JPH04504407A - Ｐｄｇｆ―ａ，ｐｄｇｆ―ａａ，ｐｄｇｆ―ａｂ，その生産方法及びそれを含む医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １、発明の名称 ＰＤＧＦ−＾、　ＰＤＧＦ−ＡＡ、　ＰＤＧＦ−ＡＢ、その生産方法及びそれを 含む医薬２、発明の詳細な説明 墓支監 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は血清中の主要マイトジェンの一つであって、 ｉｎ　ｖｆｔｒａでの繊維芽細胞と平滑ｍ細胞の成長を促進する。　ｉｎ　ｖｉ ｖｏではＰＤＧＦは血小板のα顆粒に蓄積され、血小板の刺激に応じて放出され る。高度に精製されたＰＤＧＦは塩基性のタンパク質であるが、その分子量に就 いてはかなりの不均一性（２７，Ｇｏｏ〜３１．０００　ｄ）を示す、この不均 一性は、老化、プロセッシング、並びにＡＡ、　ＡＢ又はＢＢ型の種々のイソ型 の存在によるものである。これら全てのイソ型の生体活性はジスルフィド結合の 還元により破壊される。血小板からのヒトＰＤＧＦは主としてＡＢ−ヘテロニ量 体から成るＣＨｓｌｄｉｎ　＆　Ｗｅｓｔ＠ｒｍａｒｋ　１９８４：　Ｄｅｕｅ １等１９８５；　Ｒｏｓｓ等１９８６）。

遺伝子のＤＮＡ−配列決定と関連するアミノ酸の配列決定によれば、ＡとＢとは 相同である（ｉｌｅｔｓｈｏｌｔｚ等１９８６）、　ＰＤＧＦ−Ｂはサル肉腫ウ ィルス（ＳＳＶ）の形質転換する遺伝子生成物Ｐ２Ｂ”−”−と殆ど同一である 。５ＳＶ−形質転換細胞からＢＢ型の相当するホモ二量体が検出され、これは血 小板からのＰＤＧＰに類領の特性を示した。しかしこのＢＢ−二量体はこの怒染 された細胞からは僅かしか分泌されなかった。一方ＰＤＧＦ−ＡＡ型はこれを生 産する細胞から効率よく分泌される（Ｈ＠１ｄｉｎ等１９８６）、この３種のイ ソ型ＡＡ、　ＡＢ及びＢＢがそれぞれ異なる機能を有するという示唆が益々増え てので、詳細の研究には相当量のＰＤＧＦ−Ａ　、、ＰＤＧＦ−Ｂ、　ＰＤＧＦ −ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＡＢを生産する方法の開発が必要となった。

創傷治療に於けるＰＤＧＦの適用に就いてはＥＰ−Ａ−０２８８３０７を参照さ れたい。

主−皿 実施態様の一つによれば、本発明は、 １）　ｐ−ＥＸと （ａ）　β−ガラクトシダーゼとアミノ酸配列（ｉ）ＳＸＺ　＝ｌワｋＶＣ芯’ ！’！”：”！ＺＸ？９ｊＳＱＶＤＰ’ＴＳＡＮＴｕコフ”Ｃ’ＪＴ／”ｆｌｃ ＴＧｃｃＮＴＳＳがＣＱＰＳス■ヨＳ■ηに貢バ■マてぶτ７ｑ■＝：ＬＸＱＣ ？ＬＴＴＳＬＮＰＤＹＲＥＥＤＴ’）ＶＲ（、。

のＰＤＧＦ−Ａとから成る一個の融合タンパク質、又は（ｂ）　（ａ）の融合タ ンパク質の一個の任意のアミノ酸が欠失しているか、−個の任意のアミノ酸が一 個の任意の他のアミノ酸で置換されているか、或いは一個の任意の部位にもう一 個の任意のアミノ酸を備えている一個の融合タンパク質、或いは（ｃ）　（ａ） 又は（ｂ）の融合タンパク質のＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミ ノ酸が欠失又は補充されている一個の融合タンパク質 をコードする異種ＤＮＡとから形成された一個のハイブリッドベクターを含むＥ 、ｃｏｌｔを用いて、（ａ）、　（ｂ）及び／又は（ｃ）による単量体の二量体 としての一個の融合タンパク質を発現し、■）生成した該融合タンパク質を（場 合によっては還元後に）化学的に切断して（１）（ａ）のアミノ酸配列の一個の 単量体又は相当する一個の単量体を遊離し、（但しその場合−個の任意のアミノ 酸が欠失していてもよく、−個の任意のアミノ酸が一個の任意の他のアミノ酸で 置換されていてもよく、或いは一個の任意の部位にもう一個の任意のアミノ酸を 備えていてもよく、及び／又はＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミ ノ酸が欠失又は補充されていてもよい）、 ■）そのチオール基をスルホン化により保護し、■）保護された単量体をクロマ トグラフィーにより精製し、■）精製、保護された単量体のスルホン基を還元し 、曵立尺孟ユニ４這更に、 ■）保護を解かれた単量体をジスルフィド結合により二量体とし、その後で、 ■）生成した二量体をクロマトグラフィーにより精製する方法により生産し得る ＰＤＧＦ−Ａ　Ｃ単量体）又は生体活性を有する（増殖を促進する）　ＰＤＧＦ −ＡＡ　（二量体）に間する。

もう一つの実ｙ＆ｎｓによれば、本発明は、前記の段Ｐｉ　（ＩＩＩ）に、前記 段階（ＩＩ）によるＰｉｌＦＧ−＾と、アミノ酸配列（ｉｉ）又は（ｉＩｉ） ｚｏ　ｓａ　Ｌｏ　５１３　６０ λＰτＱＶＱＸ２−”？ＶＱ’Ｖ’ＬＣＺ”７ＲＣ＜２　＝７Ｑ＜ＡτｖＴ’＝ ＤＫ　；λＣＸＣＴ！：”！　んυＪ！’ベコＳ２ＬＭ１　１り　ツ　】コ　４ り　５０　。

Ｓ　ＬａＳＬｍ　：λ工：’　λに：λ二ＣＫニスτＺ’！ＴＸ：Ｓ？！、Ｌ： ：：’、Ｔ：ＺλＮ７−７讐？ＰＣ；’Ｅ−：ＱＲＣ５ＧＣFｍＪ：％’ＪＶＱ Ｃ アコ　Ｑ　、１０　、　：クク　６１りのＰＤＧＦ−Ｂ、又はアミノ酸配列＜ｉ ｉ）又は（ｉｉｉ）に於いて、−個の任意のアミノ酸が欠失しているか、−個の 任意のアミノ酸が一個の任意の他のアミノ酸で置換されているか、或いは一個の 任意の部位にもう一個の任意のアミノ酸を備えているか、及び／又はＣ−末端又 はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ酸が欠失又は補充されている一個のアミ ノ酸配列のＰＤＧＦ−８とを使用し、前記の段階（ＩＩＩ）乃至（■）により処 理してＰＤＧＦ−ＡＢを得る方法により生産し得る生体活性を有する（増殖を促 進する）　ＰＤＧＦ−■に関する。

−もう一つの実施態様によれば、本発明は、Ｉ）ｐ−ＥＸと （１）β−ガラクトシダーゼとアミノ酸配列（ｉ）Ｓ　ＩイλｖＰＡＴＧ−ロカ コｒ７Ｒ５ＱＶＤＰＴＳ朋７＝韮”ＣＶ’ＥＶ’ＫＲＣＴＧＣＣＮＴＳＳ’ＱＸ ＣＱＰＳλう■π費πｇ＝工■Ｑ■ｕコーＣＡＣＡ？ＴＳＬＮＰＤＹＲＥΣＤＴ ＤｖＲ のＰＤＧＦ−＾から成る融合タンパク質、又は（ｂ）　（ａ）の融合タンパク質 の一個の任意のアミノ酸が欠失しているか、−個の任意のアミノ酸が一個の任意 の他のアミノ酸で置換されているか、或いは一個の任意の部位にもう一個の任意 のアミノ酸を備えている一個の融合タンパク質、或いは（Ｃ）　（ａ）又は（ｂ ）、の融合タンパク質のＣ一端末又はＮ一端末に於いて１４個までのアミノ酸が 欠失又は補充されている一個の融合タンパク質 をコードする異種ＤＮＡとから形成された一個のハイブリッドベクターを含むＥ 、ｃｏｌｉを用いて、＜ａ）、　（ｂ）及び／又は（ｃ）による単量体の二量体 としての一個の融合タンパク質を発現し、■）生成した該融合タンパク質を（場 合によっては還元後に）化学的に切断して（１）（ａ）のアミノ酸配列の一個の 単量体又は相当する一個の単量体を遊離し、（但しその場合−個の任意のアミノ 酸が欠失していてもよく、−個の任意のアミノ酸が一個の任意の他のアミノ酸で 置換されていてもよく、或いは一個の任意の部位にもう一個の任意のアミノ酸を 備えていてもよく、及び／又はＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミ ノ酸が欠失又は補充されていてもよい）、 ■）そのチオール基をスルホン化により保護し、■）保護された単量体をクロマ トグラフィーにより精製し、■）精製、保護された単量体のスルホン基を還元し 、ｋニーは、更に、 ■）保護を解かれた単量体をジスルフィド結合により二量体とし、その後で、 ■）生成した二量体をクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、Ｐ ＤＧＦ−Ａ　（単量体）の生産方法及び場合によっては生体活性を有する（増殖 を促進する）　ＰＤＧＦ−ＡＡ（二量体）の生産方法に関する。

本発明のもう一つの実施態様によれば、前記段階（Ｉ［［）に異なる２個の単量 体（ＰＤＧＦ−Ａ）を使用することができる。

本発明のもう一つの実施態様によれば、前述のように、前記段階（Ｉ［［）に、 段階（ＩＩ）に於いて得られたＰＤＧＦ−Ａ　、並びにＰＤＧＦ−８を使用する ことができる。

第３図に示すように、修飾したｐＥＸ−２−ベクターはＣｒ０−β−ｇａｌ−Ｐ ＤＧＦ−Ａ−融合タンパク質の高度発現を促進する。１ａＣＺ−遺伝子の約８０ ％ノ欠失ニヨリ、５０　％を１．ｔル割合ノＰＤＧＦ−Ａ　ヲ含ｔ；　４０．０ ００ｄの小さい融合タンパク質が形成される。この有利な条件にも拘らず０．２ ｍｇ、＃！の培養によるｒＰＤＧＦ７ＡＡの収率は比較的低い。それには次の三 つの原因がある。

ｌ）細胞は低い密度で誘導する必要があり、その為最終の光学密度は１．５０Ｄ ｉｓｓに過ぎない。その他の誘導条件乃至増殖条件では融合タンパク質の発現が 著しく低下する。

２）　ＭＳＩＥＥ、０．の部位におけるＣＮＢｒ−切断は完全には行われない。

３）　三量化により収率が低下する。

ｒＰＤＧＦ−ＡＢの生体活性はヒトの血小板ＰＤＧＦ及びＥ、ｃｏｌｉからのｒ ＰＤＧＦ−ＢＢの生体活性と同等であるが、ｒＰＤＧＦ−ＡＡの活性はその約１ ／１０である（第５図参照）。

もう一つの実施態様によれば、本発明は前記のＰＤＧＦ−Ａ、　ＰＤＧＦ−ＡＡ 及び／又はＦＤＣＦ−ＡＢを作用物質とし、場合によってはこれと通常の担体、 希釈剤及び／又は−個又はいくつかの他の成長因子又は創傷治癒促進物質とを組 み合わせることを特徴とする、創傷処置用薬剤に関する。その他の成長因子とし ては例えばインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）がある。

次に本発明を実施例と図面により詳細に説明する。生産の詳細に就いては更にＨ ｏｐｐｅ等、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、、　２８　（１９８９）　２９５６−２９６ ０及びＥｕｒ、　Ｊ、、　Ｂｉｏｃｈｅａ、、　７７Ｂ　（１９８９）を参照さ れたい。尚、配列（ｉ）乃至（ｉｉｉ）は例えばオリゴペプチド合成機を用いて 合成することができる。

１上区　ブラズミドｐＡｘ−）ＩＡの構成方法白色の枠：　ｃｒｏ−１ａｃＺ− 遺伝子　′灰色の枠：成熟したＰＤＧＦ−＾用遺伝子領域黒色の枠：ブレプロ配 列用遺伝子領域 蛇行線　：　ｍ１３＋ａｐ１９−配列 ＰＲ：バクテリオファージλプロモーター　。

ｃｒｏ−１ａｃＺ：　Ｃｒｏ−βガラクトシダーゼ融合タンパク質ｔ１．、ファ ージ転写終結因子 ｔｍ　発現したＰＤＧＦ−Ａのアミノ酸配列Ａ＝アラニン、Ｄ＝アスパラギン酸 、Ｅ＝　グルタミン酸、Ｆ＝フエニルアラニン、Ｇ＝ニブリシンＨ＝　ヒスチジ ン、Ｉ＝イソロイシン。

Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン。

Ｐ＝ニブロリンＱ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ；セリン、Ｔ；　トレオニ ン、■；バリン、Ｗ：　トリプトファン、Ｙ＝チロシン］ＬＬｆＥＬ　Ｅ、ｃｏ ｌｉ中及び精製段階に於けるＰＤＦＧ−Ａの発現の５Ｏ５−ゲル電気泳動分析 Ａ）　Ｅ、ｃｏｌｉ細胞からの内容物 Ｂ）封入体 Ｃ）　ＣＨＢｒ−断片 Ｄ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製後の単量体ｒＰＤＧＦ−Ａ Ｅ）最終精製後の二量体ｒＰＤＧＦ−ＡＡＦ）最終精製後の二量体ｒＰＤＧＦ− ＡＢＭＡＪｍ７　単量体ｒＰＤＧＦ−Ａ乃至ｒＰＤＧＦ−８からのへテロニ量体 の好ましい生成 単量体ｒＰＤＧＦ−Ａ乃至ｒＰＤＧＦ−８を記載の比率で混合し再生条件下にも たらした。１日後８μｇを５ＤＳ−ゲル電気泳動法で分析した。

！１ｆ１２−メルカプトエタノールによる還元後の精製ｒＰＤＧＦ−ＡＢの５Ｄ Ｓ−ゲル電気泳動分析 ｒＰＤＧＦ−Ａ乃至ｒＰＤＧＦ−８に相当するバンドを示した。

１立二　組み換えたＰＤＧＦ−イソ型の生体活性（Ａ）　ｒＰＤＧＦ−ＡＡ　（ ■）、　ｒＰＤＧＦ−ＡＢ　（・）、　ｒＰＤＧＦ−ＢＢ　（ム）によるＡＫＲ −２Ｂ−マウス繊維芽細胞への（”Ｈ）−チミジン挿入の刺激。２８００　ｃｐ ｓの背景レベルを差し引いた。

（Ｂ）　”１Ｉ−ｒＰＤＧＦ−ＡＡ　（■）、　”’Ｉ−ｒＰＤＧＦ−ＡＢ　（ ・）、”’Ｉ−ｒＰＤＧＦ−ＢＢ（ム）のＡＫＲ−２Ｂ−７ウス繊維芽細胞への 結合。ｒＰＤＧＦ−ＢＢをＢａ１ｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ−試薬で標識した。Ｂ／ Ｆ　＝結合因子／自由因子略号 ＨＢＳ　：　１（ＥＰＥＳ緩衝剤を加えた生理食塩水ＰＢＳ　：　リン酸塩緩衝 剤を加えた生理食塩水ＰＤＧＦ　：血小板由来成長因子 ｒＰＤＧＦ−ＡＡ、　−ＡＢ、−ＢＢ：イソ型ＡＡ、　ＡＨ，ＢＢの組換えＰＤ ＧＦＰ２８・−ｍｌ＊　、サル肉腫ウィルスの形質転換タンパク質Ｃｒ０−β− ｇａｌ　：　ｅｒａ−リプレッサーとβガラクトシダーゼから成る融合タンパク 質 ＦＣＳ　：子ウシ胎児血清 ＲＦ：複製型 ■且 ｐＭＶＷ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９Ｂ　（１９８８）　３４４．３４ ５参照ｐＥＸ１　（プラスミド）　Ｇｅｎｏｆｉｔ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；　 ＥＭＢＯＪ、、　３　（１９８４）１４２９−１４３４も参照 ｐＥＸ２　（プラスミド）　Ｇｅｎｏｆｌｔ　Ｈｅ１ｄｅｌｂｅｒｒＥ、ｃｏｌ ｉ　ＮＦＩ　ＥＭＢＯＪ、、　３　（１９８４）　１４２９−１４３４参照Ｅ、 ｃｏｌｉ　ＣＪ　２３８　ＢｔｏＲａｄＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０３　Ｐｈａｒ ｍａｃｌａｍ１３＋＋＋ｐ１８　Ｐｈａｒｍａｅｉａｍ１３ｍｐ１９　Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ 変異誘発キット　ＢｉｏＲａｄ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＪ　２３６を含む）ｐＰＧ Ｆ−２ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２９　（１９８９）　２４３．２４４塩 酸グアニジンとトリスはＳ　ｉ　ｇｍａ製、ギ酸、２−プロパツール、アセトニ トリル、三フッ化酢酸はＭｅｒｃｋ製を使用した。

５ｅｐｈａｅｒｙｌ　Ｓ−２００はＰｈａｒｍａｅｉａ製、クロマトグラフィー カラム５ｌ−３００−ｐｏｌ、ｙｏｌｂｕｔｙｌ　とアンピシリンは５ｅｒｖａ 製、培地と助剤はＧｌｂｃｏ製、放射性薬品はＡｍｅｒｓｈａｍ製であった。

豆丘立ま ゲル電気泳動は文献記載通りに実施１、た（ゲル１３．５％）　（Ｈｏｐｐｅ等 １９８６）。アミノ酸分析には分析計（Ｂｉｏｔ、ｒｏｎｉｅ社のＬＣ２０００ ）を使用した。アミノ末端配列分析には気相分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｏ＋ｓ社の４７ＯＡ）を用いた。タンパク質含有量はＢｒａｄｆｏｒｄ 　（１９７６）又はＲｅｄｉｎｂａｕｇｈ　＜１９８６＞の方法により測定した 。

実施例１　：　ＰＤＧＦ−ＡとＰ［１ＧＦ−ＡＡ−１ベ　−の ＰＤＧＦ−Ａをコードする領域を含む、クローンｐＰＧＦ−２（Ｈｏｐｐｅ等１ ９８７）からの長さ２ｋｂのＢｇｌＩ−断片を５ｓｔｌ　とＲｓａｌ　とで切断 した（第１図、ａ行）。この際得られた長さ４６０ｂの断片を、予め５ｓｔｌ　 とＨｊｎｃ　Ｉ［により切断しておいたファージｍ１３ｍｐ１９に組み込んだ（ 第１図、ｂ行）。宿主株ＪＭ１０３への形質転換後に、得られたコロニーに就い てファージ−ＤＮＡへの正しい組込みを調べた。次に株ＣＪ　２３６　（２０Ｍ ｇ）に得られたファージの３　Ｘ　１０’を感染した。

次にウラシル含宵ファージを文献記載通りに分離した（特定部位の変異誘発用の ＢｉｏＲａｄマニュアル）。次いで部位７６　（ＡＧＡ）のアルギニンをメチオ ニン（ＡＴＧ）に変える為に、−重鎖ファージ−ＤＮＡとプライマーＣＧＧ　Ａ ＧＧ　ＡＡＧ　ＡＵ工ＡＧＣＡＴＣＧＡＧ　ＧＡＡ　Ｇとからハイブリッドを形 成した（第１図、０行）。Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼによる第２鎖合成と宿主 株ＪＭ１０３への形質転換後に、４個のファージ中のＰＤＧＦ−Ａをコードする 領域をＤＮＡ−配列決定により分析した。

２個のファージに所要の置換が含まれていた。これらのファージの一方を、ＲＦ −ＤＮＡを調製するために使用した。このプラスミド−ＤＮＡを５ｓｔｌで消化 し、突出した末端を７４−ＤＮＡ−ポリメラーゼで処理して除去したく第１図、 ｄ行）。その際長さ４６０ｂの断片がＰＳｔｌ切断により遊離された（第１図、 ｅ行）。この断片を表現ベクター　ｐＥＸ−２ｃＤ　Ｈｐｘｌ／Ｐｓｔｌ一部位 に組み込んだ（第１図、ｆ行）。

、：１．ノｐＥＸ−２−プラスミド（７）　Ｈｐａｌ／Ｐｓｔｌ−消化（第１図 、ｇ行）ニヨリ１ａｃＺ−遺伝子の約２６００　ｂの長さが欠失し、ｃｒｏ−β −ｇａｌ−タンパク質の大きさが１８０００６に減少した。宿主株ＮＦＩに移入 後に得られた株をＬＢ−培地で３０℃で０．２０Ｄ　（５５０１１０１）の光学 密度になるまで培養した。ｃｒｏ−β−ｇａｌ−ＰＤＧＦ−Ａ−融合タンパク質 の生産を温度を４２℃に上げて誘導した。２時間後細胞を採取し、タンパク質を ５Ｏ５−ゲル電気泳動法により分析した。ＰＤＧＦ−Ａ−配列を高度に発現した 株が分離された。このプラスミドをｐＡＸ−ＨＡ−と命名した。

の Ｅ、ｃｏｌｌ−細胞を１！培養液は５０〜１００μｇ７ｍ　ｊ７　のアンピシリ ンを加えたＬＢ−培地で３０℃で０．２０Ｄ　（４４０ｎｍ）の光学密度になる まで培養し、次いで４２℃で更に３時間振盪した。細胞を遠心分離（５０００ｇ で１０分）により採取し、ｐｉ（７，８のトリス−ＨＣｌ　（２０ｍＭ）とＥＤ ＴＡ　（０，５ｍＭ）との２０ｍｆ　に懸濁した。典型的な調製の１例として２ ０乃至３０　Ｉｌ　の培養を行った。この細胞を２００００　ｐｓｉの圧力でプ レス（Ｓｏｒｖａｌ１社のＲｌｂｉ）を２回通すか又は超音波で処理して破壊し た。これに２％のトリトンｘｔｏｏ　＜最終濃度）を添加してから遠心分離（６ ０００ｇで１０分）にかけて封入体を取得した。

１立土」肚り豆蓋 ２０乃至３０　ｆ　の培養により得られた封入体を２にのＳＤＳと２ｘの２−メ ルカプトエタノールを含むｐＨ７，８のトリス−）ＩＣＩ　（５０ｍ１Ｊ）１０ ０＠ｆに溶解した（３７℃で約１時間）。微量の不溶解分を遠心分離（２０００ ０ｇで３０分）により除去した。上ずみ液に２容のアセトンを０℃で加え、０℃ で１５分放置後かさばった沈殿を遠心分離しく６００’Ｏｇで１０分）この沈澱 を８０ｍｊ７のギ酸（１００％）に溶解した。次いで水２０ｍ１を加え、不溶解 分を遠心分離（５００００ｇで１時間）により除去した。上ずみ液にＣＮＢｒ　 １　ｇと２−メルカプトエタノール２００μｌとを加え、室温で一晩反応させた 。溶液を回転蒸発器で乾燥し、残渣を塩酸グアニジ：／　＜６１Ｊ）　８０　ｔ ｌ、Ｉｌ　に加え、３０％のＮａ０）１によりｐ。

を７．５に調節した。別法として６Ｍの塩酸グアニジ・ンの存在下で切断を行う こともできる。切断後水１０１を用いて透析し、透析液に塩酸グアニジンを加え て最終濃度を６Ｍに調節した。

鉦ス基主之止 得られた溶液にＮａｔＳＯｘ　１　ｇとＮ＆＊ｈＯｇ　０．２５　ｇとを加え、 混合液を室温で５時間放置し、不溶解分を遠心分離（５０００Ｃ１ｒで１時間） により除去した。

−ル昌ン　・−の 上記の溶液を、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５２００を充填したカラム（寸法５　ｃａ ＋φＸ１００　ｃｍ）に通し、溶離液にはｐＨ７，４の塩酸グアニジン（４Ｍ） −トリス−ＨＣｌ　（５０ｍＭ）を用いた。送液速度は１６０ａ＋ｊ７／ｈであ った。

１５ｍｌ１ずつのフラクションを捕集し、フラクションの一定分量を５ＤＳ−ゲ ル電気泳動法により分析した。約１７　ｋｄの分子量のタンパク質を含むフラク ションを合体し、−晩５１　の水を用いて透析した。

透析中に沈殿が生じたが、これはギ酸を最終濃度ｌＯ％まで添加することにより 大部分溶解できた。不溶解分は遠心分離＜２００００ｇで２０分）により除去し た。上ずみ液（約１５０ａ＋／）をＨＰＬＣ−カラム（２ｃｔａφＸ　２５　ｃ ｍ、逆相：　Ｓ＋−３００−ｐｏｌｙｏｌｂｕｔｙｌ　５μｍ）　（Ｓｅｒｖａ 社）に２．５　！ｌｊ！　１０Ｉｉｎの速度で導入した。試料保持後カラムの２ 倍容積で洗浄した。１０％ギ酸／６’０　％　２−プロパツール７３０％水に対 する１０Ｘギ酸／水の線形勾配により１８０分の間２．５　ｍ　１　／ｍｉｎの 送液速度に於いて、ｒＰＤＧＦ−Ａ−単量体を溶出した。ｒＰＤＧＦ−Ａは早＜ ４０〜５０分後に溶出したので、相当するフラクションを合体して、５４７　の 水を用いて透析した。

−への二 Ｓ−スルホン化した単量体ｒＰＤＧＦ−Ａの濃度を０．４ｍｇ／ｍ　１２　に調 節し、尿素を２Ｍの最終濃度になるまで添加し、更にグルタチオン（５ｍＭ）と 酸化グルタチオン（０，５ｍＭ）とを加えた。トリス−ＭＣＩ（場合によっては トリス塩基）を加えてｐＨを７．８に調節した（最終濃度は約５０−）。反応混 合物を室温で２日間放置した。

二量体ｒＰＤＦＧ−ＡＡをイオン交換クロマトグラフィーにより精製し更にこの 三員化生成物を１１　の−酢酸ナトリウム＜２０　ｍＭ、　ｐＨ５，１＞を用い て透析し、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　ＳＰ　６５０を充填したカラムニ導入 した。このカラムを酢酸ナトリウム（２０ｍＭ、　ｐＨ５，１＞で平衡化し、そ の際比率をタンパク質５　ｏｇ７カラム材料ｔａｌｌ　とした。ｐＨ５，１に於 いて酢酸ナトリウム（２０ｍＭ）とＮａＣ１（１００ｍＭ）とで洗浄してから、 ｐＦ１５．１に於いて酢酸ナトリウム（２０ｍＶ）中のＮａＣＩの線形勾配（１ ００ｍＭ〜４００　ｍＭ）により溶出を行った。勾配容積はカラム容積の１０倍 であった。

三員型は一量型より遅く溶出した。

実施例２　：　ＰＤＧＦ−ＡＢ ｒＰＤＧＦ−ＢをＰ　３８３４０７９．８　＝　ＰＣＴ／ＵＳ　８９／、、、、 、又は次の修飾により取得した。ｃ−ｓｉｓを含有するクローンｐＭＶＷ−２（ ｆｅｔｃｈ等１９８６）からのｌｌｌ１−ＤＮＡ−断片（２ｋｂ）を、ベクター Ｍ１３ｍｐ１８中の逆方向配位によりサブクローニングした。ＰＤＧＦ−Ｂ−鎖 の３°−コード領域をＳｍａｌで除いた。ｃ−ｓｉｓ−遺伝子の５゛−コード領 域を除去する為に、プラスミドをＰｓｔｌ　と５ａｉｌ　とで消化して、エキソ ヌクレアーゼ■の消化の為の５゛−及び３°−付着端を公知の方法により形成し た（）Ｉｅｎｉｋｏｆｆ）。第二鎖はＳｌの消化で除去した。使用するＤＮＡは 、ＤＮＡ−ポリメラーゼ−■−クレナウフラグメントの充満によりプラント末端 を備えていた。連結反応と形質転換後に、ＰＤＧＦ−８に相同の配列を含むコロ ニーを選択、配列して、エキソヌクレアーゼ■による消化の程度を調べた。−個 のプラスミドが分離されたが、これはＰＤＧＦ−Ｂ−配列を備えた読み枠の中の Ｍ１３ｍｐ１８−多重クローニング部位の５ｐ）ｌ　Ｉ一部位のＡＴＧ−開始コ ドンを含んでいた。成熟したＰＤＧＦの。

配列中のＡｒｇｌｌＯは特定部位の変異誘発によりＢｉｏＲａｄ−プロトコール による終結コドンに変わった。

株ＣＪ２３６　（２０ｌｌｌ１）にＭ１３ｍｐ１８の３　Ｘ　１０’フアージを 感染し、Ｕ−含有ファージを公知の方法で分離した。ＡｒｇｌｌＯを終結コドン に変エルタメ、−重鎮７７　＊−ＤＮＡ　ドプライア　−ＣＧＧ　ＣＣＴ　ＧＴ Ｇ　ＡＣＣＩｗＡＧＣＣＣＧ　Ｇとからハイブリッドを形成した。第２鎖はＴ４ −ポリメラーゼ添加後に合成した。配列決定後にいくつかの株が得られたが、こ れらは１１０の部位に終結コドンを含んでいた。これらの株の一つからＲＦ−Ｄ ＮＡを作り、５ｐ）ＩＩで部分的に消化した。５ｐＨＩ一部位の突出した３′− 末端はＴ４−ポリメラーゼ処理によりプラント末端に変えた。ＰＤＧＦ−Ｂ−配 列を含む、３５０塩基対を有する断片がＥｃｏＲＩ−消化により得られた。この 断片をｐＥＸ−２のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ一部位に連結した。単量体ｒＰＤＧ Ｆ−８の生産はｒＰＤＧＦ−Ａの生産と同様に行った。

ｒＰＤＧＦ−ＡＢを生産する為に、単量体ｒＰＤＧＦ−ＡとｒＰＤＧＦ−８とを 同量混合したく最終濃度は０．４　ａ＋ｇ／ａ＋　１　タンパク質）。三量化条 件と精製に就いては実施例１を参照されたい。

再生収率はｒＰＤＧＦ−ＡＡの場合より遥かに高かった（第４図参照）。

ｒＰＤＧＦ−ＡＢの生体活性はヒト血小板ＰＤＧＦ及びＥ、ｃｏｌｉからのｒＰ ＤＧＦ−８８と同等であった（第６図参照）。

第１表：　ｒＰＤＧＦ−イソ型のアミノ酸分析括弧内の数字は、公知の配列から 導かれたアミノ酸残基の数を示す。加水分解は２４時間実施した。システィンは システィン酸として測定し、分解又は不完全な加水分解に対する補正は行わなか った。

表の値は４測定の平均値である。

第２表：　ｒＰＤＧＦ−ＡＢのＮｌ２−末端配列分析２０μｇのｒＰＤＧＦ−Ａ Ｂを気体／液体配列決定法に使用した。

第２図 ５ＩＥＥＡＶＰＡＶ（ＪＴＲＴＶＴＹＥＩＰＲ５ＱＶＤＰＴＳＡＮＦＬＴＷＰＰ ＣＶＥＶＫＲＣＩ’ＧＣ口け５ＳＶＸＣＱＰＳＲＷＥＲ５ｖＫＶＡＫＶＥＹＶＲ ＫＸＰＫＬＫＥ’ＶＱＶＲＬＥＦＪＩＬＥＣＡＣＡＴＴＳＩ。

ＮＰＤＹＲＥＥＤＴＤＶＲ ５　ＡＢＣＤＥ　Ｆ 第４図 嘲−６６ 鵞　４５ ・　３９ ＡＢＣＤ　Ｅ　Ｆ　ＧＳ 成長因子　（ｎｇ／ｍｌ　） ｒＰＤにＦ　Ｌ　結合Ｌ　タ’　”　”国際調査報告 国際調査報告 ）１−■−〜１ｓ＋ｒｗ＋、Ｉ−曖一一一参一格ｇ　＋ａ　＋ｂｅ　ｐｍ＋’＋ ｄ−幀−−噌慴ｒ−糟！−吐ハＰ嶺−−−−轡餠崗一咋ｉ酢| ′：、＝＝−；＝：：ｌ：；：Ｈｉ’；：ｌ：二一’＋１ｗｒｈ　ｗ’ｔ−Ｐｌ ｊ−６叩に？鮎−−１，−一

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＰＤＧＦ−Ａ（単量体）又は生体活性を有する（増殖を促進する）ＰＤＧＦ −ＡＡ（二量体）であって、 Ｉ）Ｐ−ＥＸと （ａ）β−ガラクトシダーゼとアミノ酸配列（ｉ）【配列があります】（ｉ） のＰＤＧＦ−Ａから成る一個の融合タンパク質、又は（ｂ）（ａ）の融合タンパ ク質の一個の任意のアミノ酸が欠失しているか、一個の任意のアミノ酸が一個の 任意の他のアミノ酸で置換されているか、或いは一個の任意の部位にもう一個の 任意のアミノ酸を備えている一個の融合タンパク質、或いは（ｃ）（ａ）又は（ ｂ）の融合タンパク質のＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ酸が 欠失又は補充されている一個の融合タンパク質 をコードする異種ＯＮＡとから形成された一個のハイブリッドベクターを含むＥ ．ｃｏｌｉを用いて、（ａ），（ｂ）及び／又は（ｃ）による一個の融合タンパ ク質を発現し、 ＩＩ）生成した該融合タンパク質を（場合によっては還元後に）化学的に切断し て（Ｉ）（ａ）のアミノ酸を列の一個の単量体又は相当する一個の単量体を遊離 し、（但しその場合一個の任意のアミノ酸が欠失していてもよく、一個の任意の アミノ酸が一個の任意の他のアミノ酸で置換されていてもよく、或いは一個の任 意の部位にもう一個の任意のアミノ酸を備えていてもよく、及び／又はＣ−末端 又はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ酸が欠失又は補充されていてもよい） 、 ＩＩＩ）そのチオール基をスルホン化により保護し、ＩＶ）保護された単量体を クロマトグラフィーにより精製し、Ｖ）精製、保護された単量体のスルホン基を 還元し、場合によっては更に、 ＶＩ）保護を解かれた単量体をジスルフィド結合により二量体とし、その後で、 ＶＩＩ）生成した二量体をクロマトグラフィーにより精製する方法により生産し 得るＰＤＧＦ−Ａ（単量体）又は生体活性を有する（増殖を促進する）ＰＤＧＦ −ＡＡ（二量体）。
2. ２．生体活性を有する（増殖を促進する）ＰＤＧＦ−ＡＢであって、請求の範囲 第１項記載の段階（ＩＩＩ）に、請求の範囲第１項記載の段階（ＩＩ）によるＰ ＤＧＦ−Ａと、アミノ酸配列（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）【配列があります】（ｉｉ ） 【配列があります】（ｉｉｉ） のＰＤＧＦ−Ｂ、又はアミノ酸配列（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）に於いて、一個の任 意のアミノ酸が欠失しているか、一個の任意のアミノ酸が一個の任意の他のアミ ノ酸で置換されているか、或いは一個の任意の部位にもう一個の任意のアミノ酸 を備えているか、及び／又はＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ 酸が欠失又は補充されている一個のアミノ酸配列のＰＤＧＦ−Ｂとを使用し、請 求の範囲第１項記載の段階（ＩＩＩ）乃至（ＶＩＩ）により処理してＰＤＧＦ− ＡＢを得る方法により生産し得る、生体活性を有する（増殖を促進する）ＰＤＧ Ｆ−ＡＢ。
3. ３．ＰＤＧＦ−Ａ（単量体）及び場合によっては生体活性を有する（増殖を促進 する）ＰＤＧＦ−ＡＡ（二量体）の生産方法であって、Ｉ）Ｐ−ＥＸと 【配列があります】（ｉ） のＰＤＧＦ−Ａから成る一個の融合タンパク質、又は（ｂ）（ａ）の融合タンパ ク質の一個の任意のアミノ酸が欠失しているか、一個の任意のアミノ酸が一個の 任意の他のアミノ酸で置換されているか、或いは一個の任意の部位にもう一個の 任意のアミノ酸を備えている一個の融合タンパク質、或いは（ｃ）（ａ）又は（ ｂ）の融合タンパク質のＣ−末端又はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ酸が 欠失又は補充されている一個の融合タンパク質 をコードする異種ＤＮＡとから形成された、一個のハイブリッドベクターを含む Ｅ．ｃｏｌｉを用いて、（ａ），（ｂ）及び／又は（ｃ）による一個の融合タン パク質を発現し、 ＩＩ）生成した該融合タンパク質を（場合によっては還元後に）化学的に切断し て（Ｉ）（ａ）のアミノ酸配列の一個の単量体又は相当する一個の単量体を遊離 し、（但しその場合一個の任意のアミノ酸が欠失していてもよく、一個の任意の アミノ酸が一個の任意の他のアミノ酸で置換されていてもよく、或いは一個の任 意の部位にもう一個の任意のアミノ酸を備えていてもよく、及び／又はＣ−末端 又はＮ−末端に於いて１４個までのアミノ酸が欠失又は補充されていてもよい） 、 ＩＩＩ）そのチオール基をスルホン化により保護し、ＩＶ）保護された単量体を クロマトグラフィーにより精製し、Ｖ）精製、保護された単量体のスルホン基を 還元し、場合によっては更に、 ＶＩ）保護を解かれた単量体をジスルフィド結合により二量体とし、その後で、 ＶＩＩ）生成した二量体をクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする 、ＰＤＧＦ−Ａ（単量体）及び場合によっては生体活性を有する（増殖を促進す る）ＰＤＧＦ−Ａ（二量体）の生産方法。
4. ４．前記段階（Ｉ）にｐＥＸ、例えばｐＥＸ１，ｐＥＸ２又はｐＥＸ３を用いて 形成した一個のハイブリッドベクターを備えたＥ．ｃｏｌｉを使用することを特 徴とする、請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記段階（ＩＩ）に於いてブロモシアンにより切断することを特徴とする、 請求の範囲第３項又は第４項に記載の方法。
6. ６．前記段階（ＩＩＩ）に於いて亜硫酸塩及びジチオン酸塩の存在下でスルホン 化することを特徴とする、前記請求の範囲の何れか１項に記載の方法。
7. ７．前記段階（ＩＶに於いてゲル浸透クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマ トグラフィーにより精製することを特徴とする、前記請求の範囲の何れか１項に 記載の方法。
8. ８．前記段階（ＩＶ）に於いてゲル浸透クロマトグラフィーを、変性剤、例えば 塩酸グアニジンの例えば１乃至６Ｍの範囲のモル濃度の存在下で実施することを 特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．前記段階（Ｖ）及び（ＶＩ）を、例えば（ａ）尿素（例えば４Ｍまでのモル 濃度）及び（ｂ）チオール試薬、例えば −−２−メルカプトエタノール（例えば２％迄の濃度）、−−グルタチオン（例 えば１００ｍＭまでのモル濃度）、並びに−−ジチオトレイトール及びジチオエ リトリトール（例えば１００ｍＭまでのモル濃度） の存在下で、共通に実施することを特徴とする、前記請求の範囲の何れか１項に 記載の方法。
10. １０．前記段階（ＶＩＩ）に於いて逆相クロマトグラフィー及び／又はイオン交 換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、前記請求の範囲の何れ か１項に記載の方法。
11. １１．請求の範囲第３項記載の段階（ＩＩＩ）に、段階（ＩＩ）による相異なる ２個の単量体を使用することを特徴とする、前記請求の範囲の何れか１項に記載 の方法。
12. １２．請求の範囲第３項記載の段階（ＩＩＩ）に、請求の範囲第３項記載の段階 （ＩＩ）によるＰＤＧＦ−Ａと請求の範囲第２項記載のＰＤＧＦ−Ｂとを使用し 、請求の範囲第３項記載の段階（ＩＩＩ）乃至（ＶＩＩ）を実施してＰＤＧＦ− ＡＢを得ることを特徴とする、ＰＤＧＦ−ＡＢの生産方法。
13. １３．請求の範囲第１項及び第２項記載のＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−ＡＡ及び／ 又はＰＤＧＦ−ＡＢを作用物質とし、場合によってはこれと通常の担体、希釈剤 及び／又は一個又はいくつかの他の成長因子又は創傷治療促進物質とを組み合わ せることを特徴とする、創傷処置用薬剤。
14. １４．その他の成長因子として、ＩＧＦ−Ｉ（インシュリン様成長因子），ＩＧ Ｆ−ＩＩ，α−ＴＧＦ，β−ＴＧＦ及び／又はＥＧＦを特徴とする、請求の範囲 第１３項記載の薬剤。