JPH04503002A - 無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質の単離物及び濃縮物の新規なる製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質の単離物及び濃縮物の新規なる 製造方法。

本発明は無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質の単離物及び濃縮物を 調製できる新規なる方法及び工程に関する。本発明は更に、本発明の方法及び工 程に従って製造された無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質の単離物 及び濃縮物に関する。

フィチン酸はダイズマメの中に存在し、同様に多数のその他の植物種子中にも存 在する。植物中のフィチン酸はカルシウム塩、マグネシウム塩、及びカリウム塩 の形で存在し、一般にそれらはフィチンと呼ばれている。種子に含まれている大 部分のリン酸はこれらの化合物中に貯蔵されている。例えば、ダイズマメ中の総 リン酸の約７０％はフィチンにより占められている。本明細書でフィチン酸なる 譜を用いた場合、それはフィチン酸の塩及びフィチン酸とその他のダイズマメ構 成成分との分子複合体を含むことを意図する。

フィチン酸は、タンパク質及び多価の金属陽イオント複合体を形成する傾向にあ る。フィチン酸の複合体は、ダイズタンパク質の栄養価を低下させる（Ｒｅｄｄ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、Ｆｏｏｄ　Ｒ金属陽イオンと相互作用するため、動 物及び人による種々の金属、例えばカルシウム、鉄及び亜鉛の消化を妨げる。こ のことは、特に菜食主義者、高齢者及び幼児に欠乏障害をもたらす。

フィチン酸は又、ペプシン及びトリプシンを含む胃腸消化管中の種々の酵素を阻 害し、そしてダイズタンパク質の消化を低下させる。他に、フィチン酸中に存在 するリン酸はヒトに有用ではない。更に、育児食中のこのような有用でないリン 酸の比較的大量の存在は、不十分な骨の鉱化をもたらしうる。

典型なる商業上のダイズタンパク質単離工程において、タンパク質を溶解するた めに脱脂したダイズフレーク又はダイズ粉は８．０から１０．０の間のｐＨ値で 抽出が行われる。この溶液の不溶性部分を分離するため、このスラリーを遠心す る。主要の両分は、タンパク質の等電点付近のｐＨ（４，５）で沈殿させ、遠心 によりこれを分離し、水によりこの沈渣を洗浄し、ｐ）Ｊ７でこれを再分散し、 そして噴霧乾燥することによりこの溶液から回収している（米国特許Ｎα３．０ ０１．８７５及び３．３９７，９９１参照のこと）。このような工程において、 フィチン酸はタンパク質に随伴し、そして得られたダイズタンパク質生成物の中 に集中する傾向にあるであろう。商業用ダイズタンパク質単離物のフィチン酸含 有量は、ダイズ種子が１−２％のフィチン酸を含む場合、約２−３％である。

食料源としてのダイズタンパク質の世界的重要性のため、ダイズタンパク質単離 物及び濃縮物のフィチン酸の濃度の低下についての方法を工夫する数多くの試み がなされている。

それ故、種々の化学的及び物理的処理、並びに内因性フィツーゼ又は麦フィター ゼのいずれかの植物フィツーゼが、ダイズマメから低フィチン酸ダイズタンパク 質単離物を調製するために用いられてきた。生きたかびによる発酵方法も、ダイ ズタンパク質単離物のフィチン酸含有を低下させる方法として研究されてきた。

しかしながら、これらの方法のいずれも、タンパク質の機能的特性に悪影響を及 ぼすことなく、無フィチン酸ダイズタンパク質単離物のための迅速、且つ経済的 な方法を提供することはなかった。

Ｂｏｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許２．７３２．３９５には、タンパク質の 等電点付近のｐＨ（約４．５）での酸性水溶液抽出による、種々の油脂種子から のフィチン酸の分離方法が記載されている。

このｐＨでフィチン酸はある程度溶解し、そして回収される。

タンパク質は、それらをアルカリのｐＨで溶解させ、不溶性の部分を分離させ、 そしてタンパク質を等電点付近のｐｎで沈殿させることで回収される。得られた タンパク質両分は４％はどの有機リン酸を含んでいた。

ＭｃＫｉｎｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、　１７８　： 　１１７−１３２（１９４９）は、フィチン酸が１１．０から１１．５の間のｐ Ｈでダイズタンパク質から解離し、そして遠心により除去できる沈殿物を形成す ることに注目している。

Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許４，０７２．６７０は、Ｂｏｌｌ ｅ　ｅｔ　ａｌ、。

により用いられた酸性条件において、タンパク質とフィチン酸との間にアルカリ 耐性複合体が形成されることを述べている。この欠点を克服する試みにおいて、 彼らはＭｃＫｉｎｎｅｙ　ｅｔ監に記載ＯｐＨ値より若干高め、即ち１１．６か ら１４の間のｐｉでのフィチン酸の沈殿を詳述している０次いでフィチン酸を、 タンパク質の等電点（ｐＨ４，５）でのタンパク質沈殿の前にタンパク質から分 離させている。この工程の欠点の一つは、このような極端なアルカリｐｉへのタ ンパク質の暴露がタンパク質の栄養価に悪影響を及ぼすことにある。また、望ま しくないリシノアラニンの形成を増大させる傾向がある。

更に、このような高いｐＨで形成された非常に軽いフィチン酸沈殿物を分離する ためには、商業用連続遠心分離機は利用できない。

ｄｅＲｈａｍ、英国特許１５７４１１０は、中性ダイズ抽出物（ｐＨ８，０で抽 出）からのタンパク質沈殿をｐＨ４，５の代わりにｐＨ５，７で行った場合、ダ イズタンパク質単離物のフィチン酸含有量を２％から０．６％へと減少できる方 法を開示している。ダイズタンパク質をｐＨ２，５で抽出し、そしてｐＨ４，５ で回収した場合、フィチン酸含有量は１．７％であったと報告している。沈殿を ｐＨ５，５で行うことにより、フィチン酸含有量が０．７％迄減少したと報告し ている。単離物のフィチン酸濃度は、タンパク質をｐ）１１１．５で抽出し、そ してそれをｐｉ５．ｓで回収することにより０．２％迄減少できる。しかしなが ら、このような方法は、タンパク質の回収率が２０％はど低下するという欠点を 有し、このことはこの方法を商業上実行不可能なものとする。

ｄｅＲｈａ＋ｗ　ａｎｄ　Ｊｏｓｔ、　Ｊ、Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　４４　：　５ ９６−６００（１９７９）　は、カルシウムイオンがｐＨ１１，５でダイズタン パク質の沈殿を高めることを述べている。非常に低いフィチン酸濃度が１０％の ＮａＣ１での抽出により得られるが、しかしこのような方法は透析又は限外濾過 により脱塩しないと実際上有用でない単離物を生成した。更に、このような方法 によるタンパク質の収率も低い。

Ｉａｃｏｂｕｃｃｉ　ｅｔ　ａｌ、＋米国特許３．７３６．１４７は、限外濾過 との組合せにおける種々の化学処理を包含した、ダイズタンパク質におけるフィ チン酸の濃度を低める方法を開示している。

この化学処理は、中性ｐＨでの内因性フィツーゼによるフィチン酸の加水分解、 低ｐＨでのカルシウム存在下における限外濾過、又は高ｐｌ（でのＥＤＴＡの利 用を含む。このような方法は複数の欠点を有する。ダイズグロブリンはこのよう な低ｐＨ値でサブユニットに解離し、そして変性することが知られている。低ｐ Ｈでのカルシウムイオの利用は、塩除去のための更なる限外濾過工程を必要とす る。フィツーゼ方法における高温度（６５°Ｃ）は、等電点のいずれの側でのタ ンパク質の溶解性含低下させる。達成された最小リン酸含有量は０．２％より低 くなく、そしてそれは０．７％のフィチン酸に相当する。

この方法はまた、非常に時間のかかるものであった（限外濾過、１８−４８時間 ）。

Ｐｕ５ｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、英国特許出願ＧＢ　２．１８０．２４１は、８から １０のｐＨ及び６５℃より高い温度でタンパク質を抽出する、ダイズタンパク質 調製方法を開示している。このタンパク質生成物は約０．３％より低いフィチン 酸を含む、しかしながら、また、このような高温度はタンパク質の溶解性及びそ の他の機能に悪影響を及ぼす。

Ｂｒｏｏｋｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒｒ、　Ｊ、Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　４７　：　１２ Ｂ０　１２８２（１９Ｂ２）はイオン交換処理を利用したダイズタンパク質単離 物からのフィチン酸の除去についての方法を開示している。効果的なフィチン酸 の除去のためには陽イオン交換及び陰イオン交換の組み合わせが必要とされる。

非タンパク質成分を除去するために透析工程を利用している。しかしながら、こ の方法は商業サイズでの利用のためには許容できない、複雑且つ高価なものであ ろう。

酵素、例えばフィツーゼもダイズタンパク質単離物の調製において用いられてい る。例えば、ＭｃＣａｂｅ、米国特許３．７３３．２０７には、減少したフィチ ン酸含有量を有する可溶性タンパク質画分の調製が記載されている。アルカリ条 件でタンパク質を溶解し、ｐｎを約５迄低めた後、麦フイターゼを加えている。

このタンパク質画分はｐ）１４．５で沈殿させずに回収している。得られたタン パク質は、酸性状態において可溶性のため、炭酸飲料に適している。しかしなが らこの酵素処理は長く、２４−３６時間必要とする。このタンパク質のフィチン 酸含有量は報告されていない。

Ａｓａｈｉ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｉｎｄ、Ｋｋに譲渡の日本出願５０．１３０ ．８００には、麦フィターゼと陽イオン交換樹脂の処理との組合せにより、水性 植物種子抽出物において６０％のフィチン酸が除去できたことを記載している。

ダイズタンパク質の最小リン酸含有量は０．２４％はどであり、それは０．８５ ％のフィチン酸に相当する。

ダイズ製品の臭い、風味又は消化性の改善のため、種々の発酵処理が企てられた 。しかしながら、典型的な発酵処理は長時間、通常２４時間以上を必要とし、そ してタンパク質の機能的又は物理的性質を実質的に変えてしまう。

Ｆｒ１ｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許４．６４２．２３’６には、ダイズタン パク質にアスペルギルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ）又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏ 　ｕｓ）種の生きたかびのベレットを接触させることを包含する、ダイズ製品の 風味の改善についての迅速な方法が記載されている。しかしながら、水性のスラ リーの処理における効率的な結果のためには、乾燥重量に基づき、１００ｇのタ ンパク質当り、大量のかび−１から１０ｇはど−を必要とする。また、抽出工程 において通常用いられる亜硫酸塩物質は、かびの活動に悪影響を及ぼす。

フィターゼの利用は、豆乳に含まれる可溶性ダイズタンパク質の処理において説 明されている。豆乳の製造において、ダイズマメは一夜浸けられ、粉砕され、そ して濾過される。

この濾過物を豆乳と称する。濾過後、この豆乳は一般に風味の悪い成分を除去す るために調理される。

Ａｎｎｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｉ　ｏｎ　５ｈｏｋｕｈｉｎ　Ｋｏ　ｏ　Ｇａｋｋａ ｉｓｈｉ　３２　３）：１７４−１８０　（１９８５）は、麦フィターゼによる 商業上のダイズ豆乳中に含まれるフィチン酸の９０％の除去を報告している。

Ｎ１ｐｐｏｎ　５ｈｉｎｙａｋｕ　、日本国出願５９．１６６、０４９は、遊離 フィターゼ及び固定化フィターゼを用いた、麦フィターゼによる豆乳中のフィチ ン酸の分解の方法を報告している。Ｆｕｊｉｗａｒａｅｔ　ａｌ、、　（Ｒｅｐ ｏｒｔｓ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｓｎｏｗ　Ｂｒ ａｎｄ　Ｍｉｌｋ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏ、Ｎａ８３（１９８６）３１．４１ ．　Ｒｅｆ、ＦＳＴＡ　１９（１９８７）９Ｊ１１８）は、リゾプスＳｐ、　フ ィターゼ処理による豆乳の消化性の改善を報告している。

微生物由来のフィターゼも、タンパク質の濃縮物及び単離物のための更なる処理 をすることなく、食品原料のフィチン酸含有を減少させることにおいて試験され ている（Ｈａｎ　ａｎｄＷｉｌｆｒｅｄ、　Ｊ、Ａ　ｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅ ｍ、　３６：　２５９　２６２（１９８８））。オートクレーブにかけること（ １２１°Ｃ，１時間）は、アスペルギルス　フィキューム（Ａｓ　ｅｒ　ｔｌｌ ｕｓ　Ｆｉｃｕ且工）フィターゼによるフィチン酸の分解を促進させる（８５％ 分解）。しかしながら、このような高温度は得られるタンパク質の機能的特性を 変化させ、且つその栄養価を低下させる。

先例の検討は、ダイズタンパク質のフィチン酸含有を低める方法を開発するため にかなりの努力が費されてきたことを示す。しかしながら、このような方法は、 不十分なフィチン酸の減少、高額、長時間の処理の必要性、処理タンパク質の許 容できない変性及び商業的ダイズタンパク質処理技術に適合しないことを含む種 々の欠点を有する。

この結果として、実際の商業スケールでのダイズタンパク質の製造を可能としな がらこのような欠点を回避できる、無フィチン酸又は低フィチン酸のダイズタン パク質単離物及び濃縮物の製造方法の改善が必要とされ続けている。

本発明は無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質単離物及び濃縮物を製 造できうる新規な方法を含んで成る。

本発明は更に、本発明の方法及び工程に従って製造した無フィチン酸又は低フィ チン酸ダイズタンパク質単離物及び濃縮物を含んで成る。

それ故、−態様において、実質的に無フィチン酸の、又は低フィチン酸ダイズタ ンパク質単離物及び濃縮物を製造する新規な方法であって、以下の段階： （ａ）少なくとも１種類のフィチン酸分解酵素を含んで成る微生物由来の酵素調 製物を粒状のダイズマメ水性スラリーに加え； （ｂ）約２．０から６．０の間のｐＨ値、及び約２０℃から５５℃の間の温度で フィチン酸分解を行い；そして（Ｃ）得られた無フィチン酸又は低フィチン酸ダ イズタンパク質を単離すること、 を含んで成る方法が提供される。

その他の態様において、ダイズタンパク質単離又は濃縮物からフィチン酸を実質 的に除去する方法であって、以下の段階： （ａ）フィチン酸含有ダイズタンパク質単離物又は濃縮物に、少な（とも１種類 のフィチン酸分解酵素を含んで成る微生物由来の酵素調製物を加え；そして （ｂ）約２．０から６．０の間のｐｔ＋、及び約２０°Ｃから５５°Ｃの間の温 度でフィチン酸分解を行う；ことを含んで成る方法が提供される。

またその他の態様において、本発明は実質的に無フィチン酸又は低フィチン酸ダ イズタンパク質単離物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）懸濁物を形成せしめるために粗く粉砕した脱脂ダイズ粒状物を水性の媒体 の中に懸濁し； （ｂ）段階（ａ）の該懸濁物のｐＨを約２．　０から６．０の間に調整し； （Ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物の中に、フィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓ（登 録商標）を導入し；（ｄ）段階（Ｃ）の該懸濁物を約１．０から約８．０時間の 間、約２０から５０°Ｃの間でインキュベートし；（ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物 を約９．０のｐＨに調製し、そしてこの調製した懸濁物を室温で約１時間インキ ュベートシ；（ｆ）不溶性の両分を段階（ｅ）の懸濁物から分離し、そして （ｇ）段階（ｆ）の懸濁物から可溶性のタンパク質を分離し、これによって実質 的に無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質単離物を得ること、 を含んで成る方法を提供する。

その他の態様において、実質的に無フィチン酸ダイズタンパク質の単離物もしく は濃縮物、又は低められたフィチン酸濃度を有するダイズタンパク質単離物を製 造する方法であって、以下の段階； （ａ）懸濁物を形成せしめるために、一定量の商業上のダイズタンパク質を水性 の媒体の中に懸濁し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物のｐ）ｌを約２．０から約６ ．０の間に調製し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物の中に、フィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導 入し； （ｄ）段階（Ｃ）の懸濁物を、約１．０から約８．０時間の間、約２０から６５ ℃の間でインキュベートし；（ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物を約４．５のｐｉに調 整し；（ｆ）段階（ｅ）の懸濁物からダイズタンパク質を分離すること； を含んで成る方法が提供され、これにより実質的に無フィチン酸ダイズタンパク 質単離物もしくは濃縮物、又は低められたフィチン酸濃度を有するダイズタンパ ク質の単離物が製造される。

その他の態様において、実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸のダイズタ ンパク質単離物又は濃縮物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）脱脂粒状ダイズマメ水性懸濁物からタンパク質を、約８．０から１０．０ の間のｐＨ値で抽出し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物から任意の不溶性物質を除 去し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物を約２．０から６．０の間のｐＨに調整し； （ｄ）段階（Ｃ）の該懸濁物の中にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入 し； （ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物を、約１．０から８．０時間の間、約２０から５５ ℃の間でインキュベートする、ことを含んで成る方法を提供し、これにより実質 的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸ダイズタンパク質単離物、又は濃縮物が 調製される。

その他の態様において、実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸ダイズタン パク質単離物又は濃縮物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）脱脂粒状ダイズマメの水性懸濁物からタンパク質を、約８．０から１０． ０の間のｐＨで抽出し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物から任意の不溶性の物質を 除（ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物のｐＨを約２．０から６．０の間に調整し； （ｄ）段階（Ｃ）の該懸濁物の中にフイターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入 し；そして （ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物を約１．０から８．０の時間の間、約２０から５５ °Ｃの間でインキュベートシ；（、ｆ）タンパク質を沈殿させるために段階（ｅ ）の懸濁物のｐｉをタンパク質の等電点に調整し；そして（ｇ）沈殿タンパク質 及び水性溶液を調製するため、段階（ｆ）の沈殿タンパク質を分離する； ことを含んで成る方法が提供され、これによって実質的に無フィチン酸もしくは 低フィチン酸ダイズタンパク質の単離物又は濃縮物が製造される。

その他の態様において、実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸ダイズタン パク質単離物又は濃縮物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）脱脂粒状ダイズマメ水性懸濁物からタンパク質を、約８．０から１０．０ の間のｐｉで抽出し；　゛（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物から任意の不溶性の物質 を除去し； （Ｃ）沈殿タンパク質及び水性溶液を調製するため、段階（ｂ）の該懸濁物のｐ Ｈをタンパク質の等電点に調整し；（ｄ）段階（ｃ）の該沈殿タンパク質を段階 （Ｃ）の水性溶液から分離し； （ｅ）段階（ｄ）のタンパク質を水性溶液中に再分散し；（ｆ）段階（ｅ）の溶 液のｐＨを約２．０から６．０の間に調整し； （ｇ）段階（ｆ）の該溶液にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入し； （ｈ）段階（ｇ）の溶液を約１．０から８．０時間の間、約２０から５５°Ｃの 間でインキュベートし；（ｉ）段階（ｈ）の溶液を中和し；そして（ｊ）段階（ ｉ）の溶液を噴霧乾燥する；ことを含んで成る方法が提供され、これによって実 質的に無フィチン酸又は低フィチン酸ダイズタンパク質単離物及び濃縮物が製造 される。

本発明は無フィチン酸及び低フィチン酸ダイズタンパク質単離物並びに濃縮物の 調製のための、簡潔、且つ商業的に魅力的な方法を提供する。本発明の利点は、 この重要な食品原料の製造の効率性及び経済性において更なる改善を有する商業 的ダイズタンパク質処理技術を完成させるためにこの方法が適していることにあ る。フィ、チン酸加水分解は、処理条件（ｐＨ及び温度）がフィチン酸分解のた めに適して調整されているならば、単離工程の前もしくは後、又は単離工程中で も行われることができる。酵素処理のための数多くの可能な場所は、製造者が現 在の単離工程に本発明の工程を採用することを容易にする。更に、本発明の方法 は、得られたタンパク質における栄養価を低め、且つ商業上の連続的な選別装置 によっては分離できない非常に軽い懸濁したフィチン酸沈殿物を生成することを 引き起こす、ダイズタンパク質を高めのアルカリ条件に暴露させることを必要と しない。

本発明の更なる利点は、ダイズタンパク質製品の溶解性及びその他の機能的特性 に悪影響を及ぼすことがある高温度（例えば６５°Ｃ以上）に、ダイズタンパク 質を暴露させないことにある。更に、本発明の方法は、ダイズタンパク質製品に 汚染を招くことがある、ダイズタンパク質を生育した微生物に暴露させることを 回避する。高額、そして時間のかかる工程、例えば限外濾過及びイオン交換処理 は、本発明の方法によって回避された。

図１は、フィチン酸分解酵素のＦｉｎａｓｅ組成物の活性へのｐＨの影響を示し た。このｐＨの影響は、４０℃で、０．２Ｍのクエン酸（ｐＨ３，５−６，５） 及び０．２ＭのグリシンＨＣＩ　（ｐＨ２，０−３，０）緩衝液における１５分 間インキュベートの後、測定された。

図２は、フィチン酸分解酵素のＦｉｎａｓｅ組成物の活性への温度の影響を示し た。この温度の影響は、０．２Ｍのクエン酸緩衝液中で、ｐ）１５．５にて１５ 分間インキュベート後測定された。

本発明は、高額なる化学的もしくは物理的処理又は装置なしで、低フィチン酸及 び無フィチン酸ダイズタンパク質製品を製造するための簡潔な方法を提供する。

ダイズタンパク質の好ましい原料は、脱脂ダイズマメ粒状物、例えば脱脂ダイズ 粉、粒、又はフレークである。

本発明の方法に従ってフィチン酸は、有効な商業上入手可能なバルク酵素組成物 により除去できる。フィチン酸分解酵素はイノシトール六リン酸を脱リン化して イノシトル及びオルトリン酸を生成し、複数のイノシトールリン酸の形が中間体 生成物となる。フィチン酸分解酵素には、フィツーゼ及び酸性ホスファターゼが 含まれる。

フィツーゼ及び酸性ホスファターゼは種々の微生物、例えばアスペルギルスｓ　 ｐ　ｐ、（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｓ旺ユ）リゾプスｓ　ｐ　ｐ、（Ｒｈｉｚ ｏ　ｕｓ　ｓ　、　）（Ａ　１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１６：１３４８−１３５ ７（１９６８）　；　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｍｔｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、５　： 　３７７　３８２（１９８３））により生産され、そしてフィツーゼはまた種々 の植物種子、例えば麦の発芽の間に生産される。当業界において知られた方法に 従って、酵素調製物は前記の生物から得られる。Ｃａｒａｎｓａ　ｅｔ　ａｌ、 、オランダ特許出願８７．０２７３５は、アスペルギルスｓｐｐ、由来のフィツ ーゼが麦由来のフィツーゼよりも、同じ酵素量でトウモロコシ中のフィチン酸を より効率的に分解したことを見い出している。

本発明の目的のために特に好ましいのはＦｉｎａｓｅ酵素、かつてはＥｃｏｎａ ｓｅＥＰ４３酵素と称せられていたＡｌｋ。

Ｌｔｄ、、　Ｒａｊａａ＋ａｋｉ、　Ｆｉｎｌａｎｄより製造されたものである 。これは本明細書で文献として組み入れている、１９８８年９月１２日の米国出 願、番号２４２．２４３に記載されている。

微生物的に生産された酵素調製物はまた、他の植物物質を分解する酵素、例えば セルラーゼ、ヘミセルロース、及び／又はペクチナーゼ活性を有する酵素を含む ことができる。これらその他の活性は、本発明の工程により得られる効果に寄与 しうる。

本発明はフィチン酸を、溶解した物質、例えば豆乳又はＭｃＣａｂｅの可溶性の タンパク質から除去するのみでなく、不溶性タンパク質−フィチン酸複合体から も除去する方法について提供する。このことは本発明固有の利点であり、なぜな ら低フィチン酸濃度で高タンパク質収率を得ることに関して、この複合体は大き な問題となるからである。本発明の方法において用いられるこのＦｉｎａｓｅｍ 成物は、抽出工程イチン酸を分解することができる。

簡潔に述べると、本発明の方法は以下の連続した段階：（ａ）１又は複数のフィ チン酸分解酵素を含んで成る酵素調製物の存在下で、脱脂ダイズマメ粒状物を水 性の媒体に懸濁し：そして （ｂ）得られた無フィチン酸又は低フィチン酸のダイズタンパク質を単離する、 ことを含んで成る。

本発明に間する好ましい水性媒体は中性ｐＨの水であるが、しかし熟練者は、日 課の作業の訓練でダイズマメ粒状物の製造開始に固有な条件を忘れないことによ り、任意の適当な水性媒体が利用できることを認識しているものである。

本発明の好ましい態様において、前述した段階（ｂ）のダイズタンパク質単離工 程は、以下の段階：（ａ）８から１０の間のｐＨ値のアルカリ条件下で、未処理 の材料からタンパク質を抽出し； （ｂ）炭水化物を含む不溶性画分を、常用の固形分分離ユニット工程、例えば濾 過又は遠心により分離し；（ｃ）４．５から５．５の間のｐＨ値の酸性条件下で ダイズタンパク質を沈殿させ； （ｄ）常用の固形分分離ユニット工程によりタンパク質を回収し； （ｅ）このタンパク質を沈殿のために用いたものと同じｐＨの酸性の水溶液で洗 浄し；そして （ｆ）このタンパク質を乾燥させる、 ことを含むことができる。

フィチン酸除去のだめの酵素処理は、精製後のダイズタンパク質の単離物又は濃 縮物にも適用させることができる（実施例４参照）。この処理は以下の段階：（ ａ）１又は複数の種類のフィチン酸分解酵素を含んで成る酵素調製物の存在下で 、タンパク質単離物又は濃縮物を水に懸濁し；そして （ｂ）このタンパク質のスラリーを食品用途において直接用いること、又は更な る処理、例えばタンパク質を乾燥させること； を含むことができる。

この酵素はまた、食品、例えば小児用流動食に直接添加できる。

本発明の方法は、約２．０から６．０の間、そして好ましくは約５．０から５． ５の間のｐＨ値、で行うことができる。

本発明に関する好ましい温度は約２０から６０℃の間であり、約５０から５５° Ｃの間がより好ましい。本発明の方法は、Ｇ。

ｏｄｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、記載の酸性条件におけるアルカリ耐性タンパク 質フィチン酸複合体の形成を防ぐ。

必要なＦｉｎａｓｅ酵素調製物の量は、用いた調製物、未処理の材料のフィチン 酸含有量、及び反応条件に依存するであろう。正しい投与量は当業者により容易 に確立できる。好ましくは、この酵素調製物は、ダイズマメ中のフィチン酸を実 質的に分解するような量の１又は複数の種類のフィチン酸分解酵素を含んで成る 。本発明は、低フィチン酸及び無フィチン酸のダイズタンパク質単離物の製造方 法であって、このタンパク質をその栄養価を低下させる高アルカリ性に暴露させ ることなく、且つ商業上の連続的分離装置により分離できない非常に軽い懸濁し たフィチン酸沈殿物を形成させることのない、節潔且つ商業上魅力的な製造方法 を提供する。これはまた、無フィチン酸ダイズタンパク質の単離物の製造方法で あって、タンパク質の溶解性及びその他の機能的特性に影響しうるタンパク質を ６５℃よりも高い温度に暴露させることをせずに製造する方法を提供する。また 、ダイズタンパク質と生きた微生物との不必要な接触、並びに時間のかがる精製 段階、例えば限外濾過及びイオン交換処理を必要としない。

本発明を詳述してきたが、以降の限定ではない実施例を参照することにより当業 者によって本発明がより完全に理解されるであろう。

１施■土 々のＨ畜　び：声でのフィチン　”　、の゛本実施例は商業上のフィチン酸分解 酵素である、Ａｌｋｏ　Ｌｔｄ、。

Ｒａｊａｍａｋｉ、　ＦｉｎｌａｎｄのＦｉｎａｓｅ酵素の活性への、ｐＨ及び 温度の影響を示す（図１及び２）。

フィチン分解活性は１％のフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を基質として用いることにより測定さ れた。この酵素反応はｐＨ５，５，４０°Ｃで行われた。フィチン酸分解酵素は フィチン酸からリン酸基を遊離させる。遊離した無機リン酸の測定は、ホスホモ リブデート複合体の還元により生成される色に基づく。

図１及び２は、Ｆｉｎａｓｅ酵素がフィチン酸を、２．　０から６．０のｐＨの 範囲にわたり、そして６０℃未満の温度で分解することを示す。最適、且つ好ま しいｐＨの範囲は約５゜０から５．５の間である。最適、且つ好ましい温度は約 ５０から６０°Ｃの間である。これらの最適範囲は、当業者にとって明らかであ ろう特定の必要性及び条件に依存して、もちろん変更が可能である。このような 変更は本発明の範囲の中にあるものとして理解される。

１施１ スケールでの　フィチン　゛イズ　ンパク！４わユ ２０ｇの脱脂ダイズフレーク（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ＋　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｔ ｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を粗く砕き、そして３０（１＋１の水に懸濁した 。

ｐＨを５．０に調整し、そして一定量のＦｉｎａｓｅ　Ｓ（登録商標）をこのス ラリーに加えた。フィチン酸分解活性がこの酵素調製物の主要なる要素である。

コントロール試験においては酵素を添加しなかった。懸濁物を４０℃で４時間、 振盪具申でインキュベートした。

酵素投与量はフィチン酸分解単位／フレークのｇとして示した。１フィチン酸分 解単位（ＩＰＵ）は、標準条件（４０’Ｃ，ｐＨ５，５）のもとで、１分間にｉ 　ｎｓ＋ｏｌの無機リン酸をフィチン酸ナトリウムから遊離させる酵素の量であ る。

酵素処理の後、このｐＨを９．０に調整し、そしてこの懸濁物を室温で１時間イ ンキュベートした。不溶性の画分を遠心により除去した。タンパク質を、４．５ のｐＨに調整することによって上清液から沈殿させた。この沈殿物を遠心により 回収し、そして凍結乾燥した。タンパク質の収率及びタンパク質両分のフィチン 酸含有量を測定した。

フィチン酸含有量の測定のため、タンパク質を酸性液により、３０分間にわたり 室温で抽出した。次に塩化第二鉄により、フィチン酸をこの透明な上滑液から沈 殿させた。第二鉄イオンは塩酸による沈殿により除去した。フィチン酸は、フィ チン酸ナトリウムを標準物質としてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に より測定した。表１は、タンパク質の残留フィチン酸及びタンパク質の収率（乾 燥重量に基づ（）ス　−ルでの　に　た゛イズ　ンバク によ　′　゛れたフィチン　′庁　び　ンパク　“０　１．９　２５ ５００　０．６　２６ ７５０　０．０　２４ 表１は本発明の方法を用いることにより、高いタンパク質の収率を維持しながら 無フィチン酸のダイズタンパク質単離物を得ることができることを示す。

実施何重 バ４ケールでの　フィチン　゛イズ　ンバク皿負■製遺 １５ｋｇのＩＬ脂ダイズフレーク（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、　Ａｍ５ｔｅｒｄａｅ＋ ＋　ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を粗く砕き、そして２３５１の水に懸濁し た。

このｐＨを５．０に調整し、そしてＦｉｎａｓｅ　Ｓ　（登録商標）を１０００ ＰＵ／ｇダイズフレークの投与量で加えた。コントロール試験においてはＦｉｎ ａｓｅ　Ｓ（登録商標）酵素は加えなかった。この懸濁物を４時間、４０°Ｃで 撹拌しながらインキュベートした。酵素処理後、ＮａＯＨフレークによりｐＨを ９．０に調整し、そしてこの混合物を加熱しないで１時間インキュベートした。

アルカリ抽出の後、この混合物を冷却し、そして不溶性画分をドラム濾過によっ て除去した。

タンパク質を３０％のＨ，ＰＯ，によってｐＨ４，５に調整することにより沈殿 させた。この沈渣を分離して回収し、そして水によりｐＨ４，５で洗浄した。分 離したタンパク質画分を凍結乾燥した。

タンパク質のフィチン酸含有量及びタンパク質の収率（乾燥重量に基づく）を測 定した。その結果を表２に示す。

ｆ パイロ・・トス　−ルでの　Ｕに　た゛イズ　ンパクによ　′　゛れたフィチン 　：声　び　ンパク　の圭 １０００　０．６　２１ 表１は、大スケールでの本発明の工程の利用が、タンパク質の収率を犠牲にする ことなく低フィチン酸ダイズタンパク質単離物を単離できることを示す。

実施何重 ダイズタンパク　のフィチン　１　の １０ｇの商業上のダイズタンパク質単離（Ｐｕｒｉｎａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ１５０ ０＋　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を１００＋ａｌの水に懸濁した 。ｐＨを５．５に調整し、そしてＦｉｎａｓｅ　Ｓ（登録商標）を１５０．５０ ０，１，０ＯＯＰＵ／ｇタンパク質の投与量で加えた。コントロール試験におい ては酵素を添加しなかった。

懸濁物を４時間、５５°Ｃでインキュベートした。

Ｆｉｎａｓｅ処理の後、ｐＨを４．５に調整し、そしてタンパク質を遠心により 回収し、そし、て凍結乾燥した。タンパク質単離物のフィチン酸含有量及びタン パク質の収率（乾燥重量ベース）を測定した。結果を表３に示した。

表−１ 、ｔｔｔ衣グ：ソど回の　日に　た　゛イズ　ンバク　−の几　によるフィチン 　の氏　び　ンパク　の　０　１．８　８９ １５０　１．１．　８８ ５００　０．０　８６ １０００　０．０　８４ 表１は、タンパク質の精製の後にフィチン酸分解酵素によりダイズタンパク質を 処理することによっても無フィチン酸ダイズタンパク質単離物を製造できること を示す。

災旋五旦 木遣１■」し乞（Ｌヱグｌ−ソでり　の　１１によ　′ヲられたイノシトールリ ン　におけるー ２０ｇの脂脂ダイズフレーク（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｔ ｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を粗く砕き、そして３００１の水に懸濁した。

ｐＨを９．０に調整し、そしてこの懸濁物を室温で１時間インキュベートした。

不溶性の両分を遠心により除去した。

上清液のｐＨを５．０に調整し、そしてこのスラリーに多量のＦｉｎａｓｅ　Ｓ 　（登録商標）を加えた。フィチン酸分解活性はこの酵素調製物の主なる要素で ある。この懸濁物を５５　”Ｃで４時間インキュベートした。コントロールの試 験においては、酵素処理を導入しなかった。

酵素の投与量はフィチン酸分解単位／ｇフレークで示した。

１フィチン酸分解単位（ＩＰＵ）は、標準の条件（４０’ｃ。

ｐＨ５，５）のもとで、１分間当りにｌ　ｎｍｏｌの無機リン酸をフィチン酸ナ トリウムから脱離させる酵素の量である。

タンパク質はｐＨを４．５に調整することで懸濁物から沈殿させた。この沈渣を 遠心により回収し、そして凍結乾燥した。

タンパク質の収率及びタンパク質画分のイノシトールリン酸含有量を測定した。

イノシトール六２五、四及び三リン酸はＳａｒｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、ＬＪ、 Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　５４：　１５９　１６２（１９８９）の方法に従って測定 した。

表４はタンパク質のイノシトールリン酸含有量の低下及びタンパク質の収率（乾 燥重量ベース）を示す。

ｌ−土 ス　−ルでの　Ｈに　た゛イズ　ンバクによ　゛　れたイノシトール１ン　゛　 び　ンバク１４回支旦 ０　０．００　１．９７　２．５Ｂ　１１．３９２８．２　５００　０．００　 ０．００　０．００　０．００２６．１ ｐＨ ＦＩＧ、１ ３０４０Ｓ０６０ 温度（”Ｃ） ＦｆＧ、２ 国際調査報告

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸のダイズタンパク質の単離物又 は濃縮物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）少なくとも一種類のフィチン酸分解酵素を含んで成る微生物由来の酵素調 製物を粒状のダイズマメ水性スラリーに加え； （ｂ）約２．０から６．０の間のｐＨ値、及び約２０℃から５５℃の間の温度で フィチン酸分解を行い；（ｃ）得られた無フィチン酸又は低フィチン酸のダイズ タンパク質を単離する； ことを含んで成る方法。
2. ２．ダイズタンパク質単離物又は濃縮物からフィチン酸を実質的に除去する方法 であって、以下の段階：（ａ）少なくとも一種類のフィチン酸分解酵素を含んで 成る微生物由来の酵素調製物をフィチン酸含有ダイズタンパク質単離物又は濃縮 物に加え；そして （ｂ）約２．０から６．０の間のｐＨ値、及び約２０℃から５５℃の間の温度で フィチン酸分解を行い；ことを含んで成る方法。
3. ３．前記の酵素調製物がアスペルギルスｓｐｐ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓ ｐｐ）由来のものである、請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．前記の酵素調製物がリゾプスｓｐｐ．（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐｐ．）由来の ものである、請求項１又は２に記載の方法。
5. ５．前記の酵素調製物が酵母由来のものである、請求項１又は２に記載の方法。
6. ６．前記の酵素調製物がＦｉｎａｓｅを含んで成る、請求項１又は２に記載の方 法。
7. ７．前記のｐＨの値が約３．５から５．５の間である、請求項１又は２に記載の 方法。
8. ８．前記の温度が約４０℃から５５℃の間である、請求項１又は２に記載の方法 。
9. ９．実質的に無フィチン酸又は低フィチン酸の単離物を製造する方法であって、 以下の段階： （ａ）懸濁物を作るため、粗く砕いた脱脂ダイズ粒状物を水性の媒体に懸濁し； （ｂ）段階（ａ）の該懸濁物のｐＨを約２．０から６．０に調整し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅＳ（登録商標） を導入し； （ｄ）段階（ｃ）の懸濁物を約１．０から約８．０時間の間、約２０から５０℃ の間でインキュベートし；（ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物のｐＨを約９．０に調整 し、そしてこの調整した懸濁物を約１時間、室温でインキュベートし； （ｆ）不溶性の画分を段階（ｅ）の懸濁物から分離し；そして （ｇ）可溶性のダイズタンパク質を段階（ｆ）の懸濁物から分離する； ことを含んで成る方法であって、これによって実質的に無フィチン酸又は低フィ チン酸のダイズタンパク質単離物を製造する方法。
10. １０．前記の段階（ｂ）のｐＨが約４．５から５．５の間に調整される、請求項 ９に記載の方法。
11. １１．前記のｐＨが５．０に調整される、請求項１０記載の方法。
12. １２．前記の段階（ｄ）のインキュベーション温度が約４０℃である、請求項９ に記載の方法。
13. １３．実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸のダイズタンパク質単離物又 は濃縮物の製造方法であって、以下の段階： （ａ）約８．０から１０．０の間のｐＨ値で、脱脂粒状ダイズマメ水性懸濁物か らタンパク質を抽出し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物からすべての不溶性物質を 除去し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物のｐＨを約２．０から６．０の間に調整し； （ｄ）段階（ｃ）の該懸濁物の中にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入 し；そして （ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物を、約１．０から８．０時間の間、約２０から５０ の℃間でインキュベートする；ことを含んで成る方法であり、これによって実質 的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸のダイズタンパク質単離物又は濃縮物を 製造する方法。
14. １４．実質的に無フィチン酸もしくは低フィチン酸の単離物又は濃縮物を製造す る方法であって、以下の段階：（ａ）約８．０から１０．０の間のｐＨ値で、脱 脂粒状ダイズマメ水性懸濁物からタンパク質を抽出し；（ｂ）段階（ａ）の該懸 濁物からすべての不溶性物質を除去し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物のｐＨを約２．０から６．０の間に調整し； （ｄ）段階（ｃ）の該懸濁物の中にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入 し；そして （ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物を約１．０から８．０時間の間、約２０から５５℃ の間でインキュベートし；（ｆ）タンパク質を沈殿させるために、段階（ｅ）の 懸濁物のｐＨをタンパク質の等電点に調整し；そして（ｇ）沈殿したタンパク質 及び水性溶液を生成するために、段階（ｆ）の沈殿タンパク質を分離する；こと を含んで成る方法であり、これによって実質的に無フィチン酸もしくは低フィチ ン酸のダイズタンパク質単離物又は濃縮物を製造する方法。
15. １５．前記の段階（ｃ）のｐＨが、約４．５から５．５の間に調整された、請求 項１３又は１４に記載の方法。
16. １６．前記のｐＨが約５．０に調整される、請求項１６に記載の方法。
17. １７．前記の段階（ｅ）のインキュベーション温度が約４０℃である、請求項１ ３又は１４に記載の方法。
18. １８．実質的に無フィチン酸のダイズタンパク質単離物もしくは濃縮物、又は低 められたフィチン酸濃度を有するダイズタンパク質単離物の製造方法であって、 以下の段階：（ａ）懸濁物を作るため、一定量の商業上のダイズタンパク質の単 離物を水性の媒体中に懸濁し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物のｐＨを約２．０か ら６．０の間に調整し； （ｃ）段階（ｂ）の該懸濁物の中にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入 し； （ｄ）段階（ｃ）の懸濁物を約１．０から８．０時間の間、約２０から６５℃の 間でインキュベートし；（ｅ）段階（ｄ）の該懸濁物のｐＨを約４．５に調整し ；（ｆ）段階（ｅ）の懸濁物からダイズタンパク質を分離する； ことを含んで成り、これによって実質的に無フィチン酸のダイズタンパク質単離 物もしくは濃縮物、又は低められたフィチン酸濃度を有するダイズタンパク質の 単離物を製造する方法。
19. １９．実質的に無フィチン酸もしくは、低フィチン酸のダイズタンパク質の単離 物を製造する方法であって、以下の段階： （ａ）約８．０から１０．０の間のｐＨ値で、脱脂粒状ダイズマメ水性懸濁物か らタンパク質を抽出し；（ｂ）段階（ａ）の該懸濁物からすべての不溶性物質を 除去し； （ｃ）沈殿したタンパク質及び水性溶液を生成するために、段階（ｂ）の懸濁物 のｐＨをタンパク質の等電点に調整し；（ｄ）段階（ｃ）の該沈殿タンパク質を 段階（ｃ）の水性溶液から分離し； （ｅ）段階（ｄ）のタンパク質を水性の溶液中に再分散し；（ｆ）段階（ｅ）の 溶液のｐＨを約２．０から６．０の間に調整し； （ｇ）段階（ｆ）の該溶液にフィターゼ換算量のＦｉｎａｓｅ　Ｓを導入し； （ｈ）段階（ｇ）の溶液を、約１．０から８．０時間の間、約２０から５５℃の 間でインキュベートし；（ｉ）段階（ｈ）の溶液を中和し；又は（ｊ）段階（ｉ ）の溶液を噴霧乾燥する；ことを含んで成る方法であり、これによって実質的に 無フィチン酸又は低フィチン酸のダイズタンパク質単離物及び濃縮物を製造する 方法。
20. ２０．前記Ｆｉｎａｓｃ　Ｓの濃度が２５０から１０００ＰＵ／ダイズ粒状物８ の間である、請求項９，１３，１４，１９又は２０に記載の方法。
21. ２１．前記の濃度が約５００から７５０ＰＵ／ダイズ粒状物ｇの間である、請求 項２１記載の方法。
22. ２２．前記の粒状ダイズマメ水性スラリーが、脱脂ダイズ粉、ダイズフレーク及 びダイズ粒より成るグループから選ばれたものである、請求項１，２又は９に記 載の方法。
23. ２３．請求項１，２，９，１３，１４，１９又は２０の方法により調製された、 実質的に無フィチン酸のダイズタンパク質単離物又は濃縮物。
24. ２４．前記の水性媒体が水である、請求項９又は２０に記載の方法。
25. ２５．前記の段階（ｂ）のｐＨが、約４．５から５．５の間に調整される、請求 項１９に記載の方法。
26. ２６．前記の段階（ｆ）のｐＨが、約４．５から５．５の間に調整される、請求 項２０に記載の方法。
27. ２７．前記のｐＨが約５．５に調整される、請求項２６又は２７に記載の方法。
28. ２８．前記の段階（ｅ）のインキュベーションが、約２から６時間の間である、 請求項１３に記載の方法。
29. ２９．前記の段階（ｈ）のインキュベーションが、約２から６時間の間である、 請求項２０に記載の方法。
30. ３０．前記の段階（ｄ）のインキュベーションが、約２から６時間の間である、 請求項９又は１９に記載の方法。
31. ３１．前記のインキュベーションが約４時間である、請求項２９又は３０に記載 の方法。
32. ３２．前記のインキュベーション温度が約５５℃である、請求項９，１３，１９ 又は２０に記載の方法。
33. ３３．前記の分離段階が、遠心又はドラム濾過を含んで成る、請求項９，１３、 又は１９に記載の方法。
34. ３４．前記の分離段階が、前記懸濁物のｐＨを４．５に調整することにより、前 記可溶性ダイズタンパク質を沈殿させることを含んで成る、請求項９に記載の方 法。
35. ３５．前記のタンパク質の等電点が約４．５である、請求項１４又は２０に記載 の方法。