JPH04503363A - 新規リピドａ誘導体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規リビドＡ誘導体およびその用途 本発明はグラム陰性内毒素の有害な作用を防止し、動物の免疫系を刺激する方法 において有用なリビドＡ誘導体に関する。本発明は、また、前記方法で用いる新 規医薬組成物に関する。

リボ多糖類は、グラム陰性菌の外膜の主要成分である。

研究によりリボ多糖類は、次の３つの構造領域を有していることが分かっている ：　（１）０−特殊多糖類、（２）普通の芯領域、および（３）リビドＡと呼ば れるリビド成分。ＬＰＳが注入されたとき、またはグラム陰性感染により蓄積し たとき、ＬＰＳは、哺乳動物に多くの病態生理学的事象を引き起こすことが知ら れている。ニスケリチアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのリボ 多糖類（ＬＰＳ）は、動物の免疫系を刺激することが知られているが、比較的有 毒である。

一般に、ＬＰＳの疎水性リビドＡ部分は、ＬＰＳの病態生理学的作用の原因とな っていると考えられているし、これには、また、Ｂ−リンパ球有糸分裂生起、マ クロファージ活性化、インターフェロン生産、腫瘍再発、抹梢血管虚脱（「内毒 素」ショック）、肺性の高血圧、肺性の浮腫、播種性向管内凝血異常症および発 熱を含んでいる。

単糖類先駆物質リピドＸが、７０Ｚ／３細胞を刺激するなんらかの活性を有して いることおよび大過剰量のリビドＸが、リピドＡと競争してその毒作用を一部妨 げることも知られている。また、イー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）からのモノホスホ リルリビドＡが、ＬＰＳと関連する多数の生物学的活性を有しているが、その毒 性が減ぜられることも知られている。一方、イー、コリからのジアシルジホスホ リルリビドＡは、ＬＰＳと関連する生物学的活性が非常に低いかまたは全く無い ことが公知であり、これは、ＬＰＳによる７　０　Ｚ／３細胞の活性に対し適度 の拮抗活性を有している。イー、コリおよびサルモネラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１ １ａ）株からのジホスホリルリピドＡはかなり有毒２６であることが知られてい る。

３０℃で成長したロドシュドモナスファエロイデス（只ｃｔｅｒ　ｓ　ｈａｅｒ ｏｉｄｅｓ）］ＡＴＣＣ１７０２３から得たＬＰＳが、無毒であると報告されて いた。

この給源からのＬＰＳの完全な構造がここに確立た。ヱール、スファエロイデス （Ｒ，ｓ　ｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＬＰＳのリビドＡ部分の構造は、有毒腸 内細菌およびサルモネラＬＰＳのリピドＡとよ（似ている。注目される４つの主 な違いは、２−位（Ｒ１）での３−ヒドロキシテトラゾカッエートの代わりの３ −ケトテトラゾカッエート、２′　−位（Ｒ２）でのアシロキシアシル結合のテ トラゾカッエートの代わりのΔ７−チトラデカノエートの存在、６個でなく５個 の脂肪酸の存在およびに１匹、スファエロイデスリビドＡのグルコサミンニ糖類 の３−ヒドロキシテトラゾカッエートの代わりの３−位（Ｒ５）での３−ヒロド キシデカノエートの存在である。

アール、スファエロイデスからのジホスホリルリビドＡ（ＤＰＬＡ）の式■を参 照されたい。

、ｃａ　５ｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ２３７８２からのもう１つの無毒なＬＰＳが報 告されている。この給源のＬＰＳからのリビドＡは、つくられていて、その完全 な構造も決定されている。このリビドＡは、グルコサミンニ糖類の２−位および ２゛−位（Ｒ２およびＲ４）に３−ケトテトラゾカッエート、３°　−位（Ｒ５ ）にヒドロキシテトラゾカッエートおよび３′　−位（Ｒ１）にΔ９ドデカノイ ルデカノエートを有している（アール、カプスラタ）からのＤＰＬＡの構造の式 ■を参照されたい）。　リビドＡの有益な性質を有しているが、毒性もしくは有 害な作用を有していない化合物に対する要求がある。

本発明の主目的は、リビドＡの有用な性質を有しその有毒なすなわち有害な作用 を有していない新規化合物を開示することである。

グラム陰性内毒素の有害の作用から動物を保護し動物の免疫系を刺激するそのよ うな化合物の利用を開示することを目的としてる。

そのような医薬用組成物を開示することも目的とじている。

本発明の方法は、免疫促進活性を有する無毒°な組成物の安全で宵効な量を動物 に投与することにより動物の免疫系の活性を刺激することを含んでいる。

本発明の新規化合物は次式 ［式中、Ｒ３、Ｒ２、Ｒ１およびＲ１は水素、分岐アルキル基または２−ヒドロ キシ脂肪酸基（ここで、ｎは、１〜１４であり、ｍは、２〜１６である）から選 択される］を有している。これらの基は、いろいろな組み合わせであってよい。

ホスフェート上の置換基（Ｒｓ、Ｒ６、Ｒ７およびＲ１１）は、Ｈ，Ｃ，〜Ｃ６ の低級アルキル、アリール例えばフェニル、ナフチルなど、−Ｃ−Ｈのようなア リール（ここで、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有するアルキルまたはとえばアミ ノアラビノース、ホスホリルエタノールアミンまたは望ましい性質を干渉または 損ねることのない他の塩基性の基である）であってよい。さらに、４°　−位の ホスフェート基は、６°　−位（Ｒ１）のヒドロキシル基と共に環化されていて もよい。

４−および６゛　−位（Ｒ１゜およびＲｓ）での置換は、エーテル結合のｃ＋− ｃ＋ｇのアルキル基、エステル結合のＣ２〜ＣＩｌ＋の脂肪酸基または１残基当 たり（好ましくはＲ９の位置）１〜２０個のグリコシド（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ）単位からの直鎖または枝分かれグルコシド残基であってよい。

グリコシド単位は、グリコピラノシルまたはグリコフラノシルおよびそのアミノ 糖誘導体であってよい。残基は、ホモポリマー、そのランダムまたは交互または ブロックコポリマーであってよい。グリコシド単位は、遊離ヒドロキシル基また はアシル化ヒドロキシ基を有している。

グリコシドは２０個以下のグリコシド単位を含んでなっていてよい。しかしなが ら、１０個未満のグリコシド単位を有するものが好ましく、最も好ましくは、３ 個または３個未満のグリシド単位を有するものである。具体的な例は、グリコシ ド残基に１または１０個のグリコシド単位を含むものである。

可能なグリコピラノシル構造には、グルコース、マンノース、ガラクトース、グ ロース、アロース、アルドロース、イドースまたはクロースがある。フラノシル 構造では、好ましいものは、フラクトース、アラビノースまたはキシロースから 誘導されるものである。好ましいジグリコシドには、スクロース、セロビオース 、マルトース、ラクトース、トレハロース、ゲンチオビオースおよびメリビオー スがある。トリグリコシドのうちでは、好ましいものは、ラフィノーズまたはゲ ンチアノースがある。アミノ誘導体のうちには、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ ミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｎ −アセチルノイラミン酸、Ｄ−グルコサミン、リキソシラミン、Ｄ−ガラクトサ ミンなどがある。

本発明の化合物のグリコシド誘導体および他のリビドＡ誘導体は、当業者に周知 の標準的な合成方法により製造され得る。

式■の新規化合物の代わりに、本発明の医薬組成物は、ロドバクタ一種たとえば アール、スファエロイデス（足。

Ｓ且」Ｌ見」ユｒａｉｄ−１）−）種およびアール、カプスラタ（Ｒ，ｃａ　５ ｕｌａｔａ）種からの精製された無毒なＬＰＳを含んでいてもよい。モノホスホ リルリビドＡ　（ＭＰＬＡ）およびＤＰＬＡも有用であり、ＤＰＬＡが大きい分 子の寸法ゆえに好ましい。ＭＰＬＡでは、ホスフェート基は、１−または４゛　 −位であってよい。ジアシル、トリアジル、テトラアシル、ペンタアシル、ヘキ サアシルおよびヘプタアシルＤＰＬＡは、すべて有用であると予期され、ペンタ アシルＤＰＬＡが好ましい。

２６℃で成長したアール、スファエロイデスおよびヱール、カプスラタのＬＰＳ から得られたペンタアシルＤＰＬＡが特に好ましい。それらを次に示す。

１．０−　［２−アミノ−２−デオキシ−Ｎ２−（３−ケトテトラデカノイル） 、０３−（３−ヒドロキシデカノイル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］　−（１ −６）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｎ２−（Δ７−チトラデカノイルー３−オ キシテトラデカノイル）、０”−（３−ヒドロキシデカノイル）−Ｅ−Ｄ−グル コビラノース　１゜４−ビスホスフェート。

２．０−　［２−アミノ−２−デオキシ−Ｎ”−（３−ケトテトラデカノイル） 、０３−（３−ヒドロキシデカノイル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−（１− ６）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｎ”−（３−ケトテトラデカノイル）、Ｏ” −（Δ９−ドデセノイルー３−オキシデカノイル−Ｅ−Ｄ−グルコビラノース　 １．４−ビスホスフェート。

式Ｉにより表される他の化合物には次のものがある＝１、モノホスホリルリピド Ａ　（ＭＰＬＡ）２、還元ＤＰＬＡ ３、リビドＸ類似体 ４、リビドＡのテトラアシル、ヘキサアシルおよびヘプタアシル誘導体。これに は先駆物質ＩＶＡの類似体を含む。前記のすべての化合物は、糖のいずれかの／ 両方の２−および２゛−位に３−ケト脂肪アシル基、３および３゛位にＣ＋Ｚ以 下の３−ヒドロキシ脂肪アシル基を含み２°　−および／または３′　−位の脂 肪アシル基に二重結合を含んでよい。

製造方法： １、ＭＰＬＡは、ＬＰＡを３０〜６０分１００℃で０゜ＩＮの塩酸中で加水分解 し、珪酸またはＤＥＡＥセルロースカラムで精製することにより製造される。

２、−重線（ｓｉｎｇｌｅｔ）脂肪酸が、ヘプタアシル、ヘキサアシルまたはペ ンタアシルリピドＡから０゜０３３％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン中で１００° Ｃでの加水分解により除去され、対応するヘキサアシル、ペンタアシルおよびテ トラアシル生成物をそれぞれ得ることができる。

３、すべてのエステル結合した脂肪酸は、０．１ＭのＮａＯＨ中での脱アシル化 反応により除去されてジアシルリビドＡを得ることができる。３−ケトテトラゾ カッエート基がＮ−結合しているので、これらはこの加水分解を受けないであろ う。

４、記載した他の普通でない二糖類すビドＡは、シバタら３４により開示された 方法により合成され得る。ケト脂肪酸の導入は、特別な合成上の間朋を生じ得る 。

５、リピドＸ類似体は、確立された手順により合成され得る。ケト脂肪酸の導入 は、特別な合成上の問題を生じ得る。

ここで好ましい化合物は、約２６℃で成長させた株Ａ体５５０　（ＡＴＣＣ）中 で、２６℃（１２〜１４日）で光合成栄養生物的に（ｐｈｏｔｏｈｅｔｅｒｏｔ ｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ）成長させ、これを細胞濃縮器と遠心分離とを用いること により集めることにより得られる。混在する不要な色素の抽出に対し、７００ｇ の細胞ペーストが（ｃｅｌｌ　ｐａｓｔｅ）、４１のエタノール／ｎ−ブタノー ル（３１）で２２℃で夜通し撹拌することにより抽出される。この抽出を２回繰 り返し、次に、無水アルコール、アセトンおよびジエチルエーテル各４１で１回 抽出をする。抽出された淡褐色の細胞の乾燥重量は、７０．４ｇである。そのよ うな標本７０．４ｇからＬＰＳが抽出され６４０ｍｇ　（０，９％）が得られる 。

このＬＰＳ標本（ｐｒｅｐａｒａｔ　１ｏｎ）をＯ，ＬＭのＥＤＴＡにｐＨ７， ０（１，０ｍｇ／ｍｌ）で懸濁させ、１０分間ソニケート（ｓｏｎｉｃａｔｅ） する。この懸濁液を２２℃で３時間撹拌する。離解したＬＰＳは、クロロホルム ／メタノールで抽出により回収してＬＰＳ３１０ｍｇを得る。

ＬＰＳは、逆相セブパックカートリッジ（ＳｅｐＰａｋ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅ） の使用により最終的に精製する。カートリッジは、まずメタノール１０ｍ１で洗 浄する。ＬＰＳ　（３０ｍｇ）は２５０μｌのりｏロホルム／メタノール（４： 　１）中のカートリッジに充填し、メタノール１０　ｍ　ｌ　、アセトニトリル ２０ｍ１およびクロロホルム／メタノール（４：　１）２０ｍｌで順次洗浄する 。

精製されたＬＰＳが最後の洗浄で得られる（２５．７ｍｇ１８６％）。

粗製ＬＰＳ　（９００ｍｇ）を、２ｍｇ／ｍｌとして０゜０２Ｍの酢酸ナトリウ ム中でｐＨ２，５で加水分解し、１００℃で７０分間温１してモノホスホリルリ ピドＡおよび幾つかの形のＤＰＬＡからなる混合物を得る。得られるＤＰＬＡ生 成物は、クロロホルム／メタノールによる抽出により回収され得る。ＤＰＬＡは 、クロロホルム／メタノール／水製水酸化アンモニウム（５０：２５・４．２） の溶剤系をもちいることにより、負荷４ｍｇ／２０ｘ２０ｃｍプレートでシリカ ゲルＨ（５００＋Ｊｍ）で調整用薄層クロマトグラフィーにより精製できる。Ｄ Ｐ　Ｌ　Ａバンドは、沃素蒸気により視覚化され、クロロホルム／メタノール／ 水（６６：　３３　：　４）による抽出によりシリカゲルから回収される。

モノホスホリルリピドＡといくつかの形のＤＰＬＡとの混合物も、ＤＥＡＥ−セ ルロースカラムで分別されて高度に精製され形態の所望のペンタアシルＤＰＬＡ を得るようにできる。混合物（１４０ｍｇ）は、アセテートの形で３．５ｘ２９ ｃｍのカラムに供給し、カラムは、２５０ｍ　ｌのクロロホルム／メタノール／ 水（２・３゜１）で洗浄する。クロロホルム／メタノール／水（２３：１）に含 むようにした０、０３〜０．０８Ｍの酢酸アンモニウムの線形傾きを用いてＤＰ ＬＡを分別する。

１５０の留分（１３ｍｌ）を集め、ＤＰＬＡの位置を知るためスポットチャリン グ（ｓｐｏｔ　ｃｈａｒｒｉｎｇ）により分析する。これらの留分は、シリカゲ ルＨおよびクロロホルム／ピリジン／蟻酸／水（４０：４８：１２：４）の溶剤 系を用いて薄層クロマトグラフィーにより分析する。特定の留分をプールし、２ 相クロロホルム／メタノール／水溶剤中で脱塩する。未同定の形のＤＰＬＡを含 むビークＢ留分５２−６１　（１１，９ｍｇ）およびビークＣ留分６８〜９０は 、精製ペンタアシル／Ｄ　Ｐ　Ｌ　Ａ　（４２、９ｍ　ｇ　）を含んでいる。別 法として、ＤＰＬＡは、珪酸カラムおよびクロロホルム／ピリジン／蟻酸／水の 溶剤系を用いることにより分別され得る。

ビークＢも哺乳動物をグラム陰性内毒素の有害な影響から保護するため哺乳動物 を治療するのに有用である。

このように得られたＤＰＬＡは、ネズミの腹膜マクロファージにインターロイキ ン−１放出を誘導させることができずこの活性を有毒なディーブラフ化学型（ｄ ｅｅｐ　ｒｏｕｇｈ　ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ）ＬＰＳにより妨害した。この結果は 、腫瘍壊死因子測定の先に報告された結果と共に、アール、スファエロイデスか らのペンタアシルＤＰＬＡが内毒素活性に欠け、マクロファージのＬＰＳ誘導活 性化の効果的なアンタゴニストであるということを強く示唆する。

Ａ、アール、スファエロイデスからのＤＰＬＡおよびＬＰＳの製造 例１および２は、アール、スファエロイデスのＬＰＳからの高度に精製されたペ ンタアシルＤＰＬＡの製造の簡単な手順を記載している。ＤＰＬＡは、組み合わ せた逆相ＨＰＬＣと質量分光分析により特徴づけられる。ネズミのマクロファー ジ中の有毒なＲｅＬＰＳによりＩＬ−１放出の誘導に対抗することが分かった。

このことはとを示している。

養物的に成長させた。細胞（ｃｅｌｌ）を２６℃（１２〜１４日）で成長させ、 これを細胞濃縮器と遠心分離とを用いることにより集めた。細胞ペースト（７０ ０ｇ）を、４１のエタノール／ｎ−ブタノール（３：　１　（ｖ／ｖ））で２２ ℃で夜通し撹拌することにより抽出した。

この抽出を数回繰り返しすべての色素を除去した。次に、これをエタノール４１ で１回、アセトン３１で２回およびジエチルエーテル４１で１回抽出した。色素 のない細胞７０．４ｇからＬＰＳが抽出されＬＰ３６４０ｍｇが得ＬＰＳ　（６ ４０ｍｇ）を３ｍｇ／ｍｌでｐＨ２，５で０゜０２Ｍの酢酸ナトリウムに懸濁さ せ、１００℃で７０分間温装してから、８．０００ｘｇで１０分間遠心分離にか けた。このペレットを６０ｍ１のクロロホルム／メタノール（２：　１　（ｖ／ ｖ）　）に溶解させ、２４ｍ１の水を加えて混合した。放置した後、下の層を回 収して２４０ｍｇの粗製ＤＰＬＡを得た。

粗製ＤＰＬＡ　（１４０ｍｇ）は、３．５ｘ２９ｃｍのＤＥＡＥセルロースカラ ム（アセテート形）に適用したクロロホルム／メタノール（２：　１　（ｖ／ｖ ）　）　２０ｍｌに溶解させ、カラムは、２５０ｍ１のクロロホルム／メタノー ル／水（２：　３　：　１　（ｖ／ｖ）　）で洗浄した。

ＤＰＬＡは、クロロホルム／メタノール／水（２：３・１　（Ｖ／Ｖ））に含む ようにした０、０３〜０．０８Ｍ酢酸アンモニウムの線形傾斜を用いてカラムか ら溶離させた。１５０の１３ｍ１の留分を集め、全ホスホラス（ｐｈｏｓｐｈｏ ｒｏｕｓ）およびシリカゲル薄層プレート上のチャー陽性スポットの外観につい て分析した。

チャー陽性スポットを与える留分は、シリカゲルＨプレートおよびクロロホルム ／ピリジン／蟻酸／水（１０：１２：３：１（ｖ／ｖ））の溶剤系を用いてＴＬ Ｃにより分析した。−重線ＴＬＣ成分を含む留分をプールし、２相クロロホルム ／メタノール／水系で脱塩した。つぎのプールした留分が得られた。モノホスホ リルリビドＡ（上記のクロロホルム／ピリジン／蟻酸／水系中でＲｆ＝０．７５ ）を含むビークＡ（１４〜１９．１１．９ｍｇ）、未同定形のＤＰＬＡ　（Ｒｆ ＝０．２０）を含むビークＢ（５２〜６１．１１．９ｍｇ）および所望のＤＰＬ Ａ　（Ｒｆ＝０．５９）を含むビークＣ（６７〜８７．２８．２ｍｇ）。ビーク Ｃは無毒な高度に精製されたペンタアセチルＤＰＬＡに対応した。

構造分析のために、ペンタアセチルＤＰＬＡを、クロロホルム／メタノール（４ ：　１　（ｖ／ｖ）　）中のケレツクス（Ｃｈｅ　１ｅｘ）１００　（Ｎａ＋） およびドウエツクッス（ＤＯｗｅ　ｘ）５０　（Ｈ＋）二重層カラムを通じて通 すことにより遊離酸に変換し、ジアゾメタンによりメチル化し、ＨＰＬＣにより 分別した。

［ ネズミのマクロファージのＩＬ−１の誘導へのペンタアシルＤＰＬＡの作用−〇 、１．１．０および１０Ｍｇ／ｍｌで試験したアール、スファエロイデスからの ペンタアセチルＤＰＬＡはネズミの腹膜マクロファージにＩＬ−１を誘導できな かった。これは０．１ｇｇ　／　ｍ　ｌの最大誘導を与える有毒ＲｅＬＰＳに匹 敵する。ブロッキング実験では、０．１．１．０または１０．Ｏｕｇ／ｍｇのペ ンタアシルＤＰＬＡを、０、Ｌμｇ／ｍｌのＲｅＬＰＳを加える２時間前に、細 胞に加えた。１．　Ｏｕｇ／　ｍ　ｇのペンタアシルＤＰＬＡ　（１０：　１の ＤＰＬＡ対ＲｅＬＰＳ質量比）の添加は、ＩＬ−１放出の誘導の６０％抑制を起 こさせた。この比を１００：１に増したとき、抑制は、完全であった。

アール、スファエロイデスのＬＰＳからのペンタアシルＤＰＬＡは、内毒素活性 を示さず、Ｂ細胞およびマクロファージのＬＰＳ誘導活性の効果的なアンタゴニ ストであることの分かった第一のリビドＡ構造である。このＤＰＬＡは、活性Ｌ ＰＳ／リピドＡ結合部位に対し有毒ＬＰＳと好都合に競争する。この理由から、 これは、レセプター−ＬＰＳ相互作用を調べるのに有用な試薬である。

Ｂ、アール、カブスラタからのＤＰＬＡ、ＭＰＬＡおよびＬＰＳの製造 アール、カブスーｙ９エイチ、ゲスト株（Ｈ，Ｇｅ５ｔｓｔｒａｉｎ）（ＡＴＣ Ｃ２３７８２）を媒体５５０中で２６℃で１２日間、光合成有機栄養物的に成長 させ、細胞濃縮器と遠心分離を用いて集める。細胞ペースト（５９８ｇ）を２２ ℃で４１のエタノール／ブタノール（３：１）と箕に２時間、さらに同じ溶剤と 共に夜通し、さらにアセトンと共に２時間順次撹拌し抽出する。粗製細胞壁が、 ｐＨ７，０の０．ＯＩＭの燐酸カリウム緩衝液１００ｍ１中にアセトン乾燥させ た細胞５０ｇを懸濁させることにより調整される。フレンチ圧力セルを用いて細 胞を破壊する。細胞は、１０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離し、ペレットを、 緩衝液ＩＬＯＯｍｌに均質化により再び懸濁させる。懸濁液を１０．０００ｘｇ で遠心分離し、ペレットを回収する。この手順を２回繰り返し、ペレットを最終 的に水洗し、凍結乾燥して粗製細胞壁１４．５ｇを得る。

ＬＰＤは、熱いフェノール−水抽出の改良手順を用いて細胞壁標本から抽出する 。細胞壁標本（１４，５ｇ）を、水１６０ｍ１に懸濁させ、１０分間ソニフイケ ート（ｓｏｎｉ　ｆ　１ｃａｔｅ）Ｌ、、６８℃に加熱する。フェノール（１６ ０ｍ　ｌ）を懸濁液に加え、３０分間６８℃で撹拌する。次にこれを４℃に冷却 してから、１０．ＯＱＯｘｇで３０分間遠心分離する。フェノール層（下層）を 回収する。この操作を細胞壁ペレットで２回繰り返す。

すべての３つのフェノール抽出物をプールし、２日間水道水の流れに対して透析 させる。沈殿する不純物をチーズクロスで濾過する。上澄み液を再び水道水の流 れに対して透析し、さらに最終的に蒸留水で３日間透析する。

ＬＰＳを含む透析済みのフェノール層を凍結乾燥して６１０ｍｇを得る。アール 、汝夕′スラタのＬＰＳからのＤＣ１比較試験 ＤＰＬＡの生物活性を証明するため、比較研究を行い、この場合、アール、スフ ァエロイデスのＬＰＳから得たＤＰＬＡをアンタゴニストであるように選択した ：その理由は、これが高度精製された形態で容易に得られ、丈ルモネラチフィム リアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ＬＬｈ　ｉｍｕ　ｒ　ｉ　ｕｍ）のＬＰＳから の有毒ＤＰＬＡに類似するからである。これは、プラズマ脱着マススベクロトメ トリーによりテトラメチル誘導体と見なされた。これは、雛胎児致死率試験（Ｃ ＥＬＤ、。〉２０μｇ）によれば無毒であり、その構造は、式■により示される 。

ＲＡＷ２６４．７ネズミのマクロファージ細胞系を活性化させるアンタゴニスト に関し、ニスケリチアコリＤ３１ｍ４からの有毒なディーブラフ化学型ＬＰＳ　 （ＲｅＬＰＳ）を選んだ（このものは最近精製したものでありのＤＰＬＡがＲＡ Ｗ２６４．７細胞によりカケクチン（Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）（腫瘍壊死因子、Ｔ ＮＦ）の誘導を妨害する。このことはリピドＡ誘導体の明白な例であり、カケク チンの誘導での有毒アゴニストに対する強力な拮抗作用を示している。

イミュノブＯ−／ト法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ｍｅｔｈｏｄ）を用い、ＲＡＷ ２６４．７ネズミのマクロファージ細胞によりカケクチン／ＴＮＦ生産を定量し た。ＲＡＷ２６４．７細胞は、５％胎児カーフ血清で補足したダルベｔコ（Ｄｕ 　１ｂｅｃｃｏ）の改良イーグル（Ｅａｇｌｅ）媒体中の濃度３ｘ５０５細胞／ ウエル（ｗｅｌｌ）で２４ウエルプレート（ナンク（Ｎｕｎｃ））に播種した（ ｓｅｅｄｅｄ）。１２時間後、細胞単層を、血清を含まない媒体１ｍｌで２回洗 浄してから、血清を含まない媒体２０μｌで覆ったままとした。次に、ＤＰＬＡ および／またはＲｅ　ＬＰＳの水性懸濁液を、示した最終濃度（ｆｉｎａｌ　ｃ ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に加えた。細胞を１２時間温１し、その後、媒体を 、イムノプロッティングによりＴＮＦの測定のために除去した。

１００ｕｌの媒体をＳＤＳ含有サンプル緩衝液１００μＩと混合し、５分間１０ ０℃に加熱してから、１０〜１５％のポリアクリルアミド傾斜（ｇｒａｄｉｅｎ ｔ）ゲル中で電気泳動にかけた。次に蛋白質を電気泳動でニトロセルロースに移 動させ、ＴＮＦを＝１：１００希釈で適用したラビットアンチマウスＴＮＦポリ クロナール血清を使用し、さらにアルカリホスファターゼ接合ボートアンチラビ ットＩｇＧ［ビオ−ラッド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）　］を使用し視覚化した。

ＲＡＷ２６４．７ネズミのマクロファージ細胞により生成したカケクチン／ＴＮ Ｆのイミュノプロットは、ＲｅＬＰＳによる誘導、ＤＰＬＡ　（アール、スフア ニロイム不）による誘導の欠如、ＤＰＬＡによる誘導の妨害を示した。バンドは 、ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒ−ａｚｏｌｉｕ ｍ）を用いて視覚化された。約０．１ｎｇのカケクチン／ＴＮＦがバンドとして 検知されるであろう。抗血清が、ウェスタンプ０−）ト（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ ｏｔ）のプロセシング中間体（ホルモン前駆体）を認めた。

イミュノプロットは、公、三ユからの有毒Ｒｅ　ＬＰＳが試験したすべての濃度 （１〜１１００ｎ／ｍｌ）でのＲＡＷ２６４．７細胞によるカケクチンの誘導を 起こしたことを示した。最適誘導は、Ｌｏｎｇ／ｍｌのＲｅＬＰＳで起こった。

アール、スファエロイデスのＤＰＬＡは、１〜１１０００ｎ／ｍｌでカケクチン の生成を誘導できなかった。我々は、１０’ｎｇ／ｍｌでほんの僅かな誘導を観 察した。アール、スファエロイデスのＤＰＬＡを１０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ＩのＲ ｅＬＰＳと共に加えたとき、我々は、ＤＰＬＡの１０”ｎｇ／ｍｌで誘導のはっ きりした抑制を観察した（ＲｅＬＰＳ対ＤＰＬＡの質量比１大であった（比１： ＜１０３）。他のリビドＡ類似体およびモノホスホリルリピドＡ”ｇ　２４、リ ビドＸ２４および先駆物質Ｉ　ＶＡ２°を含む有毒ＬＰＳに関連する先駆物質は 、イミュノプロット法により分析されたときＲＡＷ細胞のカケクチンの誘導を起 こし、抑制剤として使用するのには適当ではなかった。

Ｋ＋、ニア１ＪＬＰＳ　（１ｎｇおよび５μｇ）により腹腔内的に行うことを後 続させるＲｓＤＰＬＡによる（１００ｎｇおよび１ｍｇ）マウス（６０分および ９０分）の前処理は、ＤＰＬＡが血清ＴＮＦの上昇を妨害したことを示した。同 様な結果が、モルモット（３０分および１ｍｇＲｓＤＰＬＡおよび１０ｇｇＬＰ Ｓ）で見られた。

ＤＰＬＡを、標識細胞系Ｌ９２９を用いてＲＡＷ２６４゜７細胞によりＴＮＦ生 戊に対し分析したところ、ＤＰＬＡが、ＴＮＦの誘導に有効でないことをも示し た。　表１は、標識細胞系Ｌ９２９およびＲＡＷ２６４．７を用いたＤＰＬＡに よる前処理による誘導の妨害、ＤＰＬＡによる誘導の欠如およびＲｅＬＰＳによ るＴＮＦ　（カケクチン）の誘導があることを示している。

ＲＡＷ２６４．２７り０ファージｎ　ｍ　ｉｎ＋胞系を用いた。

ＴＮＦユニットは、標識細胞系の５０％致死を達成する培養物の上澄み液をどこ まで希釈できるかを測定することにより誘導される。

ＲｅＬＰＳにさらす２時間前に、ＤＰＬＡをＲＡＷ２６４．２の培養物に加えた 。

インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、グラム陰性敗血症（Ｇｒａｍ−ｎｅｇａ ｔｉｖｅ　５ｅｐｓｉｓ）の致死率のもう１つの重要な媒介体である。ｌＩｌ！ 膜マクロファージを用いＩＬ−１の誘導でＴＮＦアッセイと同様な拮抗実験を行 った。前記のチオグリコレートの腹腔内注入の４８時間後、腹１１５１滲出液細 胞をＢＤＦ、マウスから集Ｐ　ＬＡ　（０，１−１０％ｇ／ｍ　Ｉ）で前処理し 、有ＩＨＲｅＬＰＳ　（０，１μｇ）を添加するか、または、直ちに、ＲｅＬＰ Ｓ　（０，０１−１，００１１ｇ／ｍｌ）で刺激させた。コントロールウェルは 、０．５％のトリエチルアミンを有する１０μｌの媒体で処理した。培養物を５ ９４ＣＯｔの存在下で３７℃で１８時間温１し、この間に上澄み液を集め一２０ ℃で凍結させてから測定した。ＩＬ−１活性は、先に記載したコミトジエニック （ｃｏｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）胸腺細胞測定により測定した。

アール、スファエロイデスからのｌ’１ｌＤＰＬＡはＩＬ−１／放出活性を有さ なかった（表２参照）。しかしなＰＳにより腹膜マクロファージのＩＬ−１の放 出を妨害した。ＲｅＬＰＳ対ＤＰＬＡの質量比１：１０および１：　１００　（ ０，ｔｕｇのＲｅ　ＬＰＳを用いたとき）がそれぞれ６０％および１００％の抑 制を与えた。これらの結果は、抑制が、マクロファージの活性部位に対する１ユ 四５スフアエロイデスＤＰＬＡによる拮抗結合に寄与するという概念をさらに支 持する。

有毒なＲｅＬＰＳによるチオグリコラート誘発腹膜マクロファージ中のＩＬ−１ の誘導のアール、スファエロイデスＤＰＬＡを加えた２時間後、Ｒｅ　ＬＰＳを 培養物に加えた。トリエチルアミン−媒体ブランクは、７，７８８　（２３８） であった。ＣＰＭの標準偏差は、カッコ内に入れである。

１０’ｎｇ／ｍｌのＤＰＬＡの非常に高い濃度で、我々は、ＴＮＦの誘導の測定 可能だが低いレベルを観察した。このことは、イミュノプロット法で得た結果を 確認する。拮抗実験では、マクロファージ培養物に１．Ｏｎｇ　／　ｍ　Ｉの有 毒ＲｅＬＰＳを加える２時間前に１１００ｎ／ｍｌのＤＰＬＡを加えたとき、Ｒ ｅＬＰＳ　（ＲｅＬＰＳ対ＤＰＬＡ質量比１：１００）によるＴＮＦの誘導で９ ５％の抑制を与えた。同様な実験で僅かＬｏｎｇ／ｍｌのＤＰＬＡを用いたとき 、５５％の抑制が観察された（ＲｅＬＰＳ対ＤＰＬＡ比り二１０）、この比を１ ：１０４に増したとき、抑制は８１％に下がった。このことは、非常に高い濃度 でのＴＮＦ生成を誘導するＤＰＬＡの能力だけに帰することができた。

試験結果は、ＤＰＬＡが、ＲＡＷ２６４．７細胞で用量依存するようにして有毒 ＲｅＬＰＳによりＴＮＦの誘導を効果的に対抗し得ることをはっきり示している 。我々は、また、ＤＰＬＡが７０　Ｚ／３ブレーＢ細胞のＬＰＳ誘導活性化で有 効なアンタゴニストであることを示した。ＤＰＬＡおよび有毒Ｒｅ　ＬＰＳのリ ビドＡ部分が、構造的に非常に似ていて、このことが、両者が、マクロファージ の同じ活性結合部位から競合することを強く示唆する。高度に精製された形態で 容易に得られるＤＰＬＡも、マクロファージへ結合する、またおそらく他の応答 細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅｌｌ）へ結合する、Ｌ　Ｐ　Ｓ　／　ＩＪビ ドＡの性質を研究する有用な試薬である。

これらの結果は、他の種類のリピドＡ類似体およびＬＤＳ誘導体について行った 先の生物学的研究と一致する。

リビドＸおよびその類似体３−アザーリビドＸは、ＬＰＳ誘導ニュートロフィル プライミング（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｐｒｉｍｉｎｇ）を抑制することが分か った。

これらの類似体は、細胞結合部位に対しＬＰＳと競合することが示唆される。Ｌ ＰＳからの非ヒドロキシル脂肪酸の選択的脱アシル化が、新たな生成物をより毒 性を低いものとさせ、ＬＰＳにより誘導されるニュートロフィル内皮細胞相互作 用を抑制するのに有効であることを示す。特定の細胞表面または内部細胞の標的 に対する脱アシル化ＬＰＳとＬＰＳとの競合相互作用が関与する。

ＤＰＬＡによる哺乳動物たとえば羊またはマウスの前処理が、哺乳動物をグラム 陰性内毒素の注入の致死作用に対して直ちに抵抗性とさせるようでもある。ＤＰ ＬＡと内毒素との間のこの見かけの拮抗は、内毒素により起こされる疾病の状態 および臨床上の状況、たとえば、人間および動物の手術後のグラム陰性敗血症、 牛または豚の乳腺炎および表■に挙げた他の内毒素に関連する獣医学的疾病での 応用で有用であろう。

シャレンジに対して測定した。マウス１００％を死亡させた致死用ｉｔ　（Ｌ　 Ｄ　Ｉｏｎ）は、静脈内で２５０μｇ、腹腔内で５００μｇであった。（各ロフ トの内毒素を各ロットのマウスで標準化することが重要である。）内毒素の致死 チャレンジに対して保護するのに必要なリビドＡ誘導体のおよその用量を測定す るために、１５００μｇの内毒素（これはＬＤ＋ｏｏ用量の３倍である）でのチ ャレンジの２時間前に、マウスをリビドＡ誘導体で腹腔的前処理する。リビドＡ 誘導体でのマウスの前処理は死にいたる時間を延ばすようであった。

−Ｉ’　二、三ＩＪおよびサルモネラ株からのジホスホリピドは高度に有毒であ るが、アール、スファエロイデスからのジホスホリルリビドＡの構造を有するＤ ＰＬＡはそうではない。ガラクトサミン感作マウスでのＤＰＬＡのＬＩ）ｓｏは 、２００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇより大きかった。

リビドＡ誘導体（ＤＰＬＡ）での処理と比較して、ヱ二、ユニ誘導リボ多糖類の 単一注入（１０〜２０μｇ／ｋｇ）は、重い肺のハイパーテンションを起こし、 １５〜３０分後、４二、ユニリポ多糖類で処理した動物は、震え、咳をし、横に なった。症状は、さらに数時間してひどくなり熱がでた。２４時間で動物の約半 数が死亡した。

２６℃で成長させたアール、スファエロイデスＡＴＣＣ１７０２３の無毒なＬＰ Ｓから得られた精製済みＤＰ−プラフ化学型ＬＰＳ　（ＲｅＬＰＳ）によりＲＡ Ｗ２６４．７マクロフアージ細胞系でカケクチン（ＴＮＦ）の誘導を妨害するこ とが示された。ＲｅＬＰＳ対ＤＰＬＡ質量比１：１０および１　：　１００　（ ＲｅＬＰＳを１．０ｎｇ／ｍ！使用した）が、カケクチンの誘導でそれぞれ５５ ％および９５％の抑制を与えた。アール、スファエロイデスからのＤＰＬＡの構 造が、ユニ、ユニからの有毒ＲｅＬＰＳのリビドＡ部分の構造とよくにているの で、この抑制はマクロファージの活性部位に対するＤＰＬＡによる競合結合にお そらくよるものである。ＤＰＬＡも、マクロファージのＬＰＳ／リピドＡ結合の 性質およびおそらく他の応答細胞の性質を調べるための有用な薬剤である。

グラム陰性ＬＰＳの致死内毒性の前の研究は、この物質の注入の合併症の限定さ れた防止がグルコ゛コーチコイド、プロスタグランジン、ナロキソン、増圧物、 流体補欠療法（ｆｌｕｉｄ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔｈｅｒａｐｙ）または アンチ−ＬＰＳ抗体の投与により達成され得ることを論証している。さらに、Ｌ ＰＳ致死率に対するすべての既存の療法は、ＬＤＳチャレンジの投与前または直 後に与えられていることに依存する。

無毒なリピドＡ誘導体たとえばＤＰＬＡの投与は、表■に挙げた内毒素誘導疾病 の多くにより起こされる病理学的状態を改善し得る。さらに、リビドＡ誘導体に よるこのことは、非常に重要な治療上の要件である：その理由は、疾病の徴候と 症状は、治療が開始される前にほとんど常に明白であるからである。リピドＡ誘 導体がＬＰＳチャレンジに対して有効である保護の機構は分かっていないが、資 料は、共通の標的分子たとえば内皮細胞または血管細胞の膜レセプターに対する 競合とよく合致する。

約６℃で成長させたアール、スファエロイデスのＬＰＳのグルコサミンニ糖類の ３−ヒドロキシテトラゾカッエートの代わりに３−位での３−ヒドロキシデカノ エート、６個の代わりに５個の脂肪酸、２°　−位のアシルオキシアシル結合の テトラゾカッエートの代わりのＡ７−テトラゾカッエートおよび２−位の３−ヒ ドロキシテトラゾカッエートの代わりに３−ケトテトラゾカッエートを有するリ ビドＡ誘導体はそれ自体動物に対して有毒ではないので、これらのリビドＡ誘導 体はＬＰＳが改善することが分かっていてその毒性のために使用できない他の疾 病の治療に有用であろう。このように、リピドＡ誘導体が、遊離ラジカルの生成 を高める薬剤（たとえば、プレオマイシン、ニトロフラントイン、アドリアマイ シンなど）、酸素毒性およびスカトール毒性から動物を保護することが予期され る。ＬＰＳが、酸化剤ストレスに対し動物を保護する各種の酵素の活性を刺激す ることがり、免疫修飾（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）効果の評価 細菌性のリポ多糖類（ＬＰＳ）または内毒素は抗腫瘍性およびアジュバントの活 性を有し、また、Ｘ照射および各種の細菌性の感染に対する保護を与える。しか しながら、これらの有利な効果がそれを十分に活用されてないのは、非常に低い 用量でもほとんどのＬＰＳが、極度に毒性で、はとんど動物の種に対し発熱性で あるからである。ＬＰＳの有利な効果と有害な効果は、分子のジホスホリルリビ ドＡ　（ＤＰＬＡ）部分により引き出されるようである：しかしながら、ＤＰＬ Ａの還元端（ｒ　ｅ　ｄｕｃｉｎｇ　ｅｎｄ）からの単一ホスフェートの除去は 、モノホスホリルリピドＡ　（ＭＰＬＡ）を生ずる。ＤＰＬＡよりも活性でない がＭＰＬＡは、自然のＬＰＳにより生じた有利な効果のすべてを引き出し、高い 用量でも比較的に無毒であり非発熱性である。ＭＰＬＡによるマウスの治療は、 ５５５−ｍだけによる免疫化の後に通常はなされないＩｇＧ抗体の有意的量の合 成およびタイプ■肺炎球菌性多糖類（ＳＳＳ−１（［）に応答する抗体の大きさ の増加をもたらすことを最近の研究は示している。これらのアジュバントまたは 免疫修飾効果は、アンブリファイア−またはヘルパーＴ細胞機能の形質発現（ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をかえることなく胸腺誘導（Ｔ）サプレッサー細胞の抑制 効果を打ち消すＭＰＬＡの能力に帰せらロトハクタースファエロイデスＡＴＣＣ １７０２３（Ｒｓ−ＬＰＳ）のＬＰＳは無毒でありかつ非発熱性であり、有毒な エンテロバクチリアル（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）およびサルモネラＬ ＰＳに見られる構造に似たリビドＡ部分を有している。構造が似ているため、無 毒なＲｓ−ＬＰＳのＤＰＬＡは、カケクチンまたは腫瘍壊死因子の誘導およびニ スケリチャコリの有毒ディープラフ化学型ＬＰＳ　（Ｒｅ−ＬＰＳ）によるＩＬ −１の放出を濃度依存的で競合的に妨害し、７０　Ｚ／３ブレーＢ細胞によるＬ ＰＳ誘導誘導免疫グロブ９戊ンタゴニストとして使用され得る。このことは、無 毒なＲｓ−ＬＰＳのＤＰＬＡが、ＬＰＳにより引き出される薬理学的および免疫 学的な効果の多くを誘発するのに関与する細胞結合部位への付着に対し有毒ＬＰ Ｓと効果的に競合し得ることを示唆している。上記の拮抗作用を扱うことに加え て、Ｒｓ−ＬＰＳは、また、サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）活性の形質発現を廃棄 するその能力でＭＰＬＡに似ている。

５５５−ｍへの抗体応答のＲＳ−ＬＰＳによる処理のＵ−マウスの群に、５５５ −ｍの最適免疫用量（０。

５μｇ）での免疫化（ｉ．ｐ．）２日後、６量のＲｓ−ＬＰＳを与えた（ｉ．ｐ ．）：引き出された抗体（ＰＦＣ）応答の大きさを、免疫５日後、測定し、Ｒｓ −ＬＰＳを与えてない免疫化対照マウスのそれと比較した。得単−注入での処理 は、ｓｓｓ−ｍ−特異ＰＦＣ応答の大きさに効果（Ｐｒｏ．０５）を有さないこ とを示している：しかしながら、有意的な増加（約２倍；Ｐ＜０．０５）が、２ ０μｇのＲ　ｓ　、−　Ｌ　Ｐ　Ｓを与えたマウスに認められた。もう１つの実 験では、５５５−ｍの０．５μｇでの免疫化（ｉ．ｐ．）のその日またはその後 の日にマウスに２０μｇのＲｓ−ＬＰＳの単一注入を与えた（ｉ。

ｐ．）：生じたＰＦＣ応答の大きさを、免疫化５日後に評価し、Ｒｓ−ＬＰＳを 与えてない対照免疫化マウスのそれと比較した。Ｒｓ−ＬＰＳによる処理は、５ ＳＳ−■による免疫化の日（日にち０）または免疫化１日後（日にち＋１）に与 えたとき、ｓｓｓ−ｍ−特異ＰＦＣ応答の大きさに影響を与えなかった（いずれ のの場合もｐ〉０、０５）；Ｌかしながら、ｓｓｓ−ｍ−特異ＰＦＣ応答の有意 的増加が、Ｒｓ−ＬＰＳを与えたとき、免疫化２日後、観察された（日にち＋２ 　；　Ｐ＜０．０５）　、より大きな増加が、Ｒｓ−ＬＰＳを与えたとき、５Ｓ Ｓ−■での免疫化３日後、認められた（日にち＋３；Ｐ＜０。

００１）。ＰＦＣ応答の有意的な増大が、マウスに２０ｕｇのＲｓ−ＬＰＳを与 えたとき、０．５ｇｇの５ＳＳ−■での免疫化４日後、認められたが、得られた 増加の捏度は、Ｒｓ−ＬＰＳを同量与えたマウスに対する５ＳＳ−■での免疫化 ３日後のもの以下であった。これらの実験の結果は、５ｓｓ−ｎに対する抗体（ Ｐ　Ｆ　Ｃ）応答のＲｓ−ＬＰＳ２０μｇを与えられたマウスで常套的に証明さ れ得る事実を示している。より多い量のＲｓ−ＬＰＳを与える効果は、記載すべ き残りの実験が同じロフトのＲｓ−ＬＰＳを用いて完成できるように調べてない 。

低用量免疫麻痺の誘導と形質発現へのＲｓ−ＬＰＳの処）−先の研究は、５５５ −ｍのぎりぎりの免疫用量の単一注入に対する先立つｍＮ　（ブライミング）が 、低用量免疫麻痺と呼ばれる非応答の抗原特異形の展開をもたらすことを示した 。そのような非応答（これは十分に誘導されるまでに少なくとも３日要する）は 、ブライミングの後、数週間または数カ月持続し、Ｔｓにより伝達されることが 公知である。ＭＰＬＡでの処理は、Ｔｓの抑制効果を破壊することが示されてい るので、マウスに、ブライミング時にまたはブライミング３日後に、各種量のＲ ｓ−ＬＰＳの単一注入（ｉ、ｐ、）を与え、Ｒｓ　−ＬＰＳでの処理が低用量麻 痺の誘導または形質発現を変えるかどうかを測定した。

５５５−ｍの０．００５μｇの単一注入でのブライミングが、予期されるように ３日後に有意的な非応答の展開をもたらす（群へ対群Ｂ、ｐｒ０．００１）。ブ ライミング時のＲｓ−ＬＰＳの０．１〜１０μｇでの処理は、誘導される非応答 の程度を部分的に減じた（群Ｂ対群Ｃ１ＤまたはＥ、ｐ＜ｏ、０２）；Ｌかしな がら、残りの抗体（ＰＦＣ）ｋ応答は、プライムを行ってない免疫化しｐ＜０． ００１）。このように、Ｒｓ−ＬＰＳでの処理は、低用量麻痺の誘導に最も良く てもほんの僅かな効果しか有さないようである。十分に誘導された低用量麻痺の 形質発現へのＲｓ−ＬＰＳの０．１〜１０μｇでの処理の効果はさらに印象的で あった。マウスを０．５μｇの５５５−ｍで免疫化したブライミング３日後およ びブライミング時のＲｓ　−Ｌ　Ｐ　Ｓの増大量での処理は非応答の対応する減 少をもたらした（ｕＢ対群Ｃ，ｐ＜０．０５：群Ｂ対！！ｆＤまたはＥ、ｐ＜０ ．００１）。非応答が実質的に減少されたが、Ｒｓ−ＬＰＳＩＯμｇを与えられ たプライムしたマウスでも排除はされなかった（群Ａ対！ｆＥ、ｐｒ０．００１ ）。これらの発見から、低用量麻痺の形質発現を破壊するのに、Ｒｓ−ＬＰＳの １回よりも多い注入での処理が単一の大きな用量よりもより効果的かを調べるこ とが決定された。このことは事実であるように当然思われる。５ＳＳ−ＩＯ，５ μｇでの免疫化時（日１こちＯ）および１日後（日にち＋１）でのＲｓ−ＬＰＳ ｏ、１または０．１１μｇの２回の注入（ｉ。

ｐ、）は、発現された非応答の程度をかなり下げた（群Ｂ対Ｃまたはり、ｐ＜ｏ 、０２）。より重要なことは、僅か１μｇのＲｓ−ＬＰＳの２回の注入が非応答 を完全に破壊した：得られるＰＦＣ応答は、プライムしてない免疫化対照のそれ と有意的に異ならなかった（群Ａ対群Ｅ％ｐ＞０．０５）。

５５５−ｍに対する抗原応答のＲｓ−ＬＰＳ誘導増大を得るためのＴ細胞に対す −Ｕ件−無胸腺ヌード（ａｔｈｙｍｉｃ　ｎｕｄｅ）（ｎｕ／ｎｕ）マウスおよ びそれらの遺伝的に同様な胸腺あり対照（ｎｕ／＋マウス）に、５ＳＳＩ［ＩＯ ，５μｇでの免疫化（ｉ、ｐ、）３日後、２０ｕｇのＲｓ−ＬＰＳの単一注入（ ｉ、ｐ、）を与えた。生じた５ｓｓ−ｎ−特異ＰＦＣ応答の大きさを、５５５− ｍでの免疫化５日後、測定し、得られた結果を、Ｒｓ−ＬＰＳを与えてない免疫 化したｎ　ｕ　／　ｎ　ｕおよびｎｕ／＋マウスのものと比較した。

Ｒｓ−ＬＰ３２０μｇでの処理は、胸腺ありのｎｕ／＋マウスのＳ５５−ｍ−特 異ＰＦＣ応答に有意的な増加（約４倍；ｐ＜ｏ、００１）を生じた。しかしなが ら、Ｒｓ−ＬＰＳを与えた免疫化２日後ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕマウスに対しては増 大（ｐ＞ｏ、０５）は認められなかった。これらの結果は、ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕ マウスおよびｎｕ／＋マウスに、５５５−ｍでの免疫化２日後、ＭＰＬを与えた 先の研究で得られたものと同様である。このように、５ＳＳ−■に対する抗体（ ＰＦＣ）応答を増大させるＲｓ−ＬＰＳおよびＭＰＬの能力はＴ細胞に依存する 。

結果は、Ｒｓ−ＬＰＳでの処理なしで、ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕ　７ウスは、胸腺あ りｎｕ／＋マウスよりも良好な５ＳＳ−■抗体応答をすることを示している。こ のことは外の研究でも認められているので希な発見ではない。これは、５５５− ｍに対する抗体応答に含まれるＢ細胞が、ｎｕＺ＋マウスに存在するサプレッサ ーＴ細胞の抑制効果の不在下でより効果的に応答するという事実の反映である。

ＭＰＬまたはＲｓ−ＬＰＳでの試験管内処理後のＴｓの不活性化−プールした肺 細胞懸濁液を、５ｓｓ−■ｏ。

００５μｇの単一注入（ｉ、ｐ、）の先立つ露出（ブライミング）の１８２４時 間後、マウスから調整した。

細胞懸濁液は、媒質１９９で調節して１０ｘｌＯ’の有核細胞（ｎｕｃｌｅａｔ ｅｄ　ｃｅｌｌ）／ｍｌを含むようにし、複数の管に２．５ｍｌづつにわけた。

６管に、既知量（０，ＯＯ５ｎ　ｇ　〜５μｇ）のＭＰＬまたはＲｓ−ＬＰＳ　 （容量５０μｇ）を加えた：内容物を混合後３０〜６０分間４℃に保った。複数 群のマウスに、５−ＩＩＩＯ９５μｇでの免疫化（ｉ、ｐ、）の後、容量０．２ ｍｌの（ｉ、ｖ、）２０ｘｌＯ’の細胞を与えた：免疫化の５日後、引き出され たｓｓｓ−ｍ−特異ＳＦＣ応答の大きさを測定し、（ａ）プライムされた肺細胞 の与えられなかった免疫化されたマウスおよび（ｂ）ＭＰＬＡまたはＲ８−ＬＰ Ｓで試験管内で処理されなかったプライムされた肺細胞を与えられた免疫化され たマウスのものと比較した。

ＭＰＬＡにより処理されなかった２０ｘｌＯ’のプライムされた肺細胞の移動は 、予期されたようにＰＦＣの有意的な（ｐ＜０．０５）抑圧を起こした：そのよ うな抑圧は、抗原特異性であり、ｓｓｓ、ｍへの暴露に続き活性化されたＬｙｔ −２”Ｔｓにより起こされると示さのＭＰＬＡによる処理は、抑圧を移動させる プライムされた細胞の能力を廃棄する。同様な結果が、プライムされた牌細胞を 移動に先立ち試験管内でＲｓＬＰＳで処理したときに得られた；ここでは、Ｒｓ −ＬＰＳ５ｐｇでの処理が、プライムされた胛細胞の抑圧効果を排除した。

極端に少量のＭＰＬＡまたはＲｓ−ＬＰＳでの処理が、移動したＴｓにより生じ た抑制効果の不活性化に非常に効果的である事実をこれらの発見は証明する。

これらの実験で、ＭＰＬＡまたはＲｓ−ＬＰＳで処理された細胞は、移動に先立 って残留ＭＰＬＡまたはＲｓ−ＬＰＳを除去するように洗浄されなかった。使用 したＭＰＬＡまたはＲｓ−ＬＰＳの極端な少量という点で、このことは必要であ るとは信じられなく、その理由は、０．５μｇの５５５−ｍでの免疫化時のＭＰ 　ＬＡ　Ｌ　Ｏ〜５０μｇまたはＲｓ−ＬＰＳ２０μｇの投与は、生じるＳ５５ −ｍ−特異性ＰＦＳ応答の大きさに影響しないからである。

上記の免疫修飾効果は、１〜２０μｇのＲｓ−ＬＰＳの１回またはそれ以上の投 与の試験管内注入の後、常套的に証明され得ることに留意すべきである；しかし ながら、より多量（５０〜１００μｇ）のＭＰＬＡが同じ実験条件下で、匹敵す る結果を得るのに通常必要である。

その理由は、公知ではないが、分子の大きさの違いが一因であろう。複雑な高分 子であるＲｓ−ＬＰＳとは対照的に、ＭＰＬＳは平均分子寸法１．７１８の小さ な分子である。したがって、ＭＰＬＡは、注入後、比較的短時間で循環から排除 されると予期され、したがって、かなりの効果を生じるには多量を必要とする。

あるいは、特異的活性のＲｓ−ＬＰＳとＭＰＬとの間の違いは、その化学的組成 および／または構造の微妙な差に関連するだろう。

予め５５５−ｍに暴露したマウスから誘導したｔ、ｙｔ−２“で抗原特異性抑圧 を移動させる能力は、そのような非応答が、５５５−ｍに対する抗体の応答の大 きさを規制するのに活性な役割を果すＴｓにより当然起こされる明白な証明を与 える。極少量の無毒なＭＰＬＡまたはＲｓ−ＬＰＳによる試験管内での先立つ処 理が、抑圧を移動するそのような細胞の能力を廃棄する事実は、ＭＰＬおよびＲ ｓ−ＬＰＳがＴｓ活性を廃棄するのに極端に効果的であることを示す。このこと が起こる機構は明確にされなければならないが、Ｔｓ表面へのＲｓ−ＬＰＳまた はＭＰＬＡの結合だけ以上のものをまづ含んでいるいなければならない；他の研 究は、ＭＰＬＡで被覆されたプラスチックディシュからの抗原プライムされた胛 細胞の結合および後続する溶離が、Ｔｓ活性の＞１．　０００倍の濃縮（ｅｎｒ ｉｃｈｍｅｎｔ）（増加でない）をもたらすことをを示している。Ｔ”またはＴ 、ｌ活性が多量のＭＰＬＡでの処理により損なわれないので、Ｒｓ−ＬＰＳおよ びＭＰＬＡが、ＴＳへの結合後、（ａ）そののその分布を変えるのでそれらは５ ５５−ｍに対する抗体応答の大きさにもはや影響を及ぼし得ないといえる。

カケクチンまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）がグラム陰性細菌性感染の間の内毒素 の致死作用の主要メゾイエイタあることを示す抵抗しがたい証拠がある。この関 係において、組み換えＴＮＦの投与は、内毒素に帰せられる多くの有毒作用を模 擬することが示されていて、一方、ＴＮＦに対して特異的なポリシクロナール抗 体の注入は、そのような作用の形質発現を中和するかまたは妨害する。

このように、ＴＮＦは重い内毒素血症の間の薬物療法の介入に対する理想的な標 的であるようである。Ｒｓ−ＬＰＳの無毒なジホスホリルリビドＡ　（ＤＰＬＡ ）がマクロファージによるＴＮＦの合成および放出を誘導することに失敗しない ばかりか有毒なＬＰＳと好首尾に競合してＴＦＮの誘導を容量依存するようにし て妨害する。このことは、無毒なりＰＬＡおよびＲｓ−ＬＰＳが内毒素ショック の治療に有用であることを示唆している。ＭＰＬＡはＴＮＦの形成を誘導するの でここでは適当でない。

さらには、Ｔｓの抑制作用を廃棄することにより抗体応答を増すＲｓ−ＬＰＳの 能力は、Ｒｓ−ＬＰＳがホスト免疫性を増すのに効果的で、グラム陰性感染の間 に作り上げられた内毒素の量の有意的な減少をもたらすことを示唆する。

以上の実験を要約すると、タイプ■肺炎球菌性多糖類（ＳＳＳ−ＩＩＩ）で免疫 化したマウスの抗体応答を、ＯＦバクタースファエロイデス（Ｒｓ−ＬＰＳ）か らの無毒なリポ多糖類での処理有りと処理なしで調べた。得られる結果は、より 低濃度のＲｓ−ＬＰＳが必要とされる以外は、モノホスホリルリビドＡ　（ＭＰ ＬＡ）で処理したマウスについて前記したものと同様であった。両者とも５５５ −ｍでの免疫化のときに与えたとき効果がなかったが、２〜３日後与えたときは 有意的な増加を引き出した。そのような増加は、Ｔ細胞依存性であり、Ｂ細胞に よるＩｇＭ合成のポリクロナール活性化にはよらなかった。Ｒｓ−ＬＰＳまたは ＭＰＬでの処理は、形質発現を廃棄するが、サプレッサーＴ細胞（Ｔ　ｓ　）に より起こされることが公知である免疫学的非応答の１形態である低容量麻痺の誘 導を起こさない。２．０ｘｌＯ’の細胞当たり５μｇのＲｓ−ＬＰＳまたは５ｎ ｇのＭＰＬでのＴＳを含む細胞懸濁液の試験管内処理は、抑圧を他のマウスに移 動させるそのような細胞の能力を除去する。これらの発見は、ＭＰＬＡおよびＲ ｓ−ＬＰＳの免疫修飾効果が主にＴｓの抑制効果を排除する結果であることを示 している：このことは十分に形質発現すべきアンブリファイア−Ｔ細胞（Ｔ△） の確実な効果を許容する。

好ましい化合物の無毒な性質にどの構造的な性質が寄与するかを測定しようとし て、ＰＭＡ刺激された超酸化物アニオン放出に対するＬＰＡ／リビドＡによるマ クロファージのプルーニングの極めて鋭敏な測定で還元したて、比較試験を行っ た。未還元ＲｓＤＰＬＡのように還元したＲｓＤＰＬＡは、不活性すなわち無毒 であり、還元されたＬ二、−７’ＪＤＰＬＡは未還元のもののように活性すなわ ち有毒であった。結論は、ケト脂肪酸および不飽和脂肪酸の存在は無毒性におい て構造的な役割を果さないということである。重要な特徴は、（ａ）ＲｓＤＰＬ Ａ中の５個の脂肪酸封止、ユＩＪ　Ｄ　Ｐ　Ｌ　Ａ中の６個の脂肪酸の存在と（ ｂ）ＲｓＤＰＬＡの３−位置のＣ０゜でのＯＨ対イー、コリＤＰＬＡ中のＣＩ４ でのＯＨの存在であらねばならない。

グラム陰性注入の有害な作用から動物を保護するのに使用するため、リビドＡ誘 導体を静脈内ルート、腹腔内ルートまたは筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ）ルート用の医薬組成物の形態で動物に導入することが好ましい。このように使 用するとき、化合物は、そのような投与に適当な無菌液体に選択した化合物を含 む非経口溶液の形態であってよい。無毒なリビドＡ誘導体が経口的にまたは局所 的に最良に投与される場合、化合物は、医薬的希釈剤と組み合わせて、経口的適 用に合う投薬形態たとえばカプセルまたは錠剤または局所的適用に合う投薬形態 たとえば貼剤または軟膏としてよい。選択した化合物の正確なルート、投与量お よび投与間隔は、動物の大きさと重量、種類、所望する保護のレベルにより変わ ろう。通常、適量は、体重１キログラム当たり約１〜１約１〜５０ｍｇを含むで あろう。

本発明の化合物は、非常に低い毒性を有しているので正確なＬＤ６゜の決定が困 難である。たとえば、アール。

スファエロイデスからのＤＰＬＡは、マウスに腹腔内に投与したとき、ＬＤ５０ が２０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇより大である。

よび動物の免疫系を刺激する同じ化合物の使用（例５）を示している。

与１！：１０μｇでマウスに腹腔内投与してグラム陰性内毒素の有害な作用を防 止した。前処理は、動物を内毒素の有害な作用から保護したことが分かった。

匠五 マウスの５５５−ｍに対する抗体応答は、免疫化２日後、この動物にアール、ス ファエロイデスからのＬＰＳを腹腔内に与えることにより刺激された（０．０５ 〜２０μｇ）。

本発明の化合物は、補助薬としてワクチンとともに用いて保護免疫グロブリンの 生成を高めてもよくあるいはコルチコステロイドまたは抗ＴＮＦ因子（ａｎｔｉ 　ＴＮＦ　ｆ　ａ　ｃ　ｔ　ｏ　ｒ）と組み合わせてもよい。ＤＰＬＡ解釈は、 ＤＰＬＡがＬＰＤを妨害するので抗ＴＮＦ藁剤がＴＮＦを攻撃できるということ である。

国際調査報告 ＡｔｋｄＤ町ｔ　ｔｏ　ＦＯＦＭ　Ｉ’ＣＴ　２１０　Ｐａｒｔ　１．　Ｃ１ａ ｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｕｂｊｅｃｔ　Ｍａｔｔ■■

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ｛ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じであるかまたは異なっていて、 水素、 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼；枝分 かれアルキルまたは１−ヒドロキシ脂肪酸基であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７お よびＲ８は、同じであるかまたは異なっていて、水素、１〜６個の炭素原子の低 級アルキル、アリール、または▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒは、１〜 ６個の炭素原子の低級アルキルであるかまたは生成物の望ましい性質を干渉ある いは損ねない塩基性基である）から選択される基であり；Ｒ９およびＲ１０は、 エーテル結合中の１〜６個の炭素原子の低級アルキル、エステル結合中の Ｃ２〜Ｃ１８脂肪酸基または１残基当たり１〜２０のグリコシド単位からのグリ コシド残基から選択される；ｎは、１〜１４であり；ｍは、２〜１６である｝を 有する化合物であり、ロドバクターカプスラタからのＤＰＬＡではない化合物。
2. ２．動物に、請求項第１の化合物から選択された安全で有効な量の薬剤とロドバ クターカプスラタからのＤＰＬＡとを投与することを特徴とする動物のグラム陰 性内毒素の有害な作用を防止する方法。
3. ３．化合物が、ロドバクタースファエロイデスからの無毒なＤＰＬＡである請求 項第２の方法。
4. ４．化合物が、ロドバクターからの無毒なＭＰＬＡである請求項第２の方法。
5. ５．動物に、請求項第１の化合物から選択された薬剤とロドバクターカプスラタ からのＤＰＬＡとを投与することを特徴とする動物の免疫系を刺激する方法。
6. ６．化合物が、ロドバクターからの無毒なＤＰＬＡである請求項第５の方法。
7. ７．化合物が、ロドバクターからの無毒なＭＰＬＡである請求項第５の方法。
8. ８．補助薬として請求項第１の化合物を含むワクチン。
9. ９．請求項第１の化合物から選択された薬剤とロドバクターカプスラタとを含む ことを特徴とする医薬組成物。