JPH04504260A - エイズの痴呆症、脊髄障害および失明の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エイズの痴呆症、を髄障害および失明の治療光型９童景 本発明はヒト免疫不全ウィルスタイプＩ（ＨＩＶ−１）の感染により生じる中枢 神経系の障害の治療に関する。

ヒトへのＨＩ　Ｖ−１感染は、全身的免疫不全を生じそして、失明、を髄障害、 または発狂性の神経障害、即ちエイズ発狂性合併症のような他の症状も含まれ、 これは感染の進行した段階の患者の症状の重要な原因である。ＨＩＶ−１感染は ＣＮＳの種々の領域において報告されており、脳皮質、を髄、および網膜が含ま れる。プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら（１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：５８６ ）およびホー（ＨＯ）ら（１９８９，Ａｎｎａｌｓ　ｉｎ　ＩｎｔｅｒｎａｌＭ ｅｄｉｃｉｎｅ、１１１：４００）は、エイズ発狂性合併症の臨床的、疫病学的 、そして病理学的なまとめを行い、そして神経異常の原因のメカニズムは、感染 細胞から放出されるウィルス由来または細胞由来の毒性物質による間接的組織破 壊であろうと示唆している。

ポメランツ（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ）ら（１９８７，Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ 、３１７　：１６４．９）は、二人のエイズ患者の網膜のＨＩＶ−１感染の存在 を報告した。ブレネマン（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎ）ら（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ、 ３３５：６３９）は、ＨＩＶの外皮蛋白質であるｇｐ１２０が、海鳥のニューロ ンを殺すことを見出した。

主咀Ω区炙 本発明は、ヒト免疫不全ウィルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅 を抑制する方法に関し、その方法は患者にｇｐ１２０に応答する該患者のＣＮＳ の細胞内遊離Ｃａ　＋　０イオン濃度の上昇を抑制しつる化合物を、抑制に有効 な濃度で投与することよりなる。

好ましくは、感染患者の血液は、ＨＩＶ−１に対する抗体を含み、最も好ましく は、患者はエイズ関連合併症または後天性免疫不全症候群の症状を発現している 。本発明の方法は、細胞内遊離Ｃａ”＋イオン濃度の上昇を抑制することのでき る第二の化合物の投与も含む。最も好ましい化合物は、血液−脳関門を通過する ことか可能なカルシウムチャネル拮抗剤であり、これらは経口的にまたは静脈を 通して投与できる。そのような化合物のうちで、現在のところニモジピン（Ｎｉ ｍｏｄｉｐｉｎｅ）が最も好ましい。血液−脳関門を自由に通過しないカルシウ ムチャネル拮抗剤はそれ程好ましくはないが、そのような化合物は脳および／ま たはを髄の膜内に投与でき、または硝子体内から網膜に投与できる。そのなかで 最も好ましい拮抗剤は、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ベラパミル（ ｖｅｒａｐａｍｉ　１）、＝トレンジビン（ｎｉｔｒｅｎｄｉｐｉｎｅ）、ジル チアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）、ニカルジピン（ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ）、 フルナリジン（ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ）およびジプロテベリン（ｄｉｐｒｏｔ ｅｖｅｒｉｎｅ）である。経口または静脈からの投与も効果的でありうる。

本発明は、ヒト免疫不全ウィルスの感染に伴う、痴呆、を髄障害および視覚喪失 を軽減することができる。

本発明の他の態様および利点は、以下の好ましい態様の記載および請求の範囲の 記載から明らかにされる。

好圭旦四悪橿９説肌 最初に図面について藺単に説明する。

図１は種々のｇｐ１２０濃度において網膜神経節細胞の死を示す用量反応曲線で ある。

図２は組換えｇｐ１２０および抗血清の存在下における網膜細胞の生存のグラフ である。

図３（ａ）は、種々の用量のｇｐ１２０に応答する網膜神経節細胞内の細胞内遊 離Ｃａ”濃度（（Ｃａ２”　）ｉ）のカイネティックのグラフであり、そして（ ｂ）は、静的状態におけるｇｐ１２０濃度と［Ｃａ２“］の用量−反応グラフで ある。

図４は、ｇｐ１２０単独もしくはｇｐ１２０抗血清で免疫沈降したｇｐ１２０の 存在下において、ｇｐ１２０により促進される（Ｃａ”）の上昇の棒グラフであ る。

図５は、ｇｐ１２０および／または１０μＭニフェジピンの存在下における網膜 細胞生存のグラフである。

図６は、ｇｐ１２０および／または１μＭのニフェジピンまたはニモジピンの存 在下における網膜細胞の生存のグラフである。

図７は、ｇｐ１２ｏおよび細胞内Ｃａ”チャネル拮抗剤のニモジピンの存在下に おける（Ｃａ”）のグラフである。

図８（ａ）は、ニフェジピンおよびｇｐ１２０の存在下において、カルシウムチ ャネルを通過する流れを示し、そして（ｂ）は該流れと電位の関係を示すグラ一 般に神経電位−依存性Ｃａ＋“チャネルの任意の適当な拮抗剤を、エイズ関連視 覚喪失、を髄障害、または痴呆の軽減に使用可能である。好ましいカルシウムチ ャネル拮抗剤の非限定的例は、以下の薬剤であるが、中でも最°も好ましいもの は、血液脳関門を通過できるもので、例えば、ニモジピン（Ｍｉｌｅｓ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　ウェストへブン、ＣＴ）、スミスクラインドラッ グＮｏ、９５１２　（Ｓｍｉｔｈ　Ｋ１１ｎｅ、７レンチーヒーチヤム、フィラ テルフィ乙　ＰＡ）、およびジプロテベリン（ｄｉｐｒｏｔｅｖｅｒｉｎｅ）（ Ｓｍｉｔｈ　Ｋ１１ｎｅ、フレンチービーチャム）である。好ましさが劣る拮抗 剤はＣＮＳ通過性の低いもの、例えば、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉ　１）（ Ｃａｌａｎ、Ｇ、Ｄ、５ｅａｒｌｅ社、シカゴ、イリノイ）、イソブチン（Ｉｓ ｏｐｔｉｎ）（Ｋｎｏｌｌ、ウィッパ：−、ＮＪ）　、ニトレンジピン（ｎｉｔ ｒｅｎｄｉｐｉｎｅ）、ジルチアゼム（ｄｉ　ｉｔ　ｉａｚｅｍ）（Ｃａｒｄｉ ｚｅｍ、Ｍａｒｉｏｎ、カンザスシティー、ＭＯ）およびニフェジピン（米国特 許３，４８５、　８４７．参照により本明細書に含まれる）（Ｐｒｏｃａｒｄｉ ａ、Ｐｆｉｚｅｒ、ＮＹ、ＮＹ：Ａｄａｌａｔ、Ｍｉ　１ｅｓ）である。有用と 思われる他のＣａ２＋チヤネル拮抗剤は、ミオフラジン（ｍｉｏｆｌａｚｉｎｅ ）、フルナリジン（ｆ　Ｉｕｎ、ａｒｉｄｉｎｅ）、ベブリジル（ｂｅｐｒｉｄ ｉｌ）、リドフラジン（Ｉ　１ｄｏｆ　１ａｚｉｎｅ）、ＣＥＲＭ−１９６、Ｒ −５８７３５、Ｒ−５６８６５、ラノラジン（Ｒａｎｏ　Ｉａｚ　１ｎｅ）　、 ニソルジピン（Ｎｉｓｏｌｄｉｐｉｎｅ）、＝−カルシビン（Ｎｉｃａｒｄｉｐ ｉｎｅ）　、ＰＮ２０Ｏ−１１０、フエロジピン（Ｆｅ　１ｏｄｉｐｉｎｅ）　 、アムロジピン（Ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）　、Ｒ−（−）−２０２−７９１およ びＲ−（＋）−Ｂａｙ−に−８６４４（Ｍｉｌｅｓ、Ｂｙｅｒ）であり、これら の化学構造はボデッケ（Ｂｏｄｄｅｋｅ）らの［トレンヅインファーマコロジッ クサイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓ）Ｊ、（１９８９）１０：３９７およびトリグル（Ｔｒｉｇｇｌｅ）ら の「トレンヅインファーマコロジックサイエンシズＪ　（１９８９）１０：３７ ０に記載されている。

どのカルシウムチャネル拮抗剤に関しても、ＨＩＶ−１（または他のＨＩＶ）の 感染に伴う神経障害を防止するための有効性は、試験薬剤を神経細胞機能に対す る次のアッセイの一つまたはそれ以上でスクリーニングして決定される。即ち、 神経細胞死、ニューロン内での細胞内遊離Ｃａ２＋イオン濃度の検出、およびＣ ａ２＋チヤネルを通過するイオンの流れの検出。有効な拮抗剤はＨＩＶ−１−関 連のニューロン細胞の死滅を減少させ、ｇｐ１２０の存在下で生じる細胞内Ｃａ ２＋イオン濃度の上昇を抑制するであろう。それに加えて、有効な拮抗剤はニュ ーロンのカルシウムチャネルを通過するＣ８４　＋イオンの流入をニューロン細 胞の死滅を減少させるに十分だが、夫自体がニューロン細胞を死滅させるような 完全なＣａ””イオンの流入阻害を行わない程度に減少させるであろう。拮抗剤 は、当業者によく知られている製剤技術を用いて医薬製剤に加工されるが、拮抗 剤化合物の具体的列形は投与経路によって定まる。

ニューロン　および　゛のアッセイ 拮抗剤は本発明の方法における有用性を、以下のアッセイを用いて、慣用の技術 で健全に単離できる細胞である限り中枢神経系の任意のタイプのニューロン細胞 を用いて試験することができる。次のアッセイにおいては網膜培養を用いた（し かしながら、海馬の皮質ニューロンも例えばニューロンの死滅および細胞内カル シウムのアッセイで使用されている）。これを用いた理由は網膜培養は出生直後 の嘩乳類から得られ、十分に特性が調べられ、そして螢光標識で明瞭に同定可能 な中枢ニューロンである網膜神経節細胞を含んでいるためである。培養中の網膜 神経節細胞の実質的部分は、機能的シナプス活性を示すとともに、健全網膜中に 見られる神経伝達物質のりセプターの全てではないとしても多くを含んでいるか らである。

１２０はインビトロでニューロン細　の　°を声　るニューロン細胞の死滅は、 網膜の神経節細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで、精製した天然のまたは組換えのｇｐ１ ２０とともにインキュベートすることによりアッセイした。Ｃａ２“チャネル拮 抗剤がニューロン細胞の死滅を減少させる能力を、ｇｐ１２０および拮抗剤の両 者と共にインキュベートした時の生存細胞を数えて決定した。

出生直後のラットの網膜神経節細胞をつきとめ、その生存性を次のようにして確 認した。全身麻酔の下で、蛍光色素のグラニュラ−ブルー（Ｍａ　ｃ　ｋ　ｒ　 ｏｍ。

１ｅｋｕｌａｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃ、　ラムスタット、ＦＲＧ）を、生理食塩水中 の約２％（Ｗ／Ｖ）懸濁液として、４〜７日齢のロングエバンス（Ｌｏｎｇ　Ｅ ｖａｎｓ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ウイ ルミントン、ＭＡ）の上圧（ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）に注射 した。２〜７日後、動物を断頭して殺して眼球を摘出し、素早く網膜を取り出し た。網膜細胞を分散させ、リブトン（Ｌｉｐｔｏｎ）ら、１９８７．Ｊ、Ｐｈｙ ｓｉｏＬ　３８５：３６１に記載されたように、イーグルの最少必須培地（ＭＥ Ｍ、カタログ＃１０９０．Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、ＮＹ）ｌ：：０． ７％（Ｗ　／　Ｖ　）メチルセルロース、２ｍＭグルタミン、１μｇ／ｍｌゲン タマイシン、１６−ゾキストロースおよび５％（Ｖ／Ｖ）ラット血清を添加した 培地で培養した。

次に細胞を３５ｍｍの組織培養皿内のポリーＬ−リジンでコートした７５平方ミ リメートルのガラスカバースリップ上にまき、次にｇｐ１２０を添加した。同じ 条件の培養に、種々の用量のｇｐ１２０、ｇｐ１２０＋ｃａ２＋チャネル拮抗剤 を添加しまたは薬物を全く添加しないものも含めた。

ｇｐ１２０の二種類の単離標品であるＲＦ２および３Ｂ（ブレネマン（Ｂ　ｒ　 ｅｎｎｅｍａｎ）ら、１９８８．上記；Ｎａｔｕｒｅ　３３５；４４５）は、国 立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのフレデリ ック（Ｆｒｅｄｒｉｃｋ）、ＭＤから入手し、ロベイ（Ｒｏｂｅｙ）ら（１９８ ６、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ、Ｓｃｉ、、８３ニア０２３）、パイル（Ｐｙｌ ｅ）ら（１９８８，ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｈｕｍ、　Ｒｅｔｒｏｖｉｒ、　、　 ３：３８７）およびコーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）ら（１９８８，上記） に記載されたようにして、イムノアフィニティークロマトグラフィーで精製した 。さらに、ｇｐ１２０−３Ｂをコードする遺伝子に由来する組換えｇｐ１２０は 次のようにして得た。

組換えｇｐ１２０はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ライン（ＡＴＣ Ｃ）を、アミノ酸６１−５３１　（ラスキー（Ｌ　ａ　ｓ　ｋ　ｙ）ら、１９８ ６，５ｃｉｅｎｃｅ、２３３：２０９）をコードする、単離された３Ｂ工ンベロ ープコード配列を含むプラスミドでトランスフェクトして製造した。遺伝子を切 断して天然のアミノ末端シグナル配列およびカルボキシ末端トランスメンブレン 領域を除去し、次いで、単純ヘルペスウィルスのグリコプロティン−Ｄシグナル 配列（ベルマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、２２７：１４ ９０）に読み枠をあわせて連結し、エンベロープ蛋白質がＣＨＯ細胞により構成 的に分泌されるようにした。唾乳類細胞内での製造は、エンベロープ蛋白質のグ リコジル化を確実にした。このエンベロープグリコプロティン、ｒｇｐ１２０− ３Ｂはイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングにより測定して１００万分の ５（９９，９９５％）の純度にした。ｇｐ１２０の調製物は（低濃度では）非常 に不安定で、活性を示すためには、新たに解凍したものでなければならず、再凍 結は避けねばならない。

細胞の生存は培養１日後にアッセイした。インキュベートは５％ＣＯ，／９５％ 空気の雰囲気中で３７℃において２０−２４時間行った。神経節細胞は、蛍光青 色色素の継続的存在により明確に同定できた。網膜神経節細胞がフルオレセイン ダイアセテートを取り込んでフルオレセインに分解する能力を、細胞の生存活性 の指標として用いた。この詳細は前記バーン（Ｈａｈｎ）ら、１９８８に記載さ れている。色素の取り込みおよび分解は、点電極を用いた通常の電気生理学的特 性と良く相関する。

生存活性試験を行うため、細胞培養培地を０１０００５％のフルオレセインダイ アセテートを含む生理食塩水に１５〜４５秒間交換し、そして細胞を生理食塩水 で洗浄した。蛍光色素を含ます（したがって生きていない）網膜神経節細胞が、 しばしば位相差顕微鏡およびＵＶ蛍光顕微鏡の両者で、観察できる状態に残って いた。これは、マーカー色素であるグラニュラ−ブルーが存在し続けるためであ る。他の死滅網膜神経節細胞は崩壊し、デブリスを残すのみであった。これに対 して、観察可能な網膜神経節細胞はＵＶ光の中で青色を呈するだけでなく、フル オレセインに適するフィルターで黄緑をも呈した。したがって、二つの交換可能 な蛍光フィルターを用いると、培養中の活性な生存神経節細胞を迅速に調べるこ とが可能であり、そのような細胞は単一のニューロンとしてまたは他の細胞の間 に小さい集団（クラスター）として認められた（通常、単独とクラスターの比率 は約１：１０）。

図１は、１０−”Ｍないし１０’″”Ｍ未満の範囲のｇｐ１２０濃度に対する用 量反応曲線であり、天然の精製ｇｐ１２０　（ＲＦ２）または組換えｇｐ１２０ 調製物と培養網膜細胞とのインキュベートが、２４時間以内に有意の数の神経節 細胞の死滅を生じたことを示している。細胞死滅の有意な増加（Ｐｒｏ、０１） は、ｇｐ１２０の２Ｘ１０−１２Ｍ以上の濃度で観察された。生存細胞は各培養 物にいかなる処置を行ったか分からないようにして採点した。コントロール培養 物のカウント数は７５平方ミリメートルのカバースリップ当たり９５ないし２５ ０の網膜神経節細胞であり、これは全網膜細胞数の約１％に相当した。各実験に おける各点は、少なくとも二連で行い、そしてデータは３回の実験の結果である 。値は、平均値＋／−標準誤差で示す。統計分析のために、変数の一方向分析に 続いて平均値のシェフェ（Ｓｅｈｅｆｆｅ）多次元比較を行った。これらの結果 はこの実験におけるニューロン細胞の死滅がｇｐ１２０の添加に起因するもので あることを示した。この結果を確認するために、コントロール実験を行い、ニュ ーロン細胞の死滅がｇｐ１２０エンベロープ蛋白質に特異的な抗血清の添加によ り防止されることを認めた。

１２０　゛が　１２０に　うニューロン　を　る山羊抗−ｇｐ１２０免疫血清は 、ｇｐ１２０−３Ｂ単離物の組換えフラグメントをフロイントのアジュバントと 共に一次および二次筋肉内免疫して調製した。

これらの免疫の前に免疫前血清を各ヤギから採取した。免疫後の血清中のｇｐ１ ２０抗体の存在は免疫的に精製したｇｐ１２０のポリアクリルアミドゲル電気泳 動およびウェスタンブロッティングにより確認した。

図２は抗ｇｐ１２０血清が、組換えエンベロープ蛋白質（ｒｇｐ１２０−３Ｂ） によるラット網膜神経節細胞のニューロン細胞の殺滅を防止したことを示す。

８日齢のラットの網膜培養を、２０ｐＭのｇｐ１２０とヤギＧ１０８４からのポ リクローナルｇｐ１２０抗体を含む免疫後血清または同じヤギの免疫前血清との 存在下または不存在下で、プレートにまいた。血清はコントロール増殖培地中で １：５００の濃度に希釈して用いた。図２は５回の独立のアッセイのデータであ る。誤差の棒は平均値からの標準誤差を示す。統計分析は前記のようにして行っ た。アッセイの結果は、抗ｇｐ１２０が精製ｇｐＬ２０調製物の効果を中和する ことを示し、即ち２０ｐＭのｇｐ１２０で処理した培養物の細胞死が培養培地に ヤギ抗−ｇｐ１２０血清を添加することで防止された。該抗体のみまたは免疫前 血清のみでは、コントロール培養培地について観察された結果と比較して細胞の 生存に有意な影響を与えなかった。これに対して、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０ と免疫前血清との添加は網膜神経節細胞の有意な殺滅をもたらした（ｐ＜０．０ １）。さらに、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０と免疫前血清で処理した培養物に比 較して、二つの抗体調製物は、ｇｐ１２０に暴露された網膜神経節細胞を有意な 割合で救済した（ｐｒｏ、ＯＸ）。ｇｐ１２０の存在下における抗血清Ｇ１０８ ４での処理は、コントロール培地のみの中でインキュベートした培養物と統計的 に差が無いニューロン細胞数をもたらした。これらの数値は、培養物中の単独細 胞およびクラスター細胞の両者の結果を示すが、しかしながら、最も重要な結果 はクラスター細胞の結果であり、何故ならニューロンは脳内で相互に連結してい るからである。

１２０はＣａ２″″の細　濃　に彪！を至ｇｐ１２０−が促進する神経毒性は細 胞内Ｃａ”＋濃度の増加を伴うことが以下の実験で示される。

出生直後のラットの網膜神経節細胞および海馬ニューロン中の細胞内遊離Ｃａ２ ′″　（Ｃａ２“〕の濃度を、Ｃａ２“感受性螢光色素であるｆｕｒａ　２を用 いてデジタル造映顕微鏡法で、以下のようにして測定した。網膜神経節細胞を１ 〜２周齢のロングエバンスラットから、ライファー（Ｌｉｅｆｅｒ）ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ、２２４，３０３　（１９８４）およびリブトン（Ｌｉｐｔｏｎ）ら、 ＪＰｈｙｓｉｏｌ、、３８５，３６１　（１９８７）に記載されたようにして培 養した。神経節細胞の同定は、分解的に移動した（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅｌｙ　 ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ）赤い螢光色素（Ｄｉｒまたはローダミンで標識した微 粒子）の存在により又は形態的および免疫螢光法による基準で（例えば、大型ま たはα一様神経節細胞は神経繊維抗体で染色される；リブトンら、Ｎａｔｕｒｅ 、３０９．６２４．１９８４）行った。Ｃａ”の測定の間、特に記載しないかぎ り、ニューロンを浸す浴液は、ハンクスのバランス塩溶液；１３６．７ｍＭ　Ｎ ａＣ１，１ｍＭ　ＮａＨＣＯ，，０，３４ｍＭ　Ｎａｇ　ＨＰ○、、０．４４ｍ Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４、５，３６ｍＭ　ＫＣＩ、２．　５ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１２、０， ５ｍＭ　Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４，０５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１ｇ　、５ｍＭ　ＨＥＰ　Ｅ　Ｓ 　Ｎ　ａ　ＯＨ，２２，２ｍＭグルコースおよびフェニルレッド指示薬（０，０ ０１％　ｖ／ｖ）；ｐＨ７，２を用いた。外皮蛋白質のｇｌ）１２０および他の 材料は、通常、この浴液で希釈した後、注入によりニューロンに適用した。Ｋ＋ の高濃度溶液は、ＮａＣ１をＫＣＩに置き換えて調製した。ニューロンの［Ｃａ ””〕の分析は、ｆｕｒａ　２−アセトキシ−メチルエステル（ＡＭ）を用いて 、グリンキービッツ（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉ　ｃｚ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、、２６０．３４４０　（１９８５）；ウィリアムスら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８ ，５５８　（１９８５）：コナーら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、７．１３８４　 （１９８７）：コナーら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０，６４９（１９８８）；コー ハンら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、７．３５８８　（１９８７）；およびマツト ンら、同上、９．３７２８　（１９８９）に記載されているようにして行った。

１０μＭのｆｕｒａ　２−ＡＭを含むイーグルの最少必須培養液を網膜または海 馬細胞のニューロンに添加した後、培養物を３７℃において、５％ＣＯ□／空気 の湿潤チャンバー内でインキュベートして、次いで軽く洗った。

安定な螢光比率および測定する［Ｃａ”）に対するＣａ”イオノフオアイオノマ イシンの効果で決定した通り、色素を負荷し、捕捉し、そして１時間以内に脱エ ステル化た。Ｃａ２＋のイメージングの間、細胞はハンクスのバランス塩溶液を 含むＨＥＰＥＳ−緩衝化塩溶液の中でインキュベートした。（Ｃａ２“〕　ｉは 、ツフイスアクショバート（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ）３５顕微鏡に設置 したＤＡＧＥ　ＭＴＩ　６６　ＳＩＴカメラで、３５０および３８０ｎｍで励起 された５００ｎｍの螢光を測定して得られたイメージの割合から計算した。各写 真の露出時間は５００ｍ５である。分析は、カリフォルニア州すニーベールのク オンテックス（Ｑｕａｎｔｅｘ）ＱＸ７−２１０映像処理システムで行った。細 胞はデータの採取の間のみ紫外線に暴露したので（概ね細胞当たり合計２０秒以 下）、ｆｕｒａ　２の色あせは最小限であった。前記のようにして、組換え源か らの高度精製ｇｐ１２０を２００ｐＭ適用すると、［Ｃａ”）が驚異的に増加し た（図３）。外皮蛋白質の添加の前に得たコントロールのレベル（Ｃａ”　”　 ＝６３±４ｎＭ、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４２）と比較すると、ｇｐ１２０の適用７ 分以内にレベルが３３倍増大した（２１００±３３０ｎＭ、ｎ＝１０；値の範囲 ９３４〜３９４３ｎＭ）。天然単離物（ＲＦ２および３Ｂ）から精製した他のｇ ｐ１２０調製物も同様の結果を生じた。ここに示した全ての実験は、高度精製組 換えｇｐ１２０を用いた。

ｇｐ１２０を海馬ニューロンに適用したときも同様の結果が観察された。ＣＤラ ットの１８日齢胎児の海馬皮質をトリプシン（０，０２７％　ｗ　／　ｖ　）で 分散し、３５ｄの培養皿当たり６００，０００細胞の密度でまき、その際、各皿 にはポリーＬ−リジンでコートしたガラスのカバースリップを５枚存在させた。

増殖培地〔ローゼンベルクら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、Ｌｅｔｔ、、１０３，１６ ２　（１９８９））は、１週間に３回交換した。これらの実験において、Ｃａ” の測定は培養の１４から２１日に行った。概括的に述べると、２００ｐＭのｇｐ １２０は試験したニューロン（ｎ＝７５）の７６％において［：Ｃａ”　”　） の増加を生じた。

いくつかの実験が、ｇｐ１２０がこの（Ｃａ”）ｉの増大の原因であることを示 唆した。普通の浴液は（Ｃａ”）ｉの変化を生じなかったが、続いて同じ網膜神 経節細胞ニューロンにｇｐ１２０を添加すると、（Ｃａ”）ｉが〜２μＭに増大 した（ｎ＝１０）。ｇｐ１２０をトリプシンで処理して大豆トリプシンインヒビ ター（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）で中和すると、もはや（Ｃａ” 〕　ｉの増大活性をしめさなかった。ｇｐ１２０は、単純ヘルペスウィルスのグ リコプロティンＤシグナル配列を含む構造から製造されたものであるため、組換 えｇｐ１２０の場合と全く同じ培地中に調製したグリコプロティンＤを網膜神経 節細胞に添加した（ｎ＝６）。グリコプロティンＤは全く効果がないか又は［Ｃ ａ”）を若干増大させた（＜２００ｎＭ、ｎ＝６）が、しかしこれは同モル量の ｇｐ１２０を添加した後に典型的に観察されるマイクロモルレベルまでの増大で はなかった。

これらのニューロンに５０ｎＭＫＣ１を注入すると（Ｃａ”）を６００ｎＭの範 囲（６００±９９ｎＭ、ｎ＝５）に増大させた。ＫＣＩに対する３０秒ないし３ 分間の短時間暴露がこのようなレベルのＣａ”を生じ、最大値には添加開始から １．５分以内に到達し、その後の数分間に〜２５０ｎＭのレベル（２４０±２１ ｎＭ、ｎ＝５）に回復した。これに対して、（Ｃａ”）の増大を少しでも引き起 こすためには、２００ｐＭのｇｐ１２０は最低１分間の添加が必要であり、しか もその効果は持続的で、単一細胞において実験の間中不可逆であった（３０秒間 隔で測定しながら、［Ｃａ”“〕を１０ないし３０分間モニターした結果）。種 々の用量のｇｐ１２０を３分間適用して誘発された（Ｃａ２“〕　ｉの変化の時 間経過を図３Ａに示す。最大レベルには添加開始後〜７分で到達している。した がって、Ｋ＋に応答する（Ｃａ２”　）の増大観察結果はｇｐ１２０の場合とは 質的にも量的にも相違した。

極度に低いｇｐ１２０の用量（ピコモル量）が、段階的、用量依存的な（Ｃａ２ １〕の増大に有効であった（図３Ｂ）。２０ｄＭという少量のｇｐ１２０が〔Ｃ ａ”）ｉの増大を生じた。ｇｐ１２０の２００ｐＭまたはそれ以上の濃度で、非 常に高レベルの遊離Ｃａ”（≧２μＭ）が得られた。

ｇｐ１２０で観察された（Ｃａ”）の増大が、ウィルスエンベロープ蛋白質の精 製調製物中の夾雑物に起因する可能性は依然として否定できないかもしれないが 、高度精製組換えｇｐ１２０においてはそのようなことは考えられない。さらな る証明として、本発明者らは、プロティンＡ−をコートしたセファ０−スビーズ に結合したｇｐ１２０に対するヤギ抗体（抗−ｇｐ１２０）を用いた免疫沈降試 験を行った。

ｇｐ１２０の免疫沈降は上記の方法に若干の変更を加えて行った。１：１００ま たは１　：　５００希釈の抗−ｇｐ１２０または同じヤギからの免疫前血清を、 プロティンＡ−をコートしたセファロースビーズに結合し、洗浄し、そして７ｎ Ｍのｇｐ１２０を含む溶液で４℃にて１８時間インキュベートし、遠心分離した 。免疫前血清で処理した材料の上清は、ｇｐ１２０活性を有し、このことはイム ノブロッティングにより、および〔Ｃａ２＋〕濃度および細胞死の増大を生じる （１：３５０希釈して〜２０ｐＭにしたとき）ことから確認された；抗−ｇｐ１ ２０に暴露した材料は、殆どまたは全く活性を示さなかった。

そのような実験３回のうちの一つの結果が図４に示されている。免疫前血清での 処理は、ｇｐ１２０が［Ｃａ”）ｉを増大する能力を有意には変化させなかった （斜線棒と灰色棒を比較せよ；平均（Ｃａ”“〕　ｉは免疫前血清で処理された ｇｐ１２０の適用後においてｇｐ１２０単独後よりも高いが、この相違は統計的 有意には達していない。ｇｐ１２０および免疫前血清処理ｇｐ１２０の両者とも にコントロールに比べて有意なＩ：Ｃａ”）の増大を生じた（ｐｒｏ、０１゜シ ェフェによる平均値の多次元比較による偏差分析（ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｖａ ｒｉａｎｃｅ　（ＡＮＯＶＡ）））；有意性はアステリクスで示されている）。

これに対して、抗−ｇｐ１２０を含む免疫後血清で免疫沈降を行うと、ｇｐ１２ ０の効果を完全に排除した（図右の最終カラム）。

１２０が　准　るニューロン細　の　はカルシラムチ　ネル　斉で　止立九五 ニフェジピン（５００ｎＭ−１μＭ）は網膜神経節細胞に対する天然ｇｐ１２０ 単離物３ＢおよびＲＦ２の致死作用に拮抗する。図５において、培養物にｇｐ１ ２０（２０ｄＭ）および／またはニフェジピン（１０ｄＭ）を、プレートにまく ときに添加し、１日後にニューロン細胞の生存をアッセイした。各値は４連の組 織培養皿で得られた平均値である。コントロール群のクラスター状網膜神経節細 胞は、ｇｐ１２０で処理したものよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０１）。ｇ ｐ１２０処理培養物に比較して、ニフェジピンの添加は網膜神経節細胞の生存を 有意に増大した（ｐｒｏ、０１）。コントロールに比較して、１０ｄＭのニフェ ジピン単独への暴露は細胞の死滅をもたらした（ｐ＜０．０５）が、ｇｐ１２０ 単独の場合に観察されたのと同程度ではなかった。さらにまた、２２回の試行の うち２０回において、同様の実験は、ｇｐ１２０とニフェジピンとの処理により 網膜神経節細胞の生存が、ｇｐ１２０単独（３ＢおよびＲＦ２天然単離物並びに 組換え３Ｂ体を含む）と比較して増大したことが示された（有意性ｐｒ０．００ １、Ｓｉｇｎ検定）。

図５ａに示すように、ｇｐ１２０−３Ｂとともに１０ｄのニフェジピンを培養培 地にインキュベートのときに添加すると、ｇｐ１２０−３Ｂ単独で処理した培養 物に比較して、ニューロンの殺滅が有意に減少した。ニフェジピンは同様にして 、他の精製ｇｐ１２０単離物であるＲＦ２によるニューロンの殺滅も軽減した（ 図５ｂ）。興味深いことは、６回の実験の５回において（各回３連または４連の サンプルを使用）１０ｄＭのニフェジピンがコントロールに比較してそれ自体有 意な細胞殺滅を示した事実にもかかわらず、上記防止効果が観察されたことであ る。事実、６回の全ての実験において、ｇｐ１２０とニフェジピンとで処理した 培養皿は、ニフェジピン単独よりも高いレベルの生存率を有した（ｐ　＜　０゜ ０５、Ｓｉｇｎ検定）。この現象に対する一つの可能な説明は、ニューロンの健 康と快適に必要な細胞内Ｃａ”の最適レベルが存在するという仮説を誘導する。

少なすぎるＣａ”＋は（ここでニフェジピンの存在で認められたように）生存を 阻止し、他方、過剰量のＣａ２＋ちまた細胞の死滅をもたらすのであろう（ｇｐ １２０がＣａ”＋の流れに及ぼす影響としてここで証明されたように）。これら の二つの両極端の間で（コントロールのＣａ２＋の値またはｇｐ１２０とニフェ ジピンの共存下でのＣａ２＋濃度）、生存が増大するのであろう。別の可能性と して、ニフェジピン単独ではこれとは無関係な他のなんらかの理由で、これらの ニューロンに毒性である可能性もあるが、そうとすれば、１０ｄＭニフェジピン 単独にくらべてｇｐ１２０と１０ｄＭニフェジピンとの併用において生存が若干 良好であったという上記発見を説明するのが困難である。

ｇｐ１２０処理に続くニューロン生存に対するカルシウムチャネル拮抗剤の低用 量を用いた場合の効果が図６に示されている。図６Ａにおいて、低用量（１μＭ ）のニフェジピンが、該カルシウムチャネル拮抗剤自体による網膜神経節細胞の 生存の実質的抑制なしに、ｇｐ１２０　（２０ｄＭ）の致死作用に拮抗している 。

処理された培養物をプレートにまくときに、ｇｌ）１２０−３Ｂ　（２０ｄＭ） および／またはニフェジピン（１μＭ）を添加し、１日後に網膜神経節細胞の生 存をアッセイした。ｇｐ１２０でのインキュベートは、コントロールの同時培養 物に比ベてニフェジピン細胞の殺滅をおこした（ｐｒｏ、０１）。１μＭニフェ ジピン単独の存在は、１０μＭの場合（図５で観察された）に比べて網膜神経節 細胞の生存に対する悪影響が少なかった。したがって、この用量一応答曲線を詳 細に検討して、それ自身による細胞死を最小限としつつｇｐ１２０の毒性を実質 的に阻止するに最適のカルシウムチャネル拮抗剤のレベルを見つけることが可能 であるＨＩＶ−１感染に起因するニューロン細胞の死滅を減少させるための治療 方法には、他の特異的カルシウムチャネル拮抗剤、例えばニフェジピンよりも優 れたＣＮＳ透過性を有するニモジピン（アレンら、１９８３．Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、 Ｊ。

Ｍｅｄ、３０８：６１９）の使用も含まれる。図６ｂは１μＭのニモジピンによ る処理で、クラスター状の網膜神経節細胞がｇｐ１２０−誘発殺滅から有意に救 済されたことをしめず（ｐ＜０．０１）；Ｌかしながら、１０μＭのニフェジピ ンで観察された（図５）のと同様に、１μＭのニモジピンはそれ自身による殺滅 を生じた。図６はニフェジピンの濃度を１μＭまで低下させた時、ｇｐ１２０− 誘発細胞死滅の減少を依然として生じることを示しており、そしてこの濃度にお けるニフェジピン単独処理ではニューロン細胞の殺滅は生じないことを示してい る。これらを併せて考察すると、ニフェジピンによる結果とニモジピンによる結 果は、明らかにカルシウムチャネル阻害剤の用量が重要な因子であることを証明 している；濃度が高すぎると、ｇｐ１２０の不在下で正常ニューロンを害するよ うである。

図７は、ｇｐ１２０とインキュベートした網膜神経節細胞における細胞内遊離Ｃ ａ２″″イオン濃度に対する１１００ｎのニモジピンの効果を示している。細胞 には前記のようにしてｆｕｒａ　２を負荷した。ウィルスエンベロープ蛋白質ｇ ｐ１２０（２００μＭ）を、通常培地または１１００ｎ〜１μＭのニモジピンを 含む培地中で予め数分間加温しておいたニューロンにピペットで添加した。図７ において通常のカルシウム培地で加温したニューロンに対して、ｇｐ１２０は予 測どおり（Ｃａ”）の増大をもたらした（○；ｎ＝１０）。これに対して、ニモ ジピンでの処理の後は、ｇｐ１２０は（Ｃａ”）の有意な増大を生じなかった（ ■；　ｎ＝１１）。

１２０の　在　にお審るイオンのｌれがカルシウムチャネル、：ｌ　斉で　さ肛 旦 以下の、ニューロン細胞機能アッセイは、Ｃａ２＋チヤネルを通過するＣａ２“ イオンの流れに対するカルシウムチャネル拮抗剤の効果を試験する。ｇｐ１２０ が細胞の死滅を増大させるメカニズムに関する理論に縛られるものではないが、 ｇｐ１２０がＣａ”＋チャネルを通過するイオンの流れを増大させる可能性があ る。ｇｐ１２０に伴なう細胞内Ｃａ”濃度の上昇を減少させることのできる化合 物のスクリーニングにおける念のための手段として、次のＣａ”″の流れのアッ セイをｇｐ１２０の存在下で行う必要がある。

図８は、網膜神経節細胞中において、ｇｐ１２０の存在下でニフェジピンがＣａ ２９の流れを抑制することをしめす。図８ａにおいて、別のニューロン中で、２ ０ｐＭのｇｐ１２０−ＲＦ２の添加の間に、カルシウムチャネルを通過してＢａ ２３により運ばれる流れに対して、ニフェジピン（１０μＭ）が部分的に拮抗し た。これら三つの追跡は全てｇｐ１２０の存在下で行った。ニフェジピンによる 阻害が特に顕著であった（５３％減少）のは、電位ステップ（このケースでは。

Ｖｃ　：＝１０ｍＶ）を脱分極保持電位（ＶＨ＝　４０ｍＶ）から開始した場合 であった；この観察結果は、他の組織におけるＣａ”“の流れに対するカルシウ ムチャネルブロッカ−の作用と一致している。図８ｂは図８ａと同様の細胞に対 するＩ−■関係を示し、２０ｍ１！　ｇｐ１２０−ＲＦ２の連続的存在下におい て、種々の試験電位でのニフェジピンの効果を説明する。記録条件は電荷運搬成 分としてバリウムを用いている。Ｃａ”＋の流れに対する拮抗のための濃度範囲 は、ニモジピン（１００ｎＭ〜１０　μＭ　）においてもニフェジピン（１００ ｎＭ〜１０　ｔｔＭ　）と同様の値が得られた。

のニューロン　１２０に５瓜　である もう一つの重要な考慮事項は、網膜神経節細胞以外の唾乳類中枢神経内のＣａ２ ＋レベルもｇｐ１２０に感受性で、したがってカルシウムチャネルブロッカ−に よる治療が可能かどうかである。ミラー（１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ、２３５： ４６）は、種々の脳領域からのニューロンの９０％以上において、ジヒドロピリ ジン類がＣａ２＋の流入に少なくともある程度は影響するが、しかしながら、こ れらの薬剤の有効性に領域による相違があることを示唆した。例えばフェニルア ルキルアミンのような他のクラスのカルシウムチャネル拮抗剤について、異なる 脳領域における有効性が証明されることはありうる。例えば、海鳥ニューロン中 のＣａ２＋の流れは、ベラパミル（１００μＭ）で部分的に抑制されることが示 されている（ヤーりら、１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ、２３５：６８０）；さらに また、新規カルシウムチャネルブロッカ−またはＧ蛋白質およびそれらの効果に 影響する細胞内メツセンジャー類も、この点の有用性が証明される可能性がある （オリベラら、１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：３３８；　ドルフィンら５ ９８７、Ｊ、ＰｈＹｓｉｏｌ、、８６：１；およびヤーりら、１９８７，５ｃｉ ｅｎｃｅ、２３８：１２８８）。ミラー（前述）は、海馬ニューロンは線状体ニ ューロンに比べて、カルシウムチャネル拮抗剤に対する感受性が大きいことを示 した。この相違は、おそら（Ｃａ”流れの長期成分（Ｌ−型読れに類似する）の みがジヒドロピリジン類に感受性であることに起因するのであろう。

里塗 本発明の拮抗剤は、多くの経路の中の任意の一つで投与可能であり、例えば、ニ モジピンまたはスミスクラインドラッグＮｏ、９５１２、ニカルジピン、フルナ リジンまたはジプロテベリンのようなＣＮ５−通過性拮抗剤においては、経口ま たは静注で、６０〜１２００ｍｇ／日を分割して投与することになるであろう。

ＣＮＳの通過性がこれより劣る拮抗剤については投与はカテーテルまたは硝子体 を通して行われるであろうが、しかしながら、経口または静注投与も特に患者の 血液−脳関門に損傷が存在するときは有効であろう；ニフェジピンは２０〜８０ ０ｍｇ７日の用量で投与され、ベラパミルは８０〜７２０ｍｇ／日の用量で投与 され、そしてジルチアゼムは６０〜９６０ｍｇ／日の用量で投与される。

台間（ｑＩ） 儂虐　（ｐＭ） ＠記 傾Ａ乞 （１０ＪＪＭ）ニフニジＣン 手続補正書 １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１６７０ 平成　２年特許願第５０５８７１号 ２、発明の名称 エイズの痴呆症、を髄障害および失明の治療３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ザ・チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレーション ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正の対象 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト免疫不全ウイルスに感染したヒト患者のＣＮＳニューロンの死滅を減少 させる方法において、ｇｐ１２０に応答する該患者のＣＮＳニューロン中の遊離 Ｃａ＋＋イオン濃度の上昇を減少させることができる化合物を、該減少をひきお こすのに有効な濃度で該患者に投与することよりなる方法。
2. ２．ヒト患者の血液がＨＩＶ−Ｉに対する抗体を含む請求項１記載の方法。
3. ３．ヒト患者がエイズ関連併合症または後天性免疫不全症の症状を有する、請求 項１記載の方法。
4. ４．患者に第二の前記化合物を投与することをさらに含む、請求項１記載の方法 。
5. ５．前記化合物が血液一脳関門を通過することができるものである、請求項１記 載の方法。
6. ６．前記化合物がニモジピンまたはスミスクラインドラッグ（Ｓｍｉｔｈ　Ｋｌ ｉｎｅ　ｄｒｕｇ）ｎｏ．９５１２である、請求項１記載の方法。
7. ７．ニモジピンが患者に経口または静脈投与で投与される、請求項１記載の方法 。
8. ８．前記化合物が患者の脳脊髄膜内にまたは硝子体内に投与される、請求項１記 載の方法。
9. ９．前記化合物がニフェジピン、ベラパミル、ネトレンジピンまたはジルチアゼ ムの一種もしくは一種以上である、請求項１記載の方法。
10. １０．前記化合物がニモジピンである、請求項６記載の方法。
11. １１．前記化合物がニカルジピン、フルナリジンまたはジプロテベリンである、 請求項１記載の方法。