投与する ことを含んでなる、血管形成を阻害する方法。
19. １９．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求 の範囲１８記載の方法。
20. ２０．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲１８記載の方法 。
21. ２１．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲１８記載の方法 。
22. ２２．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲１８記載の 方法。
23. ２３．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲１８記 載の方法。
24. ２４．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲 １８記載の方法。
25. ２５．オンコスタチンＭをドナー臓器脈管系におけるＭＨＣ抗原発現を阻害する に有効な量で移植レシピエントに投与することを含んでなる、移植臓器機能の成 功可能性を改善する方法。
26. ２６．移植磁器が心臓である請求の範囲２５記載の方法。
27. ２７．移植臓器が肺である請求の範囲２５記載の方法。
28. ２８．移植臓器が腎臓である請求の範囲２５記載の方法。
29. ２９．移植臓器が肝臓である請求の範囲２５記載の方法。
30. ３０．ＭＨＣ抗原がクラスＩＨＬＡ抗原からなる請求の範囲２５記載の方法。
31. ３１．ＭＨＣ抗原がクラスＩＩＨＬＡ抗原からなる請求の範囲２５記載の方法。
32. ３２．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求 の範囲２５記載の方法。
33. ３３．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲２５記載の方法 。
34. ３４．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲２５記載の方法 。
35. ３５．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲２５記載の 方法。
36. ３６．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲２５記 載の方法。
37. ３７．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲 ２５記載の方法。
38. ３８．オンコスタチンＭがＴＧＦ−βと共に投与される請求の範囲２５記載の方 法。
39. ３９．オンコスタチンＭを血栓溶解の増強に有効な量で個体に投与することを含 んでなる、血栓性心臓血管疾患の治療法。
40. ４０．オンコスタチンＭをｔ−ＰＡと共に投与する請求の範囲３９記載の方法。
41. ４１．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求 の範囲３９記載の方法。
42. ４２．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲３９記載の方法 。
43. ４３．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲３９記載の方法 。
44. ４４．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲３９記載の 方法。
45. ４５．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲３９記 載の方法。
46. ４６．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲 ３９記載の方法。
47. ４７．オンコスタチンＭを病変部の新血管形成を阻害するに有効な量でカポジ肉 腫罹患個体に投与することを含んでなる、カポジ肉腫病変を治療する方法。
48. ４８．オンコスタチンＭが細胞性抗原を特定する抗体分子に共有結合される請求 の範囲４７記載の方法。
49. ４９．オンコスタチンＭがホルモンに共有結合される請求の範囲４７記載の方法 。
50. ５０．オンコスタチンＭが成長因子に共有結合される請求の範囲４７記載の方法 。
51. ５１．オンコスタチンＭがサイトカインに共有結合される請求の範囲４７記載の 方法。
52. ５２．オンコスタチンＭがリポソーム中にカプセル封入される請求の範囲４７記 載の方法。
53. ５３．オンコスタチンＭがマイクロカプセル中にカプセル封入される請求の範囲 ４７記載の方法。
54. ５４．内皮細胞を有効量のオンコスタチンＭと接触させることを含んでなる、内 皮細胞におけるインターロイキン６の合成を誘導する方法。
55. ５５．オンコスタチンＭの有効量が０．１ｎＭ−１０ｎＭの範囲である請求の範 囲５４記載の方法。
56. ５６．内皮細胞を有効量のオンコスタチンＭと接触させることを含んでなる、内 皮細胞におけるインターロイキン６ｍＲＮＡの合成を誘導する方法。
57. ５７．インターロイキン合成の誘導に有効な量のオンコスタチンＭを投与するこ とを含んでなる、内皮細胞の増殖を阻害する方法。
58. ５８．個体の血管内皮においてインターロイキン６の合成を誘導するに有効な量 のオンコスタチンＭを個体の循環系に投与することを含んでなる、個体の循環イ ンターロイキン６のレベルを高める方法。
59. ５９．新生物細胞の増殖を阻害しうる少なくとも１種のサイトカインの分泌を内 皮細胞に誘導するに有効な量のオンコスタチンＭを新生物細胞に隣接する内皮細 胞に投与することを含んでなる、新生物細胞の増殖を阻害する方法。
60. ６０．少なくとも１種のサイトカインがインターロイキン６を包含する請求の範 囲５９記載の方法。
61. ６１．少なくとも１種のサイトカインが顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因 子を包含する請求の範囲５９記載の方法。