JPH04504653A - アデニル酸シクラーゼ反応の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アデニル酸シクラーゼ反応の調節 針９分団 本発明はアデニル酸シクラーゼ系および珪酸、すなわち−珪酸または密接に関連 する分子種による咳系の刺戟または阻害に関する。珪酸がアデニル酸シクラーゼ 基礎活性ならびにホルモンで刺戟されたアデニル酸シクラーゼ活性を調節するこ とが発見された。

発朋至背景 外部の化学メンセンジャー、たとえばホルモン、リンホカイン、成長因子、神経 伝達物質等に対する多くの細胞の反応性はこれらの物質への受容体によって引き 出される。種々のこれらの受容体がアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）のサイタリンク アデノシンー燐酸（サイクリックＡＭＰ、または略してｃＡＭＰ　）およびピロ 燐酸塩への転化を触媒する酸素系の一種であるアデニル酸シクラーゼと結合して いる。細胞内にサイクリックＡＭＰを遊離させると他の酵素の活性化をひき起し て、最後に生物学的反応を生じる。疾病の治療、または生理的状態の制御におけ る重要なアプローチはこれらメツセンジャーに対する細胞の反応性を修正する能 力である。そうすることにより、層特有の機構によって多くの条件を修正するこ とが可能となる。本明細書に開示され、請求される本発明中に具体化される発見 においては、これまで試験を行ったサイクリンクＡＭＰ系はすべて珪酸塩処理に 反応する。

米国では２０００万人の人が骨粗鬆症にかかっており、その結果年間１３０万人 の骨折によって６１億ドルを費している（Ｒｉｇｇｓ、Ｌ、Ｂ、およびＭｅｌｔ ｏｎ、Ｌ、Ｓ、　ｍ　：　Ｉｎｖｏｌｕｔｉｏ−ｎａ　ｌ　Ｏｓ　ｔｅｏｐｏｒ ｏｓ　ｉｓ　、シイｒ工請垣虹２６　：１６７６−１６８６　（１９８６年）） 、骨粗鬆症の主要寄与要因は自然的な更年期による年令に関係する骨のミネラル の減少およびニステロゲンの欠乏である（Ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ　Ｃｏｎｆｅｒｅ ｎｃｅ　：　０ｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ、ＪＡＭＡ　２５２　：　７９９−８０ ２（１９８４年）；へｖｉｏ１ｉル、Ｖ、：０ｅｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｐａ ｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ［Ａｖｉｏｌ潤AＬ、Ｖ。

およびＫｒａｎｅ、　ｓ、Ｍ、編集Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｂｏｎｅ　Ｄｉｓｅａ ｓｅ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ第P 巻３０７−３８５頁（１９７７年）］）。この減少を招く機構は明かではない。

サイクリ、りＡＭＰはＰＴ）Ｉのみならず骨にあるカルシトニンのような他のホ ルモンの作用をも媒介する物質と判明している（Ｃｈａｓｅ、　Ｌ、Ｒ，および ＾ｕｒｂａｃｈ、Ｇ、Ｄ、　：ＴｈｅＥｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐａｒａｔｈｙｒｏ ｉｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　 Ａｄｅｎｏｓｉｎ■|３’　、５　’ −Ｍｏｎｏｐｆｉｏｓｐｈａｔｅ　Ｉｎ　５ｋｅｌｅｔａｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ｉ ｎ　ｖ珪ｒｏ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４５：１５２O−１５２６ （１９７０年）；Ｌｕｂｅｎ、Ｒ，Ａ、、Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｌ、およびＣｏｈｎ、 Ｄ、Ｖ、：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ嘯≠煤| ｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｐａｒａｔｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｃａ１ｃｉｔｏｎｉｎ 　ｏｆ　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　Ｂｏｎｅ　Ｃｅ１ｌｓ：Ｐｒｏ魔奄唐奄盾獅≠■ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　０ｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ　Ａｎｄ　０ｓ ｔｅｏｂｌａｓｔｓ、ハ如！工庶色鉦９９：５２６−５３４（１９７６年）　； 　ＰｅｃｋＪ、Ａ、、Ｂｕｒｋｓ、Ｊ、に、、Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｊ、、Ｒｏｄａ ｎ、Ｓ、Ｂ、およびＲｏｄａｎ、　Ｇ、@Ａ、　： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ 　Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｌｌｏｒｍｏｎｅ、Ｃａ１ｃｉ狽盾獅奄氏@Ａｎｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｏｎ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ、７１０ ０：１３５７−１３６４　（１９７７年）：Ｒｏｄａｎ、　Ｇ、Ａ、およびＭａ ｒｔｉｎ、Ｔ、Ｊ、：Ｒｏｌｅ　ｏｆ　０ｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　Ｉｎ　Ｈｏｒ ｍｏｎａｌ　Ｃｏｎｔｒ盾戟@ｏｆ　Ｂ ｏｎｅ　Ｒｅ５ｏｒｐｔｉｏｎ−−Ａ　Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ、Ｃａ１ｃｉｆ、 Ｔｉ５ｓｕｅｊｎｔ、、３３：３４９−３５１（１９８１年j。サ イクリ７クＡＭＰの生成に関与する酵素であるアデニル酸シクラーゼは下記３成 分により成るタンパク質複合体である：ホルモン特定受容体、グアニンヌクレオ チド結合タンパク質（ＮｓおよびＮｉ）、ならびに触媒単位（Ｒｏｓｓ＋Ｅ、門 、およびＧｉｌｍａｒ。

Ａ、Ｇ、：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｏｐｃｒｔｉｅｓ　ｏｒ　Ｈｏｒｍｏ ｎｅ　５ｅｈｓｉｔｉｖｅ　Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌ≠唐■AＡｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、４９：５３３−５６４　（１９８０年））。特定の 受容体へのホルモンの結合から生じるアデニル酸シクラーゼ活性の刺戟は刺戟性 グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｎｓの活性化；阻害性グアニンヌクレオチ ド結合タンパク質Ｎｉの活性化により生じるアデニル酸シクラーゼ活性の阻害に よってもたらされる（Ｓｍｉｇｅｌ、Ｍ、、Ｋａｔａ−ｄａ＋Ｔ、＋Ｎｏｒｔｈ ｕｐ＋Ｊ、に、＋Ｂｏｋｏｃｈ＋Ｇ−Ｍ−＋Ｕｉ＋Ｍ−およびＧｉｌ＋＋ａｎ、 Ａ、Ｇ、：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏ■@Ｇｕａｎｉ− ｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｒｅｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ［fｒｅｅｎｇａｒｄ 。

Ｐ、［集へｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｃｃｌｉｃ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｈｏｓ　ｈｏｒ　１ａｔｉｏｎ　Ｒｅ５■唐窒モ■B １７：１−１８、Ｒｅｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９年）］ 　；　Ｃｏｔｅ、Ｔ、Ｅ、、Ｆｒｅｙ、Ｅ、Ａ、および５ｅ汲浮窒＝B Ｒ，Ｄ、：Ａｌｔｅｒｅｄ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒｙ　Ｇｕａｎｙｌ　Ｈｕｃｌｅｏｔ司ｅ−Ｂｉｎｄｉｎ■@Ｃｏｍｐｏｎ− ｅｎｔ（Ｎｉ）Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｂｙ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｎ　Ｔｏｘｉｎ、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：８６９３−８６９８（１９８S年））。一 定の系に表われる総体的なアデニル酸シクラーゼ活性は存在する活性化されたＮ ｓおよび階の相体的比率を反映するように思われる。アデニル酸シクラーゼ−サ イクリックＡＭＰ系の活性化はグアニンヌクレオチドが存在するときの酵素複合 体の構造成分とＭｇ”との配位相互作用に関係する（ｌｙｅｎｇａｒ、　Ｒ，お よびＢｉｒｎｂａｕｍｅｒ、　Ｌ、　：）１ｙｓｔｅｒｉｃ　Ａｃｔｉｖａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　Ａｄｅｎｙｌｙｌ　Ｃｙｃｌａｓｅｓ：１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｐｆ　 Ｍｇ　Ｊｏｎ　ｏｎ@Ｔｈｅ　Ｒａｔｅ ｏｆ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ＢｙＧｕａｎｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　 Ａｎｄ　Ｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５U：１１０３６− １１０４１）。、はとんどのホルモンがアデニル酸シクラーゼのマグネシウム親 和力を増大させると判明しており（Ｉｙｅｎｇａｒ、Ｒ，およびＢｉｒｎｂａｕ ｍｅｒ、１．、：）ｌｏｒｍｏｎｅ　ＲｅｃｅｐｔｏｒＭｏｄｅｌａｔｅｓ　Ｔ ｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　Ａｄｅｎｙｌｙｌ　 Ｃｙｃｌａｓｅ　Ｂｙ　Ｒｅｄｕｃ奄獅■@Ｉｔｓ Ｐｅｑｕｉｒｅｎ＋ｅｎｔ　Ｆｏｒ　Ｍｇ”　Ａｎｄ　Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　Ｉ ｔｓ　Ｅｘｔｅｎｔ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｂｙ　fｕａｎｉｎｅ Ｎｕｃ　ｌｅｏ　ｔｉｄｅｓ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　ｌ　、　ａｃａｄ、 　Ｓｃ　ｉ　、　（ＵＳＡ）　７９　：　５１７９−５１８R　（１９８２年） ；Ｃｅｃｈ、Ｓ、シ、、Ｂｒｏａｄ−ｄｕｓ、Ｗ、Ｃ，およびＭａｇｕｉｒｅ、 Ｍ、Ｅ、：Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ：Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｍ ａｇｎｅｓｉｕｍ@Ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ　Ｄｉｖａｌｅｎｔ　Ｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、３３：６７−９２（１９８０年））、ホルモン活性化の機構はアデニル 酸シクラーゼ複合体の恥゛親和力の増大に関係すると提案されている。

カルシウムもアデニル酸シクラーゼ活性に影響を及ぼすことが知られている。

０．０１ないし１．０ミリモル濃度のＣａ”によるアデニル酸シクラーゼの阻害 はすべての？デニル酸シクラーゼ酵素の一般的性状であるように思われる（Ｃｅ ｅｈ、　Ｓ、Ｖ、　＋ＢｒｏａｄｄｕｓＪ、Ｃ，およびＭａｇｕｉｒｅ、Ｍ、Ｅ 、：Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ：Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｍａｇｎ ｅ唐奄浮■ Ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｄｉｖａｌｅｎｔ　Ｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３３：６７−９２（１９８０年））。モ泣ｃb トの骨の中のアデニル酸シクラーゼ活性に対するＣａ″の作用についての過去の 研究によって約１マイクロモルおよび２００マイクロモルのカルシウム解離定数 を有する２つのカルシウム阻害部位の存在が明らかにされた（Ｒｕｄｅ、Ｒ，に 、：Ｒｅｎａｌ　Ｃｏｒｔ−ｉｃａｌ　Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｇｎｅｓｉｕｓ　Ａｃｔｉｖａ ｔｉｏｎAＥｎｄｏｃｒｉｎ− 配ｍα１１３：１３４８−１３５５（１９８３年）；Ｒｕｄｅ、Ｒ，に、　：５ ｋｅｌｅｔａｌ＾ｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ：Ｅｆ■■モ■ ｏｆ　Ｍｇ”、Ｃａ”およびＰＴＨ，Ｃａ１ｃｉｆ、Ｔｉ５ｓｕｅ、Ｉｎｔ、　 ３７：３１８−３２３（１９８５年））。高親和力のカルシウム阻害部位は骨ア デニル酸シクラーゼの調節に生理的役割を演するようである。

珪素は重要な微量元素であると言われている（Ｃａｒｌｉｓｌｅ＋Ｅ、Ｍ、：５ ｉｌｉｃｏｎ　ａｓ　ａｎＥｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｅｌｅｍｅｎｔ、　Ｆｅｄ、Ｐ ｒｏｃ、　３３：１７５８−１７６６（１９７４年）；Ｃａｒｌｉｓｌｅ、Ｅ、 Ｍ、：Tｉｌｉｃｏｎ Ａｓ　Ａｎ　Ｅｓ５ｃｎｔｉａｌ　Ｔｒａｃｅ　Ｉｎ　Ａｎｉ＋ｎａｌ　Ｎｕｔ ｒｉｔｉｏｎ［５ｉｌｉｃｏｎ一旦７．．　Ｗｉｌｅｙ。

Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 　１２１）ｐｐ１２３−１３９（１９８６年）］）、生体組D の中では、結合組織に最大レベルの珪素が存在する。子供の珪素欠乏は正常な骨 格の発達を阻害するように考えられている（Ｃａｒｌｉｓｌｅ、Ｅ、Ｍ、：５ｉ ｌｉｃｏｎ：Ａｎ　Ｅｓ５ｅｎｔｉ−ａｌ　Ｅｌｅｍｅｎｔ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　 Ｃｈｉｃｋ、５ｃｉｅｎｃｅ、１７８：６１９−６２１　（１９７２年））。珪 素は進行中の骨の成長および／またはミ７ラル化の方面で必要であるように思わ れる（Ｃａｒｌｉｓｌｅ。

Ｅ、Ｍ、：５ｉｌｉｃｏｎ二Ａｎ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｅｌｅｍｅｎｔ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　ＣｈｉｃｋＳ　１ｂｉｄ、；ＣａｒｌｉｓｌｅAＥ、Ｍ、Ｈ５ｉｌ − ｉｃｏｎ：Ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｃａｌｃｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ、、５ｃｉｅｎｃｅ　１６７：２８０（１X７０年））、こ れらの影響はビタミンＤとは無関係である（Ｃ，１ｒｌｉｓｌｅ、８．Ｍ、　： ５ｉｌｉｃｏｎ：＾Ｒｅｑｕ　ｉｒｅｍｅｎ　ｔＩｎ　Ｂｏｎｅ　Ｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ　ｔｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ、Ｃａ１ｃｉｆ、 Ｔｉ５ｓｕｅＩｎｔ、　３３F２７−３４ （１９８１年））。

他の研究者の先行データは珪素化合物が骨の量を殖すことができることを示して いる。珪素化合物は骨粗Ｒ症の治療に有効であろうと言われている（欧州特許出 願第８６−１１６３６３．２号）。

発咀辺要約 珪酸はアデニル酸シクラーゼ基礎活性およびホルモンで刺戟したアデニル酸シク ラーゼ活性を修正させる。この増加は研究したすべての組織に生じているので、 本効果は普遍的なものであると思われる。

この効果のもとになる機構は明かでない。エチレングリコール０，０′−ビス（ ２−アミノエチル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ−四酢酸（ＥＧＴＡ）が存在する場合に 珪酸の効果があることを見ると、珪酸が単にイオン化Ｃａ”との結合によって作 用しようとするだけで、その結果Ｃａ”の阻害作用を除くことによってアデニル 酸シクラーゼ活性を増加させようとするのであろうということが示唆される。Ｃ ａ”が重要な細胞内の第２メンセンジヤーであって、珪酸が細胞内に存在してい るので、これは生体内での珪酸の効果が考えられる機構である。しかし、実験結 果は、それ以上のことが関与していることを示している。珪酸は恐ら＜Ｍｇ”と も結合してアデニル酸シクラーゼ活性の低下をひき起すことになろう。このこと はＣａ″０が少なく　（０，２マイクロモル）でも珪酸が活性の阻害をもたらす 腎臓および／または肝臓アデニル酸シクラーゼ系（後記）に関する知見を説明で きるかもしれない。しかし、−珪酸は極めて弱い酸であって、水酸化物の沈殿が 生じるレベルよりも僅かに低いｐＨレベルにおいて金属イオンと作用し合うだけ で、生理的ｐＨではＣａ”および？１ｇ”を排除する傾向があるであろうと考え られる。

考えられる機構はほかにもある。−珪酸はＮタンパク質のＭｇ”活性化もしくは Ｃａ”阻害化またはＮタンパク質に対するこれら２価のカチオンの親和力に影響 を及ぼすことができる。さらに、珪酸は直接Ｎｓの活性化またはＮｉ活性の阻害 化をひき起すことができるかもしれない。他の考えられる機構にはホルモンによ るに活性化の低下または接触的サブユニット活性の直接的増加がある。

これらの知見の臨床的意義はまだ明かになっていない。珪酸の欠乏は子供の正常 な骨格の発達を阻害し、補給珪素が骨の成長を増進する。これらの効果はアゾ組 織に与える顕著な効果を説明するものであろう。骨粗に症の治療に珪酸の潜在的 有用性の重要なことは明かである。

区血ｑ同単笠説皿 図１＝肝臓アデニル酸シクラレーゼ（ａ、ｃ、）活性に対するＮａＦ、　０．５ ．１．０および２．０ｍＭ５ｉ、グルカゴン、ならびにグルカゴン＋０．５．１ ．０および２．軸Ｈ珪酸の効果。珪酸はすべての濃度でグルカゴンで刺戟したａ 、ｃ、活性を増大させた。

図２：腎臓ａ、ｃ、活性に対するＮａＦ、０．５．１．０および２．０ｍＭ珪酸 、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ならびにＰＴＨ＋０．５．１．０および２．０ ＩｏＭ珪酸の効果。珪酸は０．５ｍＭで若干ａ、ｃ、活性を低下させたが２．ｈ Ｍでは刺戟した。同様に０．５１Ｍの珪酸はＰＴＨで刺戟したａ、ｃ、活性を低 下させた。しかし、１．０および２．０ｍＭの珪酸はＰＴ）Ｉ効果を増大させた 。

図３：甲状腺ａ、ｃ、活性に対するＮａＦ、０．５．１．０および２．Ｏｎ＋Ｍ 珪酸、甲状腺刺戟ホルモン（ＴＳＨ）ならびにＴＳ）Ｉ＋０．５．１．０および ２．軸珂珪酸の効果、珪酸は全濃度においてａ、Ｃ，活性を増大させた。また１ 、０および２．０ｍＭ珪酸はＴＳＨで刺戟したａ、ｃ、活性を増大させた。

図４＝骨ａ、ｃ、活性に対するＮａＦ、０．５．１．０および２．０１珪酸、Ｐ ＴＨならびにＰＴＨ＋０．５．１．０および２．軸門珪酸の効果。珪酸は全濃度 においてａ、ｃ、活性を高めた。さらに全濃度の珪酸はＰＴＩＩで刺戟したａ、 ｃ、活性効果をも増大させた。

図５　：　０．５ｍＭのエチレングリコール−０，０′−ビス（２−アミノエチ ル）−Ｎ。

Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）の無いとき（Ａ部）またはあるとき （Ｂ部）の肝臓アデニル酸シクラーゼ活性に対する２ｍＭ珪酸の効果の比較、Ａ 部では概算のＣａ”が１０マイクロモルであり、Ｂ部ではＣａ”の計算値が０． ２マイクロモルに等しい。Ａ部でわかるように珪酸は基礎活性およびグルカゴン で刺戟した活性を高めた。　ＥＧＴＡの添加はアデニル酸シクラーゼ基礎活性の みならずグルカゴンで刺戟したアデニル酸シクラーゼ活性の顕著な増加を生じた 。これらの条件下では２．軸Ｈ珪酸は効果がなかった。

図６：２．Ｏミリモル珪酸が有るとき（０−−−−Ｏ）と無いとき（・−一一一 ・）の骨アデニル酸ツクラーゼに対するＭｇ”の効果。Ａ部のデータの逆数をプ ロ、トした２つをＢ部に示す。珪酸はＶｍａｘの増加を生じたがにａＭｇはほと んど変化しなかった。

図７：２．ＯｍＭの珪酸が有るとき（ｏ−−−−ｏ）と無いとき（ｘ−−−−ｘ ）の０．１マイクロモルないし１ｍＭのＣａ”によるアデニル酸シクラーゼ活性 の阻害、珪酸は酵素の活性を阻害するＣａ”の能力を妨げることは認められなか った。

図８：０．５ｍＭのＥＧＴＡがあるときのアデニル酸シクラーゼ基礎活性および グルカゴンで刺戟した肝臓細胞アデニル酸シクラーゼ活性に対する０、５．１． ０および２．０ＩＩＭの珪酸の効果。珪酸の濃度を高めると漸次酵素の活性を阻 害した。

好適久慈様少説朋 本発明はアデニル酸シクラーゼを調節する方法において、僅カ九ｔＫシクラーゼ を僅かな調節量の一珪酸と接触させることを含む方法に関する。好適な態様にお いては、本発明はホルモンで刺戟したアデニル酸シクラーゼ系の調節に関する。

本発明は多くのアデニル酸シクラーゼ系を珪酸で調節することができるという発 見より成る。たとえば、肝臓、腎臓、甲状腺および骨の組織内のアデニル酸シク ラーゼ系を調節することができる。本発明の目的において「調節する」とは増進 するかまたは阻害するという意味である。

このように、本発明はアデニル酸シクラーゼ系、特に温血を推動物の該系を調節 するための珪酸の使用に関する。珪酸はそれ自体を処置する動物に投与すること ができる。もしくは、動物に投与する治療薬剤から動物検体によって生体内で珪 酸を産生させることができる。珪酸は処置する動物の胃腸管内、または胃腸粘膜 内、または他の部位で産生させることができる。珪酸は一珪酸、もしくは他の溶 解可能かまたは懸濁可能な水和珪酸もしくは水系たとえば血漿のような生理的媒 質中で珪酸を重合させて得られる珪酸誘導体であることができる。該物質の塩類 、たとえばナトリウム塩およびカリウム塩は珪酸源として有用である。

本発明に用いられる珪酸種の濃度は僅かな量で、通常最高珪酸のほぼ飽和レベル である。一般に、濃度は約０．０５ないし約２．０ミリモルであることができる 。所望の場合には、若干この範囲を超える濃度を用いることができる。たとえば 、前記であると、濃度は飽和レベルを超えることができ、生理的流体中にｇ濁さ せた珪酸の懸濁微粒子（たとえば、０．１ないし５．０ミクロン）を混合した懸 濁飽和溶液であることができる。低濃度は、選択的、差異的効果を得るために、 成る部位および酵素活性の成るレベルでは適当であることができる。

動物に投与する有効薬剤の量は、所望の反応を遂行するのに必要なように（前記 パラメーター内の濃度を得るように）選択する。

実験方法 （ａ）　酵素訓裂 ＪｉＪｌｌ−Ｈａｒｌｅｙ系モルモット（５５０−６００ｇ　）をベントハルビ タールで麻酔させ、胸腔を開いて殺した（Ｒｕｄｅ、Ｒ９に、、ｈ匡９士庶謄鉦 １１３：１３４Ｂ−１３５５（１９８３年））、上肢および下肢の長骨を迅速に 切り開いて付着筋肉を取り除き、０．２５鋼阿のスクロース、２５−Ｍのトリス （ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ　Ｈ（Ｊ）　、および７． ０＋＋Ｍノ（ＥＧＴＡ）を含む４°ｃの緩衝液（ｐＨ７，４）　（緩衝液Ａ）に 入れた。骨の骨幹部分を分離して、残存する筋肉および連結組織を除去した０次 に骨を縦に割き骨髄を除去した。さらに骨を微粉砕し、緩衝液Ａで洗い、ドライ アイスで凍結し、ついで５ｐｅｘフリーザー／ミル（Ｓｐｅｘ　Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉｅｓｊｎｃ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）内の液体り中で３分 間粉砕した。さらにポリトロンホモゲナイザーを用い氷冷した緩衝液Ａ中で１０ ないし１５秒間均質化を行った。ホモジネートは５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ２−８冷 凍遠心分離器中２２００ｘｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを緩衝 液Ａ中に再懸濁させ、４８０ｘｇのオン・オフ制御で酸遠心分離して、重質粒子 を除いた。次に上澄み液をさら２２００ｘｇで１０分間遠心分離し、ペレットを 再び緩衝液Ａ中で洗って、再遠心分離した。この最後ペレットを緩衝液Ａ中で再 び液体に戻し、一定量をガラス管に取って酵素の分析まで一７０’Ｃに貯蔵した 。分析直前に、原子吸光分析法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　５６０、Ｎｏｒｗ ａｌ、　Ｃｏｈｎｅｃｔｉｃｕｔ）で測定して上澄み液中のＣａ”濃希釈する前 に、２５−のＴｈ１ｓ　Ｈ（Ｊ、　３０ｍＭのにＣ／、ＩＩＩＭのジチオトレイ トー）Ｌ、　（ＤＴＴ）、０．０１３パーセント（重量／容量）ウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）より成る４°Ｃのアデニル酸ツクラーゼ分析緩衝液（ｐＨ８，０ ）の２０容量で２回洗った。

あとの実験では、脱調製にスクロース密度分画工程を加えた。４５０ｘｇで遠心 分離後直ちに、上澄み液を６０パーセントのスクロースを含む１５ミリリツトル 容量の骨緩衝液の上に層状化させ、１９２χｇで２０分間遠心分離した。スクロ ース層の上部に局在する膿画分を捕集した。次に前記のようにカルシウムがなく なるまで洗った。この方法は膜試料の特定活性をほぼ２倍高めた。

Φ）腎臓五よび甲状腺 殺した後で、腎臓を迅速に取り出した、０．２５ｍＭのスクロース、２５ｍＭの Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ（３０°ＣでｐＨ７，５）、１＋Ｈのエチレンジアミン四酢 酸（ＥＤＴＡ）　、および１＋＊ＭのＤＴＴを含む４°Ｃの緩衝液０４中に移し た。腎被膜を取出し、脂肪を切断して除いた後、腎臓を矢状に割き、そのモジュ ラ（ｍｏｄｕｌｌａ）から皮質を切り取った０次に腎皮質をメスで細かく刻み、 ６ストロークの冷却したガラス製Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザーで均質化した。ホ モジネートは５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ２−Ｂ遠心分離器中４８０ｘｇで１０分間遠 心分離した。得られたペレ・ントを２５ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣＩ　（３０°Ｃで ｐＨ７，５）、１ｍＭのＤＴＴ、　３０Ｉｌ１ＭのＫＣＺ、および０．１３パー セント（重量／容量）のＢＳＡを含む４°Ｃの緩衝液に再懸濁させて、半精製細 胞膜試料として使用した。一定量をガラス管に取り、酵素を分析するまで一７０ ’Ｃに貯蔵した。モルモットの甲状腺および肝臓からも細胞膜を得た。甲状腺を 取出し、脂肪組織から切り離し、腎皮質について述べたように細胞膜を調製した 。

肝臓を取り出し、冷却ペトリ皿の中で十分に切り刻んだ０組織を大型Ｄｏｕｎｃ ｅホモゲナイザー（６ストローク）内でｏ、ｏｏｉモルのＮａＨＣＯｉ　（４° Ｃ）中に均質化させた。プールしたホモジネートを４’Ｃの０．００１モルＮａ ＨＣＯｉ　５００ミリリツトル中で３分間洗った。１５００ｘｇで１９分間遠心 分離後、ペレットを０．００１モルのＮａＨＣＯ＋、１ｎ＋ＭのＥＤＴＡ、およ び１ｍＭのＤＴＴ中に再び均質化させた０次にホモジネートを２２００ｘｇで１ ０分間遠心分離した。得られたペレットを還元緩衝液中で洗い、再び２２００ｘ ｇで分間遠心分離し、このペレットの一定量を酵素分析まで一７０°Ｃに貯蔵し た。

（Ｃ）酵素分析 １０−５０マイクログラムのタンパク質を含む一定量の膜懸濁液を、３０ｍＭの ＭＣＩ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）１８．０）、ｉｎ＋Ｈのジチオト レイトール、０．５ｍＭのサイクリック八ＭＰ、２．５μＣｉの”Ｐ−ＡＴＰ（ Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ｌ１ｌ ｉｎｏｉｓ）、１−Z ＡＴＰ、ならびに総容１１００μ！中に２．５単位のピルビン酸キナーゼ方法０ ．３■のエノルビルビン酸−２−燐酸より成るＡＴＰ再生系を存在させて３０° Ｃで１５分間培養した。

ＭｇＣｌ２を加えて所望の濃度にした。Ｍｇ”およびＭｇ−ＡＴｐの所望の濃度 を得るために必要なＡＴＰおよびＭｇ（Ｊ、の量は？ＩｇとＡＴＰとの間の適切 な多段平衡を表わす連立方程式の計算機助成解法でめた。新しい実験にはＣａＣ １ｚおよびＨＧＴＡを加えである。

反応反応混合物中に０．５ａ＋ＭのＥＧＴＡを使用すると、次の２つの目的に役 立つ＝（１）（：、ａ６４の低濃度媒質をつくること、および（２）反応混合物 中にカルシウムおよびマグネシウムの緩衝系を生成させること。Ｍｇ”、ＣａＩ ｎおよびＭｇ−ＡＴＰの所望の濃度を得るのに必要なＡＴＰ＝　ＭｇＣＬｚの量 はこれらのカチオンとＡＴＰとＥＧＴＡとの間の適切な多段平衡を表わす連立方 程式の計算機助成解法によってめた。

珪酸、ｎ−水和物、Ｐｏｗｅｒ、’　Ｂａｋｅｒ分析処理」試薬をＶＷＲ５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃから購入して、アデニル酸シクラーゼ分析用添加物として使用し た。珪酸は脱イオン水で分析濃度の１０倍の濃度につくり、さらに分析緩衝液で 最終濃度にした。

址粟濃斐Φ浬定 分析系中の珪素濃度を算定するために、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　５６０分光 度計を用い、原子吸光分析法によって測定した。珪素、１１０００ｐｐ溶液（原 子吸光標準液）および珪素の標準物質はＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し た。

試脹績果 本発明は４．ｈＭのＭｇおよびＩＩＩＩＭのＭｇ−ＡＴＰを存在させて、アデニ ル酸シクラーゼ基礎活性およびホルモンで刺戟したアデニル酸シクラーゼ活性に 対する一珪酸の効果より成る。−珪酸は０．５ｍＭ、１．軸門、および２．０ｍ Ｍの濃度で添加した。さらに高い濃度は珪酸高分子物の沈殿をもたらす（Ｉｌｅ ｒ、Ｒ，に、：Ｔｈｅ　０ｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　Ｄｉｓｓｏｌｕ−ｔｉｏｎ、ａ ｎｄ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｉｌｉｃａ［Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　ｏｆ　５ｉｌｉｃａ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ凵@ａｎｄ　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１０頁］）。ＮａＦも絶対的な対照として各分析に包含させ た。

アー′ニル　シクーーゼ 図１は分析管当り生成したピコモル単位のサイクリックＡＭＰにおける肝臓アデ ニル酸シクラーゼを示す。基礎活性は１２．５ピコモル　サイクリ、りＡＩＩＰ であり、ＮａＦは４５ピコモル　サイクリックＡＭＰであった。見てわかるよう に、０．５ｄの珪酸は基礎活性に対してほとんど効果がなかったが、２．０ＭＭ の珪酸は活性がほぼ２倍になった。グルカゴン（Ｇｌｕ）は基礎活性を１７ピコ モル／管に高めた。珪酸の存在はすべての濃度でＧｌｕ効果を著しく高め、その 結果Ｇｌｕ士２．ＯａＭ珪酸はＮａＦよりも高い活性をもたらした（５２ピコモ ル／サイクリンクＡＭＰ／管）。表１に得られた結果を示す。

表Ｉ 生成ムんサイク１ルク静Ｐピコモル　−基礎活性　１３．７ Ｎａ　Ｆ　４５．２ Ｓｉ、　０．５ｄ　１２、Ｉ Ｓｉ、　１．軸門　１７．２ Ｓｉ、　２．０ｍＭ　２２．２ グルカゴン　１９．６ グルカゴン＋Ｓｉ、　０．５ｎＭ　３６．５グルカゴン＋Ｓｉ、　１．０ｍＭ　 ４７．５グルカゴン＋Ｓｉ、　２．０ｍＭ　５２．２賢臓アデニル　シクーーゼ 図２に示すように、試験結果は肝臓について得られたものに類似していた。ただ し、０．５ｍＭの珪酸はアデニル酸シクラーゼ活性を阻害するように思われたが 、２０＋Ｈの珪酸は活性を２倍以上高めた（２．１−５．５ピコモル　サイクリ ックＡＭＰ／管）。

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）はアデニル酸シクラーゼ活性を高め、０．シー珪酸 は再び活性を阻害するように思われた。１．０および２．０ｍＭの珪酸はＮａＦ 対照よりもさらにＰＴＨで刺戟した活性を高めた（２３ピコモル／サイクリック ＡＭＰ／管）。表Ｈに得られた結果を示す。

表■ したサイクリックＡＭＰ　、ピコモル１基礎活性　２．２４ Ｎａ　Ｆ　１４．３ Ｓｉ、　０．５ｎ＋Ｍ　１．１５ Ｓｉ、　１．０ｍＭ　１．９６ Ｓｉ、　２．０ｍＭ　５．５９ ＰＴＨ１３，０ ＰＴ）ｌ　＋Ｓｉ、　０．５ｍＭ　９．７ＰＴ）ｌ　＋Ｓｉ、　１．軸Ｍ　１５ ．５ＰＴ）Ｉ　＋Ｓｉ、　２．０ｍＭ　２３．０アデニル　シクーーゼ 珪酸はすべての濃度において、基礎条件下でサイクリックＡＭＰの蓄積を増大し た（図３）（基礎活性−０，３５；　２．０緒珪酸活性＝０．８６ピコモル／サ イクリックＡ？ｌＰ／管）。肝臓および腎臓の場合のように、珪酸は、またアデ ニル酸シクラーゼ活性に対する甲状腺刺戟ホルモン（ＴＳＨ）の効果をも高めた 。表■に得られた結果を示す。

表■ ηは肚７ＡＭＰ　、ぷ旦」 基礎活性　０．３５ Ｎａ　Ｆ　１．１１ ＴＳＨ０，７５ Ｓｉ、　０．５ｍＭ　Ｏ，４０ Ｓ＋、　］、抛Ｍ　Ｏ，６９ Ｓｉ、　２．０ｍＭ　Ｏ，８７ ＴＳＨ＋Ｓｉ、　０．５ｍＭ　Ｏ，７６ＴＳＨ＋Ｓｉ、　１．０ｍＭ　Ｏ，８７ ＴＳｆｌ　＋Ｓｉ、　２．０ｍＭ　１．０８Ａアデニル　シクーーゼ 図４でわかるように、珪酸はすべての濃度でアデニル酸シクラーゼ基礎活性を高 めた（１．０対１．８ピコモル　サイクリックＡ門Ｐ／管（２，０ｍＭ珪酸の場 合））。さらに、珪酸のすべての投与量はアデニル酸シクラーゼ活性に対するＰ ＴＨの効果を高めた（珪酸なしのＰＴ）Ｉの場合、１．４ピコモル；　ＰＴＩＮ −２，０ｍＭ珪酸の場合２．０ピコモル　サイクリックＡＭＰ）　。

亜Ａ（ると　の１、のへ果 珪素がアデニル酸シクラーゼに影響を及ぼす１つの考えられる機構は二価カチオ ンと結合することによるものであるから、概算のＣａ”濃度がほぼ１０マイクロ モルである前記のような緩衝系および０．５ｍＭ　ＥＧＴＡを含み、Ｃａ”４度 が０．２マイクロモルである系における効果の比較を行った。図５の左部に示す ように、２ｎ＋Ｍの珪酸は再び基礎活性以上にアデニル酸シクラーゼ活性を高め 、かつ肝臓細胞膜中のグルカゴン刺戟を強めた。ＥＧＴＡがあると、基礎活性お よびグルカゴン活性が顕著に高まり、２ｍＭの珪酸は添加効果がなかった。これ らのデータは珪素がＣａ”と結合してＣａ”の阻害効果を低下させるのであろう ということを示唆した。これが真実であれば、珪酸がある場合とない場合の２つ のアデニル酸シクラーゼのＭｇ”活性の逆数をプロットすると拮抗阻害のように 見えなければならない。Ｌ７かし、図６でわかるように、このことは真実ではな くて、珪酸の効果は単にＣａ４４に結合することによって媒介されるだけではな いことを示唆した。このことは、また、図７かられかるように珪酸がアデニル酸 シクラーゼのＣａ”阻害を防止しなかったという知見によっても支持される。

他の実験において、使用緩衝液中の珪酸濃度を原子吸光分析法で測定した。珪酸 に対する投与量依存反応は図８に示すように、肝臓細胞膜中で評価した１図でわ かるように、０．５１のＥＧＴＡおよび０．２マイクロモルのＣａ”が存在する と、基礎活性から珪酸２ミリモル濃度までアデニル酸シクラーゼ活性の段階的阻 害があった。

考−察 上記実験結果は珪酸がアデニル酸シクラーゼ基礎活性およびホルモンで刺戟した アデニル酸シクラーゼ活性を高めることを示す。この増加は検討したすべての組 織に現われているので、この効果は普遍的なものと思われる。

この効果を招く機構は明かではない。ＥＧＴＡがあると珪酸の効果がなくなるの は珪酸が単にイオン化Ｃａ”と結合することによって作用し、その結果Ｃａ”の 阻害作用を除去することによってアデニル酸シクラーゼ活性を高めようとするた めであろうと考えられる。Ｃａ”が重要な細胞内の第２のメツセンジャーであり 、珪酸が細胞内に存在しているので、これは生体内の珪酸の効果の考えられる機 構である。

図６で拮抗阻害の認められないことも、また図７でＣａ”阻害の低減に対する珪 酸の効果のないことも、それ以上のものが関与していることを示すものである。

珪酸は、またＭｇ”とも結合して、アデニル酸シクラーゼ活性の低下をもたらす ことになろう。これはＣａ”が低濃度（０，２マイクロモル）で珪酸の活性阻害 をひき起した図８の知見を説明できるかもしれない。しかし、−珪酸は極めて弱 い酸であって、水酸化物の沈殿が生じるレベルよりも低いｐＨレベルにおいての み金属イオンと相互に作用するだけであって、生理的ｐＨではＣａ”およびＭｇ ”を排除するであろうと思われる。

考えられる機構はほかにもある。−珪酸はＮタンパク質の？Ｉｇ”活性もしくは Ｃａ゛阻害またはＮタンパク質に対するこれら二価カチオンの親和力に影響を及 ぼすことができる。さらに、珪酸は直接Ｎｓの活性化またはＮｉ活性の阻害をひ き起すことができるかもしれない。他の考えられる機構にはホルモンによるに活 性化の低下または接触的サブユニット活性の直接増大がある。

これらの知見の臨床的意義はまだ明かになっていないけれども、上記の結果はヒ トおよび家畜用薬剤中への珪酸の数々の使用を示唆する。より具体的には、該結 果はホルモン反応を調節するのに珪酸を使用できることを示す。たとえば、グル カゴンに対する試験結果は、グルカゴンの効果が所望よりも低い場合に、患者の 血糖値を調節するのに珪酸源を使用できることを示唆する。

珪酸、または珪酸を供給する化合物を用いる治療によって改善させることができ る症状の中には、骨減少症、低血糖症、カルシウム過少血症等があり、反応はす べて特定のホルモン／アデニル酸シクラーゼ／組織系によって媒介される。例示 のために、特に興味のある本発明の態様は珪酸、または核酸を供給する化合物に よる骨粗に症の治療である。β−アドレナリン作用遮断薬／β−アドレナリン作 用薬といった種類の神経伝達物質によって影響される高血圧症／低血圧症のよう な他の症状は、これらの症状も特定のアデニル酸シクラーゼ系によって調節され るので、珪酸塩供給物質による治療のターゲットである。一般的には、サイクリ ングＡＭＰによって媒介される任意のプロセスは珪酸塩治療のターゲットである 。

本研究は珪酸がアデニル酸ンクラーゼ活性に作用し、このようにして骨格の成長 および／または骨のミネラル化に影響を及ぼすことを示すので、カルシウムに関 連する骨の疾病の兆候を阻止、処置もしくは遅滞させ、または骨の強さが所望に 達しないヒトもしくは動物検体の骨の強さを高めるのに珪酸を使用できることが 提案される。このように、上記の結果はヒトならびにイヌ、矛コ、ウシおよび草 種ならびにブタを含む商業的に重要な家畜のようなを椎動物の骨減少症を治療す るのに珪酸を使用できることを示す。ヒトの場合には、（ａ）更年期後の骨粗■ 症、（ｂ）ステロイド治療によって生じた骨粗Ｎ症、および（Ｃ）長期の寝たき りの療養、または長期の宇宙旅行による骨のミネラルの欠乏を治療するのに珪酸 を使用できることが提案される。

前記詳細な説明を承知している当業者は、添付クレームの範囲および精神を逸脱 することなく開示された発明の多（の変更を行うことができる。

図２ 図３ 図４ ピコモル、ＣＡＭＰ／ｍｇタンパク質／１０分図６Ａ 図６Ｂ 図７ アデニル酸シクラーぜ珪素 Ｋ１−４．０ｍＭ　Ｍ（］（ｆ）−２／２６／８８０１ＦＦ臓＋Ｓｉ　ｏｆｆ臓 −５ｉ 図８ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５７９９ 平成　２年特許願第５０１９１５号 ２、発明の名称 アデニル酸シクラーゼ反応の調節 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　エチル・コーポレーション ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　４年　４月１４日　（発送日）６、補正の対象 （１）出願人の代表音名を記載した国内書面国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．アデニル酸シクラーゼを調節する方法において、該シクラーゼを少量の、調 節量の珪酸と接触させることを含む方法。
2. ２．前記調節量が約０．０５ないし約２．０ミリモルの濃度である請求項１記載 の方法。
3. ３．前記珪酸が一珪酸である請求項１記載の方法。
4. ４．前記シクラーゼが肝臓アデニル酸シクラーゼである請求項１記載の方法。
5. ５．前記シクラーゼが腎臓アデニル酸シクラーゼである請求項１記載の方法。
6. ６．前記シクラーゼが甲状腺アデニル酸シクラーゼである請求項１記載の方法。
7. ７．前記シクラーゼが骨アデニル酸シクラーゼである請求項１記載の方法。
8. ８．アデニル酸シクラーゼ系を調節することによってホルモン、リンホカイン、 成長因子、および神経伝達物質のような生化学的メッセンジャーに対する反応を 修正する方法であって、該シクラーゼ系を約０．０５ないし約２．０ミリモルの 濃度範囲内の少量の、調節量の珪酸と接触させることを含む前記方法。