JPH04502855A - 正常部位抑制ハイブリダイゼーシヨンおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 正常部位抑制ハイブリダイゼーションおよびその使用背景 染色体結合技術は、特異的ヒト染色体の同定を促進し、そして現在染色体異常の 診断の主要な基礎を提供する。染色体結合のパターンの解釈は、熟練した人を必 要としそして、ことに小さい構造的変化を検出することに関して、そして複雑な 核型、例えば、高度に異数性の腫瘍細胞のそれらを分析するとき、しばしば技術 的に困難である。追加の複雑さは、読むことの出来る分裂中期染色体の広がりは 時々非常に困難であるか、あるいはある種の細胞の型または組織を調製すること が不可能であるということである。染色体異常を同定する別の方法は、とくにこ のような別の方法を有糸分裂細胞および開開細胞の両者の集団に適用できた場合 、現在の細胞生成分析の方法を増大させろうるので、価値があるであろう。

過去数年にわたって、個々の染色体のＤＮＡが哺乳動物の開開の核内の極限化領 域または空間的に付着性のドメインを占有することを示す、かなりの量の証拠が 得られてきている。フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ。

ら、ヒユーマン・ジエネティックス（Ｈｕｍ、　Ｇｅｎ　ｔ、　）　、６０　： 　４６−５６　（１９８２）；ヘンス（Ｈｅｎｓ）　、Ｌ、ら、エキスペリメン タル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅｌ　ｌ　Ｒｅｓ、Ｌ　１４９：２５７−２ ６９　（１９８３）；シャーディン（Ｓｃｈａｒｄｉｎ）、Ｍ、ら、ヒユー？： ／−ジエネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ、）、７１：２８１−２８７　（１９ ８５）：？ンウエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、ヒｘ−７：／−ジェ ネティー／クス（Ｈｕｍ、　Ｇｅｎ　ｔ、　）　、７１　：　２８８−２９３　 （１９８５）；およびビンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）、Ｄ、ら、プロシーディンゲス ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＣＰｒｏｃ、Ｎａｔ１． Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８３　：　２９３４−２９３８　（１９８６）。

これらの観測は染色体特異的プローブの組を使用して、非有糸分裂細胞における 染色体ドメインの数的または構造的異常を検出する二とができたことを示唆し、 このアプローチは「間開の細胞生成学（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ　ｃｙｔｏｇｅｎ ｉｃｓ）Ｊと名１寸けられた。フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ、ら、ヒユ ーマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎ　ｔ、）　、７４　二３４６−３５ ２　（１９８６）。事実、最近の正常部位ハイブリダイゼーションの研究は、開 開細胞を使用するトリソミー−１８の胎児の診断、およびプローブとして染色体 特異的反復ＤＮＡを使用する数的染色体異常の検出を実証した。フレマー（Ｃｒ 　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ、ら、ヒユーマン・ジエネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ 、）　、７４　：　３４６−３５２　（１９８６）およびフレマ−（Ｃｒｅｍｅ ｒ）　、Ｔ、ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、ｃｅｌｌ　Ｒ ｅｓ、）、よヱ６　：１１９−２２０　（１９８８）。

今日まで報告されたすべての染色体特異的反復ＤＮＡは、各染色体の離散した小 区域に局在化されそして、こうして、このようなりＮＡプローブは多数の型の染 色体異常の分析に不適当である（例えば、転座または欠失）。特異的染色体から なる配列のスペクトルを独特に検出することができたならば、非有糸分裂細胞に おける染色体ドメインの異常の分析は可能であろう。さらに、このような一般的 標識技術は、開開の核内の染色体のＤＮＡの空間的有機化に関する基本的な問題 の取り扱いを可能とするであろう。

発明の開示 本発明は、染色体の正常部位抑制（ＣＩ　Ｓ　Ｓ）ハイブリダイゼーションによ り、哺乳動物の有糸分裂細胞または間期細胞の中で選択した個々の染色体を検出 、同定および／または定量する方法、および細胞を染色体、染色体断片、または 染色体異常、例えば、状態または病気に関連するものの発生についての分析にお けるその使用に関する。本発明の方法において、染色体特異的プローブ（ＤＮＡ またはＲＮＡ）を分析すべき試料と組み合わせ、ここで問題の個々の染色体が標 識され、そして染色体からなる配列の複雑なスペクトルを検出できるようにする 。本発明の方法において使用するプローブは、高い遺伝子の複雑さをもち、そし て個々にまたはプールで使用する、適当に選択した、クローニングしたＲＮＡま たはＲＮＡの断片、あるいは染色体ライブラリーのＤＮＡであることができる。

本発明の方法は、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンと呼び、個々の哺乳動物の染 色体を細胞サイクルの任意の点において特異的に染色するために使用することが できる。それを使用して、本発明まで、検出が、不可能でなかった場合、時間を 消費するおよび／または困難であった、染色体の含量、とくに染色体異常（例え ば、欠失、転位、染色体数の変化）を評価することができる。この方法は、この ような評価を望む任意の関係（例えば、遺伝状態または病気の状態の診断および ／または監視）において、個々の哺乳動物の染色体の急速なかつ高度に特異的な 評価の提供において有用である。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明のＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを概略的に示す。

第２図は、異なる濃度のヒト競争ＤＮＡによる染色体７誘導ＤＮＡライブラリー 内の交差反応性配列からの抑制を示す。ビオチン標識した染色体７のＤＮＡイン サート（２ｏｎｇ／ｍｌ）をヒトゲノムのＤＮＡと２０分間予備ハイブリダイゼ ーションし、次いで分裂中期の染色体のスプレッド（ｓ　ｐ　ｒ　ｅ　ａ　ｄ　 ｓ）とハイブリダイゼーションしそしてＦＩＴＣ標識したアビジンで検出した。

ヒトＤＮＡ濃度は次の通りであった。

Ａ、０μｇ／ｍｌ；Ｂ、５０μｇ／ｍｌ　：Ｃ，１００μｇ／ｍｌ　；Ｄ、２０ ０μｇ／ｍｌ　；　Ｅ、１１００（ｂｚ／ｍｌ　：　Ｆ、ＤＡＰｒｄｅ後染色し たＥにおけるのと同一の分裂中期のスプレッド。ゲノムのサケＤＮＡを各試料に 添加して、最終ＤＮＡ：ａ度を１．０ｍｇ／ｍｌに調節した（参照、詳細につい てテキスト）。矢印は標的染色体７を指し、そして矢印のヘッドは非７染色体上 の追加の強いシグナル指す。すべてのプリントされた陰性のものは、同一の写真 条件下に露出しそして現像した。

第３図は、ハイブリダイゼーションのシグナルの特異性および強さへの予備アニ ーリング時間の効果を示す。ビオチン標識した染色体７のＤＮＡインサート（２ ｏｎｇ／ｍｌ）を、分裂中期へのハイブリダイゼーンヨンの前に、次の時間の間 、２００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡと予備アニーリングした、Ａ、０分；Ｂ、 ２分；Ｃ１５分：Ｄ、２０分。

第４図は、正常ヒトリンパ球中のＡ染色体〕、Ｂ染色体７、Ｃ染色体４、Ｄ染色 体１８、Ｅ染色体１３およびＦ染色体２０のデコレーション（ｄｅｃｏｒａｔ　 １ｏｎ）を示す。染色体１３のインサートＤＮＡのプールのみが、予備ハイブリ ダイゼーション抑制工程後に、他の染色体への有意の交差ハイブリダイゼーショ ンを示す。染色体２０（Ｆ）の検出は、全染色体ライブラリー（λファージのア ームを包含する）を使用して実施し、そして酵素基質混合物としてニトロブルー テトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢ Ｔ−ＢＣＩＰ）を使用してアビジン−アルカリ性ホスファターゼで検出した。染 色体１　（Ａ）（Ｄシグナルをピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）ら（１９８６）のサン ドイッチ技術により増幅した。

第５図は、予備アニーリングした染色体ライブラリーＤＮＡインサートにより描 写されたヒトリンパ球核中の染色体ドメインを示す。酢酸−メタノール固定した 核へのハイブリダイゼーションは、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ　Ｉ 　ＴＣ）接合アビジン（Ａ−Ｅ）またはアルカリ性ホスファターゼ接合アビジン （Ｆ）により検出された。ドメインは染色体１　（Ａ、Ｂ）　、染色体７　（Ｃ ＳＤ）および染色体１８　（Ｅ、Ｆ）について示す。中心粒の領域の優勢な染色 は染色体７ドメインの中に見られ、染色体７特異的アルフオイド（ａｌｐｈｏｉ ｄ）のＤＮＡ反復の優先的ハイブリダイゼーションを反映する：分裂中期染色体 上の同様なシグナル分布は、また、この特定の実験において観測された。

第６図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出した（Ａ、Ｃ）そして４，６−ジアミジノ ー７−フエニルインドールニ塩酸塩（ＤＡＰＩ）で後染色した（Ｂ、Ｄ）の神経 膠腫細胞系の分裂中期のスプレッドへの染色体１の挿入の正常部位抑制（ＣＩＳ Ｓ）ハイブリダイゼーションを示す。Ａ、Ｂ　ＴＣ６２０は、２つの明らかに完 全な１染色体（Ｂ中の小さい矢印）およびこれらのインサートにより特異的にデ コレーションされた２つのマーカーの転座染色体（矢印ヘッド）（Ａ）を示す。

２つのマーカー染包体の１つはｌｐ（下の左）を含有し、他方は１ｑアーム（下 の右）を含有する：１ｐ２つの正常染色体および中部動原体下の（ｓｕｂｍｅｔ ａｃｅｎｔｒｉｃ）マーカーの１ｐターミナル（相対的ＧＣに富んだ領域）は完 全には描写されない。また、１ｑ１２領域はここで大部分の実験と対照的にほと んどデコレーションを示さない。Ｘ９５０゜Ｃ，Ｄ典型的なＴＣ５９３分裂中期 スプレッドは、６つの特異的にデコレーションされた染色体を示す。３つの末端 動原体のマーカーの染色体は、すべて１ｐの切頭をもち、ＩＱ１２（Ｃにおける 矢印）に局在化する反復のとくに強い蛍光を示す。これらのうち２つにおいて、 １ｑアームは完全であるように思われるが、主要な欠失は第３において明らかで ある（Ｄにおける矢印）。第４のデコレーションされた染色体（Ｃ，Ｄにおいて 小さい矢印）は、再び、１ｑの末端部分の主要な欠失を示すが、明らかに完全な １ｐアームを保持した。第５の中部動原体下の染色体（大きい矢印ヘッド）は、 明らかに完全な１ｐアームを含有する；その短いアームのＤＮＡは同定されなか った。前述のＴＣ６２０（ｌｐ）のマーカー染色体の１つに対するこのマーカー の類似性に注意されたい。第６の完全にデコレーションされた染色体は、ＤＡＰ Ｉバンディング（白抜きの矢印）により実証されたようにイソ（１ｐ）である。

Ｘ１２００゜第７図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出された染色体４ライブラリー のインサートのｃｒｓｓハイブリダイゼーションを示す；ＴＣ５９３（Ａ〜Ｃ） およびＴＣ６２０（Ｄ）の開開核。２つの明らかに完全な開開ドメインは互いに 接近しているが、ＡおよびＣにおいて広く分離していることに注意されたい。Ｔ Ｃ６２０間期核（Ｄ）は、大きく異なる大きさの４つの染色体４間期ドメインを 示す。ＴＣ５９３（Ｅ）の分裂中期スプレッドは、２つの明らかに完全な４つの 染色体、および中部動原体下の染色体中の小さいデコレーションされた領域（矢 印）を示す。転座した４つの配列をもつマーカーは、スプレッドの約３０％にお いて観測された。ＴＣ６２０分裂中期スプレッド（Ｆ）は、１つの明らかに完全 な染色体４および異なる量の染色体４物質を含有し３つの転座マーカー（ｔ）を 示す。Ｇ−Ｊビオチニル化染色体７のインサートおよびアミノアセチルフルオレ ン（ＡＡＦ）修飾７特異的アルフォイド反復の二重ハイブリダイゼーション。Ｇ 染色体７のインサートは５つの完全にデコレーションされた分裂中期染色体を描 写する。それらのうちの４つは、完全７つの染色体であり、第５（矢印）はイソ （７ｐ）である（参照、第３図Ｅ）。Ｈわずかに４つのデコレーションされた染 色体上のＡＡＦ−７アルフオイドシグナルを示すＧと同一の場：イソ（７ｐ）上 にシグナルは検出さない。１Ｔｃ５９３の間開核は、染色体７のインサートによ り描写された５つのドメインを示す：これらのうちの４つは７アルフオイドプロ ーブにより標識される（Ｊ）。■中の矢印は開開のイソ（７ｐ）マーカーを表す 。

第８図は、アビジン−ＦＩＴＣで検出された神経膠腫細胞系の分裂中期スプレッ ドに対する染色体７および１８のライブラリーインサートのＣｌ５Ｓハイブリダ イゼーシヨンを示す。Ｘ８７５゜Ａ、ＢＴＣ６２０は染色体７のインサートヘハ イブリダイゼーションした。３つの明らかに正常の７染色体および追加の７配列 を含有する転座染色体がＡにおいて大きい矢印ヘッドで示されている。ＤＡＰＩ 染色された完全な染色体はＢにおいて小さい矢印で示されている。他の研究（参 照、テキスト）は、マーカー染色体中の７ｐｔｅｒ−ｑｌｌの転座を示した（大 きい矢印ヘッド）。Ｄ、対応するフレームはＤＡＰＩで反対染色された。Ｅ。

擬四倍体ＴＣ５９３からの分裂中期スプレッドは、７ライブラリーのインサート により際立った５つの染色体を示す。中部動原体の染色体（ｍ）は、この系統に 典型的なイソ（７ｐ）マーカーを表す（参照、また、第２図Ｇ）。インサートの 染色体（小さい矢印）は、ＤＡＰＩ染色した正常および中部動原体の７染色体を 示す。陸標のバンド７ｑ２１および７Ｑｌｌにおける構成的ヘテロクロマチンの ブロックは、両者共正常の染色体フィンサート上で優性である（矢印）が、マー カー染色体上に存在しない。その代わり、後者の両者のアームは、７ｐ２１にか すかな末端のバンドをもつ、鏡に似た染色のパターンを示す。Ｆ、Ｇ　ＴＣ５９ ３は染色体１８のインサートにハイブリダイゼーションした。４つのデコレーシ ョンされた１８染色体はＦに示されており、そしてＤＡＰＩ染色によりＧにおい てそれらのうちの３つは明瞭に転座される（１）。

第９図は、神経膠腫細胞系ＴＣ６２０（左）およびＴＣ５９３（右）における染 色体１．４．７．１８および２０のＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンにより検出 された、完全なおよび異常の染色体の要約した染色体のイディオダラムである。

Ｇ−バンド（黒色）はわれわれのデータにより示唆される近似の破壊点をもつこ とが示されている：波状のパターンで陰影を付けた区域は、マーカー転座染色体 の一部分を構成する他の染色体からのものである。ＴＣ６２０転座した４セグメ ントの２つを除外した黒い点は、染色体４の物質の割り当てが環境の証拠（例え ば、大きさの測定）にに基づくことを示す。ＴＣ５９３分裂中期スプレッド（＋ ）の約２０％の中の染色体１８の物質の小さい転座は、また、それ以上同定する ことができなかった。両者の細胞系における７ｐの過剰のりブリゼンテイション に注意されたい。

第１０図は、神経膠腫細胞系における分裂中期の異常を反映する代表的な前期の 核（Ａ）および開開の核（Ｂ−Ｆ）を示す（参照、第１図〜第３図）。Ａ１前期 ＴＣ６２０核中の７ｐ転座（ｔ）の検出。Ｘｌ、０００゜Ｂ、ＴＣ５９３におい て検出された５つのよく分離した染色体７のドメイン。Ｘｉ、２４０゜Ｃ，ＴＣ ６２０における２つの大きいおよび１つの非常に小さい１８ドメイン（矢印ヘッ ドにより示す）。Ｘｌ。

４５０゜Ｄ、ＴＣ５９３において検出された４つの染色体１８のドメイン：これ らのシグナルの１つ（矢印）はより小さいように思われる。Ｘ。

１．４５０゜Ｅ、ＴＣ６２０における４つの染色体１のドメイン（参照、第１図 Ａ、Ｂ）。Ｆ、ＴＣ５９３における少なくとも５つの染色体ｌのドメイン；１つ （矢印ヘッド）は他のものより認められ得るほどに小さい。Ｘｉ、２５０゜Ｇ、 Ｈ，ＤＡＰＩで後染色されたＴＣ５９３の技術的に劣った分裂中期のスプレッド のＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン（Ｇ）は、１８配列を有する４つの明確な染 色体をなお際立たせる（Ｈ）。

Ｘｌ、０００゜ 第１１図は、ｃｒｓｓハイブリダイゼーションにより染色体７　（Ａ〜Ｃ）　、 ２２　（Ｄ）および４（Ｅ）の開開および／または分裂中期のカウントのグラフ の表示である。開開のカウントは、よくハイブリダイゼーションした調製物の１ ５０の核について実施した。分裂中期のカウント〉２５について、完全なりＡＰ Ｉ染色したスプレッドを評価した。７つの特異的アルフォイドのＡ−Ｃのカウン ト（白い棒）を７つのライブラリーのインサート（陰影をつけた棒）と比較した 。Ａ１フィトヘムアグリチニン刺激ヒトリンパ球の開開核（４６，、ＸＹ）；　 Ｂ、間開核（７−特異的アルフォイド反復）および分裂中期スプレッド（フライ ブラリーのインサート）：Ｃ，ＴＣ５９３間期核（７開時異的アルフォイド反復 ）および分裂中期スプレッド（フライブラリーのインサート）。７アルフオイド 反復の高い厳格さハイブリダイゼーション（参照、材料および方法）を使用して 、他の染色体への交差ハイブリダイゼーションを回避した。両者の７ライブラリ ーのインサートおよびアルフォイド反復を使用する二重ハイブリダイゼーション （第２図Ｇ−１に示す）の場合において、５０％のホルムアミドを使用する標準 の条件は、多分ヒト競争ＤＮＡの存在のために、交差ハイブリダイゼーションを 回避するために十分であった。Ｄ、ＴＣ６２０（黒い棒）およびＴＣ５９３（陰 影を付けた棒）の分裂中期スプレッドにおける染色体２２のカウント。比較のた めに、これらの実験において内部対照として７ライブラリーのインサートを使用 して、交差ハイブリダイゼーションを同時に実施した（参照、Ｃ，Ｄおよび第７ 図）。Ｅ、開開カウント（白色の欅）および分裂中期カウント（陰影を付けた棒 ）を染色体４のインサートとハイブリダイゼーションしたＴＣ５９３において比 較した。シグナル調製物の比２：３は分裂中期および開開において同一であるこ とに注意されたい。

第１２図は、染色体７および２２（両者はビオチンで標識しそしてアビジン−Ｆ ＩＴＣで検出した）からのインサートとの二重ハイブリダイゼーション後のＴＣ ６２０分裂中期スプレッドを示す。２つの強（デコレーションされた２２染色体 （矢印）、３つの完全な７染色体、および７ｐｔｅｒ−ｑｌｌを含有する中部動 原体のマーカー染色体が、また、見られる。

第１３図は、神経膠腫細胞系ＴＣ５９３およびＴＣ６２０からの典型的な分裂中 期スプレッドにおけるデコレーションした正常および異常の染色体４．７および １８の相対的大きさのグラフの表示である。個々の面積は正規化し、こうして完 全な染色体は１の面積により表されている（参照、表１に対する凡例）。合計の 添加したシグナルは、存在する特異的染色体の同等体を反映する。白色の領域は 明らかに正常の染色体に相当し、黒色の領域は特異的ライブラリーのインサート によりデコレーションされた小さい遊離の染色体セグメントを示し、そして転座 されたセグメントに陰影を付けた。ＴＣ５９３における３つの転座した１Ｓ染色 体のうちの１つはこの測定により完全な染色体を表す（黒い点により示されてい る）が、２つの他の転座は、多分小さい試料の大きさのために、わずかに小さい 。

第１４図は、ビオチニル化されたＤＮＡプローブの組とのＣｌ５Ｓハイブリダイ ゼーシヨンによるヒト染色体２１の特異的標識っけを示す。

Ａ１プラスミドｐＰＷ５］、９−ＩＲ（６−Ｋｂのインサート）は正常のリンパ 球の分裂中期スプレッドにハイブリダイゼーションした。シグナルは、ＤＡＰＩ バンディング（図示せず）により評価して、２１ｐの末端に位置する（参照、イ ンサート中の４°、６−ジアミジノー７−フエニルインドール（ＤＡＰＩ）染色 した染色体）。ＢおよびＣ，９４Ｋｂのプラスミドのプールのプローブの組との ハイブリダイゼーション後の、正常ヒトリンパ球分裂中期（Ｂ）および核（Ｃ） 。ＤおよびＥ、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン（１４）のプロトコルによる９ ４Ｋｂのプローブの組（Ｄ）または染色体２１ライブラリーＤＮＡインサートと のハイブリダイゼーション後のトリソミー２１（４７、＋２１）リンパ球分裂中 期スプレッド上のシグナル１．（Ｅ）３つの染色体２１はライブラリーのインサ ートにより完全に描写される：追加の小さいシグナル（参照、テキスト）は矢印 ヘッドにより示されている（また、Ｇにおいて）。（Ｆ〜Ｊ）ライブラリーのイ ンサートによるトリラミー２１９フ８球ｃｎｌの標識づけ（ＦおよびＧＥＥと比 較）。

発明の詳細な説明 本発明は、偏在する反復したＤＮＡ配列からのハイブリダイゼーションシグナル の抑制は、高速再アソシエーション（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の反応速度 論に基づく再アニーリングの手順において全ＤＮＡを使用することによって達成 されるという、ハイブリダイゼーション法に基づく。本発明のハイブリダイゼー ション法は、このようなシグナルの選択的抑制のために、染色体の正常部位抑制 （ＣＩＳＳ）ハイブリダイゼーションと呼び、１または２以上の選択した個々の 中部動原体下の、とくにヒト染色体を、細胞のサイクルの任意の点において、特 異的に細胞染色を生じ、そして両者の有糸分裂細胞および開開細胞（すなわち、 開開核）における染色体異常を検出し、同定しおよび定量するために使用された 。

実施例において下にかつより詳細に説明する事項は、次の通りである１、　本発 明の方法（ＣＩＳＳハイブリダイゼーション）により、高い遺伝的複雑性（ｇｅ ｎｅｔｉｃ　ｃｍｐｌｅｘｉｔｙ）をもつ染色体特異的プローブの組（すなわち 、染色体ライブラリーＤＮＡ、クローニングしたＤＮＡ断片）を使用する、個々 のヒト染色体の有糸分裂細胞または開開細胞における特異的染色：２、　染色体 特異的ライブラリーのプローブを使用する、Ｃｌ５Ｓによる分裂中期および開開 の腫瘍細胞の特異的染色：および３、　Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを使用 する、遺伝状態（ダウン症候群）に関連するヒト染色体（染色体２１）における 種々の異常源からの有糸分裂細胞および開開細胞における急速な検出。

４、　染色体特異的独特配列のプローブのネスチングした組を使用して、染色体 異常を同一しそして遺伝病（例えば、ダウン症候群）を検出したことの実証。

個々のヒト染色体の特異的染色 ＣＴＳＳハイブリダイゼーション法の使用により、個々の（例えば、染色体１〜 ２２のＸおよびＹ染色体または相同性対）ヒト染色体は両者の有糸分裂細胞およ び開開細胞において特異的染色された。これは両者の分裂中期スプレッドおよび 開開核において実施され、そして適当な検出方法と組み合わせて、それぞれ、シ グナル−プローブのＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンおよびマルチ−プローブの ｃｒｓｓハイブリダイゼーションを使用して、多数の選択した（個々の）染色体 を同時に染色または標識した。この方法は第１図に概略的に表されている。

ゲノムのＤＮＡのライブラリーおよびクローニングしたＤＮＡを使用して特異的 染色体の染色 ｃｒｓｓハイブリダイゼ−ンヨンを次のようにして実施して、フローサイトメト リーでソーティングしたヒト染色体およびクローニングしたＤＮＡ断片から由来 した商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーを使用して、個々のヒト 染色体の特異的染色を生成した。パン・ディラ（ｖａｎ　Ｄｉ　Ｊ　ｌ　ａ）　 、Ｍ、　Ａ−ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、４　 ：　５３７−５５２　（１９８６）、偏在する反復配列、例えば、Ａｌｕおよび Ｋｐｎｌ要素からのハイブリダイゼーションシグナルの抑制は、高速再アソシエ ーションの反応速度論に基づく再アニーリング手順において全ヒトＤＮＡを使用 して達成された。

同様な原理は、他の人により使用されて、サザンブロツティングおよび正常部位 ハイブリダイゼーションの実験のためのニスミドＤＮＡクローンからの独特配列 のサブセットの選択的ハイブリダイゼーションが促進された。シアリイ（Ｓｅａ ｌｅｙ）、Ｐ、Ｇ、ら、核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ）、１３：１９０５ −１９２２　（１９８５）；およびランデシエンド（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ）　、 Ｊ、Ｅ、ら、ヒユーマン・シェネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎ　ｔ、）、７７　 ：　３６６−３７０　（１９８７）。両者の分裂中期スプレッドおよび開開核に おける個々の染色体の特異的標識づけは、実施例において詳細に記載する次の方 法において実施する（および起こったことを示す）。核のトポグラフィ−の分析 のための染色体のドメインの３−Ｄ再構成のためにコンピューターの助けを借り る光学的セクショニングの使用の可能性を、また、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシ ヨンと組み合わせて実証した。

最初に、ｌまたは２以上の選択した染色体からゲノムのＤＮＡをプローブＤＮＡ として使用するために調製する。ゲノムのＤＮＡはいつかの源から入手可能であ る。例えば、各々が問題の染色体を含有する、１または２以上のＤＮＡライブラ リー（染色体誘導ライブラリー）を使用して、必要なりＮＡプローブを生成する 。このようなライブラリーは、フローサイトメトリーでソーティングしたヒト染 色体から由来した、商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーであるす ることができる。

これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリイランド州ロッ クビレ）から入手可能である。ヒト染色体１．４．７．８．９．１２．１３．１ ４．１６．１７、ｐＵｃ１８、ツイーン２０，２１．２２および染色体Ｘのため のこのようなりＮＡライブラリーを、本発明のにおいて、実施例に記載するよう に使用した。他の商業的に入手可能なゲノムのＤＮＡのライブラリーまたは商業 的源以外からのゲノムのＤＮＡのライブラリーを、また、使用することができる 。あるいは、個々のプラスミド、ファージ、酵母、非酵母ＤＮＡインサートをも つ人工的染色体、およびニスミドＤＮＡクローンを、選択した個々の染色体また は多数の選択した染色体のためのＤＮＡプローブ源として使用することができる 。ゲノムのライブラリーからのＤＮＡの場合において、ＤＮＡは、検出可能なシ グナルで標識する前に、それを含有するベクターからのプールとして分離するか 、あるいはベクターから分離しないで使用することができる。

プローブを検出可能なシグナルで標識し、ここでシグナルは蛍光性レセプター、 特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジンまたは配位子−抗体）の一方の構成 員、または酵素であることができる。ベクターから除去したＤＮＡを、ニック翻 訳（例えば、Ｂ　ｉ　ｏ−１１，−ｄＵＴＰ）により、例えば、アマ−ジャムＣ Ａｍｅｒｓｈａｍ）マルチプライムＤＮＡ標識系を使用するランダムプライマー 伸長（例えば、３′末端のティリング）により、ｄＴＴＰをＢ　ｉ　ｏ−１１− ｄＵＴＰで置換するか、あるいは他の適当な技術により標識する。ベクターから の分離されなかったＤＮＡの場合において、ビオチンの標識づけはニック翻訳に より、標準の技術を使用して直接実施する。ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）ら、ウ ィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１２旦：３２−５０　（１９８３）。他の標識 を同様な方法において（例えば、２．４−ジニトロフェノール、ジゴキシン）付 加することができる。

プローブの大きさを注意して選択し、そしてコントロールして、プローブの浸透 を促進し、そして再アニーリングハイブリダイゼーションを最適化する。一般に 、５００ヌクレオチドより小さい標識したＤＮＡ断片を使用し、そして、より一 般的には、プローブの大部分は１５０〜２５０ヌクレオチドの長さである。この 長さのプローブは、より長いヌクレオチド配列から、適当な大きさの断片を生成 しそして回収するだめの普通に入手可能な酵素あるいは既知の技術を使用して作 る。また、選択した染色体のヌクレオチド配列が知られている場合、既知の技術 を使用して、その配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することができる。

このようなオリゴヌクレオチドは、いったん標識されると、特異的染色体領域を デコレーションするために使用することができる。例えば、哺乳動物の染色体の チオロマーの配列に特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドの プローブは同定された。モユイフ（Ｍｏｙｕｉｆ）ら、ブロシーデインダス・オ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｊ、）ＵＳＡ、Ｓｅｐ、１９８８゜ 競争（ｃｏｍｐｅｔ　ｉ　ｔｏｒ）ＤＮＡは、偏在する反復した配列からのハイ ブリダイゼーションシグナルを抑制する作用するＤＮＡであり、必要に応じて選 択されるであろう（例えば、その染色体を分析する動物に基づいて）。ヒト染色 体の場合において、競争ＤＮＡは偏在する反復した配列、例えば、Ａｌｕおよび Ｋｐｎｌ要素からのハイブリダイゼーションを抑制する作用をする全ヒトＤＮＡ である。それは多数の源から入手可能である。例えば、胎盤または白血球からの ヒトゲノムのＤＮＡは、既知の技術、例えば、ディビス（Ｄａｖｉｓ）らにより 記載されている技術により調製することができる。ディビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ） 　、Ｌ。

Ｇ、ら、分子生物学において基本的方法（Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｇｙ）、エルセビーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニュ ーヨーク／アムステルダム（１９８６）。それを標準の方法（例えば、ＤＮアー ゼで）消化して、プローブＤＮＡと同一の大きさ分布内の競争ＤＮＡ断片を生成 する。

ヒトＤＮＡの小さい部分とのみ競争しそして、必要に応じてハイブリダイゼーシ ョン混合物の合計の（最終）濃度を調節するために使用する、他の源からのＤＮ Ａは、また、必要に応じて含められるであろう。このＤＮＡはキャリヤーＤＮＡ と呼ぶ。このＤＮＡは、標準の方法を使用して生成または処理されるので、プロ ーブＤＮＡと同一の大きさ分布内に存在する。

最初に、検出可能な標識を有するプローブＤＮＡおよび競争ＤＮＡを予備アニー リングが起こるために適当な条件下に一緒にする。競争ＤＮＡと一緒にしたプロ ーブＤＮＡの量は、染色体の標的の相対的ＤＮＡ含量を反映するように調節する 。例えば、染色体１は染色体２１の中に存在するのＤＮＡのほぼ５．３倍のＤＮ Ａを含有する。プローブの濃度は、それぞれ、３０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍ ＋である。全ゲノムライブラリーＤＮＡをプローブ混合物として使用する（精製 したＤＮＡインサ−ト代わりに）とき、はぼ１０倍の標識したＤＮＡを、大量で 存在するベクター配列を補償するために添加する。ライブラリーＬＡＯＸＮＬＯ １（Ｘ染色体）およびＬＡ１６ＮＬＯ２（染色体１６）の場合において、ヒトＤ ＮＡインサートは全ライブラリーＤＮＡのほとんど半分を構成するので、標識し たライブラリーＤＮＡのほぼ２倍のみを添加する。キャリヤーＤＮＡ、例えば、 マスまたはサケの精巣ＤＮＡを、必要に応じて、前項て決定したレベルに全ＤＮ Ａ濃度をするために添加する。ここに記載するように、十分なサケの精巣ＤＮＡ を添加して、ハイブリダイゼーション混合物（ＤＮＡのすべての３つの型ニブロ ーブＤＮＡ、競争ＤＮＡおよび有意に競争しないＤＮＡを包含する）中のＤＮＡ の最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとする。

生ずるハイブリダイゼーション混合物を処理して（例えば、加熱により）存在す るＤＮＡを変性し、そしてほぼ３７℃において十分な時間インキュベーションし て部分的再アニーリングを促進する。

同定すべき染色体ＤＮＡ　（特異的に標識した）を含有する試料を、また、処理 して、例えば、加熱してＤＮＡを変性することによって、その中に存在するＤＮ Ａを相補的配列とのハイブリダイゼーションに有効とする。ハイブリダイゼーシ ョン混合物および試料をハイブリダイゼーションを促進する条件下にかつ十分な 時間、−緒にする。十分な時間後、染色体標的の特異的標識の検出を標準の技術 を使用して実施する。例えば、実施例に記載するように、ビオチニル化プローブ をフルオレセイン標識アビジンまたはアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合 体を使用して検出する。蛍光色素の検出のために、試料を、例えば、フルオレセ インイソチオ／アネート（ＦＩＴＣ）接合アビジンＤＣ３とともにインキュベー ションする（参照、実施例１）ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要に応じて、ビオ チン接合ヤギ抗アビジンＤ抗体とのインキュベーション、洗浄、およびＦＩＴＣ 接合アビジンとの第２ハイブリダイゼーシヨンにより実施することができる。酵 素活性の検出のために、試料を、例えば、ストレプトアビジンとインキュベーシ ョンし、洗浄し、ビオチン接合アルカリ性ホスファターゼとインキュベーション し、再び洗浄し、そして予備平衡化する（例えば、ＡＰ−緩衝液中で、実施例１ に記載するように）。酵素反応は、例えば、ニトロブルーテトラゾリウムおよび ５°オロモ４クロロ３インドリルホスフエートを含有するＡＰ緩衝液中で実施し 、モして２ＸＳＳＣ中のインキュベーションにより停止する。

Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを使用する染色体異常の検出前述の工程を使用 して、標的染色体と呼ぶ任意の選択した個々の染色体（または複数の染色体）、 またはその小領域を特異的に染色または標識することができる。実施例において 説明するように、本発明の方法は有糸分裂（例えば、分裂中期、前期）および開 開の細胞の両者の、種々の細胞において有用であることが示された。実施例２に 詳細に記載するように、本発明の方法のＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン方法は 、有糸分裂および開開の異数性腫瘍を個々の染色体の複雑な数および構造の異常 （例えば、染色体の数の変化、欠失および転位または転座）について急速にスク リーニングするために有用である。

これに関して、ビオチニル化ライブラリーＤＮＡインサートをＣｌ５Ｓハイブリ ダイゼーシヨン方法において使用してハイブリッド分子を生成し、これらの分子 を既知の技術を使用して検出した。２つの神経膠層系を異数性細胞、とくに腫瘍 細胞の一般的モデルとして使用した。一方は乏突起神経膠腫系であり、そして他 方は神経膠腫細胞腫系であった。

これらは染色体１．４．７．１８および２２に対して特異的なビオチニル化ＤＮ Ａプローブを使用して分析した。ｐｔｅｒからｑｔｅｒまでの染色体の特異的標 識づけは、分裂中期スプレッドにおけるおよび早期の前期および開開の核におけ る数の変化、欠失および転位を可視化を可能とした。完全な染色体、欠失した染 色体および転座した染色体のセグメントは、このような細胞の非常に複雑な核型 で急速に描写された。追加の小領域のプローブを、また、使用して異常の染色体 をさらに明らかにした。ディジタル画像の分析を使用して、各県の個々の分裂中 期および開開の細胞における特異的染色体のＤＮＡの全補体を定量した。染色体 ２１のリブリゼンテイションの低下および染色体７（詳しくは７ｐ）のリブリゼ ンテイションの過剰が観測された。これは普通の細胞遺伝学のバラディング（ｂ ａｕｄｉｎｇ）技術を使用する、他の研究者により従来の観測と一致する。ビグ ナー（Ｂｉｇｎｅｒ）、Ｓ、Ｈ，ら、キャンサー・ジエネティックス・アンド・ サイトジエ不ティックス（Ｃａｎｅｅｒ　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、） 、２２：１２１−１３５　（１９８７）：シャピｏ　（Ｓｈａｐ　ｉ　ｒｏ）　 、Ｊ、　Ｒ，、セミネス・オンコロジー（Ｓｅｍｉｎ、０ｎｃｏ＋、）　、１３ 　：４−１５　（１９８６）。

使用した２つの神経膠腫細胞系は、多数の神経膠腫細胞に共通のいくつかの細胞 遺伝学の特徴を表す。こうして、ＣＴＳＳハイブリダイゼーシクン方法を、同様 な方法において使用して、他の染色体を特異的にデコレーションしそして神経膠 腫瘍におけるそれらの染色体を検出することができることを期待することは、合 理的である。分析した２つの細胞の型は高度に異数性である（すなわち、それら は正常の４６よりむしろ１００の染色体を有する）。したがって、リン酸カルシ ウム方法を異数性（腫瘍）細胞の任意の型の評価において使用できることを期待 することは、合理的である。

こうして、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン方法は、患者における病気の診断お よびその状態（例えば、処置による進行、退行または変化）の監視の両者におい て、癌に関連する染色体異常の評価において使用することができる。この応用に おいて、単一の染色体または多数の染色体、およびその小領域の評価を実施する ことができる。各々が異なる標識を有する２つのＤＮＡプローブを使用する二重 ハイブリダイゼーションは、また、実施することができる。すなわち、ビオチニ ル化染色体７ライブラリーＤＮＡインサート、およびアミノアセチルフルオレン （ＡＡＦ）で修飾した染色体７上のアルフォイド反復に対して特異的のプローブ （ｐａ７ｔｌ）を使用して、２つの型の腫瘍細胞（ＴＣ５９３、ＴＣ６２０）の 両者の分裂中期スプレッドおよび開開核における染色体７の含量／特性を評価し た。ハイブリダイゼーション後、ビオチニル化染色体７のインサートをアビジン −ＦＩＴＣを使用して検出し、そして染色体７特異的アルフォイドＡＡＦＩａｋ 配列をテトラメチルフォダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）接合第２抗体 を使用して検出した。二重Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを使用して、染色体 ８および１４、バーキットリンパ腫細胞、高い悪性の形態の８９２８球腫瘍細胞 、例えば、両者の分裂中期スプレッドおよび間開細胞において見られるもの、の 間の翻訳を検出した。

これにより、２つの腫瘍細胞の型において存在する染色体筒７における類似性お よび差を検出することができる：ＴＣ５９３の中に存在する４つの完全な第７染 色体のみが検出可能な７動原体シグナルを含有した：より小さいおよび中部動原 体の第７染色体は７アルフオイド配列および７ｑ１１において異質染色質の小さ いブロックを欠いた（それが特徴ある動原体の領域を欠いたことを示す）、、対 照的に、ＴＣ６２０のすべての４つの染色体筒７は７アルフオイドプローブによ り標識された。二重Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシタンにより、また、１つの細胞 型（ＴＣ５９３）の中に存在する第７染色体を区別し、そして他方の細胞型（Ｔ Ｃ６２０）の中に存在する第７染色体の間の類似性（少なくとも評価した特徴に 関して）実証することができた。

二重ｃｒｓｓハイブリダイゼーションを使用して、パーキットのリンパ腫細胞に おける染色体８と染色体１４との間の転座を検出した：バーキットのリンパ腫は Ｂリンパ球腫瘍の高度に悪性の形態である。転座は両者の分裂中期スプレッドお よび開開細胞において検出された。

適当に選択したプローブおよび／または標識を使用することによって、多数のＣ ｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを同時に使用して分析することができる、異なる 染色体の数、ならびにそれらの染色体のあるのまたはすべてのものの上の小領域 の数を増加することができる。例えば、各々が標的染色体の小領域に対して特異 的である、１より多いプローブを使用して、その単一の染色体上のいくつかの小 領域を一度に分析することができる。また、各プローブの組（ＤＮＡまたはＲＮ Ａの断片の組）を明確な蛍光色素または異なるリポータ−分子で標識することが でき、これらの蛍光色素または分子は、プローブ−標的染色体のハイブリダイゼ ーションが起こった後、既知の技術により（例えば、特異的の蛍光また５　は酵 素試薬を使用することによって）、互いに区別することができる。

そのうえ、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンの「組み合わせの」変法ヒ　を使用 して、同時に評価することができる染色体の数を増加することが愛　できる。す なわち、各々が異なる蛍光色素（例えば、フルオレセインおく　よびローダミン ）で別々に標識した、２つの半分から構成されたプローブ配列の単一の組から作 られたハイブリダイゼーションプローブの混合物を使用することができ、前記２ つの半分は、ハイブリダイゼーションすると、もとの個々の蛍光色素の各々と光 学的に区別することができる第３の蛍光性の「色」またはシグナルを生成する。

この方法において２つの異なる蛍光色素の対は、３つの異なる蛍光色素の同定を 可能とする。

例えば、フルオレセインのみで標識したプローブの組はハイブリダイゼーション のとき１つの色を生ずるであろう；ローダミンのみで標識した同一のプローブの 組はハイブリダイゼーションのとき第２の（異なる）色を生ずるであろう。プロ ーブの組の半分が２つの一方で標識されるとき、両者の配列のサブセットは等し い確率で標的にハイブリダイゼーションすることができ、そして第３の（異なる ）色として感じられることができる（混合する塗料に類似する方法で）。２つの 蛍光色素を同一の分子の中に導入しないで、Ｅ転移（一方の蛍光色素のスペクト ルが他方の蛍光色素のそれとオーバーラツプする光を放射し、その光が第２蛍光 色素により吸収される、よ（知られているプロセス）の可能性を最小とすること が重要である。転移された電子は第２蛍光色素により放射され、これは第１蛍光 色素のクエンチングに導く。それらのスペクトルの特性のために選択した３つの 異なる蛍光色素の対となる組み合わせは、単一にそして対となる組み合わせで使 用して、同様な方法において生成することができる。これは６つの異なる蛍光性 の色またはシグナルを生成することができる（例えば、３つの対＋３つの単一の 蛍光色素）。４つの異なる蛍光色素の同様な組み合わせは１０の異なる蛍光性の 色またはシグナルを生成し、５つの異なる蛍光色素の同様な組み合わせは１５の 異なる蛍光性の色またはシグナルを生成する、など。組み合わせの蛍光色素（２ またはそれ以上の蛍光色素を組み合わせて同一のプローブの組を標識すること） のこの原理は、分裂中期および開開の染色体の分析に応用することができる。な ぜなら、各染色体は物理学的に別々の実在物であり、こうして明確な標的である からである。３つの異なる蛍光色素の混合物を使用する、複合プローブの標識づ けは、同時にマルチパラメーターの分析において有用な、なおいっそう大きい種 類の色またはシグナルを提供する。

同時に分析することができる染色体の数を増大する他のアプローチは、蛍光性の 「時間分割（ｔ　ｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）Ｊ法を包含する。

この場合において、ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）のプローブを、ランタニド類（例 えば、ユーロピウム、ツルビウム）に特異的に結合するキレート化「ケージ（ｃ ａｇｅ）Ｊで標識する。このような金属のキレートは蛍光性であるように作るこ とができる。それらは励起された状態の寿命を示し、これらの寿命はほとんどの 蛍光色素のそれら（半減期は六）秒の範囲である）より非常に長い（マイクロま たはミリ秒）。波長および蛍光性の寿命の両者は、使用するランタニド金属のイ オンの性質により影響を及ぼされる。光で数ナノ秒間励起しそして遮断を使用す る、パルス化ゲーティング系（ｐｕｌｓｅｄ−ｇａｔｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）を 使用する場合、寿命が短い蛍光色素の崩壊をそれらの基底状態にし、励起後規定 された時間（すなわち、１〜１００マイクロ秒）で検出器系を開き、そして寿命 が長い蛍光色素のみを検出することができる。この方法を使用して、同一のスペ クトルを有し、こうして時間因子を蛍光色素の区別に付加する、寿命が異なる２ つの蛍光性色素を識別することができる。

同時に分析することができる異なる染色体の数を増加する他のアプローチは、染 色体を取り付けた蛍光色素の柔軟性または剛性により区別する検出系に基づく。

ここで、２つの一本鎖のプローブの組を同一の蛍光色素で標識することができ、 一方ブローブの組において、蛍光色素をＤＮＡの本体の中に導入し、これは問題 の標的ＤＮＡとハイブリッドの分子を形成するであろう。第２プローブの組にお いて、蛍光色素はＤＮＡ配列の中に導入し、これは標的ＤＮＡとハイブリダイゼ ーションしない（例えば、デオキシヌクレオチドの末端トランスフェラーゼでポ リｄＡ−蛍光色素の３°−テイルを付加し、蛍光色素標識した異質ＤＮＡをプロ ーブのＤＮＡに結合するか、あるいはこの分野において知られている他の普通の 第２の標識づけ技術による）。ブローブー標的染色体のハイブリッドを形成する 、ＤＮＡの本体内の蛍光色素は、固定化されるようになり、こうして溶液中で自 由に回転することができないであろう。対照的に、ハイブリッドの形成に関係し ない一本鎖ＤＮＡ中の蛍光色素は、固定化されず、そして溶液中で非常にいっそ う自由に回転することができる。蛍光色素の回転の自由度の割合を測定する（例 えば、偏光で照明したとき、蛍光色素が偏光をな（す速度を測定する）ことによ って、２つの組のプローブを識別することができる。

遺伝学的障害および染色体損傷に関連する染色体異常の急速な評価のためのＣｌ ５Ｓハイブリダイゼーシヨンおよび領域的に定められたプローブの総使用 Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン法は遺伝学的障害（例えば、染色体２１の場合 において、ダウン症候群）に関連する染色体異常（例えば、染色体２１の数およ び構造の異常）の急速な評価のために有用であることが実証された。分裂中期お よび開開の細胞において末端のバンド２１Ｑ２２．３を特異的に標識するか、あ るいは全染色体２１の異常をデコレーションするＤＮＡプローブの組は、実施例 ３に記載されている。ヒト染色体２１からクローニングしたＤＮＡ断片は、種々 の細胞の型において分裂中期スプレッドおよび同種の染色体領域を特異的に標識 するために有用である。すなわち、染色体２１のプローブの組を使用するＣｌ５ Ｓハイブリダイゼーシヨンは、リンパ球、胚の慢性の絨毛細胞および神経膠腫瘍 細胞系（ＴＣ６２０）において染色体２１ＤＮＡを標識／同定するとき有効であ ることが示された。バンド２１ｑ２２．３からの独特なプローブの組を、また、 使用して充実組織（「正常の」ヒト脳組織）中の染色体２１を検出した。こうし て、ｃｒｓｓハイブリダイゼーションおよび独特配列のプローブのプールを使用 するハイブリダイゼーションは、ダウン症候群および他の遺伝学的障害または染 色体異常に関連する他の状態の診断手段として可能性を有する。

結果は、核の大部分（５５〜６５％）がハイブリダイゼーションの３つの明確な 焦点を示すので、三染包体の核型を開開細胞において容易に診断することができ ることを実証する。対照的に、二乗包体の核型をもつリンパ球中の０．　２％よ り少ない核は３つの核のシグナルを示す：興味あることには、正常のＣｖ細胞中 のこのような核の百分率はより高いが、なおかなり５％より小さい。一般に、２ ０〜３０程度に少ない細胞は二乗包体および三染包体の細胞の集団を明瞭に区別 するために十分であった。しかしながら、臨床的試料における染色体２１のモザ イク現象のレベルの不明確さにかんがみて、明瞭な診断を実施するために要求さ れる細胞の数はより高いように思われる。追加の臨床的相関関係は、絶対数の確 立を必要とするであろう。それにもかかわらず、この分析のアプローチは、細胞 の培養または分裂中期スプレッドを得ることを必要とないで、ダウン症候群の診 断を可能とするであろう。それは、また、診断の実施に要する時間を、現在の１ ０〜１４日から１日以下に減少するであろう。

独特ヒトＤＮＡのみを含有する選択したプラスミドのクローンをここで使用した が、反復配列を含有するコスミドのクローンを、また、使用して、反復配列の要 素のシグナルの寄与を抑制するＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンに似たハイブリ ダイゼーションのプロトコルを適用することによって、分裂中期および開開の細 胞における、それらの同種のゲノム領域を特異的に標識することができる。した がって、コスミドの単一のまたはネスチングした組を、ここで報告するものに類 似する方法で、他の遺伝学的病気のための診断道具として使用することができる であろう。染色体１３．１８および２１の三染色体性および染色体ＸおよびＹの 数の変化は、−緒に、出生前の核型分析の間に同定された、数の染色体異常のほ とんど大部分の原因となる。多数の非アイソトープのプローブの標識づけおよび 検出系の連続する開発により、３またはそれ以上の染色体を正常部位ハイブリダ イゼーションに従い同時に可視化することができるであろう。同時に評価するこ とができる染色体の数および／または染色体領域の数を増加するｃｒｓｓハイブ リダイゼーションの、前節に記載した、変法を、また、遺伝学的障害および染色 体の損傷に関連する染色体異常の検出に使用することができる。こうして、羊水 または慢性の絨毛細胞からの開開細胞における主要な三染包体の障害を検出する ための、迅速な自動化されたスクリーニング試験の展開は、実行できる将来の目 的である。正常部位ハイブリダイゼーションによる特異的ヒト染色体の分析は、 高度に異数性の腫瘍系統の従来の細胞発生の研究を補足するために、既に、使用 され（実施例２）、そして出生前の診断の応用への拡張は保証されていると思わ れる。

染色体２１の転座による核型の分析は、分裂中期染色体上の明瞭なシグナルによ る小さい転座を迅速に同定およびなおさらに特性決定し、こうして高い分解能の バンディングにより広範な分析を回避する、領域のプローブの組の有用性を示す 。対照的に、ライブラリーインサートプローブは、転座された染色体２１のＤＮ Ａの相対量を定めるために、いっそう適当である。開開核を分析することによっ て、また、染色体の領域の釣り合ったまたは釣り合わない数が存在するかどうか を決定することができる。しかしながら、核中で直接転座した染色体を検出する ことは、染色体２１の物質が転座したレセプター染色体を同定するために、二重 の標識づけを必要とするであろう。問題の染色体の前の知識を使用すると、この ような転座の事象は核のシグナルの並置を測定することによって評価することが できるであろう。ラポルド（Ｒａｐｐｏｌｄ）、Ｇ。

Ａ、ら、ヒユーマン・ジエネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ、）　、６７：３１ ７−３２５　（１９８４）。

染色体Ｘ上の全体の筋ジストロフィー（ＭＤ）の位置に広がるコスミドのクロー ンを使用して、染色体Ｘと染色体４との間の転座が同定された。

６ｋｂの配列を含有するプローブは、高い効率で、分裂中期スプレッドおよび間 開細胞の両者において局在化された。非アイソトープの試薬を使用するこの検出 の感度は、他の最近報告において達成されたものに類似する。非アイソトープの 正常部位ハイブリダイゼーションとＤＡＰＩまたはＢｒｄＵｒｄのバンディング またはライブラリーＤＮＡプローブを使用して全染色体のデコレーションとの組 み合わせは、こうして、遺伝子のマツピングのための間車な一般的アプローチを 提供する。組み合わせの蛍光技術は、また、い（つかの染色体の領域を同時にに 検査することを可能とし、こうして正常部位ハイブリダイゼーションによる遺伝 子連鎖の分析を可能とするであろう。それは、また、転座の染色体上の破壊点を 急速に正確に定めるための小さいＤＮＡプローブの使用を促進し、これはさらに ダウン症候群のために重要なゲノムのセグメントの決定を促進するであろう。

Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンを使用する染色体特異的配列の同定および分離 本発明のＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン法を、また、使用して、染色体特異的 配列を同定しそして、引き続いて、それらをそれぞれの配列から、既知の技術に より、分離することができる。非特異的または反復の配列から分離され、そして 標識された、このような染色体特異的配列て使用して、問題の染色体または染色 体領域（例えば、遺伝学的障害に関連するか、あるいは伝染病を引き起こすもの ）を同定し、検出しおよび／または定量することができる。１または２以上の選 択した標的核酸配列についてアッセイすべき試料および反復配列から分離した、 適当に選択した標識した染色体特異的配列（例えば、１または２以上の染色体に 対して特異的の配列、一般に標的核酸配列と呼ぶ、これらは適当な条件下に試料 中で検出および／または定量される）の組み合わせは、試料の中に存在する相補 的配列とハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションは、相補的配列 が存在しない場合、もちろん、起こらない。

このような分離した染色体特異的核酸配列は、標準のハイブリダイゼーション技 術を使用して、問題の染色体または染色体領域の同定、検出および／または定量 のために使用するキットの中に組み込むことができる。例えば、染色体２１特異 的（または染色体２１の一部分に対して特異的）であり、Ｃｌ５Ｓハイブリダイ ゼーシヨンにより同定され、そして染色体２１上に存在する反復配列から分離さ れた、標識した核酸配列を、キットの中に、他の試薬、例えば、緩衝剤、競争Ｄ ＮＡ、キャリヤーＤＮＡおよび試料の中に存在する染色体２１配列にハイブリダ イゼーションした標識した染色体２１誘導核酸配列の検出に必要な物質と一緒に 、含めることができる。このようなキットは、明らかなように、問題の１また： よ２以上の染色体からの染色体誘導核酸配列を含むように製造することができる 。ハイブリダイゼーションした配列の検出に有用な観争ＤＮＡ、キャリヤーＤＮ Ａおよび物質は前述した通りである。

Ｃｌ５ＳハイブリダイゼーシヨンにおいてゲノムのＤＮＡライブラリーを使用す る個々のヒト染色体の細胞特異的染色ＤＮＡライブラリー 次のヒトコスミドのゲノムのライブラリーは、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションから入手した：ＬＡＯＩＮＳＯ１（染色体１）　、ＬＬ０４ＮＳ Ｏ１（染色体４）　、ＬＡＯ７ＮｓＯ１（染色体７）、ＬＬ０８ＮＳＯ２（染色 体８’）　、ＬＡ１３ＮＳＯ３（染色体１３）、ＬＬ１４ＮＳＯ１（染色体１４ ）　、ＬＬ１９ＮＳＯ１（染色体１８）、ＬＬ２ＯＮＳＯ１（染色体２０）ＬＬ ２１ＮＳＯ２（染色体２１）、ＬＡ２２ＮＳＯ３（染色体２２）　、ＬＡＯＸＮ ＬＯＩ　（染色体Ｘ）。寒天プレート上のこれらのライブラリーの増［（バクテ リアの宿主としてＬＥ３９２細胞を使用する）、λファージの精製およびファー ジ−ＤＮＡプールの抽出は標準のプロトコルに従い実施した。マニアチス（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ）Ｔ、ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏ　Ｉ　ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）コー ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、：ｌ−ルド°ハーバ−、ニュージャーシイ州 （１９８２）。

分裂中期スプレッドおよび線維芽細胞の調製正常の大人の男性（４６、ＸＹ）か らのフィトヘムアグリチニン刺激したリンパ球をマツコイの５Ａ培地［ギブコ（ ＧＩＢＣＯ）］中で培養し、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）停止し、０．０７ ５モルのＫＣＩの低張溶液で処理し、酢酸−メタノール中で固定し、そして分裂 中期スプレッドを標準の手順により作った。低い継代培養の正常ヒト包皮の線維 芽（４６、ＸＹ）を顕微鏡のスライド上で成長させ、バラホルムアルデヒドで固 定し、そしてより完全な三次元構造をもつ調製物の研究について記載されたよう に浸透化した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｅｓ）、Ｌ、アナル・オブ・ 二ニーヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ、ＮＹ　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、）、４旦０　：　２０５−２２１　（１９８５）。

正常部位ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡの調製インサートのＤＮＡプロ ーブ。　染色体のＤＮＡライブラリーからのゲノムのＤＮＡの断片を、シャロン ２１Ａベクターアームからのプールとして適当な制限酵素［ＥｃｏＲＩ　（ＬＡ ライブラリー）またはＨｉｎｄｌＩＩ（ＬＬライブラリー）］を使用する消化お よび引き続り０．６％のアガロースゲル中の調製用電気泳動により分離した。イ ンサート断片をエルトラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）［シュレイヘル・アンド・シュ エル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）］中の電気溶離により ゲルのスライスから分離し、そしてエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄカラムのク ロマトグラフィー［シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ））によりさらに精製した。次いで、ＤＮＡをフェノー ル／クロロホルム（１：　１）で抽出し、そしてエタノール沈澱させた。このＤ ＮＡ断片のプールを、Ｂｌｏ−１ｌ−ｄＵＴＰを使用するニック翻訳によるか、 あるいはｄＴＴＰを０゜５ミリモルのＢｉｏ　１ｌ−ｄＵＴＰで置換するマルチ プライムのＤＮＡ１ｌｌｉｌ系［アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　 ］を使用するランダムプライマー伸長により標識した。ランガー（Ｌａｎｇｅｒ ）　、Ｐ、Ｒ，ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、ヱ 旦：６６３３−６６３７　（１９８１）およびブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）、Ｄ 。

Ｊ、ら、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１２旦：３２−５０（１９８３）。

あるいは、染色体特異的ライブラリーのＤＮＡを直接ニック翻訳によりビオチン 標識した（ベクターのアームを分離しないで）。

プローブの大きさ。　プローブの浸透を促進しかつ再アニーリングハイブリダイ ゼーシジンを最適化するために、５００ヌクレオチドより小さい標識したＤＮＡ 断片を有するすることが望ましいニブローブの大部分は一般に１５０〜２５０ヌ クレオチドの長さである。ＤＮアーゼの濃度をニック翻訳反応において実験的に 確立して所望の大きさの範囲の断片を生成し、そしてこれをアガロースゲルの電 気泳動により評価した。

ランダムプライマーの伸長を、また、匹敵するＤＮＡの大きさの分布を生ずる条 件下に実施した。

競争ＤＮＡ、記載されたように調製した、ヒトゲノムのＤＮＡ　（胎盤または白 血球から）、ならびにサケの精巣９ゲノムのＤＮＡ　［シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ） ］をＤＮアーゼで消化して、プローブＤＮＡと間−の大きさ分布をもつ断片を生 成し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させた 。ディビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ）　、Ｌ、Ｇ。

ら、「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓ　ｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇ）’）Ｊ、！ルセビーア（ＥｌｓｅｖｉｅｒＬ ニューヨーク　アムステルダム（１９８６）。これらの競争ＤＮＡは、第２図を 参照して記載したように、プローブ配列とともに変化する比率で使用した。

再アニーリングおよびハイブリダイゼーション。　標準の条件下に、５μｇ／ｍ １〜３０μｇ／ｍ＋のライブラリーのインサートの断片を表す、ビオチン標識し たＤＮＡ、および変化する量の競争ＤＮＡを一緒にし、エタノール沈澱させそし てホルムアミドの中に再懸濁した。プローブの濃度を調節して、各染色体標的の 相対的ＤＮＡ含量を反映させた。

例えば、染色体１は染色体２１のほぼ５．３倍のＤＮＡを含有する：こうして、 使用するプローブの濃度は、それぞれ、３０μｇ／ｍｌおよび５　μｇ／ｍＩで あった。メンデルソーン（Ｍｅｄｅ　Ｉ　５ｏｈｎ）　、Ｍ。

Ｌ、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１７９：１１２６−１１２９（１９７ ３）。精製したＤＮＡインサー６代わりにプローブの混合物として全体の全ライ ブラリーＤＮＡを使用したとき、１００倍程に多いＤＮＡを大量のベクター配列 を保証するために添加した。Ｘ−染色体ライブラリ−１ＬＡＯＸＮＬＯＩ、の場 合において、２倍程度に多い標識したライブラリーＤＮＡを使用した。なぜなら 、ヒトＤＮＡインサートは全ＤＮＡのほとんど半分を構成するからである。比較 の目的で、ハイブリダイゼーション混合物中のヒト競争ＤＮＡの濃度を１〜１． ０ｍｇ／ｍ＋で変化させ、そしてサケの精巣ＤＮＡを必要に応じて添加して、５ ０％のホルムアミド、１Ｘｓｓｃ　（０，１５モルの塩化ナトリウム、０゜００ １５モルのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）および１０％の硫酸デキストラン 中のＤＮＡの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとした。これらの溶液を７５℃に５分 間加熱してＤＮＡを変性し、次いで３７℃において種々の時間インキュベーショ ンして部分的再アニーリングを促進した。

予備アニーリング工程をエッペンドルフ管中で、検体へのハイブリダイゼーショ ン混合物の適用直前に、実施した。ガラススライド上の核および染色体のスプレ ッドを７０％のホルムアミド、２ｘＳＳＣ］中で７０℃において２分間インキュ ベージタンして、染色体のＤＮＡを変性し、次いで１系列の水冷エタノール中で 脱水した（７０％、９０％および１００％、各々３分間）。予備アニーリングし たプローブ混合物（２，５μｍ／ｍりを４２℃予備加温したスライドに適用した 後、カバースリップを添加し、そしてゴムセメントでシールした。次いで、試料 を直ちに３７℃において湿った室内で１０〜２０時間インキュベーションした。

パラホルムアルデヒドの固定を使用して検体の３−Ｄ構造を最適に保存した場合 において、スライドを５０％のホルムアミド、１ｘｓｓｃ　（２×５分）中で平 衡化し、過剰の流体を試料を乾燥せずに除去し、プローブ混合物を添加しく５μ ｍ／ｃｍす、そしてカバースリップを取り付け、そしてゴムセメントでシールし た。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｅｓ）、Ｌ、アナル・オブ・ニューヨー ク・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ、ＮＹ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、 ４５０：２０５−２２１　（１９８５）。両者のプローブおよび細胞のＤＮＡの 変性は７５℃において５分間実施した後、ハイブリダイゼーションを３７℃にお いて一夜進行させた。

検出 ハイブリダイゼーション後、スライドを５０％のホルムアミド、２×ｓｃｃ　（ ３％５分、４２℃）中で洗浄し、次いでＯ，ｌＸ５ＳＣ（３×５分、６０℃）中 で洗浄した。その後、スライドを３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、４ｘ ＳＳＣと３７℃においてほぼ３０分間インキ二ベーンヨンした。ビオチニル化プ ローブの検出は、フルオレセイン標識したアビジンまたはアビジン−アルカリ性 ホスファターゼ複合体を使用して達成した。すべての検出試薬は４ＸＳＳＣ１０ ，１％のツイーン２０．１％のＢＳＡ中で構成し、そしてすべての洗浄は４ｘＳ ＳＣ，０゜１％のツイーン２０　（３％３分、４２℃）中で実施した。蛍光色素 の検出のために、スライドを５μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアナート （Ｆ　Ｔ　ＴＣ）接合アビジンＤＣＳ　［ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］と３７℃において３０分間インキュベーシ ョンし、次いで洗浄した。希な場合において、ＦＩＴＣシグナルは、５μｇ／ｍ ｌのビオチン接合ヤギ抗アビジンＤ抗体（ベクター・ラボラトリーズ）と３７℃ において３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、５μｇ／ｍｌのＦＩＴ Ｃ接合アビジン（３７℃、３０分）と第２回のインキュベーションを実施し、最 後に洗浄することによって増幅した。ピンケル（Ｐｉｎｋｅｒ）　、Ｄ、ら、プ ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　 ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８３　：　２９３４−２９３８　（ １９８６）。酵素活性による検出のために、試料を２．５μｇ／ｍｌのストレプ トアビジンとインキュベーションし、洗浄し、２μｇ／ｍｌのビオチン接合アル カリ性ホスファターゼ（ベクター・ラボラトリーズ）とインキュベーションし、 再び洗浄し、そしてＡｐ−緩衝液９．　５　（１００ミリモルのトリスＨＣＩ、 ｐＨ９，５，１００ミリモルのＮａＣ］、５０ミリモルのＭｇＣ＋２）中で２× ５分間室温において予備平衡化した。酵素反応を３３０μｇ／ｍｌのニトロブル ーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および１６５μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルホスフェート（ＢＣＩ　Ｐ）を含有するＡＰ緩衝液９゜５中で ３７℃において０．５〜１時間実施し、そして２ＸＳＳＣ中のインキュベーショ ンにより停止した。すべての調製物は２００ｎｇ／ｍｌの４．６−ジアミジノー ７−フエニルインドールニ塩酸塩（ＤＡＰＩ）　、２ＸＳＳＣで５分間室温にお いて反対染色し、そして２０ミリモルのトリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，２，３％の ＤＡＰＣＯアンチフエーチンａｎｔｉｆａｄｅ）、１，４−ジアザビシクロ−２ （２，２，２）オクタンを含有する９０％のグリセロール中で取り付けた。ジタ ンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　、Ｇ。

Ｄ、ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、５５：２３１−２４２　（１９８２）。

デンシトメトリー フレームグラツバ−（ＩＴＥＸ　ＦＧ−１０１、画像形成技術）ａｈＶグラフィ ックス・ワークステーション［ＶＡＸステーションＩＩ／ＧＰＸ、ディジタル・ イクウィップメント・コーポレーション（Ｄ　ｉ　ｇ　ｔｉａｌ　Ｅｑｕｉｐｍ ｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎ）コおよびツアイス（Ｚｅｉｓｓ）Ｓ−プラナ −（Ｐｌ　ａｎａｒ）６０ｍｍし：ｚズを有するディジ（Ｄａｇｅ）−ＭＴＩ− ６５ビデオカメラを、マヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　ｌ　ｉ　ｄ　ｉ　ｓ）　、 Ｌ、およびＪ、ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソー？　（Ｃｈｒｏｍｏｓｏ ｍａ）　、９６　：　３９７−４１０　（１９８８）に記載されているように使 用した。画像をネガから直接ディジタル化し、そしてディスクに保存した。バッ クグラウンドを除去し、そして各染色体のまわりの多角形領域を定めた。限界の 密度のレベルを使用して、定めた多角形の区域内の染色体の領域の輪郭を描いた 。これらの輪郭を描いた染色体の領域、Ｒ１内の平均の密度のレベルを合計のシ グナルｆ　Ｉ　（ｘ、ｙ）　ｄＲ／面積面積上り決定し、ここでｆ　Ｉ　（ｘ、 ｙ）は領域Ｒ内の各点における絵素の強度（０〜２２５）である。限界のバック グラウンドの強度を、標識した染色体７およびバックグラウンドの染色体の両者 について、平均の領域の密度から減じた。シグナル対ノイズの比を平均の染色体 ７のシグナル／平均のバックグラウンドの染色体のシグナルとして計算した。

前述の研究の結果を下に説明する。これらの結果は、示した個々の染色体の特異 的標識づけを明瞭に実証する。最初の節はビオチンで標識した染色体のライブラ リーのインサートの使用を説明し、そして第２の節はＤＮＡインサートの断片の 使用を説明する。

第２図は、後述するように、異なる濃度による、染色体７誘導ＤＮＡライブラリ ー内の交差反応した配列からのシグナルの抑制を示す。

第２図Ａは、ビオチンで標識し、そしてヒト競争ＤＮＡをもたない正常ヒトリン パ球からの分裂中期スプレッドにハイブリダイゼーションした、染色体７ライブ ラリーのインサートを示す。２つのＮｏ、７染色体の優勢の標識づけが観察され る；さらに、ハイブリダイゼーションの明確なバンド様パターンが大部分の他の 染色体上に見られ、そして２つのＥ一群の染色体はことに鮮明に染色されている 。この一般的染色体のバンディングのパターンはＲ−バンディングに類似し、そ してバックグラウンドの交差ハイブリダイゼーションのシグナルの有意の部分が Ａｌｕ反復配列から由来することを示唆する。従来の研究は、Ａｌｕ配列がＲ− バンディングのパターンを描写するが、ギエムサ（Ｇｉ　ｅｍｓａ）陽性バンデ ィングびプロフィルはＫｐｎＩ散在反復により際立っている。

マヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　ｌ　ｉ　ｄ　ｉ　ｓ）　、Ｌ、およびＣ，Ｄ、　 ’７−ド（Ｗａ　ｒ　ｄ）　、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９１： ２８−３８　（１９８４）。

反復要素からハイブリダイゼーションシグナルを排除する実験手順の確立 したがうて、１系列のパイロットの研究を実施して、このような反復２列からハ イブリダイゼーションシグナルを排除するための実験のパラメーターを確立した 。溶液中の核酸の再アソシエーション（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の反応速 度論は、核酸の合計の濃度（Ｃｏ、ヌクレオチドのモル数／リットル）および復 元の時間（１，秒）に依存する。

再アソシエーションの条件が温度（ホルムアミドの濃度を考慮する）、カチオン の濃度および緩衝系について標準化されるとき、再アソシエーションの反応速度 論Ｃｏｔ値に関して比較可能である。規定された条件下に、高度に反復性のＤＮ Ａを含有する哺乳動物のゲノムの速い再アソシエーションの分画はＩ　Ｘ　１０ −’〜５Ｘ１０−’のＣｏｔ値において完全に再アニーリングされる：中程度の 反復ＤＮＡを含有する中間の分画はｌＸｌ０”のＣｏｔ値において完全に復元さ れる。ブリラテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）、Ｒ，Ｊ、およびり、　Ｅ、　：Ｉ−ネ（ Ｋｏｈｎｅ）、サイエンス（Ｓｃｆｅｎｃｅ）　、１６１　：５２９−５４０　 （１９６８）、こうして、１．０ｍｇ／ｍ＋のヒトＤＮＡ濃度（３Ｘ１０−”モ ルのヌクレオチド／リットルに相当する）において、速い分画はほぼ１０秒で復 元されるが、中程度の反復ＤＮＡは完全な再アニーリングに到達するために９時 間以上を要するであろう。偏在する反復ＤＮＡの大部分またはすべてを含有する 再アンシエーションするＤＮＡの速い分画は交差ハイブリダイゼーションシグナ ルを引き起こすので、１．０ｍｇ／ｍｌの合計のＤＮＡ濃度を使用し、そしてプ ローブ混合物の部分的アニーリングは検体への適用前に可能であった。最適な復 元時間は実験的に決定した（下を参照）。これは重要であった。なぜなら、正常 部位ハイブリダイゼーションは再アソシエーションの反応速度論が決定される標 準の条件（例えば、３７℃における５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼー ションは約７０℃における０％のホルムアミドに相当する；硫酸デキストランは 、また、再アソシエーション時間を有意に増加する）から偏るからである。さら に、中程度の反復ＤＮＡが非特異的シグナルにどの程度寄与するか、したがって 、また、予備アニーリング手順によりハイブリダイゼーションから防止されるか は不明瞭であった。

再アニーリングおよび正常部位ハイブリダイゼーションの実験のための厳格さを 、５０％のホルムアミド中で３７℃（標準の正常部位ハイブリダイゼーションの プロトコルから適合した）およびｌＸ５ＳＣ［Ｑ。

１６５モルのこのカチオン濃度は反応速度論、ブリラテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）　 、Ｒ，Ｊ、およびり、Ｅ、：Ｉ−ネ（Ｋｏｈｎｅ）の研究において使用した濃度 に近い。ブリラテン（Ｂｒｉｔｔｅｎ）、Ｒ，Ｊ、およびり、Ｅ、：ｌ−ネ（Ｋ ｏｈｎｅ）、サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ）　、１６１　：　５２９−５４ ０　（１９６８）］において決定した。競争ヒトＤＮＡを再アソシエーション手 順において添加して、所望の最終の高いＤＮＡ濃度にしそして予備アニーリング するであろうＤＮＡ配列の高い反復レベルを維持した。合計のヒトゲノムのＤＮ Ａは予備アニーリングにより除去すべき高度に反復性のＤＮＡのすべてを表すが 、それは、また、標的染色体の配列を含有する。こうして、過剰量のヒトＤＮＡ の添加は染色体特異的シグナルを減少することが期待されるであろう。したがっ て、競争体として使用する合計のヒトＤＮＡの最適な濃度をまず決定した。

合計のＤＮＡ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌの一定に保持するために、ゲノムのサケＤ ＮＡを必要に応じて添加した。サケＤＮＡはある種の反復ＤＮＡ要素、例えば、 ヒトＤＮＡに普通であるポリｄＣｄＡを共有するが、他のもの、最も顕著にはＡ ｌｕ−およびＫｐｎＩ反復を欠く。ハマダ（Ｈａｍａｄａ）　、Ｈ，ら、プロシ ーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

’）ＵＳＡ、７９　：　６４６５−６４６９　（１９ｇ２）。これは、再アソシ エーション反応においてサケＤＮＡの量が増加するにつれて、後者の配列の頻度 を低下する。

第２図は、２０μｇ／ｍｌの染色体７のプローブの組を５０μｇ／ｍ！　（Ｂ） 　、１００μｇ／ｍｌ　（Ｃ）　、２００μｇ／ｍｌ　（Ｄ）または１０００μ ｇ／ｍｌ　（Ｅ）の、２０分間予備アニーリングしたＤＮアーゼ消化ヒトゲノム のＤＮＡと一緒に変性したとき得られた、典型的な実験結果を示す。ハイブリダ イゼーションおよびアビジン−ＦＩＴＣを使用する検出は、前述したように実施 した。各調製物について、１０枚の黒白の写真をデンシトメトリーの研究のため に標準化した写真の条件下に撮った（下を参照）。ヒトゲノムの競争体の不存在 下に（Ａ）、シグナルは染色体特異的をほとんど示さなかった。しかしながら、 ５０および１００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡでは、標識特異性が容易に明らか である（第２図Ｂ、　Ｃ）。染色体７の特異的染色は１００および２００μｇ／ ｍｌヒト競争ＤＮＡを使用してシグナルの強度のピークで達成された（第２図Ｃ ，Ｄ）。より高い濃度のヒトＤＮＡは、ことに１０００μｇ／ｍｌのヒトＤＮＡ において、シグナルの強度の明らかな減少を引き起こした（第２図Ｅ）。しかし ながら、これらの後者の条件下に得られたシグナルは観測者に合理的になお輝い ているが、最適な例示には異なる露出を必要とする（図示せず）。

定量的デンシトメトリーのコンピューターにより助けられる方法（上を参照）を 使用して、標識づけの特異性の全体のレベルを確立した。間」の標的染色体から の蛍光性シグナル対非標的染色体から発するバックグラウンドの蛍光性のノイズ の比は、第２図に図解するように、ＤＮＡの滴定実験の多数の写真ネガからディ ジタル化した画像から決定した。

ヒト競争ＤＮＡの各濃度で得られたシグナル対ノイズ比を表１に記載する。

５０　７４．５０　８　３７ｊ３２Ｂ　１．９９±０．０７Ｚｏｏ　１６２．６ ４　８　２０．０６　２３　１１．１１’ｆ０．３５２００　１１！＋７．３５ 　８　２０．５３　２６　７．１１１±０．３７５００　８９．７８　Ｂ　１８ ．６３　２１　４．８２±０．２８１０００　９１！ｉ、３７　Ｂ　３０．５１ 　１フ　３．ｏ９±０．１２°　標的染色体の絵素の強度の平均値 ５　非標的染色体の絵素の強度の平均値（同一の分裂中期スプレッドから） ゛　信頼区間はフィエラー（Ｆ　ｉ　ｅ　ｌ　］　ｅ　ｒ）の理論を使用して計 算した［フィンネイ（Ｆｉｎｎｅｙ）、Ｄ、Ｊ、　、生物学的アッセイにおいて 統計学的方法（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｇｉｃａｌ　ａｓｓａｙ）、第２版、ハフナー・プレス（ Ｈａｆｎｅｒ　Ｐｒｅｓｓ）、＝ニーＥｌ−り、１非特異的シグナルの抑制のた めに最適な再アニーリング条件（２０μｇ／ｍｌの染色体７のプローブおよび１ ００〜２００μｇ／ｍｌのヒトゲノムのＤＮＡを使用する）は、約８：１のシグ ナル対ノイズの比を与えた。ハイブリダイゼーションの厳格さを増加することに よって（例えば、Ｏ，Ｘ５ＳＣ）シグナル対ノイズ比を改良する追加の試みは、 明らかな改良を与えず、そしてシグナル強度の全体の減少に導いた。

約１００〜２００μｇ／ｍｌのヒト競争ＤＮＡは最適の特異性を与えることが示 されたので、２００μｇ／ｍ＋を復元時間に関するシグナルの特異的の他のそし てのために使用した（上を参照）。０．２．５．１０．２０．４０および５０分 の予備アニーリング後、アリコートを取り、そして前述のように正常部位ハイブ リダイゼーションの実験のために使用した。第３図に示すように、特異的標識づ けはすべての予備アニーリング時間について得られた。シグナルの小さい改良は 復元時間を０から２０分に増加するとき見られる。６０分までのより長い再アニ ーリング時間（示さない）は、シグナルの強さまたは染色体特異性において有意 の改良を与えなかった。２０分の予備アニーリングを使用するシグナルの主観的 印象（第３図Ｄ）は、前述したように実施した、デンシトメトリーの分析により 確証することができなかった。なぜなら、異なる予備アニーリング時間のシグナ ル対ノイズ比の有意差が観測されなかったからである（データは示されていない ）。したがって、すべての引き続（実験における標準の復元時間は１０〜２０分 であった。シグナルは復元時間０において明瞭に見ることができるので、プロー ブ混合物を顕微鏡のスライドに移すために必要な数秒は交差ハイブリダイゼーシ ョンにより非特異的標識づけを引き起こす多数の配列を有効に予備アニーリング するために十分であると思われる。さらに、大過剰の一本鎖の競争ＤＮＡはビオ チニル化プローブ配列と、ハイブリダイゼーション反応の間に、偏在する染色体 標的について効率よく競争することができる。これらの結果が実証するように、 高度に反復性のＤＮＡ配列の大部分は十分に抑制されて、正常部位ハイブリダイ ゼーションによる染色体特異的標識づけを達成する。

ある場合において、全染色体にわたるシグナルの分布は実験毎に多少の変動を示 す。全体のシグナルが減少するとき、ある染色体の小領域はより明るい染色を示 す；これらのシグナルのホットスポットは一般に染色体特異的反復配列を含有す る染色体部位を構成する。第２図および第３図に示す実験において、染色体７の 動原体領域の優勢の染色が見られ、これはアルフォイドの反復ＤＮＡの染色体特 異的シグナルに相当する。

ワイ（Ｗａｙｅ）　、Ｊ、Ｓ、　ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ ロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｌ　７：３４９−３５６　（１９８７） および参照、実施例２゜明らかなように、これらの反復配列の存在はここで使用 する条件下にそれらの抑制を防止するために十分に低い。等しくないシグナルの 分布は、前述したように抗体サンドイッチ技術を使用して全体のシグナルを増幅 することによって克服することができる。さらに、サテライトＩ　Ｉ　ｌＤＮＡ の染色体部位に相当する領域１Ｑ１２の優勢の染色は、染色体１を標識するとき 頻繁に観測された。クーテ（Ｃｏｏｋｅ）　、ＨｌＪ、およびＪ、ヒントレイ（ Ｈｉｎｄｌｅｙ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）、旦：３１７７−３１９７　（１９７９）およびゴスデン（Ｇｏｓｄｅｎ） 、Ｊ、Ｒ，ら、キャンサー・ジエネティックス・アンド・サイトジエネテイック ス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、）、２９：　３２−３９ 　（１９８１）および参照、実施例２゜このような増幅後に見られる、釣り合っ たシグナル分布の例は第４１ＭＡ示されている。

各々が単一のヒト染色体を表す、いくつかの商業的に入手可能なりＮＡライブラ リーを、前述の標準化された再アニーリングの条件下に、前述したように、染色 体部位について調節したプローブ濃度で、それらが表す染色体を特異的に標識す るそれらの能力について試験した。第４図に示すように、染色体１．４．７．１ ３．１８および２０についての、いくつかの例が明瞭に実証するように、特異的 標識づけはほとんどの染色体ライブラリーを使用して達成することができる。表 ２は、それらの特異的に標識する相対的スコアで試験したライブラリーを記載す る。すべてのスコアは、問題の染色体が常にデコレーションされたので、陽性で ある。他の染色体に対する有意の交差ハイブリダイゼーションが観測されないと き、最高のスコア（４＋）を使用し、モしてｃｒｓｓハイブリダイゼーションす る配列の量が増加するにつれて、スコアを減少する（３＋から１＋に）。

「 ζ 「 １３　ＬＡ１３ＮＳＯ３１＋ １４　ＬＬ１４ＮＳＯ１２十 １１１　ＬＬ１８ＮＳＯ１ｌ−＋ ２０　ＬＬ２ＯＮ５０１　＆＋ °　スコアの定義についてテキストを参照。

１　標準の予備アニーリングの条件下に、染色体２２のライブラリーは＋１のス コアを与えた：＋３の値はヒト競争ＤＮＡ濃度≧μｇ／ｍｌを使用したときにの み達成された（合計のＤＮＡ濃度１゜０μｇ／ｍｌ）。

実験の条件を変化することによって他の染色体上の追加のシグナルを減少するす べての試みは、染色体２２を使用する実施例を除外して失敗した；この場合にお いて、より高い濃度のヒト競争ＤＮＡ　（７００μｇ／ｍｌ）はシグナルの特異 性を有意に改良した。最低の染色体特異性を示すライブラリーは染色体１３のラ イブラリーであった（第４図Ｅ）。

他の染色体上の多数の小さい結合部位、ならびにＹＱ１２の例外的に輝いた染色 が観測された：Ｙ染色体上のシグナルは競争体として女性または男性のヒトＤＮ Ａを使用して見ることができた。試験した実験のパラメーターのいずれもこのラ イブラリーの特異性を改良しなかつた。

顕著なことには、弱いシグナルか、あるいはシグナルの不存在さえをある染色体 の動原体領域において観測することができる（参照、染色体４および１８、第４ 図Ｃ，Ｄ）。染色体特異的反復要素を含有する染色体１および７と対照的に、染 色体４および１８の動原体領域は、反復配列、最もアルフォイドサテライトＤＮ Ａと思われる反復配列を明らかに含有し、これらは非常に豊富に存在し、こうし て再アニーリング技術により抑制される。しかしながら、これらの染色体領域は 非常に小さく、そしてその作用は対応する染色体がかなり細長いときにのみ観測 することができる。

ビオチニル化された合計のライブラリーＤＮＡ　（ファージのベクター配列を含 有する）を、また、ヒトＤＮＡインサートの量にｍＮした濃度で、プローブとし て使用した（上を参照）。１つの例はｃ２０のライブラリーとともに第４図Ｆ示 されている。問題の染色体のすぐれた染色は一般に達成されたが、全体のスライ ド上の有意の非特異的バックグラウンドは共通の問題であった。ラムダファージ のライブラリーからスクリーニングしたヒトＤＮＡを含有するプラスミドのライ ブラリーを使用して、同様な結果が得られた。対照的に、全染色体ライブラリー ＬＡＯＸＮＬＯＩを使用してバックグラウンドの問題は存在しなかった。このラ イブラリーは、ヒトＤＮＡインサートの大きさは非常に大きいので、プローブ混 合物の中に有意により小さい比率のベクター配列を含有する。

この再アニーリング技術により反復配列の抑制は、また、開開核内の染色体のド メインの検出にフローソーテッド（ｆ　ｌｏｗ−ｓｏｔｅｄ）染色体の表面を可 能とする。染色体ｌ、染色体７および染色体１８のプローブの組を酢酸−メタノ ール沈澱後の正常ヒトリンパ球にハイブリダイゼーションした後得られた結果の 典型的な例を、第５図に示す。ハイブリダイゼーションシグナルの離散した焦点 のドメインはが見られ、すべてのライブラリーは２＋またはそれ以上のスコアを 有する（参照、表２）。

はとんどの核（ｎ≧１００７推定値）は２つのドメインを示した（６０〜７０％ ）；シかしながら、有意の数は１つのみのドメインを示した（２０〜３０％）か 、あるいはハイブリダイゼーションシグナルをまったく示さなかった（５〜１０ ％）。したがって、Ｘ染色体ライブラリーＤＮＡをプローブとして使用したとき 、男性の核の約９５％は１つを示し、そして約５％はハイブリダイゼーションシ グナルを示さなかった。

顕著なように、試験した染色体のプローブの組のいずれについても、３つのドメ インをもつ核は発見されなかった。対照的に、すべての分裂中期スプレッドは、 例外な（両者の染色体の相同体のデコレーションを示した。この間期の変動性は 、一部分、ある細胞における２つの個々のドメインの密接な並置を反映するか、 あるいは核の体積内の異なる領域を実際に占有するが、二次元の画像形成方法に より検査したとき分割されないドメインの分割不可能性を反映する［参照、第５ 図Ｄ：論考については、また、参照、フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）ら、エキス ペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、エヱ旦：１９ ９−２２０　（１９８８）］。ハハイブリダイゼーションシグナを示さない小さ い数の核は、最適以下のハイブリダイゼーション条件の反映であろう。

核内のドメインの大きさは同種の分裂中期染色体の相対的大きさとよく合理的に 相関関係をもつことに注意することは重要である。これらの観察は、個々の染色 体のＤＮＡが正常ヒト細胞の開開核において明瞭な境界の有機化を示す明確な証 拠を提供する。

酢酸−メタノール固定した核のスプレッド、例えば、第５図に示すものは、検査 した染色体の各々のための境界の有機化を明らかに保持する；しかしながら、核 の構造は最適には保存されない。パラホルムアルデヒド固定したヒト二倍体の線 維芽を使用しモして３−Ｄ画像の再構成にレーザー走査共焦点蛍光顕微鏡アセブ リーを使用する、３−Ｄ構造をよりよく保持する検体の追加の研究を実施した。

細胞をマヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　１　ｉｄ　ｉ　ｓ）が記載するように固定 しそして浸透化し、そして上に概説したように染色体ライブラリーのプローブと ハイブリダイゼーションした。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　Ｉ　ｉｄ　ｉｓ） 　、Ｌ、　、アナル・オブ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（ Ａｎｎ、ＮＹＡｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）　、４５０　：　２０５−２２１　（１９ ８５）。ブローブー競争ＤＮＡ混合物をスライドに直接適用し、そして細胞ＤＮ Ａと同時に変性した。結果は、核中の染色体７のドメインの配置および染色体ド メイン内の頻繁に観測される標識されたらせん構造を示した。このらせん性が真 のドメイン小構造を反映するか、あるいは調製および固定手順を反映する人工物 である程度は、現在研究中である。それにもかかわらず、この予備的観測は、開 開細胞における染色体のドメインのトポグラフィ−を分析するために染色体特異 的プローブの使用が可能であることを確立する。

実施例２　染色体特異的ライブラリーのプローブを使用するＣｌ５Ｓハイブリダ イゼーシヨンにより腫瘍細胞中の染色体異常の検出 細胞 ＴＣ５９３はヒト神経膠芽細胞腫から確立された偽四倍体の細胞系（形態上の染 色体番号、８３）である：それは平らな広がる方法で成長し、そして多数のプロ セスを含有する。ＴＣ６２０は形態上の染色体番号６４をもつ偽三倍体であり、 そしてヒト乏突起神経膠腫から確立された：それは上皮の方法で成長する。両者 の細胞系を詳細に説明する。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、お よびＥ、Ｅ、　ｖヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌ　１ｄｉｓＬ神経病理学における 進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｖｏ］、４ ．２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、二ｘ−ヨ ーク（１９７９）、この実験は、マヌエリディス（ＭＨｌｕｅ　１　ｉｄ　ｉＳ ）およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　］　ｉ　ｄ　ｉ　ｓ）に従来記載されて いるようにして（上の参考文献を参照）、培養した本来の腫瘍系統の単細胞から 反復してスクリーニングした後はぼ１８０回の継代培養で、サブクローンＣ２Ｂ 　（ＴＣ５９３）およびＣ２Ｂ　（ＴＣ６２０）を使用した。細胞の標準の低張 処理および酸／メタノールの固定を使用した。フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）ら 、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１７ ６：１９９−２２０　（１９８８）。

ＤＮＡプローブおよびライブラリー ソーティングしたヒト染色体からのファージＤＮＡライブラリーは、ＡＴＣＣか ら入手した：ＬＡＯＩＮＳＯ１（染色体１）　、ＬＬ０４ＮＳ０１（染色体４） 　、ＬＡＯ７ＮＳＯ１（染色体７）　、ＬＬ１８ＮＳＯＬ（染色体１８）および ＬＡ２２ＮＳＯ３（染色体２２）。これらのライブラリーの増幅、ヒトＤＮＡイ ンサートの分離およびビオチニル化は、実施例１に記載するようにして実施した 。染色体７上のアルフォイドの反復に対して特異的なプローブ（ｐａ７ｔｌ）は 、Ｈ，ウィラーソ（Ｗｉｌｌａｒｄ）の贈り物であり、そして高い厳格さの条件 下（６０％のホルムアミド）に染色体７の動原体周囲の異質染色質を特異的にデ コレーションする。ワイ（Ｗａｙｅ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バ イオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、７：３４９−３５６（１９８７ ）；フレ７−　（Ｃｒｅｍｅｒ）ら、エキスヘリメンタル・セル・リサーチ（Ｅ ｘｐ、Ｃｅ］ｌ　Ｒｅｓ、）、１ヱ旦：１９９−２２０　（１９８８）。あるＤ ＮＡプローブをアミノアセチルフルオレイン（ＡＡＦ）で修飾した；そしてフレ マー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）らにより記載されているように二重標識づけ実験のた めに検出した。ランデゲント（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ）ら、エキスペリメンタル・ セル・リサーチ（Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１５３：６１−７２　（１９８４）：フレマー（Ｃｒｅ ｍｅｒ）ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１１　Ｒｅｓ 、）、１７６：１９９−２２０（１９８８）。

正常部位ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションしたプローブの 検出 ビオチニル化ライブラリーのＤＮＡインサートとのＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシ ヨンおよびハイブリッド分子の検出は、一般に、実施例１１＝詳細に記載されて いるようにして、標準の条件を使用して実施した。ビオチニル化染色体７のライ ブラリーＤＮＡインサートおよびＡＡＦ修飾７アルフオイドブローブを使用する 二重Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンにおいて、後者のプローブを別々に熱変性 し、そして再アニーリング工程の終わりにおいて１０μｇ／ｍｌの最終濃度でハ イブリダイゼーション混合物にのみ添加した（参照、実施例１）。

特異的にデコレーションした分裂中期および開開の染色体のディジタル画像の分 析 ＩＴＥＸ　ＦＧ　１００−Ｑフレーム・グラバ−（イメジング・テクノロジー） を有するＶＡＸステーションＩＩ／ＧＰＸゲラフックス・ワークステーション（ ディジタル・イクウィプメント・コーポレーション）を、前述したように、ツァ イスＳ−プラナー６０ｍｍレンズおよびＤａｇｅ−ＭＴＩビデオカメラと一緒に 使用した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびＪ、ボーデン （Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソー？　（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）　、９６　：３９ ７−４１０　（１９８８）。

画像を分裂中期スプレッドおよび開開核のネガからディジタル化した二バックグ ラウンドを除去し、そして多角形領域を特異的にデコレーションされた分裂中期 の染色体または開開のドメインに定めた（参照、実施例１）。走査線のアルゴリ スムを使用して、多角形領域内のヒストグラムを計算した。定めた領域内の特定 の強度（０〜２５５）のヒストグラムＨ（ｉ）の値はその強度正において絵素の 数であるので、強度の範囲ｉ、−ｉ、内に入る領域内の面積は１６−ｉｌからの ヒストグラムの積分である。同様に、強度の範囲ｔ、−ｉ、により定められる領 域中の２−Ｄの積分＝ΣＨ（ｉ）、ｉ、、ｉ、を各ハイブリダイゼーションのた めに選択して、デコレーションされた染色質を適切に輪郭を明らかにし、そして この区域をバックグラウンドの領域と区別した。１１は最大値２５５にセットし て、限界より上の全体の強度の範囲を捕捉した。

合計のシグナル強度対面積の測定は、間開核内の変化する染色体ドメインの拡張 の潜在的存在のための対照として設計した。開開において、より拡張した染色体 ドメインはより大きい面積（または体積）を有し、しかもより低い蛍光性のシグ ナル強度／単位面積を有することが期待できるであろう。一定量のハイブリダイ ゼーションしたＤＮＡが一定の合計の蛍光に相当する場合、合計のシグナル強度 は標識されたＤＮＡ含量の測度である。また、核内の３−Ｄハイブリダイゼーシ ョンした体積および３−Ｄ積分した合計のハイブリダイゼーションしたシグナル を測定することができる。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌ　１ｄｉｓ）、Ｌ、お よびＪ、ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓ。

ｍａ）　、９６　：　３９７−４１０　（１９８８）、バックグラウンド、ｂ、 は標識された領域内の明確な２−Ｄ積分Ｉｆ　Ｉ　（ｘ、ｙ）ｄＡから減じて合 計のシグナルを生成した：　Ｓ　ｉ　ｇ１＝ｆ　ｆ　Ｉ　（ｘ、ｙ）　ｄＡ−ｂ ｆｆｄＡ、ここでｄＡは単一の絵素である。同様に、領域内の平均の強度は２− Ｄ積分／面積またはｆ　ｆ　１　（ｘ、）’）　ｄＡ／ｆ　ｆ　ｄＡとして計算 される。

前述の研究の結果を、適当な図面を参照して、次に説明する。それらはヒト神経 膠腫細胞系におＩフる、全体の個々の染色体および染色体の小領域の損失および 獲得を包含する、構造および量の変化を明瞭に説明する。それらは、また、各細 胞系における両者の小さいおよび優勢の核型の特徴を特性決定することができた ことを示す。今日まで試験したすべての染色体（すなわち、１．４．７．１８お よび２２）数および／または構造の異常を明瞭に際立たせ、それらのあるものは 不安定であった。

分裂中期スプレッドにおける数および構造の染色体異常の検出第６図〜第８ｖ！ ：Ｊおよび第１２図は、ヒト染色体ｌ、４．７．１８および２２の各々からのビ オチニル化ＤＮＡインサートとのＣｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン後の、悪性神 経膠腫細胞系ＴＣ６２０およびＴＣ５９３からの典型的な分裂中期スプレッドを 示す。ハイブリダイゼーションしたインサートをアビジンフルオレセインインチ オシアナ−）（ＦＩＴＣ）で検出し、そして細胞を４，６−ジアミジノー７−フ エニルインドールニ塩酸塩ＣＤＡＰＩ＞で反対染色した。「完全」と表示した染 色体は明らかに正常の大きさの、動原体インデックスおよびＤＡＰＩ染色パター ンを有した。この表示にかかわらず、これらの完全な染色体は追加の研究によっ てのみ検出可能な、繊細な構造の異常を含有することができる（下を参照）。明 らかに、完全な染色体１．４．７．１８および２２は両者のＴＣ６２０およびＴ Ｃ５９３において観測された。さらに、これらの染色体の他の相同体は、転座お よび欠失を包含する、有意の転位および異常を示した。これらの細胞系の各々に おいて描写された優勢の数および構造の異常を下に記載する。最小２５のすぐれ た分裂中期スプレッドは、各神経膠腫細胞系および各染色体のために評価した。

これらのデータを第９図に要約する。

染色体Ｉ ＴＣ６２０において、乏突起神経膠腫系統において、染色体１のインサートは２ つの明らかに完全な１染色体および２つのマーカーの転座染色体をデコレーショ ンした（第６図Ａ、第６図Ｂ１第９図）。一方のマーカーは中部動原体であり、 そして完全にデコレーションされた１ｑアームを含有したが、そのｐアームは他 の染色体（未知の由来の）からのものであった。他方のマーカー染色体はけ中部 動原体下であり、そして１ｐアームに取り付けられた他の染色体からの小さいセ グメントを示した。両者のマーカー染色体において、破壊点は１ｐ１１または１ ｑ１１における動原体に密接して局在化した。１ｐセグメントの同定は、ＤＡＰ Ｉバンディングにより（第６図Ｂ）、５°−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ ＢｒｄＵ）のバンディングにより、そして１ｐ３６．３プローブとのハイブリダ イゼーションにより（データは示さない）確立した；１ｐ３６．３プローブは、 さらに、明らかに完全な１染色体の１つ中のこの小領域の試料をさらに明らかに した。全体の写真は染色体１のほぼ三染色体性の表示をもち、共通の破壊点およ び引き続く転座を有した。

ＴＣ５９３、神経膠腫細胞系統、において、なおいっそう複雑な数および構造の 染色体１の異常のパターンが観察された。５０の分裂中期スプレッドの試料にお いて、大部分（５２％）はデコレーションされた６つの異常染色体を示した；分 裂中期の１４％は５つの異常の染色体を示し、そして３４％はより高い数の染色 体１セグメント（１４までの）を示した。第６図Ｃ，Ｄおよび第９図は、最も典 型的な、優勢の核型を示し、そしてこの細胞系における染色体１の異常の迅速な 決定を実証する。異常はｌｐｌにおける首尾一貫した破壊点をもつ３つの末端動 原体の染色体、１ｑの末端パーク（ｐ　ａ　ｒ　ｋ）を欠失した染色体、完全な １ｑを損失した中部動原体下の転座の染色体、およびイソ（１ｐ）マーカー染色 体（参照、第９図）を包含した。

染色体４ ＴＣ６２０において、染色体４特異的インサートは、１つの明らかに完全な染色 体４、および染色体４のＤＮＡを含有するセグメントをもつ３つの追加の染色体 をデコレーションした（第７図Ｆ、第９図）。転座染色体上のこれらの後者のセ グメントは、バンディング手順単独では急速にかつ明瞭に定めることが困難であ ったであろう。転座した染色体４の最小のものは、はぼ中部動原体の染色体の一 部分を形成した。２つのより大きいセグメントは、異なる全体の大きさの中部動 原体下の染色体上に見いだされた。より小さい染色体において、４の短いアーム および長いアームの一部分は明らかな破壊点４ｐ２にもって存在した、すなわち 、４ｐｔｅｒ−４ｑ２゜より大きい中部動原体下の染色体において、４の残部を 表すことができる領域（４ｑ２−ｑ　ｔ　ｅ　ｒ）が現れる。こうして、ＴＣ６ ２０の優勢の核型はほんのわずかのに２当量より大きい染色体を示した（参照、 また、下に記載する面積の測定）。

ＴＣ５９３において、一般に染色体４のＤＮＡインサートによりデコレーション されたわずかに２つの染色体が存在し、そしてこれらの両者は正常の４染色体に 匹敵した。ＴＣ５９３における分裂中期スプレッドのほぼ３０％は、染色体４の 物質をもつ追加の中部動原体下の染色体を示した（第７図Ｅ）。こうして、両者 の４染色体は明らかに正常であったが、この偽四倍体系統においてこの染色体の 有意に低いリブリゼンテイションが存在した（第９図）。

染色体７ ３つの完全な７染色体、および転座した７の物質を含有する１つのより小さい中 部動原体の染色体が、典型的には、ＴＣ６２０分裂中期スプレッドの中に見いだ された（第８図Ａ１第９図）。転座した染色体７の物質は、染色体７の短いアー ム（ＤＡＰＩバンディングにより示されるような；参照、第８図Ｂ）、およびＴ ｑｌ中の破壊点をもつ周辺動原体の異質染色質を包含した（また、下を参照）。

ＴＣ５９３において、染色体７のインサートのプローブにより完全にデコレーシ ョンされた５つの染色体は規則的に観測された（第７図Ｇ、第８図Ｅ）。これら のうちの４つは完全な染色体７を表すように思われるが、１つはより小さくそし て中部動原体であった。ＤＡＰＩバンディング（第８図Ｅ、インサート）および 大きさの測定（参照、第１３図）はイソ（７ｐ）と一致した。この結論は、さら に、ビオチニル化染色体７のインサート（アビジンＦＩＴＣで検出した）および 染色体７特異的アルフォイドＡＡＦ標識配列（トリメチルローダミニッチオシア ネート（ＴＲＩＴＣ）接合第２抗体で検出した）との二重正常部位ハイブリダイ ゼーション実験により支持された。それらが示したように、わずかに４つの完全 な７染色体は検出可能な７動源体のシグナルを含有した（分裂中期、第７図Ｇ、 Ｈ，開期、第７図１．Ｊ）。こうして、イソ（７ｐ）マーカー染色体は、７アル フオイド配列および７ｑ１１における異質染色質の小さいブロックの両者を欠（ ので、特徴ある動源体の領域をもたなかった（参照、第８図Ｅ１インサート）。

対照的に、ＴＣ６２０のすべての４つの７染色体は７アルフオイドプローブによ り標識された（データは示されていない）。

染色体１８ ＴＣ６２０において、２つの明らかに完全な１８染色体および切頭された小さい 染色体は完全にデコレーションされた（第８図Ｃ，Ｄ、第９図）。この切頭染色 体は１８Ｑ−（および多分また１８ｐ−）である。

染色体１８を包含する３つの転座染色体は、典型的には、ＴＣ５９３の分裂中期 スプレッド中の明らかに正常の染色体１８に加えて、検出された（第８図Ｆ、Ｇ 、第９図）。小さい比率の分裂中期において、小さい追加の転座が観測される。

この転座した１８物質が誘導された、正確な染色体の領域はＤＡＰＩ染色により 分割することができなかった。したがって、１８について優勢の核型はこの細胞 系において四乗包体に近いが、擬三倍体のＴＣ６２０において低くリブリゼンテ イションされている。

ＴＣ６２０における１８ｑ−マーカー染色体およびＴＣ５９３における３つの転 座した１８染色体の両者は、染色体１８特異的アルフォイド反復に強くハイブリ ダイゼーションした。したがって、完全なおよび異常の両者の１８染色体は、ま た、この動源体のプローブとの正常部位抑制ハイブリダイゼーション後、カウン トされることができたであろう。

フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ、ら、エキスペリメンタル・セル・リサー チ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１ヱ６　：１９９−２２０　（１９８８） （また、下を参照）。ＤＡＰＩバンディングおよび１８特異的アルフォイド反復 へのハイブリダイゼーションは、これらの転座染色体が１８ｐに破壊点をもつ、 全体の１８ｐ領域および動源体を包含することを示した。

染色体２２ ２つの明らかに正常の２２染色体は、はとんどのＴＣ６２０およびＴＣ５９３分 裂中期スプレッドにおいて可視化された（第１０図Ｅ）。この染色体の小さい転 座を確認することは困難であった。なぜなら、染色体２２インサートとのハイブ リダイゼーションは他の染色体に対する多少の交差ハイブリダイゼーション生じ たからである。この交差ハイブリダイゼーションのあるものは、多分、核の有機 化領域からの共有された配列（５つの正常の末端動原体のヒト染色体上の）およ び動源体における共有された配列のモチーフのためである。マクダーミド（Ｍｃ Ｄｅｒｍｉ　ｄ）　、　Ｈ，Ｅ、ら、クロモソーｖ　（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ） 　、旦Ａ：　２２８−２３４　（１９８６）および参照、実施例１゜最後に、普 通のバンディング分析と対照的に、現在の実験のアプローチは、非常に劣った量 の分裂中期スプレッドにおいて（第１０図Ｇ、Ｈ）あるいは早期の前開時におい て（第１０図Ａ）数および構造の染色体異常を明瞭に描写することにことに注意 すべきである。これらの調製物は、染色体が広範に互いに重なるので、バンディ ング分析が不可能である。

開開核中の染色体ドメインの評価 正常部位の方法の１つの潜在的な利点は、個々のヒト染色体を開開核中で明確な 境界として直接可視化し、こうして充実腫瘍の検体の分析において価値を有する ことができることである。マヌエリデイス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、ヒユ ーマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ、ＧｅａｒｄｉｎＬＭ、ら、ヒユーマン・ジ ェネティーｉクス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ、）、ヱ１　：　２８１−２８７　（１９ ８５）：ビンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）、Ｄ、ら、プロシーデインダス・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、）ＵＳＡ１旦旦：　２９３４−２９３８　（１９８６）。核トポグラフィ −のこの特徴は、また、ここで検査した悪性細胞において明らかであり（第７図 Ａ−ＤＳＩ、第１０図Ｂ−Ｆ）　、その精度および診断的有用性について評価さ れた。第１０図Ａは、３つの明らかに完全な７染色体および前期のＴＣ６２０核 中の１つの切頭された７Ｐアームを示す。第３図および第１０図Ｂは、分裂中期 スプレッドにおいて前に描写された、ＴＣ５９３の間開時における５つの染色体 ７のドメインを示す。第１０図Ｃは、正常二倍休校において見られたものに匹敵 する大きさの２つの１８ドメインをもつ、ＴＣ６２０間期核を示開時参照、実施 例１）。第３の、認められ得るほどに小さい、デコレーションされた１８ドメイ ンは、また、検出され、そして前述の分裂中期スプレッドの中に見られた切頭１ ８染色体を表す。第１０図りは、ＴＣ５９３の間開植生の４つの染色体１８のド メインを示し、これは再び分裂中開時における数に匹敵する。第１０１ｍＥは４ つの染色体１のドメインをもつＴＣ６２０の開開核を示すが、第１０図Ｆは少な くとも５つの別々の染色体１ドメインをもつＴＣ５９３を示す（参照、それぞれ 、第６図Ａ、ＢおよびＣ，Ｄ）。

第１０図示されている核のハイブリダイゼーションパターンは各細胞系について 高度に特徴をもつが、開開染色体のドメインのカウントはある固有の困難性を有 する。１例として、第１１図Ａ（暗い柱）は、フライブラリーインサートとハイ ブリダイゼーションした二倍体のヒトリンバ球の不規則的に選択した核における 、標識された開開ドメインのカウントの分析を表す。染色体特異的ドメインの数 および相対的大きさは大部分の核において正確に評価することができるが、すべ ての核が染色体の構成の信頼性ある指数を表すわけではない。なぜなら、核のか なりの分画は１つのみのデコレーションされたドメインを明らかにし、そして場 合に応じて核はシグナルを全（示さないからである。さらに、すべてのドメイン はこれらの２−Ｄの調製物において常に明瞭に分離可能であるわけではない。

第１１図は、これらの調製物の代表的なカウントを示す。染色体４のＴＣ５９３ 分裂中期のカラントと一致して、核のカウントは一般に３つの明瞭に分離された ドメインを示した（第１１図Ｅ）。しかしながら、２つのシグナルの調製物は分 裂中期におけるより開開において小さかった（４５．３％対６４％）。この人工 的減少は、大きく、ただ１つのデコレーションされたドメインを示すか、あるい はシグナルをまったく示さない核の対応する百分率の増加のためであった。０ま たは１のドメインのカウントは分裂中期スプレッドにおいて存在しなかった。有 意には、開開のＴＣ５９３０１９，３％は３つの明瞭に分離された染色体４のド メインを表し、そしてこれらの余分のドメインは同一の条件下にこれまたは他の ライブラリーにハイブリダイゼーションした二倍体のヒトリンパ球の開開核の中 に存在しなかった（第１０図Ａ；実施例１）。最後に、２つ対３つのドメインの 比は両者の分裂中期および開開の細胞について同一であった。こうして、開開核 は単一の染色体または染色体のセグメントの余分コピーの検出のために信頼性を もって使用することができるが、染色体のコピーの損失の検出について制限され た信頼性を有する。

開開染色体の小領域からのプローブの正常部位ハイブリダイゼーションは、適当 に高い厳格さの条件下に実施されるかぎり、ライブラリーのプローブより正確に 染色体の構成の一般的カウントを反映することができる。ラポルド（Ｒａｐｐｏ ｌｄ）、Ｇ、ら、ヒユーマン・ジェネティックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ、）　、６ ７　：　３１７−３２５　（１９８４）；フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ 、ら、ヒユーマン・ジェネテイックス（Ｈｕｍ、Ｇｅｎｔ、）　、７４　：　３ ４６−３５２　（１９８６）；フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ、ら、エキ スベリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１７６：１９９−２２０（１９８８）、しかしながら、 このような領域のセグメントのプローブは、このセグメントを欠く、転座した要 素または異常の染色体を描写しない。したがって、このようなプローブは、また 、完全には正確ではない。例えば、ＩＱ１２に対して特異的なプローブを使用す るＴＣ６２０およびＴＣ５９３中の染色体ｌのカウントは、Ｃｌ５Ｓハイブリダ イゼーシ３ンを使用してここで示したより少ない１染色体を示した。フレマー（ Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）、Ｔ、ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、 Ｃｅ　ｌ　Ｉ　Ｒｅｓ、）　、１７６　：１９９−２２０　（１９８８）、動源 体の配列のみを使用する染色体７のカウントは、この点を強調する（上を参照） 。ＡＡＦ増幅した７アルフオイドのプローブおよび染色体フライブラリーのイン サートを使用する二重正常部位ハイブリダイゼーションは、典型的には、５ドメ インをもつ開開核を示し、それらのうち４つのみは動源体のプローブで同時に標 識された（第７図Ｉ、Ｊ、第１１図Ｃ）。しかしながら、ＴＣ６２０において、 両者のプローブは同一の結果を与えた（第１１図Ｂ）。

特異的染色体の過度のリブリゼンテイションおよび低いリブリゼンテイション これらの神経膠層系における相対的染色体の投与量を、また、とくに興味ある染 色体７を使用して評価し、この染色体７は一般に神経膠層中で過度にリブリゼン テイションされることが認められた。ビグナー（Ｂｉｇｎｅｒ）　、Ｓ、Ｈ，ら 、キャンサー・ジェネティックス・アンド・サイトジェネティー／クス（Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、）　、２９　：１６５−１７０　（ １９８６）；シャビｏ（Ｓｈａｐｉｔｏ）　、Ｊ、Ｒ，Ｓｅｍ１ｎ、０ｎｃｏ１ ．．１３　：　４−１５　（１９８６）。比較のため、他の個々の染色体のプロ ーブを対照として使用した。

分裂中期の染色体のカウントは、ＴＣ６２０が６４染色体の形態状の数をもつ擬 三倍体であるが、ＴＣ５９３は８３の形態状の数をもつ偽四倍体であることを示 した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ。

およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｅ、Ｅ、　、神経病理学にお ける進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ。

ｇｙ）　、Ｖｏｌ、４、ｐｐ、２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ 　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）、したがって、３つの完全なコピー がＴＣ６２０の中に存在し、そして４つがＴＣ５９３の中に存在する場合、染色 体およびそのセグメントは一緒に釣り合った状態で存在するであろう。

これらのそれぞれのコピーの数より多くを実証することができる場合、相対的に 過剰のリブリゼンテイションが存在する。期待した（三乗包体または西東包体） の値よりより少ない数は、染色体が核型において相対的に低いリブリゼンテイシ ョンにあることを示す。追加のＤＡＰＩバンディングの情報が選択的にデコレー ションされた異常の染色体を定めるために十分であった場合、染色体特異的イン サートにより標識された染色体の片は分析のために一緒にされた（第９図）。第 ２のアプローチにおいて、コンピューターの分析を使用して、これらの結果を独 立に評価した（下を参照）。

バンディングにより分析したＴＣ６２０は、同等の３つの１染色体を示し、こう してこの染色体について釣り合った状態を示した。同一のことは４つのコピーの 中に存在するＴＣ５９３中の１ｐアームついて真実であった。しかしながら、１ ｑの末端部分はＴＣ５９３において低くリプリゼンテイションされた（参照、上 の詳細な説明）。両者の神経膠層系において、７ｑは釣り合っている思われるが 、７ｐはＴＣ６２０において過度にリブリゼンテイションされ、そしてＴＣ５９ ３において２倍にリブリゼンテイションされた。さらに、両者の神経膠層系にお いて、染色体２２は明らかに低くリブリゼンテイションされた。この発見を確証 するために、染色体７および２２のインサートを使用する二重正常部位ハイブリ ダイゼーションを実施した。この例は第１２図示されており、そして同一の細胞 における７のＤＮＡの過度のリプリゼンテイションおよび２２のＤＮＡの低いリ ブリゼンテイションを実証する。この分析方法により両者の細胞系において実施 した分裂中期のカウントは第１１図Ｂにおいて染色体７について（暗い柱）およ び第１１図Ｅにおいて染色体２２について描写されている。要約すると、これら の両者の神経膠層は相対的な染色体２２の低いリブリゼンテイションおよび７ｐ アームの過度のリブリゼンテイションを示す。ＴＣ５９３において染色体４およ びＴＣ６２０において４の一部分の低いリブリゼンテイションが、また、認めら れる。

ディジタル化した画像を、また、使用して、分裂中期の集団および簡明細胞にお いてデコレーションされた区域を定量的測定し、ここで染色体のドメインはよく 分割された。

染色体の同等体の定量的評価（表３）は、６つの例のうちで５つにおいて簡明対 分裂中期について高度に調和した数を示した：１８インサートでデコレーション されたＴＣ５９３においてのみ不一致が存在した。

これは試料の大きさが小さいためでであろう。

表３ 染色体４．７および１８のライブラリーからのＤＮＡインサートでデコレーショ ンされた優勢の数を示す、２４の分裂中期スプレッドを、同一のプローブを使用 してよく分離されたドメインをもつ２８の開開核と比較した。同一の（線状のフ ィルム）条件下に画像を取り、モしてディジタル化した。各分裂中期スプレッド において、各々正常および異常の染色体について得られた面積を明らかに完全な 染色体について得られた平均の面積で割った。開開核において、最大のｎ−標識 されたドメインが完全な（正常の）簡明染色体を表したと仮定して、ドメインを 比較した。こうして、これらの正規化された値の合計は単一の細胞における特異 的染色体の同等体の数の測度を表す。いくつかの細胞の平均値を各場合について 示す。間期および分裂中期の細胞について得られた染色体同等体の平均の数は、 ｒ＝＋０．９５の強い全体の相関関係の係数を示す。

面積の測定と比較して、２−Ｄの強度の積分により決定された染色体同等体の平 均の数（上を参照）はｒ＝＋ｏ、、９９の全体の相関関係の係数を示した。

染色体同等体 染色体　細胞系　簡明　分裂中期　期待値４　τＣ５９３２，０２，０１！ｔ、 ０丁Ｃ６２０２，５２，４３，０ ７丁Ｃ５９３＆、Ａ　４，６　１！ｔ、０丁Ｃ６２０３，５３，３３，０ １８丁Ｃ５９３３，０３，６１ａ、０ τＣ６２０２，５２，３３，０ ディジタル画像分析から誘導された染色体同等体は、ＤＡＰＩバンディングによ り両者の神経膠層系において認められた標的染色体の相対的リブリゼンテイショ ンを独立に確証する。合計の分裂中期シグナルからなるセグメントをさらに第１ ３図に詳細にグラフで表示する。コンピューター分析は、転座したセグメントが 明瞭に定めることができない場合において、ことに有用であった。コンピュータ ー分析は、また、簡明−分裂中期の相関関係、および明確に異なる大きさをもつ 正常および異常の染色体の定量的評価において価値を有した。

実施例３　正常部位ハイブリダイゼーションによるヒト染色体２１の迅速な検出 ＤＮＡプローブ すべてのプラスミドは２１ｑ２２．３にマツピングされたヒト染色体のインサー トを含有する。モイサン（Ｍｏ　ｉ　５ａｎ）　、Ｊ、Ｐ、　、メツティ（Ｍｅ ｔｔｅｉ）、Ｍ、Ｇ、　、ベテマンーポルケル（Ｂａｅｔｅｍａｎ−Ｖｏｋ　ｅ 　ｌ）、Ｍ、Ａ、、７７テイ（Ｍａｔｔｅｉ）、Ｊ、Ｆ、、ブラウン（Ｂｒｏｗ ｂ）　、Ａ、Ｍ、Ｃ，、ガーニーア（Ｇａ　ｒｎ　ｉ　ｅ　ｒ）、Ｊ、　Ｍ、　 、フェルツシｘ（Ｊｅｌｔｓｃｈ）、Ｊ、Ｍ、　、？シアコラスキー（Ｍａｓ　 ｉ　ａｋｏｗｓｋｙ）　、Ｐ、　、ｏパーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｍ、およびマ ンデル（Ｍａｎｄｅ］）　、Ｊ、Ｌ、（１９８５）　、サイトジエネティックス ・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅ ｔ、）、４０．７０１−７０２　（アブストラクツ）。ランデ（Ｔａｎｚ　ｉ） 　、Ｒ，、ワトキンス（Ｗａｔｏｋｉｎｓ）　、Ｐ、　、ギポンス（Ｇ　ｉｂ　 Ｏｎ　Ｓ　）　、Ｋ、　、ファリニアルズ（Ｆａｒｙｎｉａｒｚ）、Ａ、　、ワ レイス（Ｗａ　ｌ　１ａｃｅ）　、Ｍ、　、ハレウエル（ＨａｌＪｅｗｅｌｌ） 、Ｒ，、：Ｉンネアリイ（Ｃｏｎｎｅａ　ｌ　ｌＶ）　、Ｐ、Ｍ、およびグセラ （Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ、（１９８５）、サイトジエネティックス・アンド・セ ル・ジェネテイックス（Ｃｙｔ。

ｇｅｎｅｔ、ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ、）、４６．６６７（アブストラクツ）。ム ンケ（Ｍｕｎｋｅ）　、Ｍ、　、フェル？−（Ｆｏｅｌ　Ｉｍｅｒ）、Ｂ、　、 ’７トキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ、Ｃ，、：Ｉラワン（Ｃｏｗａｎ）　、Ｊ 、Ｍ、　、力ロール（Ｃ，ａｒｒｏｌｌ）、Ａ、Ｊ、　、グセラ（Ｇｕｓｅｌｌ ａ）、Ｊ、Ｆ、およびフラグ（Ｆｒａｋｅ）　、Ｕ、（１９８８）、アメリカン ・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジエネティックス（Ａｍ、Ｊ、　Ｈｕｍ、　 Ｇｅ　ｎ　ｅ　ｔ、　）　、　４２．５４２−５４９゜すべてのインサートは既 知であるか、あるいはサザンプロット分析により単一のコピーのＤＮＡであるこ とを評価した：　ｐＳ２以外のプラスミドはλファージのライブラリーまたはコ スミドのライブラリーから誘導したサブクローンである。ファン・ケウレン（Ｖ ａｎ　Ｋｅｕｒｅｎ）　、Ｍ。

Ｌｏ、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）　、Ｐ、Ｃ，、ドラブキン（Ｄｒａｂｋｉ ｎ）、Ｈ，Ａ、　、ジャブス（Ｊａｂｓ）　、Ｅ、Ｗ、　、グセラ（Ｇｕｓｅｌ ｌａ）、Ｊ、Ｆ、およびパターンン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｄ、（１９８６） 、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジェネティックス（Ａｍ、Ｊ、 Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、）　、３８．７９３−８０４゜マンアコウスキー（Ｍａｓ ｉａｋｏｗｓｋｉＬ　Ｐ、　、ブレスナチ（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ）　、Ｒ，、 ブロチ（Ｂｌｏｃｈ）、Ｊ、　、ガンノン（Ｇａｎｎｏｎ）　、Ｆ、　、クルス ト（Ｋｕｒｕｓｔ）、Ａ、およびチャンポン（Ｃｈａｍｂｏｎ）　、Ｐ、（１９ ８２）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１０． ７８９５−７９０３゜ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）　、Ｐ、Ｃ，、ランデ（Ｔ ａｎｚｉ）、Ｒ，Ｅ、　、ギポンス（Ｇｉｂｂｏｎｓ）　、Ｋ、Ｔ、　、トリコ リ（Ｔｒｉｃｏｌｌｉ）、Ｊ、Ｖ、　、ランデス（Ｌａｎｄｅｓ）　、Ｇ、　、 エディ（Ｅｄｄ７）　、Ｒ，、シタウズ（Ｓｈｏｗｓ）、Ｔ、Ｂ、およびグセラ （Ｇｕｓｅｌｌａ）、Ｊ、Ｆ、（１９８５）核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１３．６０７５−６０８８゜ワトキンス（Ｗａｔ ｋｉｎｓ）、Ｐ、Ｃ，、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）、Ｐ、　Ａ、　、ホフマ ン（Ｈｏｆ　ｆｍａｎ）　、Ｎ、およびスタンニソロビチス（Ｓｔａｎｉｓｌｏ ｖｉｔｉｓ）、Ｐ、（１９８５）サイトジェネティックス・アンド・でル・ジエ ネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、）、４０．７７３−７７４　（アブストラクッ）。

プラスミドを表４に、ヒト遺伝子マツピングのワークショップの記号および近似 の断片長さと一緒に記載する。カブラン（Ｋａｐ　Ｉ　ａｎ）　、Ｊ。

Ｃ８およびカリット（Ｃａｒｒｉｔ）、Ｂ、（１９８７）サイトジェネティック ス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、）、４６．２５７−２７６゜１１４２１ｐ２２３からの インサートをもつプラスミドＩｃＥＸ　ｐｓ２（２３）　０．６　ｔ１２１ｓ５ ６　ｐＰＩＪ５２０−１０ｔ　＆、６０２１５３　ｐＰＵ２３Ｌｒ　Ｏ，ｊ　ｐ Ｐ９５２Ｇ−Ａｌｌ　Ｌ、５ｐＦｕ２３１Ｇ　Ｏ−フ　０２１５５７　ｐＦｕ５ ２３−１０１　６．５Ｄ２ＬＳ２３　ｐＰＩＪ２４１−Ｄ　１．ＯｐＰＩＪ５２ ３−１）Ｉ７．０Ｄ２１Ｓ５３　ｐＦｕ５１２−６１１　３．０　ｐＰ＄＋５２ ３−５Ｒ２，２ｐＰＩＪ５１２−ａＢ　３．１１　ｐＰＶ５２３−１ＯＲ３，８ ｐＦ＄７５１２−１１４　２．９　ｐＦＩＪ５２３−１９１　２．５ｐＰ９３１ ２−１６Ｆ　２．７　ｔ１２Ｌｓ６＆　ｐＰＩＪ５５１−ａＰ　１９ｐＦＩＪ５ １２−ＬＩＩＦ　１．６　ｐＦＩＪ５５１−Ｌ２Ｐ　＆、２ｐＰＩ７５１２−４ Ｒ＆、７　Ｄ２１５７１　ｐＰｓＪ５１９４０Ｐ　ｏ、５ｐＰＩＪ５１２−１２ １　２．０　ｐＰＩＪ５１９−１１Ｆ　３．０Ｄ２１Ｓ５５　ｐＰ＄Ｊ５１ｉ４ Ｍ　１．６　ｐ！’ｖ５１９−ＩＲ６，ＯｐＰｓＪ５１ｇ−１０Ｐ　２−９　ｐ ＦＩ３５１９−８Ｒ２，９ｐＰｓＦ５１８−５ＳＬ　５．２　ｐＰｕ５１９−９ Ｒ１，７Ｄ２１ｊ５６　ｐＰＶ５２０−５８　５．０　ｐＰｓＦ１１９−１４１ Ｌｊ。

ｐＰ＄２５２０−６８　１．ＯｐＰ＄＋５１９−２２１Ｌ　１．１１プラスミド ＤＮＡの調製は標準のプロトコルに従った。マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、 Ｔ、　、フリトラ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ、Ｆ。

およびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、Ｊ、（１９８２）分子クローニン グ：実験室の７−ユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）（：Ｉ−ルドースプリング・ハーバ−・ラボラト リ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）。種々のプローブの組 をプラスミドをプールしく等しいモル量）、９５ｋｂ　（すべてのプラスミドを 列挙した）　、７５ｋｂ　（星印で標識したプラスミド）または２９ｋｂ　（ダ ガーで標識したプラスミド）のＤＮＡプローブ複合体を生成することによって得 た。

ヒト染色体２１のゲノムのライブラリーＬＬ２１ＮＳＯ２はアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクションから入手し、そして寒天プレート上で推奨されるよ うに増幅した。ファージＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＤＮ Ａインサートをベクターのアームから調製用ゲル電気泳動により０．５％のアガ ロース中で分離した。ＤＮＡをゲルのスライスから電気溶離により分離した；エ ルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ）−ｄクロマトグラフィーにより精製した（シュレイヘ ル・アンド・シュエル）；フェノール／クロロホルム、１　：　１　（Ｖ／Ｖ） で抽出した；そしてエタノールで処理した。

ヒト細胞 分裂中期スプレッドおよびｉｐＣは次のものから調製した＝　（ｉ）正常の（４ ６、ＸＹ）個体のリンパ球培養物、（ｉ　ｉ）ダウン症候群の（４７、＋２１） 個体のリンパ球、（ｉ　ｉ　ｉ）出生前の診断のために培養した慢性の絨毛試料 ［ｉｉおよびｉｉｉはＴ、ヤン〜ゲング（Ｙａｎ−Ｇｅｎｇ）、エール大学（Ｙ ａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の細胞遺伝学研究所、から提供された］、およ び（ｉｖ）ＴＣ６２０、乏突起神経膠腫誘導擬三倍体細胞系、の培養物。マヌエ リディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　 １　ｉｄｉ　ｓ）　、Ｅ。

Ｅｌ、神経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒ。

ｐａｔｈｏｌｏｇｙＬジンンマーマン（Ｚｏｍｍｅｒｍａｎ）、Ｈ。

Ｍ８編、Ｖｏｌ、４、ｐｐ、２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　 Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）、コスミド処理、低張処理、およびメ タノール／酢酸の固定の標準の技術を使用した。「正常」ヒト脳（４６、ＸＹ） の皮質領域からのバイオプシー物質を、記載したように、固定し、切片にし、そ して浸透化した。マヌエリディス（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ）、Ｌ、およびボーデ ン（Ｂｏｒｄｅｎ）　、Ｊ、、クロモソー７　（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、９６ 　：　３９７−４１０　（１９８８）。

正常部位ハイブリダイゼーション Ｂｉｏ　１ｌ−ｄＵＴＰでニック翻訳により標識したプラスミドＤＮＡの種々の 組み合わせを、プールの大きさに依存して２〜１５Ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度でハ イブリダイゼーションに使用した。ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔ　ｉ）　、Ｄ、Ｊ、 　、ミエルノン（Ｍｙｅｒｓｏｎ）　、Ｄ、　、レラリー（Ｌｅａｒｙ）　、Ｊ 、Ｊ、　、スパルホルズ（Ｓｐａ　１　ｈｏ　ｌ　ｚ）、Ｂ９、トラビス（Ｔｒ ａｖ　ｉ　ｓ）　、Ｓ、Ｚ、　、７ｔング（Ｆ　ｏ　ｎ　ｇ）、Ｃ，Ｋ、Ｌ、　 、ヒシウング（Ｈｓ　ｉｕｎｇ）　、Ｇ、Ｄ、およびワード（Ｗａｒｄ）、Ｄ、 Ｃ，（１９８３）ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１２６．３２−５０゜例えば 、プローブ混合物が９４キロ塩基（ｋ　ｂ）のインサートＤＮＡを含有する場合 、１５Ｐｇ／ｍｌを使用したニブロープの濃度はプローブ混合物の配列の複雑性 に対して比例して減少した。プローブＤＮＡの大きさは、実験的に、ニック翻訳 反応におけるＤＮアーゼの濃度を変化させることによって１５０〜２５０ヌクレ オチドの長さに調節した。ハイブリダイゼーションのカクテルは、また、５０％ のホルムアミド、０．３０モルのＮａＣ１，０，０３モルのクエン酸ナトリウム （ｐＨ７）　、１０％（Ｗ／Ｖ）の硫酸デキストランを含有し、そして場合に応 じて０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精液のＤＮＡを含有した。プローブ および標的ＤＮＡの同時の変性を７５℃において６時間（分裂中期スプレッド） または９４℃において１１分（組織のスライス）実施した。ハイブリダイゼーシ ョン反応は３７℃において一夜インキユベーシジンした。

ソーティングしたヒト染色体から誘導されたＤＮＡプローブを使用する個々の染 色体の描写は、前述したように（ＣＩ　Ｓ　Ｓ）ハイブリダイゼーションにより 実施した。簡単に述べると、ビオチニル化染色体２１ライブラリーＤＮＡインサ ート（５μｇ／ｍｌ）、ＤＮアーゼ消化したヒト気体（２００μｇ／ｍｌ）およ びサケ精液ＤＮＡ　（８００μｇ／ｍｌ）をハイブリダイゼーション溶液中で一 緒にし、加熱変性し、そして１０〜３０分間３７℃において予備ハイブリダイゼ ーションした後、変性した検体に別々に適用した。

ハイブリダイゼーション後の洗浄、アルカリ性ホスファターゼ接合アビジンまた はフルオレセインイソチオシアナート接合アビジンを使用するハイブリダイゼー ションしたプローブの検出、および写真の条件は実施例１に記載する通りであっ た。２９ｋｂ以下の標的配列を含有するブローブの組を使用したとき、フルオレ セインイソチオシアナートの検出は一般に実施例１に記載するように１サイクル のシグナルの増幅により増強した。

開開シグナルのすべての定量的分析はいくつかの独立の実験からのスライドを使 用することによって実施し、１００／スライドより多い核を分析した。正常およ び三乗包体の試料におけるシグナルの比較は盲検試験の方法で実施した。

この研究において、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨンは、記載する条件下に、分 裂中期および簡明の両者の細胞における染色体２１の数および構造の異常を迅速 に検出することが実証された。

リンパ球の分裂中期スプレッドおよび開開核中の染色体を特異的に標識するため のヒト染色体２１からのクローニングしたＤＮＡ断片の使用プローブ中の独特配 列のＤＮＡの最大量は約９４ｋｂであった：このプローブの組は染色体２１の相 同体の両者の染色分体の末端領域の明瞭に可視の標識を生じた（参照、第１４図 Ｂ）。これらのシグナルは、すべての分裂中期スプレッドにおいて、少ない量の スプレッドにおいてさえまたは前期細胞からのものにおいてさえ、明瞭にかつ例 外なく見えた（図示せず）。正常の開開細胞において、核の大部分（６５〜７５ ％）は２つのシグナルを示しく参照、第１４図ＣＬ２５〜３０％は１つのシグナ ルを示し、そして５％より少ないものはシグナルを示さなかった。

３つのシグナルをもつ核は希にのみ見いだされ（＜０．　２％）、そして試料中 のわずかの四倍体細胞に対する不完全なハイブリダイゼーションを反映すること ができる。同様な結果は２９または７５ｋｂのＤＮＡを含有するプローブの組を 使用して得られた。２０ｋｂより少ないインサートＤＮＡを含有するプローブの 組では、２より少ないシグナルをもつ細胞の数は増加した。こうして、これらの プローブの組は診断の目的に不適当であると思われた。しかしながら、このよう なプローブは、なお、染色体２１の大部分について、６ｋｂの単一のコピーのＤ ＮＡを使用してさえ（参照、第１４図Ａ）、ことにシグナルの増幅を使用すると き、特異的シグナルを生じた。

染色体２１を検出するための染色体ライブラリーＤＮＡのＣｌ５Ｓハイブリダイ ゼーシヨンの使用 染色体２１は正常リンパ球の分裂中期スプレッドにおいて特異的かつ完全にデコ レーションされたが、ある追加の小さい結合部位は他の末端動原体の染色体、こ とに染色体１３の動源体またはその付近に見られた（正常核型は示されていない ：第１４１５ＵＦ）。染色体１３および２１の動源体領域に主として位置する反 復ＤＮＡを検出する、プラスミドＬ１゜２６を包含する追加のＤＮＡを使用して 抑制は、小さい非２１染色体のシグナルを効率的に抑制しなかった。デビリー（ Ｄｅｖｉ　１ｅｅ）、Ｐ。

、フレｖ−（Ｃｒｅｍｅｒ）　、Ｔ、　、スラグブーム（Ｓｌ　ａｇｂｏｏｍ） 、Ｐｌ、バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）　、Ｅ、　、ショイル（Ｓｈｏｉｌ）、Ｈ， Ｐ、　、ヘイガ−（Ｈａｇｅｒ）　、Ｈ，Ｄｏ、ステベンメン（Ｓｔｅｖｅｎｓ ｏｎ）　、Ａ、Ｆ、Ｇ、　、コーネリッセ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅ）、Ｃ，Ｊ、 およびパーメン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｐ、Ｌ、（１９８６）サイトジェネティッ クス・アンド・セル・ジェネティックス（Ｃｙｔ。

ｇｅｎｅｔ、ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ、）、４１．１９３−２０１゜開開核のシグ ナルの定量的評価は、再び、３つのシグナルをもつ無視できる部分を示した；し かしながら、２つより小さいシグナルをもつ核の有意の増加は観測された（２つ のシグナルをもつ５０〜６０％、１つのシグナルををもつ３５〜４５％、および シグナルをもたない５〜１０％）。

２つの異なるプローブを使用して観測された数の差は、一部分、後者の分析から 排除された核の数（３つのうちの１つまで）により説明することができる。なぜ なら、それらは二次元のリプリゼンテイションにおいて２つの別々の染色体ドメ インとして明瞭に分割することができなかった、より大きくかつより多い拡散シ グナル、最もありうることには１より多い染色体を示したからである。前述の小 さい交差ハイブリダイゼーションする部位は第２実験の複雑さを表すが、データ の解釈に悪影響を与えなかった。

染色体２１の異常を含有する細胞の試験最適な（９４ｋ　ｂ）プラスミドのプー ルおよび染色体２１ライブラリーのインサートを使用するＣｌ５Ｓハイブリダイ ゼーシヨンを、さらに、染色体２１の異常を含有する細胞を使用することによっ て試験した。両者のプローブの組は、ダウン症候群のリンパ球の培養物からのす べての分裂中期スプレッドにおいて三乗包体２工の速い明瞭な診断を可能とした （参照、第１４図りおよびＥにおける例）。さらに、前述のように分析したのと 同一の調製物の間開植生のハイブリダイゼーションシグナルの定量的分布は、い ずれかの型のプローブを使用しても類似した［細胞のく５％シグナルなし、５〜 １５％１つのシグナルをもつ、２５〜３５％２つのシグナルをもつ、および５５ 〜６５％３つのシグナルをもつ（第１４図Ｆ−Ｊ）］。ライブラリーのＤＮＡイ ンサートは１５％までの４つのシグナルの核を与え（比較、第１４図ＦおよびＧ ）、最もありそうなことには他の染色体上の小さい結合部位のために、プラスミ ドのプールは４つのシグナルをもつ無視できる百分率の核（＜０．　２％）明ら かにした。これらの結果が示すように、三乗包体２１は小さい集団の非有糸分裂 細胞を使用して診断的に意味ある方法で検出することができる。

胚の慢性絨毛細胞中の染色体２１のＤＮＡの局在化胚の慢性絨毛（ＣＶ）細胞を 、また、父親が逆ｔ（４：２１）転座を有した場合、９４ｋｂのプラスミドプロ ーブを使用して研究した。ＣＶ細胞の分裂中期スプレッドへのハイブリダイゼー ションは、転座した染色体（４ｐｔｅｒ−４ｑ３３：　：２１Ｑ１１．２−２１ Ｑｔｅｒ）が事実胎児により遺伝されることが示された（参照、第１３図りおよ びＭ）。

ＣＶ細胞の簡明細胞核中のシグナル（参照、第１４図Ｋ）は、正常核型をもつ細 胞のそれ（上を参照）と平行する分布を有し、２１ｑ２２．３の釣り合ったリプ リゼンテイションを示しそして可能な診断としてダウン症候群を排除した。正常 のリンパ球のそれを越える３つおよび４つのシグナルの小さい増加（両者く５％ ）がまた観測され、これは多分このようなＣＶ試料中のより高い部分の四倍体細 胞を反映する。

神経膠腫細胞中の染色体２１のＤＮＡの局在化つ擬三倍体であることが知られて いる、神経膠腫細胞系、ＴＣ６２０、を使用することによってさらに試験した。

フレマー（Ｃｒ　ｅｍｅ　ｒ）、Ｔ、ら、エキスペリメンタル・セル・リサーチ （Ｅｘｐ、Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　Ｒｅｓ、）、ｌヱ旦：１９９−２２０　（１９８８） ；フレマ　（Ｃｒｅｍｅ　ｒ）　、Ｔ、ら、ヒユーｖンージェネティックス（Ｈ ｕｍ、Ｇｅｎｔ、）、印刷中（１９８８）；７ヌエリデイス（Ｍａｎｕｅ　１　 ｉ　ｄ　ｆ　ｓ）　、Ｌ。

およびマヌエリディス（Ｍａｎｕｅ　ｌ　ｉｄ　ｉ　ｓ）　、Ｅ、　Ｅ、　、神 経病理学における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ。

ｇｙＬジンンマーマン（Ｚｏｍｍｅｒｍａｎ）　、Ｈ，Ｍ、編、Ｖｏ　Ｉ。

４、ｐｐ、２３５−２６６、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　ＰｒｅｓＳ）、ニ ューヨーク（１９７９）。分裂中期スプレッドは２つの明らかに正常の染色体２ １および１つの転座染色体上らかにした（参照、第１４図ＮおよびＯ）。興味あ ることには、ライブラリーのプローブにより標識された転座染色体上の染色体２ １ＤＮＡは、正常の２ＩＱ領域に等しい大きさを有し、こうしてロバートノン転 座の事象を示唆する。しかしながら、２１Ｑの繊細な構造の異常（すなわち、小 さい欠失など）はこの分析により排除することができない。両者のプラスミドの プローブの組およびライブラリーのインサートを使用して見られた簡明シグナル は、それぞれ、三乗包体２１Ｑ２２．３および三乗包体２１と一致した。

充実組織における染色体２１のＤＮＡ配列の局在化９４ｋｂのプラスミドのプロ ーブの組の充実組繊中の染色体２１ＤＮＡ配列を局在化する能力を、また、評価 した。両者の染色体２１はプローブにより明瞭に標識され、そして核付近に位置 した：この核の位置は染色体２１が通常核の中に局在化されるリポソームの遺伝 子のクラスターを含有するという事実と一致する。この観測が示唆するように、 これらのプローブは、また、特異的細胞または組織の型中の染色体２１のモザイ ク性の頻度を評価ために有用であることを証明することができる。

さらに、ダウン症候群の表現型に関連する種々の核型の変化が神経組織中の染色 体２１の正常の核のトポグラフィ−を変更するかどうかを見ることは興味あるで あろう。

同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同等の多くの実施態様を認識 するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるで あろう。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを意 図する。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ 染色体シグナルの数　Ｆ／Ｇ／ＩＥ ＦＩＧ、／ＩＣ ＦＩＧ、１４ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８平成３年５月１５日 特詐庁長官　植　松　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５２５３ ２、発明の名称 正常部位抑制ハイブリダイゼーションおよびその使用３、特許出願人 名称　エール・ユニバーシティ ４、代理人　〒１０７ 電話　３５８５−２２５６ ５６補正書の提出年月日 １９９１年３月１４日 ６、添付書類の目録 （１）　補正音の写しく翻訳文）　１通１）　請求の範囲（補正） １、個々の哺乳動物の染色体を有糸分裂細胞または開開細胞の中で染色体特異的 プローブと、哺乳動物の染色体中の反復した配列へのハイブリダイゼーションを 抑制する条件下に、正常部位ハイブリダイゼーションさせて、約９０％またはそ れより大きい特異性をもつ特異的シグナルを生成することによって、個々の哺乳 動物の染色体を標識する方法。

２、個々のヒトの染色体を有糸分裂細胞または開開細胞の中で染色体特異的プロ ーブと、ヒト染色体中の反復した配列へのハイブリダイゼーションを抑制する条 件下に、正常部位ハイブリダイゼーションさせて、約９０％またはそれより大き い特異性をもつ特異的シグナルを生成することによって、個々のヒトの染色体を 標識する方法。

３、染色体特異的である標識したＤＮＡプローブを、約９０％またはそれより大 きい特異性をもつヒト有糸分裂細胞またはヒト簡明細胞の中でＤＮＡに正常部位 抑制ハイブリダイゼーションすることからなる、個々のヒト標的染色体の高度に 特異的なデコレーションを生成する方法。

４、ＤＮＡプローブは、全組み換えライブラリーのＤＮＡ、染色体誘導組み換え ＤＮＡライブラリーから精製したＤＮＡインサート、および染色体から誘導した 特異的ＤＮＡ断片から成る群より選択される、上記第３′ｒｉ記載の方法。

５、標識したＤＮＡプローブは、少なくとも１種の蛍光色素で標識したＤＮＡプ ローブ、特異的結合対の少なくとも１つの構成員で標識したＤＮＡプローブ、お よび酵素で標識したＤＮＡプローブから成る群より選択される、上記第４項記載 の方法。

６、蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　 ｒｅｄ）、ルシファーイエｏ　−（Ｌｕｃｉｆｅｒ　ｙｅｌｌｏＷ）、フィコビ リンタンパク質およびシアニン色素から成る群より選択され、そして特異的結合 対の構成員はビオチンである、上記第５項記載の方法。

７、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ標識を生成する条件下に、染色 体の正常部位ハイブリダイゼーションにより、ヒト細胞中の染色体異常を評価す る方法。

８、ヒト細胞は、分裂中期細胞、前期細胞および開開細胞から成る群より選択さ れる、上記第７項記載の方法。

９、工程： ａ）１）存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用 可能に処理した、ヒト異数性細胞；および２）特異的染色体から誘導された標識 したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブ リダイゼーション混合物を、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが 約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に、− 緒にし、そしてｂ）前記異数性細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションし た特異的染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出する、からなる、ヒト 異数性細胞中の染色体異常を検出する方法。

１０、異数性細胞はヒト腫瘍細胞である、上記第９項記載の方法。

１１、ヒト腫瘍細胞は、分裂中期細胞、前期細胞および開開細胞から成る群より 選択される、上記第１０項記載の方法。

１２、ヒト腫瘍細胞はヒトグリオーム細胞である、上記第１０項記載の方法。

１３、工程： ａ）１）試料の中に存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーシ ョンに利用可能に処理した、試料；および２）選択した染色体から誘導された標 識したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイ ブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーション が約９０％またはそれより大きい特異性をもって起こるために適当な条件下に、 −緒にし、そしてｂ）試料の中に存在する核酸配列にハイブリダイゼーションし た選択した染色体から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出する、からなる、試 料の中に存在するヒトコスミドの数の変更を試料の中で検出する方法。

１４、選択したヒト染色体は、染色体１３．１８．２１、ＸおよびＹから成る群 より選択される、上記第１３項記載の方法。

１５、選択したヒト染色体は染色体番号２１であり、そして選択した染色体から 誘導された標識したヒトＤＮＡは染色体誘導組み換えＤＮＡライブラリーから精 製したＤＮＡインサートである、上記第１３項記載ａ）１）ヒト腫瘍細胞の中に 存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能に処 理した、ヒト腫瘍細胞；および２）選択した染色体から誘導された標識したＤＮ Ａ断片、競争ＤＮＡ。

およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物を、相 補的核酸配列の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい 特異性をもって起こるために適当な条件下に、−緒にし、そして ｂ）前記腫瘍細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションした標識したヒト染 色体特異的ＤＮＡ断片を検出する、からなる、ヒト腫瘍細胞中の選択した染色体 またはその一部分のりブリａ）次の配列：１）選択した哺乳動物の染色体を含有 する開開の核、２）検出可能な標識を有する選択した哺乳動物の染色体から誘導 したＤＮＡ断片、３）競争ＤＮＡ、およびキャリヤーＤＮＡを、相補的核酸配列 の特異的ハイブリダイゼーションが約９０％またはそれより大きい特異性をもっ て起こるために適当な条件下に、−緒にして、検出可能な標識を有するＤＮＡ断 片と選択した哺乳動物の染色体との複合体を形成し、そして ｂ）工程（ａ）において形成した複合体を検出する、からなる、選択した哺乳動 物の染色体の中に存在する染色体特異的ＤＮＡを同定する方法。

１８、工程（ａ）において−緒にした残りの物質から形成した複合体を分離する ことによって、選択した哺乳動物の染色体中の染色体特異的ＤＮＡを単離するこ とをさらに含む、上記第１７項記載の方法。

１９、存在するＤＮＡが相補的核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションに利 用可能とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の 開開細胞を、２またはそれ以上の選択した検出可能に標識した、高い遺伝的複雑 性をもつ、染色体特異的ヌクレオチドプローブと、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシ ヨン条件下に、−緒にして、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ選択し た染色体を標識し、そしし　て標識した選択した染色体を検出することからなる 、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の開開細胞の中で選択した染色体を同 定する方法。

２０、存在するＤＮＡが相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能 とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の簡明細 胞を、同定すべき異なる染色体の１つに対して相補的な少な（とも第１の検出可 能に標識した核酸プローブ２および同定すべき異なる染色体の第２のものに対し て相補的な第２の検出可能に標識した核酸プローブからなる、検出可能に標識し た染色体特異的プローブの組と、Ｃｌ５Ｓハイブリダイゼーシヨン条件下に、− 緒にして、約９０％またはそれより大きい特異性をもつ検出可能に標識した選択 した染色体を生成し、前記第１の検出可能に標識した核酸プローブ上の検出可能 な標識は前記第２の検出可能に標識した核酸プローブ上の検出可能な標識と異な り、そして標識した選択した染色体を検出することからなる、哺乳動物のを糸分 裂細胞または哺乳動物の開開細胞の中で少なくとも２・　つの異なる選択した染 色体を同定する方法。

２１、検出可能に標識した染色体特異的プローブは蛍光的に標識されている、上 記第２０項記載の方法。

国際調査報告 ”””””　紡−一”　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０５２５３国際調査報告　ＰＣＴ ／ＵＳ　８９１０５２５３Ｔ’ｋｋ　ｗａｇｓ　ｌｂ＋ｖ　ｌ１ｗ　ｐｓｈｗｌ 　１７ＩＦ−一一一軸〜−−−−−−−−船一＋ｗｗ＋ｉ＋ｗ４−一一一岬蛸ｔ ＝＝；二：；に；：：Ｈご＝；ニーーユ、−慣す児−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、個々の哺乳動物の染色体を有糸分裂細胞または間期細胞の中で染色体特異的 プローブと正常部位ハイブリダイゼーションさせて、染色体特異的シグナルを生 成することによって、個々の哺乳動物の染色体を標識する方法。 ２、個々のヒトの染色体を有糸分裂細胞または間期細胞の中で染色体特異的プロ ーブと正常部位ハイプリダイゼーションさせて、染色体特異的シグナルを生成す ることによって、個々のヒトの染色体を標識する方法。 ３、染色体特異的である標識したＤＮＡプローブをヒト有糸分裂細胞またはヒト 間期細胞の中でＤＮＡに正常部位抑制ハイブリダイゼーションすることからなる 、個々のヒト標的染色体の高度に特異的なデコレーションを生成する方法。 ４、ＤＮＡプローブは、全組み換えライブラリーのＤＮＡ、染色体誘導組み換え ＤＮＡライブラリーから精製したＤＮＡインサート、および染色体から誘導した 特異的ＤＮＡ断片から成る群より選択される、上記第３項記載の方法。 ５、標識したＤＮＡプローブは、少なくとも１種の蛍光色素で標識したＤＮＡプ ローブ、特異的結合対の少なくとも１つの構成員で標識したＤＮＡプローブ、お よび酵素で標識したＤＮＡプローブから成る群より選択される、上記第４項記載 の方法。 ６、蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓｒ ｅｄ）、ルツファーイエロー（ＬｕｃｉｆｅｒｙｅｌＩｏｗ）、フィコビリンタ ンパク質およびシアニン色素から成る群より選択され、そして特異的結合対の構 成員はビオチンである、上記第５項記載の方法。 ７、染色体の正常部位ハイブリダイゼーションにより、ヒト細胞中の染色体異常 を評価する方法。 ８、ヒト細胞は、分裂中期細胞、前期細胞および間期細胞から成る群より選択さ れる、上記第７項記載の方法。 ９、工程： ａ）１）存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイプリダイゼーションに利用 可能に処理した、ヒト異数性細胞；および２）特異的染色体から誘導された標識 したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイブ リダイゼーション混合物を、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションが起こる ために適当な条件下に、一緒にし、そして ｂ）前記異数性細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションした特異的染色体 から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出する、からなる、ヒト異数性細胞中の 染色体異常を検出する方法。 １０、異数性細胞はヒト腫瘍細胞である、上記第９項記載の方法。 １１、ヒト腫瘍細胞は、分裂中期細胞、前期細胞および間期細胞から成る群より 選択される、上記第１０項記載の方法。 １２、ヒト腫瘍細胞はヒトグリオーム細胞である、上記第１０項記載の方法。 １３、工程： ａ）１）試料の中に存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダイゼーシ ョンに利用可能に処理した、試料；および２）選択した染色体から誘導された標 識したヒトＤＮＡ、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤＮＡからなるハイ ブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列のハイプリダイゼーションが起こ るために適当な条件下に、一緒にし、そして ｂ）試料の中に存在する核酸配列にハイブリダイゼーションした選択した染色体 から誘導された標識したヒトＤＮＡを検出する、からなる、試料の中に存在する ヒトコスミドの数の変更を試料の中で検出する方法。 １４、選択したヒト染色体は、染色体１３、１８、２１、ＸおよびＹから成る群 より選択される、上記第１３項記載の方法。 １５、選択したヒト染色体は染色体番号２１であり、そして選択した染色体から 誘導された標識したヒトＤＮＡは染色体誘導組み換えＤＮＡライブラリーから精 製したＤＮＡインサートである、上記第１３項記載の方法。 １６、工程： ａ）１）ヒト腫瘍細胞の中に存在する核酸配列を相補的核酸配列とのハイブリダ イゼーションに利用可能に処理した、ヒト腫瘍細胞；および２）選択した染色体 から誘導された標識したＤＮＡ断片、競争ＤＮＡ、およびヒト以外のゲノムのＤ ＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物を、相補的核酸配列のハイブリダイ ゼーションが起こるために適当な条件下に、一緒にし、そして ｂ）前記腫瘍細胞からの核酸配列にハイブリダイゼーションした標識したヒト染 色体特異的ＤＮＡ断片を検出する、からなる、ヒト腫瘍細胞中の選択した染色体 またはその一部分のリプリゼンテイションの過剰または低下を検出する方法。 １７、工程： ａ）次の配列：１）選択した哺乳動物の染色体、２）検出可能な標識を有する選 択した哺乳動物の染色体から誘導したＤＮＡ断片、３）競争ＤＮＡ、およびキャ リヤーＤＮＡを、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションが起こるために適当 な条件下に、一緒にして、検出可能な標識を有するＤＮＡ断片と選択した哺乳動 物の染色体との複合体を形成し、そして ｂ）工程（ａ）において形成した複合体を検出する、からなる、選択した哺乳動 物の染色体の中に存在する染色体特異的ＤＮＡを同定する方法。 １８、工程（ａ）において一緒にした残りの物質から形成した複合体を分離する ことによって、選択した哺乳動物の染色体中の染色体特異的ＤＮＡを単離するこ とをさらに含む、上記第１７項記載の方法。 １９、存在するＤＮＡが相補的核酸配列とのハイプリダイゼーションに利用可能 とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細 胞を、２またはそれ以上の選択した検出可能に標識した、高い遺伝的複雑性をも つ、染色体特異的ヌクレオチドプローブと、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション条 件下に、一緒にして、選択した染色体を標識し、そして標識した選択した染色体 を検出することからなる、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞の 中で選択した染色体を同定する方法。 ２０、存在するＤＮＡが相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能 とするように予備処理された、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細 胞を、同定すべき異なる染色体の１つに対して相補的な少なくとも第１の検出可 能に標識した核酸プローブ２および同定すべき異なる染色体の第２のものに対し て相補的な第２の検出可能に標識した核酸プローブからなる、検出可能に標識し た染色体特異的プローブの組と、ＣＩＳＳハイブリダイゼーション条件下に、一 緒にして、検出可能に標識した選択した染色体を生成し、前記第１の検出可能に 標識した核酸プローブ上の検出可能な標識は前記第２の検出可能に標識した核酸 プローブ上の検出可能な標識と異なり、そして標識した選択した染色体を検出す ることからなる、哺乳動物の有糸分裂細胞または哺乳動物の間期細胞の中で少な くとも２つの異なる選択した染色体を同定する方法。 ２１、検出可能に標識した染色体特異的プローブは蛍光的に標識されている、上 記第２０項記載の方法。