JPH04503761A - Ｐａｉ―２の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＦＡＩ−２の・ □ 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、ＦＡＩ−２の遺伝子工学 的に製造された変異体に関する。

盈工豐皇！丘 Ｅ、コリ株ＢＴＡ１４４５を、１９８７年２月１１日、寄託番号ＡＴＣＣ５３５ ８５として、ブダペスト条約の規定に従って、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　 Ｄｒｉｖｅ＋　Ｒｏｃｋｒｉｌｌｅ　ＭＤ　２０８５２．Ｕ、Ｓ、Ａ。

のＡｏ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｆｏｎに寄 託した。

肢±宵景 ブラスミノゲーン活性化因子（ＦＡ）は、豊富な細胞外チ主−ゲン、すなわちプ ラスミノーゲンをプラスミンに転換するセリンプロテアーゼ、すなわち細胞外マ トリックスのすべての成分の分解を促進することができる活性プロテアーゼであ る。（Ｄａｎｏなど、　Ａｄｖ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４：１３９〜２６ ６．１９８５）。

２種の異なったタイプのＰＡが哺乳類組織に認識される：（ｉ）　イブのブース ミノ−°ン’　ｔ−ＰＡ　。

ｔ−ＦＡは、５２７個のアミノ酸を含む１つのポリペプチド鎖から構成される、 約７０，０００の分子量を有するセリンプロテアーゼである。プラスミンによる 制限された消化に基づいて、分子は１つのジスルフィド結合により結合される２ つの鎖活性化因子に転換される。これは、その分子のＮ末端部分に由来するＨ鎖 （Ｍｒ３８，０００）及びＣ００）（−末端領域を含んで成るＬ鎖（Ｍｒ３２， ０００）を生成するＡｒｇ２７５−１１ｅ２７６ペプチド結合の分割により生じ る。ｔ−ＰＡのＬ鎖に位置する触媒部位は、Ｈｉｓ３２２Ａｓｐ３７１及び５ｅ ｒ４７８から成る。ｔ−ＰＡはプラスミノーゲンにおけるＡｒｇ５６０−Ｖａ　 １５６１結合の加水分解を特異的に触媒する。フィブリンは、ｔ−ＰＡによりプ ラスミノーゲン活性化因子を強く刺激することが見出された。

ｕ−ＰＡは、５０，０００のＭｒを有し、そして１つのポリペプチド及び２つの ポリペプチド鎖形で存在する。１つの積形は不活性プロ酵素であり、そして２つ の積形は活性酵素である。ｕ−ＰＡは、フィブリンの不在下で実質的なプラスミ ノーゲン活性化因子活性を有し、そしてその存在により刺激されない。フィブリ ンに対するｔ−ＰＡの扁い親和性は、それが繊維素溶解機能に最っとも関与され 、そしてｕ−ＰＡは細胞外タンパク質分解出来事、たとえば組織改造及び破壊（ すなわち、器官退縮、炎症反応及び特に悪性腫瘍の侵入的増殖及び転移性広がり ）に関与されることを示唆する。

ヒトにおける血栓崩壊剤としてｔ−ＰＡ及び一本積ｕ−ＰＡの実験的な使用が有 望である。しかしながら、ＰＡは、いくつかの動物モデルから予測されるよりも 、ヒトにおいてより低い明白なフィブリン特異性を有することが明らかになって おり、臨床的な血栓崩壊治療において前記分解剤又はそれらの投与スケムの追加 の改良のための必要性を示唆する。１つの可能性は、ＰＡの全身性フィブリン溶 解効果を調整するためにＰＡの特異的に早い活性タンパク質インヒビターの使用 である。

最近の出来事は、ウロキナーゼ介在のプラスミノーゲン活性化因子はまた、悪性 細胞の侵入挙動に役割を演じることができることを示唆する。少々の例外を伴っ て、悪性細胞は、異常に高い量、ＰＡを放す。０ｓｓｏｈｓｋｉ　ａｎｄ　Ｒｅ １ｃｈ（Ｃｅｌｌ、３５　；６１１〜６１９．１９８３）は、抗−ウロキナーゼ 抗体がニワトリの胚の漿尿膜上に接種されたヒ）ｆｆ表皮癌細胞の転移を阻害し たことを報告した。Ｂｅｒｇｍａｎ　ｌ　ｅ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、８３　：９９６〜１０００　、１９８６）は、プロテアーゼネクシン Ｉ２すなわちウロキナーゼ及びプラスミンの繊維芽細胞−分泌インヒビターが、 ヒト繊維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の細胞 介在分解を効果的に阻害することを示した。最後に、５ｕｌｌｉｖａｎ　ａｎｄ 　Ｑｕｉｇｌｅｙ（Ｃｅｌｌ　４５　：　９０５〜９１５　、１９８６）は、Ｆ Ａに対するモノクローナル抗体がＲｏｕｓ肉腫ウィルス−形質転換性ニワトリ繊 維芽細胞によるＥＣＭの分解を阻止することを示す。ウロキナーゼの特異的プロ テアーゼインヒビターは、腫瘍組織における活性腫瘍細胞ＦＡのレベルを変える ことにおいて臨界的な役割を演じ、そして従って、インビボでの腫瘍の増殖及び 侵入に影響を及ぼすことが観察される（Ｍｉｇｎａｔｔ　葺、、Ｃｅ１１４７： ４８７（１９８６）；Ｏｓｓｏｗｓｋｉ。

Ｃｅ１ｌ　５２：３２１（１９８Ｂ）；Ｒｅ１ｃｈｆζ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、４８：３３０７（１９８８）　）。

ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子の特異的インヒビターは近代 医学に役割を有する他の指摘が存在する。ＦＡは、広範囲の炎症状態、たとえば 関節炎に関与される。プラスミンは、軟骨を分解することができ（Ｌａｃｋ、Ｃ Ｈ＆Ｒｏｇｅｒｓ、ＨＪ（１９５８）Ｎａｔｕｒｅ　１８２　：　９４８）　、 そしてプラスミンによる低レベルのフィブリン溶解活性が滑層に組織学的に検出 された。ＰＡ／プラスミンシステムは、リウマチ様細胞培養で検出され（ｋｅｒ ｂ、Ｚ星？、（１９７７）Ｎａ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　２９６．１０１１７） 、そして高レベルのｕＰＡがリウマチ様滑液に示された（Ｍｏｃｈ−ａｎ、　Ｅ 　＆　Ｌｌｈｌ、　Ｊ、（１９８４）　Ｊ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ　１１．１２３ 　：ｌ　、従って、関節におけるｕＰＡの特異的インヒビターの使用は、この疾 病に関与される組織破壊を阻止することができる。

特異的ＰＡゼインビターの適用が用いられ得る他の状態は、疾病又は変形性関節 炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ様疾患、乾盲、天庖遺、角膜潰瘍、胃 十二指腸潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋ジストロフィーのような状態を包含 する。最後に、ＦＡベインビターは、２種のトリプシンインヒビターが創傷組織 の高められた引張強さを有する結合組織の形成を高めることが示され（Ｋｗａａ ｎ、）Ｉｃ　ａｎｄ　Ａｓｔｒｕｐ、Ｔ（１９６９）Ｅｘｐ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｐａ ｔｈ、　１１　、８２）　、そしてケラチン細胞がｕＰＡ及びｔＰＡの両者を生 成することが知られているので（Ｇｉｏｎｄａｈｌ−Ｈａｎｓｅｎ、Ｊ、など、 （１９８Ｂ）Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔａｌ：ｌ　、特に皮膚創傷の治癒 など組織修復において有意な役割を有する。

ＦＡベインビター、すなわちセルビン遺伝子種類のメンバ（Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ 　ａｎｄ　Ｋｌｕｆｔ、　Ｂｌｏｏｄ　６９　：　３Ｂ１〜３８７＋１９８７） 　は、４種の免疫学的に異なるグループに分類された：１）内皮細胞タイプのイ ンヒビター、ＦＡＩ−１，２）胎盤タイプのＰＡ−インヒビター、ＦＡＩ−２， ３）尿タイプのＰＡ−インヒビター、ＦＡＩ−３，４）プロテアーゼ感受性ンＴ 、ＤＮＩ。

ＦＡＴ−２（Ｍｒ約４６，０００）は、胎盤組織、単球及びヒト単球細胞系Ｕ９ ３７から精製された。これらの異なった源からのＰＡＩ−２インヒビターは、免 疫学的に関係し、そしてヒト胎盤及びヒ）Ｕ９３７細胞系に由来するＦＡＩ−２ の最近のｃＤＮＡ配列分析は、それらが同一であり、但し分子の２つの形はたっ た３個の単一のアミノ酸残基において異なって存在することを確証した。両ｃＤ ＮＡ形は、Ｕ９３７細胞から単離された。（Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ　星？、Ｍｏ １．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．ユニ４５６４〜４５６７　、１９８７　；　Ａｎｔａ ｌｉｓ　ｆＺ　？、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　８５　：９８５〜 ９８９　、１９８８）　、　Ｆ　Ａ　Ｉ　−２はｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡの一両者 と反応しく一本鎖のｔ−ＰＡとよりも二本鎖ｔ−ＰＡとより反応する）、ＳＤＳ 安定複合体を形成する。ＦＡＩ−２はフィブリン又はフィブリン結合ｔ−ＰＡに 結合しない。

最っとも可能性ある生物学的に活性的なタンパク質に良くあることだが、ＦＡＩ −２は、インビボにおいてひじように少量生成され、そしてそれ自体、従来の生 化学的アプローチにより精製し、そして特徴づけることは困難である。細菌細胞 におけるＦＡＴ−２の最近の発現（Ａｎｔａｌｔｓ　１１　ｅ　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８５　：　９８５〜９８９＋　１９８８　；　Ｂ ｕｎｎ星ｅ　、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄＣｅ ｌｌ、Ｂｉｏｌ、ｏｆ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｂｒ ｏｏｋｈａｖｅｎ　ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂ、、４月、１９８９）は、上記の種 々の可能性ある臨床的適用におけるその生物学的効率を評価するために必要とさ れる精製されたＦＡＩ−２の量の生成を可能にする。

主五■皿丞 ＦＡＩ−２の完全なヌクレオチド配列の知識は、天然の分子に比べて改良された 性質を示すことができるＦＡＩ−２の変異体を生成する特定の遺伝的操作を可能 にする。

所望の改良された性質は、高められたインビボ半減期、高められた又は変更され た特異性及び／又は改良された医薬効果を包含する。

変更は、新しい適用分野を開く種々の性質又は産業上の製造により従う変異体を 供給し、従って改良された生成方法を導びく。

ＦＡＩ−２と他のセルビンとの間のユニークな差異は、Ｃｒ　Ｄらせん開領域に おける３３個の残基（６６〜９８）の追加の拡張である（Ｈｕｂｅｒ、　Ｒａｎ ｄ　Ｃｏｒｒｅｌｌ　ＲＷ（１９８９）Ｂｉｏｃｈ−ｅｍｉｓｔｒｙ益　８９５ １〜８９６６　）。この領域は一般的に、オボアルブミンにおけるように短い９ −残期の拡張に制限されるか又は超科の他のメンバー（たとえばヒトαｌ−抗ト リプシン、ヒト抗トロンビン■）におけるように不在である。この構造の有意性 は未知である。本発明者は、この領域がプロテアーゼに対して敏感であり、生成 の間、ＦＡＩ−２の３７ｋＤ形の発生を導びくことを発見した。ＦＡＩ−２ｔＪ ｌ製物における３７ｋＤの汚染物の存在は、規定する権威にたぶん許容されない 。さらに、ＦＡＩ−２の３７ｋＤ形は、ｕ−ＰＡに結合できない。

従って、タロテアーゼに対して敏感でない生物学的に活性的なＦＡＩ−２分子を 供給することが所望される。所望しない特徴を欠く特定のタンパク質の変異体を 供給する場合、その変異体が、特に変更が有意である場合、親タンパク質の所望 する生物学的活性を維持するであろうかどうかを予測することは不可能である。

ＦＡＩ−２の６６〜９８のアミノ酸領域がＦＡＩ−２にユニークである場合、分 子のこの領域への変更が、たぶん、得られる分子を不活性化にし又はその活性に 対して逆効果を少なくとも有することが予測される。驚くべきことには、本発明 の変異体は、天然のＰＡＩ−２の生物学的活性を保持するが、プロテアーゼ感受 性を欠く。

ＦＡＩ−２への変化は、本発明の変異体を供給するために、ＤＮＡの特定部位突 然変異誘発によりＰ、ｌ−２の個々のアミノ酸を変性することによって又はＤＮ Ａ欠失又は挿入により大量に再構成することによって製造され得る。ＤＮＡの実 際の操作は一般的に、当業界における標準技法に従って行なわれ得る。例示され る特定の変化は、ＤＮＡ欠失により再構成することによって生成される。

本発明の第１の態様によれば、ＦＡＩ−２変異体が供給され、ここでＦＡＩ−２ の６６〜６８のアミノ酸残基が、変異体がＦＡＩ−２の生物学的活性及びＦＡＩ −２の９９から６５までのアミノ酸を整合して保持する少なくとも１つのプロテ アーゼ感受性部位を排除するために変更された。好ましくは、変異体は欠失変異 体である。

本発明は特に、本明細書に定義されるようなＦＡＩ−２変異体Δ６６−９８を提 供し、ここでΔ６６−９８は、欠失されたＦＡＩ−２アミノ酸配列（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ、１）のアミノ酸６６〜９８を有する。本発明はまた、特に、本明細書 に定義されるような変異体Δ７４−９６を提供し、ここでΔ７４−９６は欠失さ れたＦＡＩ−２アミノ酸のアミノ酸７４〜９６を有する。

本発明の第３の態様によれば、ＤＮＡ分子が提供され、この配列は第１の態様の ＰＡＩ−２変異体をコードする。

本発明の第４の態様によれば、第３の態様のＤＮＡ分子及びベクターＤＮＡを含 んで成る組換えＤＮＡ分子が提供される。

典型的には、ベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡである。

本発明の好ましいプラスミドベクターは、Ｅ、コリ発現ベクター、たとえばＰ、 プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃ　７”ロモーター又はｔｒｐプロモ ーターに基づくベクター、ｐＧＥＭ４Ｚ及びそれに由来するベクター、ｐｓｐ７ ０及びそれに由来するベクター、バキュロウィルストランスファーベクター、た とえばｐＡｃ３７３、ｐＡｃ　３６０及びそれらに由来するベクター、哺乳類発 現ベクター、たとえばｐＢＰＶ−１，’ＦＩＢＰＶ−ＢＶＩ、ｐｄＢＰＶ−ＭＭ Ｔｎｅｏ。

ＳＶ４０に基づく発現ベクター、たとえばｐＢＴＡ６１３及びそれらに由来する ベクター、ワタシニアウィルス発現ベクター、レトロウィルス発現ベクター及び 相同又は異種宿主における組換えＤＮＡ分子の発現のために使用される他のベク ターを包含する。

これらのベクターに由来するベクターは、これらのベクターに構造的な変更を行 なうことによって得られるこれらのベクターである。変更のタイプの例は、特定 のベクターがらの発現を高めるために製造されるものを包含する。

ｐＢＴＡ６１３は哺乳類細胞発現ベクターである。外来性遺伝子は、ＳＶ４０初 期プロモーターを上流に及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを下流に有する複 数のクローニング部位中にクローン化することによって発現される。ｐＢＴＡ６ １３は、次のフラグメントを順に含んで成る。ＳＶ４０起原からの３４５ｂｐの ＰＶｕｌｌ−ＨｉｎｄＩ［［フラグメント、ｐＵｃｌＢからの５１ｂｐのＨｉｎ ｄＩ［［−ＥｃｏＲＪ複数クローニング部位、ｐＢＲ３２７からの１５ｂｐのＥ ｃ　ｏＲＩ　−Ａａ　ｔ　Ｉｆフラグメント、両端に結合されるＡａｔｎリンカ −を有するｐＭＳＧからの８５３ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｘｈ　ｏ　１７ラグメント 、２７ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧ ＡＣＴＡＧＴＣ：配列識別番号４）、ｐＢＲ３２７からの２８８ｂｐのＥａｇｌ −３ａｌＩフラグメント、ＳＶ４０起原からの３４５ｂｐのＰｖｕＩＩ−Ｈｉｎ ｄＩ［Ｉフラグメント、ｐＳＶ２−ＤＩ（ＦＲからのマウスジヒドロ葉酸レダク ターゼをコードする７４３ｂ９のＨｉ　ｎｄｍ−Ｂａ　Ｉ　ＩＩフラグメント、 ＳＶ４０の小さなｔイントロン領域からの１４１ｂｐの５ａｕ３Ａフラグメント 及びＳＶ４０初期ポリアデニル化８１からの２９３ｂｐの５ａｕ３Ａフラグメン ト。ｄｈｆｒ遺伝子の５′末端でのＨｊｎｄ１部位がＳｌヌクレアーゼを用いて 欠失され、他の不和合端はＳ１ヌクレアーゼを用いてフラッシュされ、又はｄＮ ＴＰ及びＤＮＡポリマラーゼＩ　（フレノウ）によりフィルインされた。

本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、ｐＢＴＡ８２９゜ｐＢＴＡ８４０．ｐＭ ＩＮＤＥＬ　７４−９６及びこれらの組換えＤＮＡ分子の誘導体を含む。

これらの組換えＤＮＡ分子の誘導体は、これらの分子に由来する分子であり、そ して変更がコードされたＦＡＩ−２変異体の発現の制御を改良し又は変えるため にＤＮＡ構造体になされた分子を含む。本発明の組換えＤＮＡ分子誘導体は、親 分子の領域をコードするＦＡＩ−２変異体を維持する。

本発明の第５態様によれば、第４Ｂ様の組換えＤＮＡ分子により形質転換され° た形質転換宿主細胞が提供される。

典型的には、宿主細胞系が適切なＥ、コリに一１２株から誘導される。それらは また、真核生物から誘導され得、そしてＣＯ３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ９３７細胞 、ＢＨＫ−２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶＩ細胞、Ｃ１２７細胞及び昆虫ｘｉト ブテルスフルキヘル゛（釦並並印ユ　ヒ■江肛並）及ヒーボーンビックスモリ（ 並畦Ｈｍｏｒｉ）に由来する細胞系を包含する。

本発明の第６態様によれば、第１態様のＦＡＩ−２変異体を製造するための方法 が提供され、この方法は、９９から６５までのアミノ酸が整合して存続し、そし て得られる変異体がＦＡＩ−２の生物学的活性を保持するように、ＦＡＩ−２を コードするＤＮＡ分子の６６−９８アミノ酸残基領域からヌクレオチドを欠失す ることを含んで成る。

本発明の第７態様によれば、第４Ｍ様の組換えＤＮＡ分子を製造するための方法 が提供され、前記方法は、第３態様のＤＮＡ分子をベクターＤＮＡ中に挿入する ことを含んで成る。

本発明の第８態様によれば、第５態様の形質転換された宿主細胞を製造するため の方法が提供され、前記方法は、形質転換のために適切な宿主コンピテント細胞 を製造し、そして第４Ｂ様の組換えＤＮＡ分子により前記コンピテント宿主細胞 を形質転換することを含んで成る 本発明の第９態様によれば、第１態様の少なくとも１種のＰＡＩ−２変異体の有 効量、並びに医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤及び／又は希釈剤を含んで 成る治療用及び／又は診断用組成物が提供される。使用され得る医薬的に許容で きるキャリヤー、希釈剤及び賦形剤は、医薬製剤の調製に標準的に使用されるも のから選択され得る。診断目的のために使用される場合、前記物質はラベルされ た形で少なくとも１種の変異体を含んで成る。ＦＡＩ−２変異体は、放射性同位 体、たとえばＩ　＋３１　によりラベルされ得、又は適切な酵素又は他の化学物 質に接合され得る。少なくとも１種の変異体が、本明細書で定義される場合、Δ ６６−９８及び／又はΔ７４−９６を含んでなるような物質が特に供給される。

抗体の生成のために使用される場合、組成物はアジュバントを含むことができる 。

本発明の第１０態様によれば、腫瘍侵入を阻害しそして／又は腫瘍を処理するた めの方法が提供され、前記方法は、第１態様のＰＡＩ−２変異体の治療的に効果 的な量及び／又は第９！Ｉｇ、欅の組成物をそのような処理を必要とする患者に 投与することを含んで成る。

本発明の第１１１１様によれば、炎症疾患、たとえばリウマチ様関節炎、変形性 関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、転層又は天庖癒の処理方法が提供され、 前記方法は、第１態様のＦＡＩ−２変異体の治療的に有効な量及び／又は第９態 様の組成物をそのような処理を必要とする患者に投与することを含んで成る。

本発明の第１２態様によれば、フィブリン溶解疾患、たとえば全身性フィブリン 溶解の処理方法が提供され、前記方法は、第１態様のＦＡＴ−２変異体の治療学 的に有効な量及び／又は第９態様の組成物をそのような処理を必要とする患者に 投与することを含んで成る。

本発明の第１３態様によれば、多発性硬化症、角膜又は胃十二指腸潰瘍、紫斑病 、歯周炎、出血及び筋ジストロフィーのような状態の処理方法が提供され、前記 方法は、第１態様のＰ、ｌ−２変異体の治療的に有効な量及び第９態様の組成物 をそのような処理を必要とする患者に投与することを含んで成る。

本発明の第１４態様によれば、組織学的検体又はインビボでの腫瘍の境界を見出 し、そして／又は定義するための方法が提供され、前記方法は、第２態様のラベ ルされたＦＡＩ−２変異体の有効量を検体に適用し、又はインビボイメージング の必要な宿主にそれを投与し、そしてイメージングによりラベルの濃度の位置を 決定することを含んで成る。

本発明の第１５１ｉ様によれば、血栓症のＰＡ処理の臨床学的効力を改良するた めの方法が提供され、前記方法は、フィブリン溶解及び付随するフィブリン／ブ イプリノーデフ分解の全身活性化を中和するために第１態様のＰＡ　１−２変異 体の治療的に有効な量及び第９１１様の組成物をそのような処理を必要な宿主に 投与することを含んで成る。

本発明の第１６１１様によれば、第１態様のＰＡ　Ｉ−２変異体に対する抗体が 提供される。その抗体はモノクローナル又はポリクローナル抗体のいづれかであ り得る。

本発明の抗体は、ＦＡＩ−２を検出するために使用され得、そして従って、多く の疾病状態、たとえば単球白血病、癌、胎児発育及び慢性炎症疾患の検出又はモ ニターすることに有“用である。

本発明の第１７態様によれば、第１６態様の抗体を調製するための方法が提供さ れ、前記方法は、第１態様のＦＡＩ−２変異体の有効量及び／又は第９態様の組 成物により免疫適格宿主を感作することを含んで成る。

本発明の第１８態様によれば、第１６態様の抗体並びに医薬的に許容できるキャ リヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を含んで成る抗体組成物が提供される。

本発明の抗体組成物は、第１６態様の抗体が使用され得る疾患状態の検出又はモ ニターに使用される。

本発明の第１９態様によれば、第１６態様の抗体及び／又は第１ＢＢ様の抗体組 成物を含んで成る診断試薬が提供される。

本発明の第２０態様によれば、細胞毒素に結合される第１態様の変異体を含んで 成る接合体が提供される。本発明の接合体の調製に使用され得る細胞毒素の例は 二゛アビリン；リシン；メリチン；ゲロニン；及びジフテリア（肚匹旦肛ｉ　ａ 、）、破傷風、クロストリジウム属、ベルツ＞Ｚ　（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓχ、之 ！Ｌｚ−（とｎ社比）　、ブ７．二ｌ”Ｅ±久（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コ レラ又は旦−ユユ不安定毒素を包含する。

これまでの研究は、ヒト結腸癌が隣接する無関係な組織に存在するよりも有意に 多量のウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子を生成することを示した 。ＦＡＩ−２は、この潰瘍関連プラスミノーゲン活性化因子に結合し、そして阻 害することができることが見出された（Ｓ　ｔｅｐｈｅｎｓ　ｆｉ　ｔ！：　。

Ｂｌｏｏｄ　６６３３３〜３３７．１９８５）。従って、生物学的に活性的なＦ ＡＩ−２変異体は、インビボ及び組織学的検体の両者において潰瘍を同定し、そ して定義するための試薬として通用される。腫瘍をインビボでイメージ化するた めには、本発明のＦＡＩ−２変異体は、適切な同位体、たとえばＴｃ−９９ｍ（ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｖ、Ｊ、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４０；３５．１ ９７９）又はｌ−１３１（Ｂｅｇｅｎｔ、　Ｒ，Ｈ，Ｊ、Ｌａｎｃｅｔ、　１０ 月２日、１９８２）によりラベルされ得る。ＦＡＩ−２変異体調製物の投与の後 、腫瘍の位置及び境界は、既知の放射性同位体法、たとえばγ−カメライメージ ングにより決定され得る。従って、ＦＡＩ−２変異体は、小さな転移性癌、特に 手術介入の後に生じる癌の同定を可能にする敏感な方法を提供する。組織学的検 体の分析において、ＦＡＩ−２変異体又はそこに発生する抗体は、同位体、たと えば）　１３１によりラベルされ、又は適切な酵素又は他の化学試薬に接合され 得る。組織学的検体、たとえばバイオプシー断片との接触に基づいて、本発明の ＦＡＩ−２変異体は、分泌のその場所で腫瘍タイププラスミノーゲン活性化因子 に結合し、それによって腫瘍の境界及びたぶん腫瘍の転移状態を同定する。診断 的適用の他に、ＦＡＩ−２変異体はまた、腫瘍の直接的な処理への使用のために も向けられる。

酵素の特定的インヒビターが、腫瘍がまわりの組織に侵入する工程に包含される 場合（Ｄａｎｏ、　ｋ、星ｆｆ、、　Ａｄｖ、ｉｎ　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４４ 　、１３９．１９８５）、腫瘍増殖及び転移の制御及び特に阻害が達成され得る 。さらに、ＦＡＩ−２変異体は、増殖する腫瘍に直接レクチン又は毒素を運ぶ薬 物投与システムとして使用され得る。このシステムは、特異性及びひじように可 能性ある殺腫瘍能力についての多くの利点を提供する。

ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子が包含される他の生物学的方 法は、侵入及び組織破壊、たとえば慢性炎症状態、たとえばりウマチ様関節炎に 関係する生理学的出来事を包含する。ＦＡＩ−２変異体は、そのような状態を改 良することにおいて、インビボで投与される場合、治療効果を有することが示さ れる。

本発明の第２１態様によれば、第２０Ｂ様の接合体並びに医薬的に許容できるキ ャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を含んで成る細胞毒性組成物が提供される。

本発明の第２２態様によれば、細胞毒性物質を腫瘍に運ぶ方法が提供され、前記 方法は、第２０態様の接合体の有効量及び／又は第２１態様の細胞毒性組成物を そのような処理の必要な宿主に投与することを含んで成る。

本発明の第２３態様によれば、対照として第１態様の変異体及び／又は第９態様 の組成物及び第１６態様の抗体、第１７態様の抗体組成物及び／又は第１９態様 の診断試薬を含んで成る診断キットが提供される。

本発明の診断キットは、本発明の抗体が使用され得る疾病及び状態の検出又はモ ニターに使用される。

園皿二呈車呈脱所 茅上区　ＦＡＴ−２ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列識別番号１）。矢印は、こ れまで同定された特異的切断点を示す。

ｍ　それぞれＥ、コリに−１２及び昆虫細胞におけるＦＡＩ−２及びその変異体 の発現に使用される細菌性（ｐＢＴＡ６４１）及びバキュロウィルストランスフ ァーベクター（ｐＡｃ３７２）。

里１皿　誘発されていない（レーン１及び２）及び誘発された（レーン３及び４ ）、プラスミドｐＢＴＡ６４１を含むＥ、コリに−１，２細胞に由来するＰ、１ Ｍ−２の免疫学的検出。

ＩＩＥＩ　欠失変異体Δ６６−９８　（配列識別番号３）及びΔ７４−９６　（ 配列識別番号２）を創造するためにＦＡＩ−２内での特異的ヌクレオチド及びア ミノ酸変化。変更された領域は、６６−９８のために配列識別番号５ｉ７４−９ ６のために配列識別番号６に記載され；そして配列識別番号１８における天然の 配列と比較される。

１工皿　ｐＢＴＡＢ２９における欠失変異体Δ７４−９６を創造するために使用 される、オリゴヌクレオチドＡＩ（配列識別番号７）及びＡ２　（配列識別番号 ８）の配列。

１ｆｆｉ　欠失変異体Δ７４−９６を含むプラスミドｐＢＴＡ８２９の構成。（ 使用される略語：Ｂ、ＢｇＩＩＩ；Ｈ。

Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ　；　Ｐ　、Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　＋　Ｅ　、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　 ；　Ｐ　Ｌ　１バクテリオフアージλの左側のプロモーター；Ｔ１、バクテリオ ファージＴ、からのプロモーター；ＡＰ、耐アンピシリン遺転子、ＣＩＡＰ、ウ シ腸アルカリホスファターゼ）第工皿　ｕ−ＰＡ結合実験において検出されるＦ ＡＴ−２特異的バンド（第７図Ａ）及びウロキナーゼ特異的バンド（第７図Ｂ） の代表的な図。

“星１区　ｐＢＴＡ８４０における欠失変異体Δ６６−９８を創造するために使 用される、オリゴヌクレオチドＡ１３４／３０１（配列識別番号９Ｌ　Ａ１３４ ／３０４　（配列識別番号１０）及びＡ１３４／３０５　（配列識別番号１１） の配列。ＰＡＬ−２コード領域内でのオリゴヌクレオチドの位置は、添付する番 号により示される。塩基の番号付けは第１図における通りである。

オリゴヌクレオチドＡ１３４／３０１及びＡ１３４／３０５は、欠失される塩基 ２４４〜３４２を伴って、塩基２３５〜５４１のＰＡＩ−２コード領域を拡張す るＤＮＡフラグメントを生成するためにＰＣＲ反応に使用された。オリゴヌクレ オチドＡ１３４／３０４及びＳｐ６配列プライマーは、欠失される塩基２４４〜 ３４２を伴って、塩基４９〜３５１０ＰＡＩ−２コード領域を拡張するＤＮＡフ ラグメントを生成するためにＰＣＲ反応に使用された。オリゴヌクレオチドＡ１ ３４／３０１及びＳｐ６配列プライマーは、欠失される塩基２４４〜３４２を伴 って、塩基４９〜５４１のＰＡＩ−２コード領域を拡張するＤＮＡフラグメント を生成するために上記２種のＰＣＲ反応に使用された。

ｍ　欠失変異体、Δ６６−９８を含むプラスミドｐＢＴＡ８４０の構成。（使用 される略語：Ｂ、ＢｇｌＩ［；Ｅ。

ＥｃｏＲＩ　；Ｐ、　Ｐｓ　ｔ　Ｉ　；ＰＬ　、バクテリオファージλの左側の プロモーター；Ｓｐ６、バクテリオファージＳｐ６からのプロモーター；Ｔ７、 バクテリオファージＴ、からのプロモーター；Ａ１、耐アンピシリン遺転子；Ｃ ＩＡＰ、ウシ腸アルカリホスファターゼ、ＰＣＲ、ポリマラーゼ鎖反応）。

員土立皿　精製されたＦＡＩ−２Δ６６−９８の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＦＡＩ −２欠失突然変異体６６−９８の１２％ポリアクリルアミドゲル（ａ）及びウェ スターン（ｂ）（抗−ＦＡ　Ｉ−２ポリクロ一ナル抗体）。

１土上皿　Ｕ−ＰＡ、二本鎖ｔ−ＰＡ及び一本積ｔ−ＰＡによる結合実験におい て検出されるＦＡＩ−２特異的バンドの代表的な図。

日　るための　のピ 本発明の組換えＤＮＡ分子及び形質転換された宿主が分子生物学の標準技法を用 いて調製される。

本発明の変異体を、特定の宿主に適切な標準条件下で本発明の形質転換された宿 主を培養し、そして標準技法によりその培養物から変異体を分離することによっ て得る。その変異体は、ＦＡＩ−２への変化は、ＤＮＡの特定部位突然変異誘発 により又はＤＮＡ欠失又は挿入よる全体の再構成によりＦＡＩ−２の個々のアミ ノ酸を変性することによって行なわれ得る。これらの変化は、当業者によく知ら れている種々の方法で達成され〔たとえば“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”チャプター１５　”５ｉｔｅ −ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆｃｌｏｎｅｄ　ＤＮＡ’Ｊ 、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｙｓｃｈ、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ（版）１ ９８９；”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ”チャプター８”Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ 　ＤＮＡ’＾ｕｓｕｂｅｌ＋　Ｂｒｅｎｔ、　Ｋｉｎｇｓｔｏｎ＋Ｍｏｏｒｅ、 　Ｓｅｉｄｍａｎ、　Ｓｎ＋ｉｔｈ　ａｎｄ　５ｔｒｕｈｌ（版）１９８９　： ｌ　、そしてし１づれか所望する変化により遺伝子又は遺伝子セグメントを創造 するために、点挿入及び欠失突然変異誘発のためのオリゴヌクレオチド、ネステ イド突然変異のための変性オリゴヌクレオチド、長いオリゴヌクレオチドの組合 せの使用；欠失突然変異体を創造するためにＢａ１３１、ＤＮアーゼＩ又はエキ ソヌクレアーゼ■の使用：化学物質の使用及びポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の 使用を包含する。これらの技法は、ＦＡＩ−２変異体を生成するために、ＦＡＩ −２分子の６６−９８アミノ酸残基領域を変更するために使用され得る９次に、 生成されるＦＡＩ−２変異体は、例１及び２に記載される技法によりスクリーン され、３７ｋＤ形の不在により明らかであり、そして例１及び２に記載されるよ うにΔ６６−９８及びΔ７４−９６のためにＦＡＩ−２の生物学的活性の維持に ついて試験されるように、特定の変異体が、６６−９８のアミノ酸残基領域にお けるＦＡＩ−２のプロテアーゼ感受性を欠くかどうかが決定され得る。

本発明の組成物は、変異体並びに医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／ 又は賦形剤を医薬調製の標準の方法を用いて混合し、好ましくは均等に混合する ことによって調製される。

単一投与形を生成するために必要とされる変異体の量は、処理される条件、処理 される宿主及び投与の特定の態様に依存して異なるであろう。いづれかの特定の 患者のための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使用される変異体の活 性、年齢、体重、一般的な健康、性別及び患者の栄養状態、投与の時間、投与路 、排出の速度、薬物の組合せ及び処理下の条件の厳正さに依存するであろう。必 要とされる量は、標準の医薬技法に従って決定され得る。

組成物は、従来の非毒性で、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は 所望により賦形剤を含む単位投与配合で非経口投与され得る。

本発明の変異体の注射可能製剤、たとえば滅菌された注射可能な水性又は油性懸 濁液が、適切な分散及び湿潤剤及び懸濁剤を用いて当業界で知られている技法に より配合され得る。

滅菌された注射可能製剤はまた、たとえば１．３−ブタンジオールにおける溶液 として、非毒性非経口性許容希釈剤又は溶媒中、滅菌された注射可能溶液又は懸 濁液でもあり得る。

使用され得る許容できるビークル及び溶媒の中には、水、リンガ−溶液、及び等 張塩化ナトリウム溶液が存在する。さらに、滅菌された固定油が従来、溶媒又は 懸濁媒体として使用される。この目的のためには、いづれがの無刺激性固定油、 たとえば合成モノ−又はジグリセリドが使用され得る。さらに、脂肪酸、たとえ ばオレイン酸は、注射可能物の調製に使用され得る。

適切な投与システムが開発される場合、本発明の変異体を経口的に又は局所的に 投与することが可能であることが予測される。

抗体は、適切な宿主における標準の接種法を用いて発生せしめられる。宿主は、 本発明の変異体又は組成物により接種される。接種目的のために使用される組成 物は、アジュバン”トを含むことができる。

動物の接種のための適切なアジュバントは、油エマルジョン、たとえばＭａｒｃ ｏｌ　５２：Ｍｏｎｔａｎｉｄｏ　８８８（ＭａｒｃｏｌはＥｓ５ｏの商標であ り、Ｍｏｎ　ｔａｎ　ｉｄｅは５ＥＰＰＩＣ＋　Ｐａｒｉｓの商標である）、ス クアラン又はスクアレン、アジュバント６５（ビーナツツ油、マンニドモノオレ エート及びアルミニウムモノステアレートラ含む）、鉱物ゲル、たとえばアルミ ニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、カルシウムホスフェート及ヒ みょうばん、界面活性剤、たとえばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、 リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウシムブロミド、Ｎ、Ｎ−ジオ クタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン、 メトキシヘキサデシルグリセロール及びプルロニックポリオール、ポリアニオン 、たとえばビラン、デキス］・ランスルフェート、ポリアクリル酸及びカルボボ ール、ペプチド及びアミノ酸、たとえばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン 、タフトシン及びトレハロースジミコレートを包含するが、但しこれだけには限 定されない。本発明の変異体はまた、リポソーム又は他の微小キャリヤー中への 導入に続いて、又は多糖類、タンパク質又はポリマー−・の接合の後、投与され 得る。本発明に使用するために適切な他のアジュバントは、変異体並びに原核又 は真核生物起原の膜タンパク質、たとえばＴｒ　ａＴを含んで成る接合体を含む 。

投与のための路、投与される投与形及び注射の頻度は、当業者により最適化され 得るすべての要因である。典型的には、初めの接種後、数週間後、ｌ又は複数回 の追加免疫が行なわれ、その効果は、変異体に対する高い力価の抗体の生成であ る。

本発明の変異体に対するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体生成のため の標準技法を用いて調製され得る。

抗体組成物は、抗体並びに医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦 形剤を医薬調製の標準方法を用いて混合し、好ましくは均質混合することによっ て調製される。

ヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準方法を用いて混合し、好ましく は均質混合することによって調製される。

接合体は、接合体合成のための標準技法を用いて調製される。接合体は、細胞毒 性薬物に結合される本発明のＰＡＩ−２変異体を供給するために、必要な場合、 結合剤を用いて化学的に又は組換えＤＮＡ技法により調製される。

単一投与形を調製するために必要とされる接合体の量は、処理される条件、処理 される宿主及び投与の特定の態様に依存して異なるであろうゆいづれか特定の患 者のための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使用される接合体の活性 、年齢、体重、一般的な健康、性別及び患者の栄養状態、投与の時間、投与の経 路、排出の速度、薬物の組合せ、及び処理下の条件の厳正さに依存するであろう 。使用される量は、標準の医薬技法により決定され得る。

接合体組成物は、従来の非毒性で、医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び ／又は所望により賦形剤を含む単位投与配合で非経口投与される。

診断キットは、適切な濃度での抗体並びに医薬的に許容できるキャリヤー、希釈 剤及び／又は賦形剤を配合することによって調製される。本発明の既知濃度の変 異体の陽性対照は同様にして調製される。陰性対照は、キャリヤー、希釈剤及び ／又は賦形剤のみを含んで成る。診断キットの例は、腫瘍診断を包含し、ここで 試薬は、本発明の抗体を含んで成り、そして陽性対照は本発明の変異体を含んで 成る。

ブｊｊ辷Ｉ　Ｆ 本研究に使用される種々のプラスミドは、ｐＢＴＡ４３Ｂに由来した。プラスミ ドｐＢＴＡ４３Ｂは、ｐＵｃ１８にクローンされたＦＡＩ−２をコードする１、 ６Ｋｂのｃ　ＤＮＡから成るＣ’１ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ星ｅ、Ｇｅｎｅ 　３３　：　１０３〜１１９　（１９８５））。

ｐＢＴＡ４３Ｂを用いて、Ｅ、コリ株Ｊ　Ｍ　１０９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅ ｒｒｏｎｆｌｅ、Ｇｅｎｅ　３３　：　１０３〜１１９（１９８））を形質転換 し、株ＢＴＡ１４４５を生成し、これを、１９８７年２月１１日、寄託番号第５ ３５８５号としてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１−ｅ ｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｕｉｌｌ ｅ、ＭＤ　２０８５２　、ＵＳＡに寄託した。

プラスミドＰＢＴＡ６４１を、次のようにしてｐＢＴＡ４３８から誘導すること ができる。ｐＢＴＡ４３８を、Ｘｈ。

■及びＤｒａｌにより部分消化し、そして１５５０ｂｐのフラグメントを単離し 、そしてＢｇｌｎ及びＳｍａ　Ｉにより切断されたベクターｐＬＫ５８に連結す る。得られたプラスミドｐＢＴＡ４４６をＢｇｌＩＩにより線状化し、そして配 列ＧＡＴＣＴ（Ｎ）　ｌ　＆ＡＴＧＧＡＧ　（配列識別番号１２）（Ｎはいづれ かのヌクレオチドを表わす）を有し、細菌リポソーム結合部位及び天然のＰＡＩ −２遺伝子の初期ヌクレオチドを含む合成二本鎖の２７マーのオリゴヌクレオチ ドに連結し、プラスミドｐＢＴへ６４１を性成する。プラスミドｐＥＴＡ４４７ はｐＢＴＡ６４１と同一であるが、但し、配列ＧＡＴＣＴ（Ｎ）＋５ＡＴＧＧＡ Ｇ　（配列識別番号１３）を有する細菌リポソーム結合部位を含む２６マーのオ リゴヌクレオチドが前記２７マーの代わりに使用された。

プラスミドｐＭＩＮｓ７１を次のようにして誘導した＝ｐＢＴＡ６４１からのＢ ｇ　ｌ　ＩＩ−Ｅｃ　ｏＲＩのＰＡＴ−２遺伝子フラグメントを、ＢｇｌＩ［／ ＥｃｏＲ１部位でｐＳｐ？２　（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に挿入し；２７ベクターか らのＢｇＩＩＩ−３ａｃｌのＰＡ　Ｔ−２遺伝子フラグメントを、付着Ｈｊｎｄ ］ＩＩ−ＢｇｌＩＩ末端を有する合成アダプターによる三段階連結でｐＧＥＭ４ Ｚ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩ［Ｉ／５ａｃ１部位に挿入し、ｐＭＩＭｓ ７１を得た。

ヱｌ史上 Ａ、ＦＡＩ−２の ｐＢＴＡ４４７及びｐＢＴＡ６４１を含む、誘発された（４２°Ｃでの細胞のイ ンキュベーションにより）及び誘発されていない（３０”Ｃでのインキュベーシ ョン）Ｅ、コリに一１２宿主細胞の細胞抽出物を、ヒ）ＦＡＩ−２に対する親和 性精製モノクローナル（Ｂｉｏｐｏｏｌ）又はポリクローナル抗体を用いてＰＡ Ｌ−２の存在についてスクリーンした。

ウロキナーゼ−ＦＡＩ−２複合体の形成を特徴とする生物学的活性を、ウロキナ ーゼの存在下で電気泳動移動度のシフトにより評価した。第３図に示されるよう に、ヒト胎盤インヒビターに対するモノクローナル抗体及び沃素化されたプロテ ィンＡを用いてウェスターントランスファーにより可視化されたＦＡＩ−２タン パク質バンド（Ｍ　ｒ　４６ｋＤ）が、誘発された（４２℃）サンプルに存在す る。低分子量（Ｍｒ３７゜０００）の免疫学的に交差反応するタンパク質バンド がまた観察され、それはＦＡＩ−２分子の可能性あるタンパク質分解性切断を示 す。

プラスミドｐＢＴＡ４４７を有するＥ、コリに一１２細胞を、１０！の発酵器に おいて３８°Ｃで２４時間、熱誘発し、そして次に細胞を、１７，０００Ｘｇで ２０分間の遠心分離により回収した。合計５２４ｇの湿量の細胞を、発酵ブイヨ ン８ｉから回収した。

細胞（５２４ｇ）を、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＰＭＳＦを４°Ｃで含むＯ ，ＩＭのＮａホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）溶液１５００ｄ中に懸濁し、そ して８０００ｐｓｉでＭａｒｔｉｎ−Ｇａｕｌｉｎプレスを通しての４回の通過 により溶解した。このプレスを上記緩衝液３００−により洗浄し、そして溶解物 及び洗浄液を組合した。この溶液に、ＭｇＣ＋□を添加し、２１１１Ｍの最終濃 度にし、そしてその溶液を１７，７００Ｘｇで６０分間、遠心分離した。この遠 心分離から得られる上清液（１６００ｄ）を、３０，１１００Ｘで６０分間、再 遠心分離し、残る不溶性物質を除去し、そして上清液を回収した。

この上清液（１５’７０ｄ）に、固体硫酸アンモニウム５７４．６ｇを添加し、 ６０％飽和溶液を得、その溶液を１５分間撹拌し、そして次に、３０，０００Ｘ ｇで３０分間、遠心分離した。ＦＡＩ−２を含む、その得られたペレットを８当 分し、そして−２０°Ｃで貯蔵した。

（ｉｉ）ＤＥＡＥ−３ｅ　ｈａｃｅｌり０７トグ一フイー〇〜６０％の硫酸アン モニウム沈殿物の１７８アリコートを、１ｒａＭのＥＤＴＡ及び０．１ＭのＤＴ Ｔを含む０．１ＭのＮａホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）２００ｄに溶解し、 そして３７°Ｃで９０分間インキュベートした。次にこの溶液を、１ｍＭのＥＤ ＴＡ及び０．０５％の２−メルカプトエタノールを含む０．１ＭのＮａホスフェ ート緩衝液（ｐＨ７，０）により５００ｄに希釈し、そして同じ緩衝液に対して ４°Ｃで４８時間、透析した。次にその透析された溶液を、上記緩衝液で平衡化 されたＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｃｅ　１カラム（４，４Ｃ１１１Ｘ１０ＣＩ１１） に通用し、そして２８０ｎａ＋での吸光度が底線に戻るまで、溶出した。同じ緩 衝液におけるＯ〜０．５ＭのＮａＣ１の２２の線状グラジェントを通用し、そし てカラムを２ｍ／分の流速で溶出した。１０１ＲＩｌの両分を集め、そして２０ ０４のアリコートを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてウェスターン分析し た。ＦＡＩ−２を、これらの条件下で、５８ｍＭ〜８１ｍＭのＮａＣ］の間で溶 出し、そしてこれらの両分をプールし、そして０．０５％の２−メルカプトエタ ノールを含むＩＩＩＩＭのＮａホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）に対して４° Ｃで４８時間透析した。

（ｉｉｉ）ヒドロキシ１１丁　りロマトグーフイー前段階からの透析されたＦＡ Ｔ−２を、０．０５％の２−メルカブトエタノールを含むＩＩＩＩＭのＮａホス フェート緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化されたＢｉｏｇｅｌ　ＨＰＴの３．２ｃ ｍＸ１５ｃｍカラムに適用し、そしてそのカラムを同じ緩衝液により、２８０ｎ ｍでの吸光度が底線に戻るまで、洗浄した。

１ｍＭ〜２００ｍＭのＮａホスフェートの１１の線状グラジェントを適用し、そ してカラムをｌｄ／分の流速で溶出した。６戚の両分を集めた。カラムから溶出 するＦＡＩ−２を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンプロットを用いて検出し、 そして還元条件下で、２つの明確な免疫学的に交差反応するタンパク質バンドを 示した。これらのＰ、ｌ−２の２種の形の分子量は、約４６ｋＤ及び約３７ｋＤ であった。

（ｉｖ）Ｊ　“　クロマトグーフィー Ｐ、ｌ−２のこれらの２種の形を分解するために、ＦＡＩ−２を含むＢｔｏｇｅ ｌ　ＨＰＴカラムからのアリコートを、０．１％ＴＦＡ中、アセトニトリルのグ ラジェントを用いてＶｙｄａｃ　Ｃ４ＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフィー処 理した。このクロマトグラフィーは２つの主要ピークを示し、非還元性５ＤＳ− ＰＡＧＥにより決定される場合、前者はＦＡＩ−２の３７ｋＤ形を含み、そして 後者はＦＡＩ−２の４６ｋＤ形を含む。ＦＡＩ−２の約３７ｋＤ形のアミノ酸配 列は、配列−Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌ ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＧｉｎＡｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　（配列識別番号 １４）を示した。

この配列は、ＦＡＩ−２の成熟形の残基８７で出発するＦＡＩ−２の形に対応し 、そしてグルタミン８６−リシン８７　（Ｑ８６−に８７）ペプチド結合はタン パク質分解に対してひじょうに敏威であることを示唆する。約３７ｋＤの類僚す る免疫学的交差反応性形がまた、Ｕ９３７細胞からの天然に存在するＦＡＩ−２ の精製の間；観察され、Ｑ８６−に８７ペプチド結合でのタンパク質分解性切断 が哺乳類及び細菌細胞の両者で生じることを示唆し、そしてこの結合がひじょう に不安定である概念を支持する。

Ｃ，３７ｋＤ乏の　！ プラスミドｐＢＴＡ６４１を有する旦−Ｕ細胞を、１０１の発酵器において３８ ℃で２４時間、熱誘発し、そして次に細胞を、１７．ＯＯＯＸｇで２０分間の遠 心分離により回収した。

（ｉ）鳳ｌ望麗 この発酵５１から得られた細胞ペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｗＭのε− アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）及び１０１の２−メルカプトエタノールを含む ５０５ＭのＮａホスフェート緩衝液（ｐＨ６，６）８００ｍに懸濁し、そして９ ０００ｐｓｉでＭａｒｔ　１ｎ−Ｇａｕｌ　ｉｎ１５ＭＲホモジナイザーを通し ての６回の通過により溶解した。この得られた溶解物（９００ｍ）に、ＭｇＣ１ □を添加し、２ｍＭにし、そしてそ”の懸濁液を１７，７００Ｘｇで１時間、４ ℃で遠心分解した。

（ｉｉ　）硫　アンモニウム゛ 上記遠心分離からの上清液に、固体硫酸アンモニウムを添加し、３０％飽和溶液 を得た。その溶液を４℃で３０分間撹拌し、そして次に、沈殿物を、１７，７０ ０Ｘｇで１時間、４°Ｃでの遠心分離により除いた。上清液（７６０ｄ）を、追 加の固体硫酸アンモニウムの添加により５０％飽和に調整し、そして４°Ｃで３ ０分間の撹拌に続いて、その上清液を１７，７００×ｇで１時間、４°Ｃで遠心 分離した。この沈殿段階から回収されたペレットを、緩衝液Ｂ（５０＋ｎＭのク エン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのｔ−ＡＣＡ及び１０ｍＭの２ −メルカプトエタノール、ｐ）１５．５）に溶解し、２００滅の最終体積を得た 。次に、この溶液を、４℃で一晩、緩衝液８２０体積に対して透析した。

（ｉｉｉ）；−王、三ノｌ、−ｔ−７二Ｌ」し：≦乙じ乙正し！−ト３６ラーフ イー透析された溶液を、硫酸アンモニウム中でＩＭにし、そしてそのサンプル（ ２８６ｄ）を、緩衝液Ａ（これはＩＭの硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂである ）で平衡化されたフェニルセファロースカラム（５ｃｍＸ１９ｃｍ；Ｖｔ＝３７ ３ｄ）に、１００ｄ／時の流速で適用した。サンプルの負荷に続いて、カラムを 、２８　Ｏｒ＋ｍ　（Ａ２８０）での吸光度が底線に戻るまで、緩衝液Ａにより 洗浄し、そして次に、８００成の緩衝液Ａ〜８００ｄの緩衝液Ｂの線状グラジェ ントを適用した。

１０戚の両分を集めた。グラジェントの完結後、カラムを５０ｍＭのグリシン（ ｐＨ９，０）により、Ａｚｓ。が底線に戻るまで洗浄した。Ｃｏｌｅｍａｎ　ａ ｎｄ　Ｇｒｅｅｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ８０：４０８ 〜４１．８　、１９８１）のウロキナーゼ阻害により及び免疫学的ドツトプロッ トアッセイにより決定されるように、ＰＡｌ−２を両分７５〜１５０に溶出した 。これらの両分をプールしく８５０ｄ）、そして硫酸アンモニウムの添加により ６０％飽和にし、沈殿せしめた。ペレットを、１７，７００×ｇで３０分間、４ °Ｃでの遠心分離により回収し、そして緩衝液Ｃ（２５＋＋＋Ｍの硼酸ナトリウ ム、ＩＯＩＭのＥＤＴＡ、ＩＣ１５Ｍのε−ＡＣＡ、１０＋ａＭの２−メルカプ トエタノール、ｐＨ９，０）に溶解した。

（ｉｖ）Ｓｅ　ｈａｃｒ　ｌ　３２００クロマトグーフイーＦＡＩ−２を含む溶 液（２５ｄ）を、緩衝液Ｃで平衡化された５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００カラム （３，３Ｃ１１１Ｘ９５ｃｍ）に適用し、そして４０ＩＲ１／時の流速で溶出し た。６戚の両分を集め、そしてウロキナーゼ阻害、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びドツト プロットアッセイにおける免疫学的交差反応性によりＦＡＩ−２について分析し た。、ＦＡＩ−２を含む画分（画分５２−９０）をプールし、そして６０％飽和 硫酸アンモニウムにより沈殿せしめた。ペレットを、１７，７００×ｇで３０分 間、４°Ｃでの遠心分離により回収し、そして緩衝液Ａに再溶解した。この溶液 のｐｌ’［をＭＣＩにより５．５に調整し、そして進行した沈殿物を、１７，７ ００Ｘｇで３０分間、４°Ｃでの遠心分離により除去した。

（ｖ）２０　のフェニルセフ　ロースクロマトグーフィー上滑液ヲフェニルセル ファロースカラム（５ａｎｘｌＯｃｍ）に６０ｒ！１１／時の流速で通用した。

負荷の後、カラムを緩衝液Ａにより洗浄し、そして次に、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ の線状グラジェントを、上記（ｉｊ）に記載されるようにして通用した。グラジ ェントの完結後、カラムを、５０１のグリシン（ｐＨ９）により洗浄し、そして ＦＡＩ−２を含む両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンプロットにより同定 した。

ＦＡＩ−２を含む画分１５−２７をプールし、６０％硫酸アンモニウムにより沈 殿せしめ、そして緩衝液Ｃ１５１ｄ！に再溶解した。

（ｖｉ）２０　のＳｅ　ｈａｃｒ　Ｉ　３２００クロマトグ一上記２回目のフェ ニルセファロースカラムからのＰＡＩ−２含有サンプルを、緩衝液Ｃにより平衡 化された５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００カラム（２，、５ａｉＸ　９５Ｃ１＋） に適用し、そして３０ｄ／時の流速で溶出した。２．６−の画分を集め、そして ５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＦＡＩ−２について分析した。

（Ｖｉ）’　ＨＰＬＣｌ ２回目の５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００カラムからの両分の５ＤＳ−ＰＡＧＥは 、２−メルカプトエタノールの存在下で電気泳動される場合、約４６ｋｆ＋及び ３７ｋＤの分子量を有する２種のタンパク質の存在を示した。これらのタンパク 質のバンドは、“Ｂ、３７ｋＤ形の精製”で観察されたバンドに類似する。これ らの２種の形を分解するために、上記２回目の５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００カ ラムからの百分１０６のアリコート９０ｕ１を、０．１％のＴＦＡ中、アセトニ トリルのグラジェントを用いて、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上でクロ マトグラフィー処理した。このカラムから溶離される主要吸光度ピークの前縁は 主に３７ｋＤのタンパク質を含んだ。この両分のアミノ酸配列は、アミノ酸残基 ８１で出発するＦＡＴ−２の配列に相当するＦＭＱＱＩＱＫＧＳＹ（Ｐｈｅ　Ｍ ｅｔ　ＧｉｎＧｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　：配 列識別番号１５）のＮ−末端配列を示した。従って、このＦＡＩ−２の形は、グ リシン８０−フェニルアラニン８１結合でＦＡＩ−２の成熟形のタンパク質分解 から生じたことが結論づけられた。

この方法によりＥ　コリ中に過剰発現されたＦＡＩ−２の精製及び特に、リジン 特異的プロテアーゼのインヒビターとしてのε−ＡＣＡの包含は、Ｇ８６−に８ ７結合で切断からＦＡＩ−２を保護するが、しかしこの部位の上流でのたった６ 個のアミノ酸領域で切断からそれを保護しない観察は、その分子のこの領域がプ ロテアーゼ切断に対してひじょうに敏感である観点を強化する。

Ｄ・−影ユ遅」包１１袈 上記で観察されるタンパク質分解が他の宿主ムこおける発現より妨げられるかい づれかを決定するために、ＦＡＩ−２！バクユロウイルス昆虫細胞系において過 剰発現せしめた（Ｌｕｃｋｎｏｗ　ａｎｄ　Ｓｕｍａ＋ｅｒｓＪｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　６　：　４７〜５５　ｒ　１９８８）　ｅ発現された生成物を、段 階（ｉ）〜（ｉｖ）を用いて１．゛ｃ。

３ＶｋＤ形の精製”に記載されているようにして実質的に精製した。但し、（ｉ ｉ）における５０％硫酸アンモニウム沈殿段階が排除された。５ｅｐｈａｃｒｙ ｌ　Ｓ−２００カラムが”ら溶出するＦＡＩ−２を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ及びウェスターンプロットにより検出した。この分析は、ＰＡｌ−２の４６ ｋＤ及び３７ｋＤ形の両者の存在を示し、これは前で観察されたように、分子の タンパク質分解が生じることを示唆する。この切断の部位をさらに定義するため に、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００クロマトグラフイ一段階から得られたＦＡ Ｉ−２プールを、２０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｔｍＭの２ −メルカプトエタノール（ｐ）１９．　Ｏ）溶液に対して透析し、そして次に、 そのサンプル（３０ｄ）を、Ｑ−セファ０−スカラム（０，９ｃｍＸ２４ｃｉｉ ）に６０−７時の流速で適用した。二〇カラムから阻止されないで溶出され及び ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＰＡＩ−２は、Ｍｒ約３７ｋＤ及び約４６ｋＤの２種の クーマシーブリリアントブルー染色ハンドを示した。この物質のアリコートのＮ −末端アミノ酸配列は、下記に示されるように一本の配列を示した：　ＧＦＭＱ ＱＴＱＫＧＳＹＤＤＡＩ（すなわちＧｌｙ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉ ｌｅ　：配列識別番号１６）。十分な長さのＦＡＩ−２のための確実なＮ−末端 配列は観察されず、これは、昆虫細胞に発現される場合、ＦＡＴ−２の４６ｋＤ 形がブロックされたＮ−末端を含むことを示唆する。類似する結果が、、Ｕ９３ ７細胞（Ｋｒｕｉｔｈｏｆ２．Ｂ’、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２１６：１１２ ０７〜１１２１３　．１９８６）及び胎盤Ａｎｄｒｅａｓｅｎ星（！：”　、　 ２６１　：　７６４４〜７６５１１９８６）から単離された十分な長さのＰＡＩ −２に関して観察された。その観察された配列は、システィン７９とグリシン８ ０との間に生じるタンパク質分解に適合し、Ｇ３０−Ｆ８１切断部位からの上流 のたった１つのペプチド結合が、“０゜３７ｋＤ形の精製”においてＥ、コリか ら精製されるＦＡＩ−２に関して観察された。

これらの結果は、ＦＡＴ−２分子のこの領域のタンパク質分解敏感性の高い程度 をさらに確証する。

Ｅ、ＦＡＴ−２のに８７Ａパ　の　ｌ アミノ酸残基８７がＬｙｓからＡｌａに変えられた変異体ＰＡ１−２の創造と、 ＦＡＩ−２コード領域からファージＭ１３ベクターｍｐ１８にトランスファーし た後、特定部位突然変異誘発により達成した。一本積ファージＤＮＡの調製及び 使用、並びに突然変異誘発された配列を含む２つのオリゴヌクレオチド［（５’ 　−ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＣＣＴ −３’（配列識別番号１７）、配列識別番号１７の５　’　−ＡＧＧ　ＡＴＡＡ ＣＴ　ＡＣＣＴＧＣＣＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ−３’補体）〕の使用を、 前に記載のように行なった（Ａｍｅｚｓｈａｍ：オリゴヌクレオチド指図のイン ビトロ突然変異誘発システム）。

ＦＡＩ−２のに８７Ａ変異体を、プラスミドｐ　ＢＴＡ６７４を有する旦−ユＪ Ｋ−１２細胞のＩ！！、培養物から精製した。

このプラスミドは、ｐＢＴＡ６４１と同一であるが１．シかしＦＡＩ−２ＤＮＡ がＦＡＩ−２の変異体形により置換されている。

精製を、“Ｃ１３７ｋＤ形の精製”、段階（ｉ）　〜（ｉｖ）に記載されるよう にして実質的に行なったが、但し、段階（ｉｉ　）における５０％硫酸アンモニ ウム沈殿が排除された。還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンプロットによる 、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラムから溶出される画分の分析は、ＦＡＴ −２の４６ｋＤ及び３７ｋＤの両者の存在を示し、これは、リシン８７からアラ ニン残基への突然変異誘発が、敏感なプロテアーゼとして前で同定された領域に おけるＦＡＩ−２分子の切断を妨害するのに失敗したことを示唆する（８．３７ ｋＤ形の精製を参照のこと）。

ス１１１上 ブローアーゼ感　ｔｌｌｌの１、 ＦＡＩ−２中のプロテアーゼ感受性部位を含むＨｉｎｆｌ−Ｐｓｔｌセグメント を、Ｈｉｎｆ　ＩおよびＰｓｔｌ粘着末端を有する合成オリゴヌクレオチド（図 ５参照）により置き換え、アミノ酸７４〜９６（７４と９４を含む）が除去され た変異体ＦＡＩ−２を作製した。この欠失変異体の作製に含まれる出来事を図６ に記載する。本質的には、ｐＢＴＡ６４１からのＢｇｌｌｌ−）（ｉｎｆｌ断片 、ｐＭＩＮｓ７１がらのＰｓｔｌ−Ｂｇｌｎ断片、およびアニーリングしたオリ ゴヌクレオチドＡｌ（配列番号７）とＡ２　（配列番号７）の間の三部連結によ り中間ベクター中に欠失変異体を構築せしめた。

構築された欠失ＰＡＩ−２を中間ベクターから切り出し、そしてｐＢＴＡ６４１ 中の生体のＰＡＩ−２と交換してｐＢＴＡ８２９を作製した。

オリゴヌクレオチド（図５の配列番号７と８）をＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ ｅ＊ｓのＤＮＡ合成装置（モデル３８０Ａ）上で合成し、ポリアクリルアミドゲ ルから精製した。相補性オリゴヌクレオチド（Ａ１：配列番号７およびＡ２：配 列番号８）を１＝１０モル比で混合し、５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を使って６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０＋ｎＭＭｇＣ１□、５ ｍ１Ｍ　ジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ中でリン酸化した。混合物を６５° Ｃで１０分間加熱し、次いで室温までゆっくり冷却してアニーリングさせた。次 のようにして種々の制限断片を調製した。精製プラスミドＤＮＡの制限酵素消化 は製造業者により推奨される緩衝液中で行った。

Ｔｒｉｓ−酢酸塩緩衝液中の０．８−１．５％５ｅａ−ＰＩａｑｕｅ　アガロー ス（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａｔ　１ｏｎ）上でのゲル電気泳動によりプラスミドか ら必要なりＮＡ断片を分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。臭化エチジ ウムでの染色およびＵＶ照射により断片を可視化した。適当な断片を含むアガロ ースのバンドをゲルから切り取り、６５℃で融解し、そしてＤＮＡをフェノール ／クロロホルム／イソアミルアルコールで３回抽出した。次いでエタノールでＤ ＮＡを沈澱させた。

ベクターは典型的には次のように調製した。プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素 で消化し、消化物を同容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール で抽出し、そして２，５容のエタノールでＤＮＡを沈澱させた。消化したＤＮＡ を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ）１９．ＯｌｌｄＭｇＣ１ｚ　、０．１ｍＭ 　ＺｎＣ１ｇ　、１ｍＭスペルミジン中に一再懸濁し、１〜２単位の子ウシ腸ア ルカリホズファターゼ（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に３７ ℃にて３０〜６０分間インキュベートした。酵素を７０℃で１５分分間率活性化 し、次いでＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し 、そしてエタノールで沈澱させた。

連結は次のようにして行った。ベクターと挿入ＤＮＡとを１＝１〜１：５（挿入 断片が１００ｂｐより小さい場合には１：１０）のモル比で２０ｉの容量の１ｍ Ｍ　ＡＴＰ、１０ｍＭ７．５中に混合した。０．１〜１単位のＴ４ＤＮＡリガー ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｒａ）を用いて１６°Ｃにて一晩連 結を行った。コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌユ）Ｋ２宿主（Ｈａｎａｈａｎ＋ Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏ１．１６６：５５７−５８０．１９８３）中への形質転換用に 連結混合物から５〜１０ｉｚ１を取った。１００ｇ／−のアンピシリンを含むト リプトン−大豆寒天プレート上へ塗布することにより、形質転換体を選択した。

個々のコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限分析により正しい組換えプ ラスミドを同定した。欠失が作られたＦＡＩ−２遺伝子の領域を配列決定し、変 化を確かめた。配列決定は、取扱い説明書に記載されたようにして５ｅｑｕｅｎ ａｓｅＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＵＳＢ）を使って二本鎖プラス ミドＤＮＡ上で行った。使用したプライマーはＴ７プライマー（Ｐｒ。

ｍｅｇａ）であった。

および ベクターｐＬＫ５８中のラムダＰＬプロモーターの支配下にＦＡＩ−２の完全コ ード配列および欠失変異体を配置し、ＡＴＣの上流の合成オリゴヌクレオチドは 該開始コドンから適当な距離のところに細菌性リポソーム結合部位を提供し、生 来のＰＡＩ−２配列をコードするプラスミドｐＢＴＡ６４１と欠失変異体Δ７４ −９６をコードするプラスミドｐＢＴＡ８２９を得た。

それらのプラスミドを用いて、ラムダの熱不安定性リプレッサーｃ１８５７を含 む大腸菌に一１２ΔＨＩΔｔｒｐを形質転換せしめた。形質転換細胞をＴＳＢ培 地（Ｏｘｏｉｄ）中で２８°Ｃにて一晩増殖させた。次いで細胞をＭＥＭ培地（ ｒｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８２　：　８８ −９２　、１９８５）中に希釈し、１．０のＯＤ６．、まで２８°Ｃにて一晩増 殖させ、予め温めた（４８°Ｃ）ＭＥＭ培地を同体積添加し温度を３８゛Ｃに平 衡化した。３８゛Ｃで４時間増殖させた後、８０００Ｘｇでの１５分間の遠心に より細胞を収得した。細胞ベレントをＢｅｈｓ緩衝液（１０ｍＭｐ−クロロ水銀 安息香酸、１０ｍＭＥＤＴＡ　（Ｎａ）　２．１０ｍＭ　１　、１０−ツェナチ オリン、１００ｍＭ　リン酸塩、ｐＨ７，０）中に再懸濁し、そして１６．００ ０ｐｓｉでのフレンチプレスへの２回の通過（氷上）により溶解せしめた。溶解 細胞からの上清を８０００Ｘｇでの１５分間の遠心により清澄化し、そしてヒ） ＦＡＩ−２に対するアフィニティー精製モノクローナル抗体（Ｂ　ｉ　ｏ　ｐ　 。

ｏｌ）またはポリクローナル抗体を使って、ＦＡＩ−２の存在について試験した 。後述のようにして、ウロキナーゼ−ＦＡＴ−２の形成の特徴を示すウロキナー ゼの存在下での電気泳動移動度のシフトにより、生物活性を評価した。

−東二ヱ込Ｊｌ笈狂 ウロキナーゼに結合する前記ＦＡＩ−２欠失変異体の能力を、ウロキナーゼ結合 実験において測定した。Δ７４−９６変異体は生来のＦＡＩ−２に比較してかな り変わった分子であるので、変異体が生物活性を有するか否かを予測することは 不可能である。生来の（即ちｐＢＴＡ６４１から発現されるもの）もしくはＡ７ ４−９６変異体（即ちｐＢＴＡ８２９から発現されるもの）を発現する溶解細胞 、または全＜ＰＡＩ−２を発現しない細胞（即ちｐＢＴＡ８３６を含む細胞）か らの透明な上清に、ウロキナーゼ（ＬＭＷ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏ −ｓｔｉｃａ）を添加した。負の対照として、ウロキナーゼを添加しない溶解物 を使った。プラスミドｐＢＴＡ８３６は、Ｂｇｌ■およびＥｃｏＲＩでの消化に よりＦＡＩ−２を切除し、次にフレノウ酵素を使ったフィルイン反応および連結 反応によりＦＡＩ−２遺伝子を欠くプラスミドを再形成することからｐＢＴＡ６ ４１から誘導した。

室温で９０分間反応を進行させた。次いでＳＤＳおよび２−メルカプトエタノー ルを含む緩衝液を添加した後、試料を３分間無沸し、そしてＦＡＩ−２に対する ヤギポリクローナル抗体（図７Ａ）またはウロキナーゼに対するウサギポリクロ ーナル抗体（図７Ｂ）のいずれか一方を使って、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェス タンブロッティングにより分析した。

第一抗体に対して向けられた第二抗体−ＨＲＰ接合体を使って、結合した抗体を 検出した。

図７はそのような実験の結果を示す。生来のまたはΔ７４−９６変異体のＰＡＩ −２を含む溶解物へのウロキナーゼの添加は、ＦＡＩ−２に対して向けられたポ リクローナル抗体（図７Ａ、レーンＣおよびｅ）またはウロキナーゼに対して向 けられたポリクローナル抗体（図７Ｂ、レーンＣおよびｅ）と反応する約６９ｋ ＤのＳＤＳ安定性複合体の形成をもたらした。ウロキナーゼの不在下、またはＦ ＡＩ−２を欠く細胞溶解物においては、Ｐ、ｌ−２に対する抗体（図７Ａ、レー ンｂ、ａ、ｒ、ｇ）またはウロキナーゼに対する抗体（図７Ｂ。

レーンｂ、ｄ、ｆ、ｇ）を使って、そのような複合体は検出できなかった。それ らの結果はウロキナーゼ−ＦＡＩ−２複合体の形成に特有であり、生来のＰＡＩ −２と変異Δ７４−９６ＰＡｌ−２の両方がウロキナーゼを結合することができ 、よって両者が生物活性を有することを示す。

ンバク　′ｎ感　の、土 生来のＰＡＩ−２（即ちｐＢＴＡ６４１由来）を発現する大腸菌細胞において、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ般よびウェスタン移行後にＦＡＩ−２特異抗体により検出され た主要生産物は、生来のＦＡＴ−２を表す４６ｋＤ形、および分解産物を表す３ ７ｋＤ形である（図３、レーン３および４；図７Ａ、レーンｂ）。特異Δ７４− ９６ＦＡＩ−２（即ちｐＢＴＡ８２９由来）を発現する細胞においては、３７ｋ Ｄの分解産物は検出できなかった（図７Ａ、レーンｄ）、それらの結果は、変異 体Δ７４−９６Ｐ、ｌ−２が生来のＰＡＩ−２のタンパク質分解感受性を有さな いことを示す。

裏層■又 プロテアーゼ感　）の オーバーラツプ伸長による部位特異的突然変異誘発のポリメラーゼチェーン反応 （ＰＣＲ）技術（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ７７　：　５１−５９　、１９８９）を使っ て、ＦＡＩ−２コード領域から、アミノ酸６６−９８　（６６と９８を含む）を コードするＤＮＡ配列を除去した。ＰＣＲ反応において使用したオリゴヌクレオ チドは図８に示され（配列番号９．１０および１１）、そしてこの欠失変異体の 作製の概略を図９に示す。

簡単に言えば、ＰＣＲ反応において使用した中間ベクターにＰ、ｌ−２ＤＮＡを 移行し、アミノ酸６６−９８　（６６と９８を含む）をコードする配列が除去さ れているＢｇｌＩＩ／Ｐｓｔｌ断片を作製した。ＰＣＲ生成りｇｌＩ［／Ｐｓｔ ｌ断片を中間ベクター中の生来の断片と交換し、そして独立した５つの形質転換 体からの全Ｂｇ　］　ＩＩ／Ｐｓ　ｔ　１６１域を配列決定した。生来のＰＡＩ −２との唯一の相違がアミノ酸６６−９８（６６と９８を含む）をコードする配 列の欠失であるそれらの形質転換体のうちの１つから、ＦＡＩ−２ＤＮＡを回収 し、そしてベクターｐＬＫ５８中に連結せしめ、ｐＢＴＡ８４０を作製した。

オリゴヌクレオチド（図８＝配列番号９，１０および１１）をＡｐｐｌｉｅｄ　 ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置（モデル３ＢＯＡ）上で合成し、トリチ ル基を残しておき、製造業者の教示に従ってオリゴヌクレオチド精製カートリッ ジ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅｍｓ、カタログ番号４００７７１）上 で精製した。１つのオリゴＳｐ６プライマーはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。

ＰＣＲ反応は、１００ピコモルのオリゴヌクレオチドおよび０．３５ピコモルの ＥＣ０ＲＩ線状化ＦＡＩ−２プラスミドを使って、５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ 　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１ｐＨ８，３，１，５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌｚ　、０．０１％ （Ｖ／Ｖ）ゼラチン、２００禮　ｄＮＴＰ、２．５Ｕ　ａｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）中で実施した。

１分間の変性（９４°Ｃ）、１分間のアニーリング（５０°Ｃ）および１分間の 伸長（７４°Ｃ）を伴う２５サイクルに設定されたＧｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ　 （Ｔｎｎｏｖｏｎｉｃｓ）上でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を５ｅｐｈａ ｃｒｙｌＳ−２００カラム上で、またはＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、１９８２）中での１．５％５ｅａ−ｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣＣｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上でのゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色、Ｕ■照 射による可視化、および製造業者の教示に従ったＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）上で のアガロースゲル切片からの精製により精製した。

他の必要なりＮＡ断片は、０．８−１．５％の５ｅａ−ｐｌａｑｕｅアガロース 上でのゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡから分離し、そしてＰＣＲ生成物に ついて上述したようにして精製した。

ベクターは典型的には次のようにして調製した。プラスミドＤＮＡを適当な制限 酵素で３７°Ｃにて１〜２時間消化した。

制限消化物に子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、１〜２単位）を直接添加し、３７°Ｃにて１時間インキュ ベーションを続けた。

成る場合、平滑末端または、３′突出末端を生じる制限酵素を使用する時、ＣＩ ＡＰとのインキュベーションを３７°Ｃで３０分間そして５０°Ｃで３０分間行 った。ＣＩＡＰ酵素を７０°Ｃで１５分分間率活性化し９、そしてＤＮＡをフェ ノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでエタノールで沈 澱させた。

連結および大腸菌に１２宿主の形質転換は実施例１に記載した通りに行った。成 る場合には、連結は４°Ｃで４８時間または１６℃で４〜６時間であった。

アルカリ変性後、Ｍｕｔｉｗｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉ ｎｇ　ＳｙｓｔｅｍＫｉｔ（Ａｓ＋ｅｒｓｈａａ＋）を使って、取扱い説明書に 記載されたようにして、二本鎖プラスミドＤＮＡ上でＢｇｌｎ／Ｐｓｔｌ領域の 配列決定を行った。

この作業に使用したプラスミドは上記のようにして誘導した。

Ｅ　ｃｏｌｉ　での プラスミドｐＢＴＡ８４０を用いて、ラムダの熱不安定性リプ　レッサーｃ１８ ５７を含む大腸菌ΔＨ＋　Δｔｒｐ宿主を形質転換せしめた。単一の形質転換体 をＴＳＢ培地中で２８°Ｃにて一晩増殖させ、得られた培養物を用いて１０ｆの 醗酵槽に接種した。大腸菌細胞を３８°Ｃにて２４時間熱誘導し、１７，０００ Ｘｇでの２０分間の遠心により細胞を回収した。

Δ６６−９８およびΔ７４−９ＳＰＡＩ−２の　１＋ＦＡＩ−２変異体Δ６６− ９８およびΔ７４−９６は、該分子を発現する大腸菌細胞から、生来の分子の精 製において使用される方法、即ちＰｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグ ラフイー、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００クロマトグラフイー、イオン交換クロ マトグラフィーおよび／または逆相ＨＰＬＣを含む方法により、精製することが できる。それらの方法は国際特許出願ＰＣＴ／Ａ１１８５１００１９１（Ｗｏ　 ８６１０１２１２）および国際特許出＠ＰＣＴ／ＡＵ８７１０００６７（讐ｏ　 ８７１０５６２８）において記載されており、そしてΔ６６−９８の精製の結果 を図１０に示す。

ｕ　−Ｐ　Ａ、二本Ｈｔ−ＰＡおよび−１’ｔ−ＦＡ　Ａｕ　−Ｐ　Ａ、二本鎖 ｔ−ＰＡおよび一本積ｔ−ＰＡに結合する変異体Δ６６−９８の能力を、実施例 １に記載したものと同様な結合実験において調べた。Δ６６−９８ＰＡＩ−２（ 配列番号３）の結合特性を生来のＰＡＩ−２（即ちｐＢＴＡ６４１から発現され たもの）（配列番号１）、Δ７４−９６変異体（即ちｐＢＴＡ８２９から発現さ れたもの）（配列番号２）、およびｐＢＴＡ６４１から発現されたＰ、ｌ−２と ３つのアミノ酸が異なる生来のＰＡ　Ｉ−２の第二の形（Ｓｈｌｅｕｎｉｎｇら 、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、ユニ　４５６４−４５６７　、１９８７）によ り示されたものと比較した。別の生来のＰＡＩ−２はｐＢＴＡ６８３から発現さ れた。ＦＡＩ−２の第二の形において見つかる３アミノ酸に変更する部位特異的 突然変異誘発によりｐＢＴＡ６４１からプラスミドｐＢＴＡ６８３を誘導した（ Ｓｈｌｅｕｎｉｎｇ−ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、ユニ　４５６４−４５ ６７１９８７）　）。

種々のＦＡＩ−２（各々０．２５ｇ）を、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７， ５、７５ｍＭＭａＣ１、２，５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５％　ＴＸ−１００中 で、ｕ−ＦＡ（３，７５ｇ、Ｂｅｈｒｉｎｇ）、二本鎖ｔ−ＰＡまたは一本積ｔ −ＦＡ（各々３．７５ｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）と共に 室温で１６０分間インキュベートした。試料を１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル上で分析し次いでウェスタンブロッティングした。プロットをＦＡＩ−２ に対するヤギポリクローナル抗体で探索し、結合した抗体を抗−ヤギーＨＲＰ接 合体により検出したＣ図１１）。

全ＰＡＩ−２（２種の生来形および２種の欠失変異体）が同等な結合特性を示し た。ｕ−ＰＡ、二本鎖ｔ−ＰＡまたは一本積ｔ−ＰＡとインキュベートすると、 ＦＡＩ−２の高分子量ＳＤＳ安定成形が認められた。そのような高分子量形は、 ＦＡＴ−２とそれらのプラスミノーゲン活性化因子との間の複合体の形成の特徴 を示す。

ンバク　感　の 変異体Δ７４−９６と同様に、生来のＦＡＩ−２の精製時に観察された３７ｋＤ の分解産物は、変異体Δ６６−９８の精製調製物中に検出されなかった（図１０ ）。

上の１　可 本発明のＦＡＩ−２変異体は、腫瘍を有する患者または慢性炎症状態、例えば関 節リウマチを患っている患者において、治療薬および診断薬として使用すること ができる。

特異的ＰＡ阻害剤の適用が利用可能である他の状態としては、変形性関節症、多 発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ様疾患、乾盲、天庖癒、角膜潰瘍、胃十二指 腸潰瘍、紫斑、歯周炎、出血および筋ジストロフィーといった症状および疾患が 挙げられる。特異的ＰＡ阻害剤は、ＰＡを伴う血栓崩壊療法への補助剤として用 いることができる。というのは、そのような処置の副作用、即ち全身性フィブリ ン溶解現象の発生率および過酷さを減少させるからである。最後に、２種のトリ プシン阻害剤が結合組織の形成を増強し、創傷組織の破断強さを増加させること が示されておりＣＫｗａａｎ、　ＨＣおよびＡｓｔｒｕｐ、Ｔ（１９６９）Ｅｘ ｐ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｐａｔｈ、　１１．８２）　、そして角質細胞がｕＰＡとｔＰ Ａの両方を生産することが知られている［Ｇｒｏｎｄａｈｌ−Ｈａｎｓｅｎ、　 Ｊら（１９８８）Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　）ので、ＰＡ阻害 剤は皮膚創傷の治癒および組織の修復において重要な役割を有することができる 。

本発明の変異体に対する抗体は、単球性白血病、ガン、胎児発達および慢性炎症 性疾患といった病的状態または状態の検出もしくは追跡において有用であろう。

配列の列挙 （１）一般的情報 （ｉ）出願者：　Ｇｏｓｓ、Ｎｅ１ｌ　Ｈｏｗａｒｄ（アメリカ）Ｒｉｃｈａｒ ｄｓｏｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ａｎｄｒｅｗ（アメリカ） Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ（アメリカ以外 の国） （ｉｉ　）発明の表題：　ＰＡＩ−２の変異体（ｉｊ）配列の数：１８ （ｉｖ　）通信先： （Ａ）住所：　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　Ｈａｃｋ　＆　Ｃ。

（Ｂ）通り：　７１　Ｙｏｒｋ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市：　５ｙｄｎｅｙ （Ｄ）州：　Ｎｅｗ　５ｏｕｔｈ　Ｗａｉｅｓ（Ｅ）国：　ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ （Ｆ）郵便番号：　２０００ （Ｖ）コンピューター読み取りフオーム（Ａ）媒体タイプ：　３１／２インチの ２ＤＤフロツピーデイスク （Ｂ）コンピューター：　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｃ）操作システム：　Ｍａｃｉ ｎｔｏｓｈ、６．０４及びそれ以上（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｍｉｃｒｏｓｏｆ ｔ　ｗｏｒｄ　４（ｖｉ）現出朝日：　入手できない （Ａ）出願番号： （Ｂ）出朝日： （Ｃ）分類： （ｖｉ）前出朝日： （Ａ）出願番号：　ＡＵ　ＰＪ７９２４（Ｂ）出朝日：　１９８９年１２月２０ 日（２）　配列識別番号１についての情報（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　１６１０個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ〜ｍＲＮＡ（Ａ）説明：　ヒトプラスミノーゲ ン活性化因子インヒビタータイプ２タ ンパク質をコードする （ｉｊ）ハイポセティカル：Ｎ０ （１ｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：　Ｎ／Ａ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン塩： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハブロタイブ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：　単球 （Ｈ）セルライン：　０９３７ （Ｉ）オルガネラ名： （ｖｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー塩： （Ｂ）クローン塩：　ＢＴＡ　１４４５（ｖｉ）ゲノム内での位置： （Ａ、）染色体／セグメント名＝１８ （Ｂ）染色体上の位’ｌ　：　１８ｑ２１−ｑ２３（Ｃ）単位： （ｘｉ）　配　列　：　配列識別番号１ＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴ　ＣＴＧＣＡＡＡ ＡＧＡ　Ｔ丁ＴＴＴＧＴＡＧＡ　ＴＧＡＧＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴ 　１３５：１配列識別番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１５１２個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ　＝ｍＲＮＡ（Ａ）説明：　アミノ酸７４−９ ６が欠失されているヒトプラスミノーゲン活 性化因子インヒビタータイプ ２タンパク質をコードする （ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （Ｖ）フラグメント型：　Ｎ／Ａ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン塩： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハブロタイブ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：　単球 （Ｈ）セルライン：　０９３７ （Ｉ）オルガネラ名： （ｖｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン塩：　ＢＴＡ　１９１６（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー　ＰＡＩ−２変異体 （Ｂ）位Ｗ：　アミノ酸７４−９６ （Ｃ）同定方法：　実験による （Ｄ）他の情報：　プロテアーゼ感受性部位の除去の生成物はウロキナーゼ組 織プラスミノーゲン活性化因 子に結合する （ｉｘ）　配列の説明　：　配列識別番号２ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣＡ ＡＡ　ＧＧＣＡＡＡ　ＡＴＣＣＣＡ　ＡＡＣＴＴＧ　ＴＴＡ　ＣＣＴ　５１０Ｔ ＴＴ　ＴＴＣＧＧＣＡＧＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣＴＣＡ　ＣＣＣＴＭ　ＡＡＣＴＡＡ ＧＣＧＴ　１２１０ＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴ　ＴＧＣＣＡ／ １ＡＡＡＴ　ＴＴＡＧＡＧＡＴＧＴ　１２９０ＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡ　ＴＴＴＣ ＴＧＣＴＣＴ　ＴＣＴＧ八ＡＣへ八ＣへＴＴＣＴＧＣＴＡＣＣ１３３０ＣＡＣＴ ＭＡＴＡＡ　ＡＡＡＣＡＣＡＧ八Ａ　ＡＴＡへＴＴＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡ Ｔ　１３７０ＴＡＴＭＣＡＴＧＡ　ＣＡＡＣＣＣＴＡＴＴ　ＡＡＴＣＡＴＴＴＧ Ｇ　ＴＣＴＴＣＴＭＡＡ　１４１０ＴＧＧＧＡＴＣ，！１．ＴＧ　ＣＣＣＡＴＴ ＴＡＧ八　ＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＴＣＡＧＴＴＴＡ　１４５０ＴＴＴＴＴＡ Ｔ、’、ＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴ　ＡＣＴＴＴＧＴＴＡＴ　ＴＴＡＴＴＡＴＴ ＴＴ　１４９０ＡＴＡＴＡＡＴＧＧＴ　ＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧ　ＧＧ　１５Ｌ２ 配列識別番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１４８２個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ　）配列の種類：　ｃＤＮＡ　＝ｍＲＮＡ（Ａ）説明：　アミノ酸６６− ９８が欠失されているヒトプラスミノーゲン活 性化因子インヒビタータイプ ２タンパク質をコードする （ｉｉｉ）ハイポセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：　Ｎ／Ａ （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン塩： ＣＤ）分イヒの程度： （Ｅ）ハブロタイブ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：　単球 （Ｈ）セルライン：　０９３７ （Ｉ）オルガネラ名： （ｖｊ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー塩： （Ｂ）クローン名：　ＢＴＡ　１９２２（ｉｘ）特＠： （Ａ）名称／キー　ＦＡＩ−２変異体 （Ｂ）位置：　欠失されたアミノ酸６６−９８（Ｃ）同定方法：　実験による （Ｄ）他の情報：　プロテアーゼ感受性部位の除去、生成物はウロキナーゼ組 織プラスミノーゲン活性化因 子に結合する （ｘｉ　）　配列の説明　：　配列識別番号３ＭＣＴＡＡＧＣＧＴ　ＧＣＴＧＣ ＴＴＣＴＧ　ＣＡＡＡＡＧＡＴＴＴ　ＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡ　１２１０ＧＣＴＧ ＴＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣ入ＡＡＴ　ＴＧＣＣＡＡＡＡＡ Ｔ　１２５０ＴＴＡＧＡＧＡＴＧＴ　ＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡ　ＴＴＴＣＴＧＣＴ ＣＴ　ＴＣＴＧＡＡＣＡＡＣ１２９０ＴＴＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＴＡＡＡＴＡ Ａ　ＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡ　ＡＴＡＡＴＴＡＧＡＣＮ３３０ＡＡＴＴＧＴＣＴＡ Ｔ　ＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡ　ＣＡＡＣＣＣＴＡＴＴ　ＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧ　１ ３７０ＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡ　ＴＧＧＧＡＴＣＡＴＧ　ＣＣＣＡＴＴＴＡＧＡ　 ＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣ１４１０ＴＡＴＣＡＧＴＴＴ、Ａ　ＴＴＴＴＴＡＴＡＡＣ ＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴ　ＡＣＴＴＴＧＴＴＡＴ　！４５０ＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴ 　ＡＴＡＴ入ＡＴＧＧＴ　ＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧ　ＧＧ　１ｔ＋ε２配列識別番 号４についての情報 （ｉ）配列の特！！［： （Ａ）長さ２２７個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本領 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　他の核酸 説明二　合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ｉｆｉ）ハイボセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号４ＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧ　ＡＴＡＴＣＴＣ ＧＡＧ　ＡＣＴＡＧＴＣ２７配列識別番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　９個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ＝ａ＋ＲＮＡ（Ａ）説明：　６６−９８アミノ 酸欠失変異体における欠失されたアミノ酸を 示すＦＡＩ−２分子における塩基 対２４１〜３４８のコード領域 （ｉｊ）ハイボセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：　中間部 （Ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号５配列識別番号６についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝３９個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ”ｍＲＮＡ（Ａ）説明：　７４−９６アミノ酸 欠失変異体における欠失されたアミノ酸を 示すＦＡＩ−２分子における塩基 対２４１〜３４８のコード領域 （ｉｊ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：　中間部 （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号６配列識別番号７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ８１８個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　一本領 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ　）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明：　７４−９６アミノ酸コ一ド領域欠失変異体におけるＦＡＩ−２遺 伝 子の旧ｎｆＩ／Ｐｓｔｌ領域を置換す るための合成りＮＡアダプター （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：　中間部 （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号７配列識別番号８についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２１１個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明：　７４−９６アミノ酸コ一ド領域欠失変異体におけるＰ＾Ｉ−２遺 伝 子の旧ｎｆＩ／Ｐ３ｔｉ領域の置換の ための配列識別番号７のアダ ブタ−への相補的配列 （ｉｊ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （Ｖ）フラグメント型： （ｘｉ　）配列の説明；　配列識別番号８ＧＣＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＧ　１１ 配列識別番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２２２個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明：　ＰＡＩ−２の６６−９８アミノ酸欠失変異体をコードする遺伝子 を 創造するためにＰＣＲ反応への 使用のための合成りＮＡオリゴ ヌクレオチド （ｉｊ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ　）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｖ）フラグメント型： （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号９ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴ Ｔ　ＣＴＡ　ＧＧＡ　Ａ　２２配列識別番号１０についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ７２９個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明：　ＰＡＩ−２の６６−９８アミノ酸欠失変異体をコードする遺伝子 を 創造するためにＰＣＲ反応への 使用のための合成りＮＡオリゴ ヌクレオチド （市）ハイボセティカル＝ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス：　Ｙｅｓ （ｖ）フラグメント型： （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号１〇八Ｔ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＣＴ ＣＣＣＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＴＡ八　八ＣＴ　２９配列識別番号１１についての 情報 （Ｈ配列の特徴： （Ａ）長さ＝２８個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明：　ＰＡＩ−２の６６−９８アミノ酸欠失変異体をコードする遺伝子 を 創造するためにＰＣＲ反応への 使用のための合成りＮＡオリゴ ヌクレオチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型： （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号１１ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＣＧＣＴ　ＧＣ Ａ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＣＡＴ　Ｔ　２Ｂ配列識別番号１２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２２７個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明二　合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ｉｊ）ハイボセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ。

（ｖ）フラグメント型： （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号１２ＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮ　ＮＡＴＧＧＡＧ　２７配列識別番号１３についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２２６個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明二　合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ｔｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ ０ （ｘｉ）配列の説明：　配列識別番号１３ＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮ　ＡＴＧＧＡＧ　２６配列識別番号１４についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１５個の塩基対 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ペプチド （ｊｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （Ｖ）フラグメント型：　Ｎ−末端フラグメント（ｘｔ）配列の説明；　配列識 別番号１４配列識別番号１５についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１０個のアミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ペプチド （ｉｊ）ハイボセティカル二ＮＯ 、（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （Ｖ）フラグメント型：　Ｎ−末端フラグメント（ｘｉ）配列の説明：　配列識 別番号１５配列識別番号１６についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＝１５個のアミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝　Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型：　Ｎ−末端フラグメント（ｘｉ）配列の説明：　配列識 別番号１６配列識別番号１７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２２７個の塩基対 ＣＢ）型：　ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数二　一本領 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ　）配列の種類：　他の核酸 （Ａ）説明二　合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ｊｊ）ハイボセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｘｉ　）配列の説明：　配列識別番号１７配列識別番号１８についての情報 （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ８１０８個の塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）配列の種”１１　：　ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ（Ａ）説明：　ＰＡＩ−２の 欠失変異体のための領域における差異を示す天然 のＰＡＩ−２コ一ド配列の塩基 ２４１〜３４８ （ｉｊ）ハイポセティカル二ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型： （ｘｉ　）配列の説明：　配列識別番号１８ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　 ＧＣＴ　ＧＣＡ　１０８０−　リ０　リー　ト■　ＣＪｕ　ＣＤ口謬　８と　鑓 ；　は　慕　兆 じｅ　ｕ−リコ ト　騒屓　；ｕ　５ｅ　：ｅ　；、ｆｆ１Ｈ：ｌ　＜Ｔｏ　（Ｊ皿　ミｇ　に芸 　に！（ＩＪ　ＣＤ＜　○＜　（Ｊ、Ｗ　？Ｑ、　＜ＷＱ＋　リＣじの 托ξ　話　弓騎　＄よ　′５．２　菰 じコ　くロ　○Ｉ−１０り　リコ　トへ８　８；　璽　乏ご　已ｇ　原 し　訂　髄　６灯　藤　１３　託 韮　りさ　ａａ　却３　■　揖三　１ 二　拍　目　麺；　藤　■　ヨ３　Ｉ ！；′＝　６芯　ド品　急ご　８と　に起　Ｐ已：　廓シ　足ミ　乏ミ　ミｇ　 冒に　む８Ｑ＜　ロＱ　トド　く−←−←ト　Ｕへ←−く０　じ：ｌ　ｕ＋　ｈ ｕ じ藁　豊芸　く心　ＯＷ　［−１の　トＱ　くト［−１り　Ｅ−ＩＱＩ　←ｓ　 ＜＜　ｈ−［、：ｌ＞　？←冒茂　む３　が片　８’；ｌ’　：３（ｓ；　ｅ＋ ：６Ｓ　設ご　ご芯　６６　８と　ゴ３　８６じ：　６８　８芸　に−にシ　ご ＝　Ｆ−１、）（ＣＪＱ、　＜←　り〉　く―　←ψ　くΣ淀′！：、　にｇ　 ＝、！　ゴ：　８；　と芸　８二ｄ：Ｊ　ＣＪ−＜ＨロＱ　←φ　ト−Ｑく？ぷ 　乏！　ギ鼾　ごピ　８“　５工 じ５　［−一　じじ　Ｏく　くく　ゴ浣　○じ足シ　已♂　諒＝　乏！　？ぷ　 ８：　藁９℃じ＜　Ｅ−ＩＪ　＜ψ　ａａ　Ｕ−ロく　Ｑエゴ！　８芸　叩：　 じ：　〉：　８ピ　ビ芸口じ　Ｅ−Ｉｎ、　ｏｏ　じく　ロク　０く　←〜＜■ 　ｏｈ　ｏ＝５　ロ←　トド＜卜　り一＜Ｈ（Σ　ｕｑ　＜ｒ：　ｈｈ　じＱ　 ａ＞；　し　りゑ　６封　ヨ３　号　連３　託−ｅ　５　９　：　９召　囲　ヨ ３　訂　■謳ご　ｉ〜　と品　？ζ　にた　６已　已に韮　劇　藤　ＩＥ言　珪 騎　■ Ｈび　（Ｊコ　トα　０に　リＯＵ＞　じσ８曝　じ３　６曜　５曜　８に　８ 已　定曝○コ　くコ　Ｑｌ）　Ｑコ　くω　じ←　じコトー　じａ　ａ＜　ｕａ 　＜ｗ　＜Σ　０じυ−く：Ｉ　←ω　くり　υ−ｏｕ　（ｊＷ＜＞　（＞　０ ■　Ｕω Ｅ−ＩＥ−１（ＪｔＪ　＜Ｈ＜−←Ｈくω　←ωじ←　←コ　υ− Ｈ閲　←ω　Ｑω くΣ　ＬＬＪ　［−１ω ヒー　←ω　←■ ←Ｑ　←Ｊ：　←１α じ＞　［−１Ｑ、　←ム ＦＩＧ［２ Ｌ匹旦現り二 ０１ｉｇｏ八、（１エマーン　−Ａ１に対して相補的０１ｉｑｏｓ　Ａよ／Ａ２ 　−キナーゼ処理、混合及びアニーリングの後Ｃｏ−付着端　Ｃｏ−付着端 τｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａ１８Ａｌａ　−：］−ドされたアミノ酸７ ２　７：ｌ　９７　９Ｂ　９９　１００　−天然のＦＡＩ−２タンパク質におけ る位置ＦＩＧＵＲＥ　６ ＦＩＧＵＲＥ７ Ａ。

ａｂｃｄｅｆｇｈ プラユミド　−６４１８２９８３６− Ｂ。

ａ　ｂ　ｃ　ｄ　ｅ　ｆ　ｇ　ｈ プウユミド　−６４１８２９８３６− ｍ−−３００ 旦αＪ旧ヱ Ａ１３４／３０１　（２２７→　−ＰＣＲ反応のためのオリゴヌクレオチド、非 コード鎖Ａ１３４／３０４　（２９７→　−ＰＣＲ反応のためのオリゴヌクレオ チド、３トコード鎖Ａ１３４／３０５　（２８７→　−ＰＣＲ反応のためのオリ ゴヌクレオチド、コード鎖ＦＩＧＵＲＥ　９ Ｆｉ口ｕｒｃ　１０ （還元されなかった） ｂ。

−　： ε　１　− 国際調査報告 要　約　書 ６６〜９８のアミノ酸残基領域が少なくとも１種のプロテアーゼ感受性部位で排 除されるように変えられたプラスミノーゲン活性化因子インヒビターＦＡＩ−２ の変異体が供給される。本発明の変異体は、ＦＡＩ−２の生物学的活性及びＦＡ Ｉ−２の６５〜９５までのアミノ酸を維持する。ラベルされた形での本発明のＰ 、ｌ−２変異体、並びに本発明の変異体をコードするＤＮＡ分子、本発明の変異 体を発現する形質転換された宿主細胞、本発明の変異体を含んで成る組成物及び 診断用キット、本発明の変異体に対する抗体及び本発明の変異体、ＤＮＡ分子、 形質転換された宿主、組成物及び抗体の生成方法がまた記載される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．６６−９８アミノ酸残基領域が少なくとも１つのプロテアーゼ感受性部位を 排除するために変更されているＰＡＩ−２変異体であって、前記変異体がＰＡＩ −２の生物学的活性及びＰＡＩ−２の９９から６５までのアミノ酸を整合して維 持することを特徴とするＰＡＩ−２変異体。 ２．前記変異体が、６６−９８アミノ酸残基領域における少なくとも１つのアミ ノ酸残基が欠失されている欠失変異体である請求の範囲第１項記載のＰＡＩ−２ 変異体。 ３．Δ７４−９６が欠失されたＰＡＩ−２のアミノ酸７４−９６を有するＰＡＩ −２変異体Δ７４−９６。 ４．Δ６６−９８が欠失されたＰＡＩ−２のアミノ酸６６−９８を有するＰＡＩ −２変異体Δ６６−９８。 ５．ラベルされた形で存在する請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載のＰＡ Ｉ−２変異体。 ６．ラベルが放射性同位体、酵素及び化学物質から成る群がら選択される請求の 範囲第５項記載のＰＡＩ−２変異体。 ７．ＤＮＡ分子であって、その配列が請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載 のＰＡＩ−２変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。 ８．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ分子及びベクターＤＮＡを含んで成る組換え ＤＮＡ分子。 ９．前記ベクターＤＮＡかプラスミドＤＮＡである請求の範囲第８項記載の組換 えＤＮＡ分子。 １０．前記プラスミドＤＮＡが、Ｅ．コリ発現ベクター、バキュロウィルストラ ンスファーベクター、哺乳類発現ベクター、ワクシニアウイルス発現ベクター及 びレトロウイルス発現ベクターから成る群から選択される請求の範囲第９項記載 の組換えＤＮＡ分子。 １１．前記Ｅ．コリ発現ベクターが； ＰＬプロモーターに基づくＥ．コリ発現ベクター；Ｉａｃプロモーターに基づく Ｅ．コリ発現ベクター；ｔａｃプロモーターに基づくＥ．コリ発現ベクター；ｔ ｒｐプロモーターに基づくＥ．コリ発現ベクター；ｐＧＥＭ４Ｚ及びそれに由来 するプラスミド；及びｐＳｐ７０及びそれに由来するプラスミドから成る群から 選択される請求の範囲第１０項記載の組換ＤＮＡ分子。 １２．前記バキュロウィルストランスファーベクターが、ｐＡｃ３７３、ｐＡｃ ３６０及びそれらに由来するプラスミドから成る群から選択される請求の範囲第 １０項記載の組換えＤＮＡ分子。 １３．前記哺乳類発現ベクターが： ｐＢＰＶ−１；ｐＢＰＶ−ＢＶ１；ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ；ＳＶ４０基礎の 発現ベクター、たとえばｐＢＴＡ６１３；及びそれらに由来するプラスミドから 成る群から選択される請求の範囲第１０項記載の組換えＤＮＡ分子。 １４．前記に定義されるような組換えＤＮＡ分子ｐＢＴＡ８２９。 １５．前記に定義されるような組換えＤＮＡ分子ｐＢＴＡ８４０。 １６．前記に定義されるような組換えＤＮＡ分子ｐＭＩＮＤＥＬ７４−９６。 １７．請求の範囲第８項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された形質転換 宿主細胞。 １８．前記宿主細胞が、Ｅ．コリＫ１２株、真核生物に由来する細胞及び昆虫ス ポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄｅ）及びポ ンビックスモリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）に由来する細胞系から成る群から選 択される請求の範囲第１７項記載の形質転換宿主細胞。 １９．前記真核生物に由来する細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｕ９３７細胞 、ＢＨＫ−２１細胞、Ｖｅｒ細胞、ＣＶＩ細胞及びＣ１２７細胞から成る群から 選択される請求の範囲第１８項記載の形質転換宿主細胞。 ２０．請求の範囲第１項記載のＰＡＩ−２変異体を生成するための方法であって 、ＰＡＩ−２の残基９９から残基６５までのアミノ酸が整合して存続し、そして 変異体がＰＡＩ−２の生物学的活性を維持するように、ＰＡＩ−２をコードする ＤＮＡ分子の６６−９８アミノ酸残基領域からヌクレオチドを欠失せしめること を含んで成る方法。 ２１．請求の範囲第８項記載の組換えＤＮＡ分子を生成するための方法であって 、請求の範囲第７項記載のＤＮＡ分子をベクターＤＮＡ中に挿入することを含ん で成る方法。 ２２．請求の範囲第１７項記載の形質転換宿主を生成するための方法であって、 形質転換のための適切な宿主細胞をコンピテントにし、そして請求の範囲第８項 記載の組換えＤＮＡ分子により前記宿主コンピテント細胞を形質転換することを 含んで成る方法。 ２３．治療用及び／又は診断用組成物であって、請求の範囲第１〜４項のいづれ か１項記載の少なくとも１つのＰＡＩ−２変異体の有効量並びに医薬的に許容で 奉るキャリヤー、賦形剤及び／又は希釈剤を含んで成る組成物。 ２４．治療用及び／又は診断用組成物であって、請求の範囲第５項記載の少なく とも１つのラベルされた変異体の有効量並びに医薬的に許容できるキャリヤー、 賦形剤、及び／又は希釈剤を含んで成る組成物。 ２５．腫瘍の侵入を阻止するための方法であって、請求の範囲第１項記載のＰＡ Ｉ−２変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有効量をそのような 処理を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。 ２６．腫瘍を処理するための方法であって、請求の範囲第１項記載のＰＡＩ−２ 変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有効量をそのような処理を 必要とする患者に投与することを含んで成る方法。 ２７．炎症性疾患を処理するための方法であって、請求の範囲第１項記載のＰＡ Ｉ−２変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有効量をそのような 処理を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。 ２８．前記炎症性疾患が、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰 瘍性大腸炎、乾癬及び天疱瘡から成る群がら選択される請求の範囲第２７項記載 の方法。 ２９．フィブリン溶解疾患を処理するための方法であって、請求の範囲第１項記 載のＰＡＩ−２変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有効量をそ のような処理を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。 ３０．前記フィブリン溶解疾患が全身性フィブリン溶解である請求の範囲第２９ 項記載の方法。 ３１．多発性硬化症、角膜潰瘍、胃十二指腸潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋 ジストロフィーから選択された状態を処理するための方法であって、請求の範囲 第１項記載のＰＡＩ−２変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有 効量をそのような処理を必要とする患者に投与することを含んで成る方法。 ３２組織学的検体又はインビボでの腫瘍の境界を位置決定し、そして／又は定義 するための方法であって、請求の範囲第５項記載のラベルされたＰＡＩ−２変異 体又は請求の範囲第２４項記載の組成物を検体に適用し、又は前記ラベルされた ＰＡＩ−２変異体又は組成物をインビボイメージングの必要な宿主に投与し、そ してラベルの濃度の位置を像化することによって決定することを含んで成る方法 。 ３３．血栓のプラスミノーゲン活性化因子処理の臨床的効力を改良するための方 法であって、フィブリン溶解の全身性活性化及び付随するフィブリン／フィブリ ノーゲン分解を阻止するために、請求の範囲第１項記載のＰＡＩ−２変異体及び ／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の有効量を、そのような処理の必要な宿 主に投与することを含んで成る方法。 ３４．請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載のＰＡＩ−２変異体に対する抗体 。 ３５．請求の範囲第３４項記載のポリクローナル抗体。 ３６．請求の範囲第３４項記載のモノクローナル抗体。 ３７．請求の範囲第３４項記載の抗体を調製するための方法であって、請求の範 囲第１項記載のＰＡＩ−２変異体及び／又は請求の範囲第２３項記載の組成物の 有効量により免疫コンピテント宿主を免疫化することを含んで成る方法。 ３８．請求の範囲第３４項記載の抗体並びに医薬的に許容できるキャリヤー、希 釈剤及び／又は賦形剤を含んで成る抗体組成物。 ３９．請求の範囲第３４項記載の抗体及び／又は請求の範囲第３８項記載の抗体 組成物を含んで成る診断用試薬。 ４０．細胞毒素に結合される請求の範囲第１項記載のＰＡＩ−２変異体を含んで 成る接合体。 ４１．請求の範囲第４０項記載の接合体並びに医薬的に許容できるキャリヤー、 希釈剤及び／又は賦形剤を含んで成る細胞毒素組成物。 ４２．細胞毒素物質を腫瘍に運ぶための方法であって、請求の範囲第４０項記載 の接合体及び／又は請求の範囲第４１項記載の細胞毒素組成物の有効量をそのよ うな処理の必要な宿主に投与することを含んで成る方法。 ４３．診断用キットであって、対照として請求の範囲第１項記載の変異体及び又 は請求の範囲第２３項記載の組成物、並びに請求の範囲第３４項記載の抗体、請 求の範囲第３８項記載の抗体組成物又は請求の範囲第３９項記載の診断用試薬を 含んで成るキット。